Summary
우리는 셀과 다중 세포 소기관으로 3D 문화와 실험을 위한 장치를 구성 하는 방법을 설명 합니다. 이 장치는 정의 된 화학 유인 구배가 있는 3D 미세 환경에서 가용성 신호에 대 한 셀룰러 응답을 분석 할 수 있습니다. 유기 체는 약한 시끄러운 입력의 검출에 단일 세포 보다 낫다.
Abstract
2D 세포 배양 시스템의 다양 한 한계는 살아있는 조직의 공간적 및 화학적 복잡성을 더 잘 모방 하 고 생체 내 조직 기능을 모방 하는 3D 세포 배양 및 분석 플랫폼에 대 한 관심을 촉발 시켰습니다. 최근 미세 제조 기술의 진보는 세포가 잘 정의 된 세포 외 기질 (ECM)과 가용성 또는 매트릭스 관련 생체 분자의 정의 된 집합으로 통합 될 수 있는 생체 외 환경에서의 개발을 촉진 시켰다. 그러나, 기술 장벽은 연구 실험실에서 그들의 대폭적인 사용을 제한 했습니다. 여기서, 우리는 정의 된 화학 유인 구배와 함께 3D 미세 환경에서 세포와 멀티 셀로 노이 드와 3D 문화와 실험을 위한 간단한 장치를 구성 하는 방법을 설명 합니다. 이 플랫폼의 사용은 상피 세포와 유기 체의 반응의 분석을 위해 표 피 성장 인자 (EGF)와 같은 성장 인자의 그라데이션에 관한 것 이다. EGF 그라데이션은 유 방 소기관에서 지시 된 지점 형성으로 이어지는 며칠 동안 장치에서 안정 하였다. 이 분석을 통해 셀 그룹에의 한 집단 그라데이션 감지가 더 민감하고 단일 셀 이라고 결론을 내릴 수 있었습니다. 우리는 또한 포토 리소 그래피 시설이 나 고급 소프트 리소 그래피 기술이 필요 하지 않은 제조 방법을 설명 합니다. 이 방법은 암을 포함 하 여 발달 및 병리학 적 상태 분석의 맥락에서 3D 세포 거동을 연구 하는 데 도움이 될 것입니다.
Introduction
생리 적 환경에서 세포는 셀 외 기질 (ECM)에 내장 되어 과다 한 생체 분자에 노출 됩니다. 세포와 주변 미세 환경 사이의 상호 작용은 마이그레이션, 성장, 분화 및 생존1을포함 하 여 다양 한 표현 형을 제어 하는 세포내 프로세스를 조절 합니다. 많은 것은 종래의 2D 세포 배양에서 세포 거동에 대해 배웠다. 그러나 3D 하이드로 겔에 내장 된 세포에 대 한 생체 내 이미징 및 실험의 출현으로, 세포 거동에 중요 한 차이는 간단한 2D 시험관 내 배양과 3D 조직 유사 환경에서 인식 되었습니다. 셀이 ECM 섬유와 상호 작용 하 고 3D 매트릭스 내에서 기계적 특성을 감지 하는 동안 젤의 재료 강성은 2D 시험관 시스템에서 완전히 독립 된 변수가 아닙니다. 차원은 초점 부착 형성을 변경 하 여 다른 세포 형태학과 행동을 초래 합니다. 또한 2D 표면의 셀은 3D에서 모든 방향으로 열린 셀 보다 더 적은 신호 전달에 노출 됩니다.
이러한 한계는 생체 조직의 공간적 및 화학적 복잡성을 나타내고 체 내 조직 기능을 더 잘 예측 하는 3D 시스템에 대 한 관심을 증가 시켰습니다. 그들은 ECM3,4에 무작위로 산재 된 세포에 세포 마이크로 구조체를 자체 조립 하는 것과 같은 다양 한 형태로 개발 되었습니다. 미세 제조 기술의 최근 진보는 표현 형 변화를 연구 하기 위한 3d 배양 시스템 (5,6,7,8,9 )의 출현을 촉진 하 고 가용성 신호에 대 한 세포 반응; 그러나, 기술 장벽은 연구 실험실에서 널리 사용을 제한 합니다. 대부분의 경우 제작 공정에는 포토 리소 그래피 기법과 배경 지식을이 필요 합니다. 더욱이, 장치를 성공적으로 구축 하 고 장기간에 걸쳐 장치의 최적 기능을 달성 하기 위해 다양 한 요인을 제어 해야 합니다.
우리의 방법은 정의 된 화학 유인 구배와 함께 3 차원 미세 환경에 세포 및 멀티 세포 소기관을 통합 하 고 EGF10에 대 한 상피 반응을 분석 하기 위한 3d PDMS 장치를 구성 하는 방법을 설명 합니다. 당사의 데이터에의 하면, 얕은 EGF 그라데이션에 반응 하는 소기관의 용량은 갭 접합부를 통한 세포 간 화학적 커플링에서 발생 합니다. 이는 취약 하 고 시끄러운 공간적으로 등급이 매겨진 입력을 보다 정밀 하 게 감지할 수 있는 소기관의 가능성을 시사 합니다. 제조 공정은 청정 실 시설이 나 포토 리소 그래피 기술이 필요 하지 않습니다. 그러나, 3D PDMS 디바이스는 3D 생리학적 환경의 필요한 요인을 포함 한다. 이 방법은 3D 셀룰러 동작을 연구 하는 데 도움이 될 것 이며 다른 세포 유형, chemoattractants 및 ECM 조합으로 큰 연구 잠재력이 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
모든 동물 작업은 검토 및 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 진행 되었다, 존스 홉킨스 대학, 의학의 학교.
1. mesofluidic 장치의 제작
- 3D CAD 소프트웨어를 사용 하 여 PDMS 장치용 몰드 마스크를 설계 합니다.
- 열 저항 수 지가 있는 스테레오 리소 그래피 장비를 사용 하 여 금형을 인쇄 합니다.
참고: 여기에 설명 된 절차는 상업용 3D 프린팅 서비스에 의해 수행 되었습니다. - 경화제와 함께 PDMS 모노 머 용액을 10:1 비율로 철저히 섞어 줍니다. 3 mL의 PDMS 혼합물을 소자의 제조에 요구 하였다. 총 체적은 조작 하는 금형의 수에 따라 달라 집니다.
- 진공을 적용 하 여 혼합물을 가스 제거 하 고 1 시간 동안 내부 실험실 진공 또는 진공 건조 기에 감압 펌프를 사용 한다.
- 접착 테이프로 몰드 표면을 살짝 두 드려 먼지를 제거한 다음 PDMS 혼합물을 몰드에 부 어 넣습니다. 거품이 공정에 도입 되는 경우, 진공 건조제에 탈 기를 반복 한다. 금형의 기둥 사이에 갇힌 기포는 날카로운 바늘로 파고 하 여 제거 할 수 있습니다.
참고: 실 온에서의 탈 기 공정은 1 시간 이내에 이루어져야 합니다. - 80 ° c에서 2 시간 동안가 열 하 여 PDMS를 경화 시킨다. 몰드가 실 온에서 냉각 되도록 합니다.
- 블레이드를 사용 하 여 몰드와 PDMS 사이의 경계를 자른 다음 몰드에서 PDMS를 조심 스럽게 벗 겨 냅니다.
- 22 mm x 22mm 커버 슬립에 맞게 PDMS 파트를 트림 하 고 입구에 구멍을 뚫습니다.
참고: 여기서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. - 낮은 보풀 조직으로 표면을 닦 고 70% 에탄올로 PDMS 부분과 22mm x 22mm 커버 슬립을 청소 합니다. 그런 다음 접착 테이프로 큰 먼지 입자를 제거 합니다.
- PDMS 부품과 커버 슬립을 자동 멸 균 (121 ° c, 습식 15 분간 건조) 또는 1 시간 동안 자외선에 노출 시키는 방법으로 소독 합니다.
- 조직 배양 후드에 5 분간 코로나 방전 총으로 PDMS 파트와 커버 슬립의 바닥면을 처리 한 후 함께 결합 한다.
주의: 폴리스 티 렌 폼과 같은 비 전도성 물질을 바닥에 놓고이 과정에서 모든 전도 물질을 제거 하십시오. 콜라겐 젤과 유리 커버 슬립 사이의 결합을 증가 시키기 위해 치료 후 5 분 이내에 즉시 장치에 교원 질을 주입 하십시오.
2. 세포 준비: 1 차 유 방 관 능 분리
참고: 유 방 관 능 분리의 세부 사항은 이전 작업11에서 찾을 수 있습니다. 임의의 종류의 단일 세포 또는 관 능 노이 드를 자신의 절연/분리 프로토콜에 따라 제조할 수 있다.
- 쥐의 유선 조직을 메스로 하 여 조직을 이완 하 고 37 ° c에서 30 분 동안 50 mL의 콜라 게 나 제/트립 신 용액 (마우스 당 10ml)의 0.1 g을 사용 하 여 보충 하 고, 트립 신과 콜라 게 나 제, 0.1의 g , FBS의 5 mL, 1 μ g/m l 250 μ l 및 50 μ g/mL 겐 타 마이 신의 50 μ l.
- 콜라 게 나아 제/트립 신 용액을 10 분 동안 1250 x g 에서 원심 분리 하 여 흡 인에 의해 상층 액을 제거 한다. DMEM의 10ml의 세포를 분산 시키고 10 분 동안 1250 x g 에서 원심 분리기를 분리 합니다. 흡 인에 의해 DMEM/F12를 제거한 후, DNase (2 단위/μ l)의 40 μ l로 보충 된 4Ml/f12 DMEM의 세포를 재 중단 하십시오.
- 2-5 분 동안 DNase 용액을 손으로 흔들고 10 분간 1250 x g 에서 원심 분리 합니다.
- 단일 세포에서 4 개의 차동 원심 분리 (펄스-1250 x g )를 통해 소기관을 분리할 수 있으며 의도 한 속도에 도달한 후 원심 분리기 3-4을 중지 합니다. 각 펄스 사이에, 상층 액을 흡 인 하 고 10ml의 DMEM/F12에서 펠 렛을 소생 한다.
- 콜라겐 준비를 위해 1% 페니실린/streptomycin와 1% 인슐린 트랜스 페 린-셀 렌-X와 DMEM의 원하는 양의 성장 배지의 최종 펠 렛을 재 일시 중단 하십시오.
3. 콜라겐 준비 및 주입
참고: 다른 유형의 ECM 젤은 자체 겔 화 프로토콜에 따라 제조할 수 있습니다.
- 콜라겐 타입 I 용액 (3.78 mg/ml)을 준비 하 고, 10 배 DMEM, 1nnaoh 용액을 얼음에 정상적인 성장 배지로 제조 하였다.
참고: 절차가 완료 될 때까지 얼음을 보관 하십시오. - 1 N NaOH 용액 6 μ l를 추가 하 고, 200 μ l의 성장 배지 및 50 μ l의 DMEM을 미리 냉장 된 마이크로 원심 분리기 튜브에 넣고 용액을 완전히 섞어 줍니다.
- 425 μ l의 콜라겐을 미리 혼합 된 용액에 넣고 파이 펫 팅을 통해 철저히 섞어 줍니다.
- 콜라겐 혼합물을 짧게 (5 초 미만) 원심 분리 하 여 혼합물 로부터 기포를 제거 한다.
- 중성화 된 콜라겐 용액을 얼음 위에 1 시간 동안 보관 하 여 섬유 형성을 유도 한다.
- 세포 현 탁 액의 50 μ l을 콜라겐 혼합물에 넣고 완전히 섞어 줍니다.
참고: 최종 콜라겐 농도는 2mg/ml입니다. - 전체 챔버가 채워질 때까지 PDMS 디바이스의 입구를 통해 200 μ l pipet를 사용 하 여 용액을 주입 한다. 콜라겐 혼합물이 기둥의 틈새를 통과 하는 경우, 겔 화 후에 날카로운 외과 잎으로 과잉 콜라겐 젤을 잘라냅니다.
- 상기 장치를 배양 기에 37 ° c에서 1 시간 동안 5% co2로 유지 하 여 겔 화를 유도 한다.
- 양쪽에 있는 저장소를 성장 매체로 채우고 공초점 이미징이 수행 될 때까지 5% CO2를 사용 하 여 37 ° c의 인큐베이터에 장치를 보관 하십시오.
4.3D 이미징 및 정량화
- 라이브 셀 이미징 배양 챔버를 공초점 현미경에 설치 하 고 온도와 CO2 내지 37을 각각 미리 설정 한다. 습도를 높이기 위해 챔버의 저수지에 물을 추가 하 고 필요한 경우 젖은 물티슈를 챔버에 놓습니다.
- 챔버에 PDMS 디바이스를 배치 하 고 그라데이션 형성에서 EGF의 ' 소스 '로 서 하나의 저장소에 EGF를 추가 한다. 다른 저장소는 공간적으로 등급을 매긴 EGF 분포의 개발에 필요한 ' 싱크 '를 제공 합니다. 2.5 nM의 EGF를이 연구에서 0.5 nM/mm의 기울기를 만들기 위한 싱크에 첨가 하였다.
- 관심 있는 소기관의 부피를 덮는 Z 스택의 범위를 설정 하 고 이미징을 시작 합니다.
주의: 광 독성을 피하려면 공초점 이미징에서 낮은 레이저 강도를 시도 하거나 다중 광자 이미징 기술을 사용 하십시오. - 상업용 소프트웨어나 사용자 지정 프로그램을 사용 하 여 2D 이미지 스택에서 3D 이미지를 재구성할 수도 있습니다. 소기관 또는 개별 세포의 이동 으로부터 연장 되는 지점의 길이와 각도를 측정 한다. 여기서, ImageJ를 사용 하 여 상기 관 능 체를 중심으로 자유형 윤곽을 그려 정량화를 수행 한다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
EGF는 유 방 땀 샘의 형태 형성을 촉진 하는 필수 레 귤 레이 터 이며, 침 습성 암 성장에서 유방암 상피 세포의 이동을 유도 하는 중요 한 화학 유인 제입니다. 위에서 설명한 메조 스코프 유체 장치를 사용 하 여 정의 된 EGF 그라데이션 (도 1a, B)에 대 한 세포의반응을 연구 하였다. 이 장치는 폭이 5mm, 길이 10mm, 높이 1mm의 문화 영역을 생성 합니다. 배양 영역의 측면은 표면 장력을 통해 세포 배양 영역 내의 액체 ECM 및 세포 혼합물을 트랩 하는 데 사용 되는 육각형 기둥에 의해 개방 우물에서 분리 된다. 우리는이 3D 문화의 크기를 감안할 때, 포토 리소 그래피10에 의해 적절 한 크기의 몰드를 구성 하는 것이 매우 어렵고, 비싸고, 시간이 많이 소요 될 것 이라는 점을 주목 한다. 표준 기술, 스테레오 리소 그래피의 새로운 응용 프로그램을 사용 하 여, 우리는 신속 하 고 저렴 하 게 금형을 생산 했다. 또한 설계를 수정 하 여 지 수 구배 (도1c, i) 또는 다중 선형 기울기를 칩 (도1c, ii)으로 유도 하는 것은 물론 연속적인 흐름으로 안정 된 구배를 유도할 수도 있다 (도 1c, iii).
모두 인실 리코 (도 2a, B, C) 및 시험관 내에서 (도 2d,E, F) 시험은 약 2 일 동안 지속 되는 세포 배양 영역에 걸친 안정한 선형 EGF 그라데이션의 형성을 입증 하였다 ' 소스 ' 및 ' 싱크 ' 저수지. 단백질의 시간 의존적 확산은 상용화 된 다중 물리 소프트웨어를 사용 하 여 시뮬레이션 되었다. 챔버 구성의 3D 형상이 소프트웨어 상에 재작성 되 고 챔버 부피 내의 평균 농도가 결정 되 고 플롯 되었다. 이러한 결과는 EGF, 6.4 kDa 단백질, 상대적으로 짧은 기간 동안 전술한 바와 같이 제조 된 콜라겐 겔 내에서 안정한 확산 기반 구배를 형성할 수 있음을 시사 하였다. 우리는 또한 1, 10 및 150 kDa의 단백질의 유사한 프로필이이 방법을 사용 하 여 형성 될 수 있다고 결정 했습니다.
유 방 소기관은 공간적으로 균일 한 2.5 nM의 EGF와 분기 형성의 존재 하에서 여러 가지를 형성 하 고 3 일에 걸쳐 방향성 바이어스를 표시 하지 않았다 (도 3a, D). 그러나, EGF가 0.5 nM/mm의 선형 기울기의 형태로 첨가 되는 경우, 분기 형성은 상당한 방향성 바이어스를 표시 한다 (도 3b, E). 그러나 동일한 기울기의 단일 셀에 대해 이러한 바이어스를 감지 하지 않았습니다. 그라데이션 응답에 멀티 셀 통신이 필요한 지 여부를 확인 하기 위해 다양 한 억제제가 있는 세포 간 갭 접합부를 차단 하면 편향 된 분기 형성을 예방할 수 있는지 살펴봅니다. 갭 접합 억제제는 실제로 그 구배에 반응 하는 소기관의 능력을 억제 하였다 (도 3c, F). 이 방법10을 설명 하는 원 연구에서 더욱 광범위 하 게 탐구 된 것 처럼, 이러한 결과는 유 방 유기 oid (10)에서 EGF 그라데이션 반응을 위해 갭 접합부를 통한 통신이 필요 하다는 가설을 뒷받침 한다.
그림 1입니다. 정의 된 EGF 그라데이션으로 Mesofluidic 장치. (A) pdms 칩의 3d 뷰: (i) 금형의 정면도 (단위: 3) 몰드 로부터가 해지는 pdms (투명 한) pdms 챔버가 충 진 된 몰드 (v)의 배열 (v) 조립 장치 (vi)의 개략도는 장치 충전의 실제 그림 콜라겐 젤과 배양 액을 드 렸 습니다. (B) 유기 oid가 포함 된 mesofluidic 챔버를 콜라겐 겔과 높은 (적색) 및 저 (적색) egf 농도의 저장소에 내장 하 여 egf 그래디언트를 생성 하는 개략도 (이 도면은10에서 수정 되었다). (C) 지 수 구배를 유도 하기 위한 잠재적 설계 (i), 칩에서 4 개의 상이한 선형 그라데이션 및 연속 흐름 (iii)을 갖는 안정 된 구배. 적색 영역은 배지로 채워진 소스 또는 싱크를 나타내며 회색 영역은 겔/세포 혼합물로 채워진 챔버를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. 칩 전반에 걸친 리간드 기울기의 평가. (A) 그 레이디언 트 프로 파일을 보여주는 칩 전반의 리간드 농도 시뮬레이션. (B) 1 kda 단백질 및 (C) 70 kda의 시뮬레이션 된 구배 프로 파일. (D) 선형 그래디언트 10 KDa의 덱 스 트 란 청색을 갖는 소자의 이미지는 EGF의 확산을 가시화 하는 데 사용 된다. 육각형 점선은 겔 영역 측면의 기둥을 나타냅니다. 칩 상에 서 1, 10 및 150 kDa 덱 스 트 란의 실험 구배 프로 파일 (이 도면은 48 시간 후에 8 시간 및 F ) 후에 2016 변경 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3입니다. EGF 그라데이션에 대 한 셀룰러 반응. (A) 2.5 NM EGF를 균일 하 게 갖는 콜라겐 내 유기 oid의 비 방향성 분기. (B) 0.5 nM의 선형 구배를 갖는 콜라겐의 유기 oid의 방향성 분기. (C) 갭 정션 차단기를 갖는 EGF의 0.5 nM/mm의 선형 구배에서 유기 oid의 비 방향성 분기. (D. F) 각각 (A)에 해당 하는 관 능 식 분기 방향의 각 히스토그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
PDMS 몰드의 제작은 상업용 3D 프린팅 서비스를 사용 하 여 수행 되었지만, 사내 하이 엔드 3D 프린터로도 수행할 수 있습니다. 다양 한 3D 제작 방법 중에서 입체 리소 그래피는 고해상도 몰드 생성에 권장 됩니다. PDMS 경화는 고온 (80 ° c)에서 발생 하기 때문에 인쇄를 아웃소싱 할 경우 재료는 충분히 열적으로 내성이 있어야 하며이를 명시적으로 지정 해야 합니다. 열 후 경화는 부품의 열 저항을 높이기 위해 인쇄 서비스 회사와 논의 할 수 있습니다. 인쇄 서비스 및 재료의 세부 사항은 재료 표에명시 되어 있습니다.
경화 된 PDMS의 기계적 성질은 경화 온도에 따라 달라진 다. PDMS 혼합물을 오븐에서 경화 하기 전에 오랜 시간 동안 실 온에서 보관 하면, 완전 경화 후에도 너무 탄성이 된다. 따라서, 실 온에서의 탈 기 공정은 1 시간 이내에 이루어져야 한다. 탈 기는 PDMS 내의 미세 기포를 제거 하는 데 도움을 줄 수 있는 진공의 순환 적용을 의미 합니다.
콜라겐 용액의 pH는 겔 화 뿐만 아니라 세포 생존에도 중요 합니다. 콜라겐이 세포와 혼합 되기 전에 중화 되지 않으면 세포 생존 율이 낮을 것입니다. 콜라겐 혼합물을 중화 시키기 위한 1 N NaOH 용액의 양은 본래 콜라겐 용액의 pH에 따라 다르며 이론적으로 계산할 수 있다. 그러나, NaOH 용액을 콜라겐 용액에 서서히 첨가 하 여 페 놀 적색 지시약 또는 pH 테스트 테이프를 사용 하 여 배지의 pH 판독값을 확인 하는 것이 좋습니다.
겔을 제거 하는 것은 전체 과정에서 중요 합니다. 콜라겐 혼합물이 장치 내로 주입 된 후 겔 화 동안 기포가 형성 되는 경우, 이들은 또한 10 분 이상 동안 얼음에 장치를 배치 하 여 제거 될 수 있다. 온도를 떨어 뜨 리 면 기포의 크기가 감소 하 고 공 극이 결국 겔 혼합물에 의해 점유 됩니다. 용기에 배양 액을 첨가 한 후 기둥 사이에 거품이 갇혀 있을 때 동일한 방법을 사용할 수 있습니다.
우리는이 기술을 사용 하 여 대형 다중 세포 구조를 생리 적으로 관련 된 세포 외 기질 환경에 포함 시키고 성장 인자 및 기타 가용성의 정의 된 그라디언트로 통합 하는 mesofluidic 장치를 개발 했습니다. 생리 활성 분자. 고해상도의 스테레오 리소 그래피를 통해 고품질의 저비용 금형을 생산할 수 있었습니다. 제조 공정은 청정 실 시설이 나 포토 리소 그래피 기술을 필요로 하지 않으며, 따라서 세포 배양 및 실험에 대 한 3D 환경의 간단 하지만 효과적인 생성을 할 수 있습니다,이는 여러 가지 이점이 대 한 기존의 2D 실험. 여기에 예시 된 장치는 5mm 너비의 배양 영역, 10mm 길이 및 1mm 높이를 갖도록 설계 되었습니다. 높이가 더 두꺼운 상대적으로 큰 배양 영역에서는 수만에서 수백 마이크로미터의 크기에 이르는 메조 크로 오 이드 또는 스 페 라 이드의 성장을 허용 합니다. 그것은 또한 분 지 상피 형태 형성의 분석을 허용 하 고, 3D 환경 내에서 집단적 및 단일 세포 이동의 분석. 장치의 측면은 표준 파이 펫을 사용 하 여 미디어를 변경 하거나 일반적으로 주류 미세 유체 장치에 사용 되는 액체 제어 장치와 복잡 하 게 인터페이싱 할 필요 없이 약물을 추가 할 수 있는 개방형 우물입니다. 더욱이, PDMS 챔버와 하단에 커버 글래스를 간단 하 게 구성 하는 것은 다양 한 현미경 시스템과 보편적으로 호환 됩니다. 장치의 사용은 통상의 유 방 조직에서 형태학 적으로 형성 된 지의 분기 방향을 나타내 었 고, 임 포 징 된 EGF에 응답 하 여 장치의 사용에 대 한 대표적인 예이다. 그러나,이 사용법은 또한 3D에서 세포/조직 행동의 분석을 위한 다른 조직, 세포 근원, chemoattractants 및 약으로 연장 될 수 있습니다. 사용은 또한 더 현실적인 조직 모델링을 수용 하도록 확장 될 수 있으며,이는 중간 엽 기질 및 면역 성분을 포함 하 여 다른 세포 유형의 통합과 함께 겔 내의 개별 세포 로부터 혈관 네트워크 형성을 수용할 것입니다. 다양 한 상피 세포 유형.
스테레오 리소 그래피는 3D 프린팅 기법 중에서 최고의 해상도를 제공 하지만, 최소 피처 크기는 여전히 수십 마이크로미터로 제한 됩니다. 따라서,이 프로토콜은 여러 마이크로미터의 스케일로 제조 금형에서 포토 리소 그래피를 대체 하기에 충분 하지 않다. 이 프로토콜의 또 다른 제한은 기존의 현미경 검사 법을 사용 하 여 이미징 조직 규모의 구조에 내재 된 문제 인 x-y 방향에 비해 z 방향에서 높은 품질의 이미징의 상대적으로 낮은 깊이 이다. 그러나 이러한 제한 사항이 있더라도 기술 된 방법은 제작 및 사용이 용이한 강력 하 고 유연한 분석 플랫폼을 제공할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작업은 AJE (NSF PD-11-7246, 유방암 연구 재단 (BCRF-17-048) 및 NCI U54 CA210173) 및 AL (U54CA209992)에 대 한 보조금에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22mm x 22mm coverslip | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Collagen I, Rat | Fisher Scientific | CB-40236 | |
| Collagenease | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| COMSOL Multiphysics 4.2 | COMSOL Inc | Used for simulating diffusion dynamics | |
| 10x DMEM | Sigma-Aldrich | D2429 | |
| DEME/F12 | Thermo Fisher | 11330032 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D4623 | |
| EGF Recombinant Mouse Protein | Thermo Fisher | PMG8041 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 16140-071 | |
| Fiji-ImageJ | Used for measuring branching length and angles | ||
| Gentamicin | GIBCO | 5750-060 | |
| IMARIS | Bitplane | ||
| Insulin | Sigma-Aldrich | 19278 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X | GIBCO | 51500 | |
| Low-lint tissue | Kimberly-Clark Professional | Kimtech wipe | |
| Mold Material | Proto labs | Accura SL5530 | |
| Mold printing equipment | Proto labs | Stereolithogrphy | Maximum dimension: 127mm x 127mm x 63.5mm, Layer thnickness: 0.0254mm |
| Mold printing Service | Proto labs | Custom | https://www.protolabs.com/ |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| Penicillin/Streptomycin | VWR | 16777-164P | |
| Spinning-disk confocal microscope | Solamere Technology Group | ||
| Sylgard 184 | Electron Microscopy Sciences | 184 SIL ELAST KIT | PDMS kit |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9935 |
References
- Humphrey, J. D., Dufresne, E. R., Schwartz, M. A. Mechanotransduction and extracellular matrix homeostasis. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 15 (12), 802-812 (2014).
- Schwartz, M. A., Schaller, M. D., Ginsberg, M. H. Integrins: emerging paradigms of signal transduction. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 11, 549-599 (1995).
- Yin, X., et al. Engineering Stem Cell Organoids. Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).
- Doyle, A. D., Carvajal, N., Jin, A., Matsumoto, K., Yamada, K. M. Local 3D matrix microenvironment regulates cell migration through spatiotemporal dynamics of contractility-dependent adhesions. Nature Communications. 6, 8720 (2015).
- Meyvantsson, I., Beebe, D. J. Cell culture models in microfluidic systems. Annual Review of Analytical Chemistry (Palo Alto, Calif). 1, 423-449 (2008).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
- Zervantonakis, I. K., et al. Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13515-13520 (2012).
- Barkefors, I., Thorslund, S., Nikolajeff, F., Kreuger, J. A fluidic device to study directional angiogenesis in complex tissue and organ culture models. Lab on a Chip. 9 (4), 529-535 (2009).
- Hou, Z., et al. Time lapse investigation of antibiotic susceptibility using a microfluidic linear gradient 3D culture device. Lab on a Chip. 14 (17), 3409-3418 (2014).
- Ellison, D., et al. Cell-cell communication enhances the capacity of cell ensembles to sense shallow gradients during morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), E679-E688 (2016).
- Nguyen-Ngoc, K. V., et al. 3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion. Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).
