Summary
Vi beskriver en metode for å konstruere enheter for 3D-kultur og eksperimentering med celler og flercellede organoids. Denne enheten tillater analyse av cellulære reaksjoner på oppløselige signaler i 3D-microenvironments med definerte chemoattractant graderinger. Organoids er bedre enn enkeltceller ved påvisning av svake støyende innganger.
Abstract
Ulike begrensninger av 2D cellekultur systemer har skapt interesse for 3D cellekultur og analyse plattformer, noe som ville bedre etterligne den romlige og kjemiske kompleksiteten av levende vev og etterligne in vivo vev funksjoner. Nylige fremskritt innen microfabrication teknologi har gjort det mulig å utvikle 3D in vitro-miljøer der celler kan integreres i en veldefinert ekstracellulære matrise (ECM) og et definert sett med oppløselige eller Matrix-tilknyttede biomolekyler. Teknologiske barrierer har imidlertid begrenset sin utbredte bruk i forskningslaboratorier. Her beskriver vi en metode for å konstruere enkle enheter for 3D-kultur og eksperimentering med celler og flercellede organoids i 3D-microenvironments med en definert chemoattractant gradering. Vi illustrerer bruken av denne plattformen for analyse av responsen av epitelceller og organoids til graderinger av vekstfaktorer, slik som epidermal vekstfaktor (EGF). EGF graderinger var stabile i enhetene i flere dager fører til rettet gren dannelse i bryst organoids. Denne analysen tillot oss å konkludere med at kollektive gradient sensing av grupper av celler er mer følsom kontra enkeltceller. Vi beskriver også fabrikasjon metoden, som ikke krever Foto litografi fasiliteter eller avanserte myke litografi teknikker. Denne metoden vil være nyttig å studere 3D cellulære atferd i sammenheng med analyse av utvikling og patologiske tilstander, inkludert kreft.
Introduction
I fysiologiske miljø, er celler innebygd i en ekstracellulære matrise (ECM) og utsatt for en overflod av biomolekyler. Interaksjoner mellom celler og de omkringliggende mikromiljøet regulerer intracellulære prosesser som kontrollerer ulike fenotyper, inkludert migrasjon, vekst, differensiering og overlevelse1,2. Mye har lært om mobilnettet atferd i en konvensjonell 2D cellekultur. Men med bruk av intravital Imaging og eksperimentering med celler innebygd i 3D-hydrogeler, viktige forskjeller i celle atferd har blitt anerkjent i forenklet 2D in vitro kulturer g. 3D vev-lignende miljøer. Mens cellene samhandler med ECM-fibre og føler sine mekaniske egenskaper i 3D-matrisen, er ikke materialets stivhet en helt uavhengig variabel i et 2D in vitro-system. Dimensionality endrer fokus vedheft formasjon, noe som resulterer i ulike celle morfologi og atferd. I tillegg blir celler på en 2D-overflate utsatt for færre signal signaler enn celler som er åpne for alle retninger i 3D.
Disse begrensningene har økt interessene for 3D-systemer som representerer den romlige og kjemiske kompleksiteten av levende vev og bedre forutsi in vivo vev funksjoner. De har blitt utviklet i mange former fra organoids som selv-montering Cellular mikrostrukturen til celler tilfeldig ispedd i ECM3,4. Nylige fremskritt innen microfabrication teknologi har muliggjort bruk av ulike typer 3D-kultur systemer5,6,7,8,9 for å studere fenotypiske endringer og cellulære reaksjoner på oppløselige signaler; teknologiske barrierer begrenser imidlertid utbredt bruk i forskningslaboratorier. I mange tilfeller, fabrikasjon prosesser forlange Foto litografi teknikker og miljøet kunnskaper for bløt litografi. Videre må ulike faktorer styres for å kunne bygge en enhet og for å oppnå en optimal funksjon av enheten over en lang tidsperiode.
Vår metode beskriver hvordan å konstruere en 3D PDMS enhet for å innlemme celler og flercellede organoids inn i en 3D mikromiljøet med definerte chemoattractant graderinger og deretter analysere epitel responser til EGF10. Våre data viser at kapasiteten til organoids å reagere på grunne EGF graderinger oppstår fra intercellulære kjemisk kopling gjennom gap knutepunkter. Det tyder på potensialet i organoids for mer presis påvisning av svake og støyende romlig gradert innganger. Det fabrikasjon forarbeide er ikke forlange en renrom Letter heller ikke Foto litografi teknikker. 3D PDMS-enheten inneholder imidlertid de nødvendige faktorene for 3D-fysiologisk miljø. Denne metoden vil være nyttig å studere 3D mobilnettet atferd og det har stor forskning potensial med ulike celletyper, chemoattractants, og ECM kombinasjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr arbeidet ble gjennomført i samsvar med protokoller gjennomgått og godkjent av institusjonelle Animal Care og use Committee, Johns Hopkins University, School of Medicine.
1. fabrikasjon av mesofluidic enheten
- Design masken av mold for PDMS enhet ved hjelp av en 3D CAD-programvare.
- Skriv ut mold ved hjelp av Stereolithography utstyr med en termisk resistent harpiks.
Merk: prosedyrene som beskrives her, ble utført av en kommersiell 3D-utskrift. - Bland grundig en PDMS monomer løsning med herding agent i en 10:1 ratio. 3 mL PDMS-blanding var nødvendig for fabrikasjon av anordningen. Det totale volumet avhenger av antall formene som skal fabrikkert.
- Degas blandingen ved å bruke et vakuum med bruk av en in-House laboratorium vakuum eller vakuum pumpe i et vakuum desikator i 1 time.
- DAB overflaten av mold med en selvklebende tape for å fjerne støv, og deretter helle den PDMS blandingen til mold. Hvis boblene er innført i prosessen, gjenta avgassing i vakuum desikator. Bobler fanget mellom søyler av mold kan fjernes ved å poking dem med en skarp nål.
Merk: avgassing prosessen ved romtemperatur bør gjøres innen 1 time eller mindre. - Cure PDMS ved oppvarming ved 80 ° c i 2 timer. La mold avkjøles ved romtemperatur.
- Skjær grensen mellom mold og PDMS med et blad og deretter skrelle av PDMS fra mold nøye.
- Trim PDMS delen til å passe på 22 mm x 22 mm dekkglass og punch et hull ved innløpet.
Merk: protokollen kan stanses midlertidig her. - Rengjør PDMS-delen og 22 mm x 22 mm dekkglass ved å tørke av overflatene med lavt lo-vev og 70% etanol. Fjern deretter store støvpartikler ved dabbing med en selvklebende tape.
- Sterilisere PDMS-delen og dekkglass ved enten autoklavering (121 ° c i 8 minutter våt, 15 minutter tørr) eller eksponering for UV-lys i 1 time.
- Behandle den nederste overflaten av PDMS del og dekke slip med Korona utladning pistol i 5 min i vevet kultur panseret og deretter bånd dem sammen.
FORSIKTIG: Lay noen ikke-gjennomfører materiale som polystyren skum på bunnen og fjerne alle gjennomfører materialer under denne prosessen. Injiser kollagen i enheten umiddelbart, innen 5 minutter, etter behandlingen for å øke bindingen mellom kollagen gel og glass dekkglass.
2. celle forberedelse: primær bryst organoid isolasjon
Merk: detaljer om bryst organoid isolering finnes i et tidligere arbeid11. Enhver form for enkelt celle eller organoid kan tilberedes i henhold til deres egen isolasjon/avløsning protokoller.
- Hakke bryst kjertel vev av mus med en skalpell til vevet slapper av og rist den i 30 min ved 37 ° c i 50 mL kollagenase/Trypsin løsning (10 mL per mus) i DEME/F12 supplert med 0,1 g av Trypsin, 0,1 g av kollagenase , 5 mL FBS, 250 μL av 1 μg/mL insulin og 50 μL av 50 μg/mL Gentamicin.
- Sentrifuger den kollagenase/Trypsin løsningen ved 1 250 x g i 10 min. Fjern supernatanten ved aspirasjon. Spre celler i 10 mL DMEM/F12, og sentrifuger ved 1 250 x g i 10 min. Etter å ha fjernet DMEM/F12 ved aspirasjon, må du suspendere celler i 4 mL DMEM/F12 supplert med 40 μL av DNase (2 enheter/μL).
- Rist DNase løsningen for hånd for 2-5 min og deretter sentrifuger ved 1 250 x g i 10 min.
- Skill organoids fra enkeltceller gjennom fire differensial centrifugations (puls til 1 250 x g og stoppe sentrifuger 3-4 s etter at den når ønsket hastighet). Mellom hver puls, aspirer supernatanten og resuspend pellet i 10 mL DMEM/F12.
- Re-suspendere den siste pellet i ønsket mengde vekstmedium DMEM/F12 med 1% penicillin/Streptomycin og 1% insulin-transferrin-selen-X for kollagen forberedelse.
3. tilberedning og injeksjon av kollagen
Merk: andre typer ECM-gels kan tilberedes i henhold til sine egne gelation protokoller.
- Forbered kollagen type I løsning (3,78 mg/mL), 10x DMEM, 1 N NaOH løsning, normal vekstmedium på isen.
Merk: Hold på isen til prosedyren er fullført. - Tilsett 6 μL av 1 N NaOH-oppløsning, 200 μL av vekstmedium og 50 μL av 10x DMEM i en pre-kjølt mikrosentrifugen tube og bland løsningen grundig.
- Tilsett 425 μL av kollagen i den pre-blandede løsningen og bland godt med pipettering.
- Sentrifuger kollagen blandingen kort (mindre enn 5 sekunder) for å skille og fjerne bobler fra blandingen.
- Hold den nøytralisert kollagen løsningen på isen i 1 time for å indusere fiber dannelse.
- Tilsett 50 μL av celle fjæring i kollagen blandingen og bland godt.
Merk: den endelige kollagen konsentrasjonen er 2 mg/mL. - Injiser oppløsningen ved hjelp av 200 μL-Pipet gjennom innløpet til PDMS-enheten til hele kammeret er fylt ut. Hvis kollagen blandingen renner over gjennom hullene av søyler, kutte ut overflødig kollagen gel med skarp kirurgisk blad etter gelation.
- Oppbevar enheten i inkubator ved 37 ° c med 5% CO2 i 1 time for å indusere gelation.
- Fyll reservoarene på begge sider med vekstmedium og hold enheten i inkubator ved 37 ° c med 5% CO2 til konfokalmikroskopi bildebehandling er utført.
4.3D-avbildning og kvantifisering
- Installer en live-celle Imaging kultur kammer til et konfokalmikroskopi mikroskop og pre-set temperaturen og CO2 til 37 ° c og 5%, henholdsvis. For å få fuktighet opp, tilsett vann i reservoaret av kammeret og plasser våte kluter i kammeret om nødvendig.
- Plasser PDMS enheten i kammeret og Legg EGF til et av reservoaret som en "kilde" av EGF i gradient formasjonen. Det andre reservoaret vil tjene en "synke" nødvendig for utvikling av romlig gradert EGF distribusjon. 2,5 nM av EGF ble lagt i vasken for å gjøre gradient på 0,5 nM/mm i denne studien.
- Sett rekkevidden av Z-stakken dekker volumet av organoids av interesse og starte bildebehandling.
FORSIKTIG: for å unngå Phototoksisitet, prøv en lavere laser intensitet i konfokalmikroskopi avbildning eller bruk multi-Foton Bildeteknikker. - Rekonstruere et 3D-bilde fra 2D-bilde stabler ved hjelp av enten kommersiell programvare eller et skreddersydd program. Mål lengden og vinkelen på grener som strekker seg fra organoids eller migrering av enkeltceller. Her utfører kvantifisering ved å tegne en Frihånd omriss rundt organoid kroppen ved hjelp ImageJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
EGF er en viktig regulator av forgrening morphogenesis i brystkjertler og en kritisk chemoattractant guiding migrasjon av bryst epitelceller i invasiv kreft vekst. Vi brukte Mesoskopisk fluidic enhetene beskrevet ovenfor for å studere responsen av celler til definerte EGF graderinger (figur 1a, B)10. Enheten gir et kulturområde som er 5 mm bredt, 10 mm langt og 1 mm høyt. Sidene av kulturen området er atskilt fra åpne brønner av sekskantede søyler, som brukes til å felle væsken ECM og celle blanding i cellen kulturområdet gjennom overflaten spenning. Vi registrerer at, gitt størrelsen på denne 3D kulturen, ville det være svært vanskelig, dyrt og tidkrevende å konstruere en hensiktsmessig størrelse mold av foto litografi10. Ved å bruke en roman anvendelse av en standard teknikk, Stereolithography vi raskt og rimelig produserte mold. Videre, ved å endre utformingen, en eksponentiell gradient (figur 1C, i) eller flere lineære graderinger i en chip (figur 1C, II) kan indusert så vel som en stabil gradient med kontinuerlig flyt (figur 1C, III).
Både i silisiummangan (figur 2a, B, C) og in vitro (figur 2D, E, F) tester demonstrerte dannelsen av en stabil lineær EGF-gradient over cellekultur området som varte i ca. to dager uten å fylle på ' kilde ' og ' sink ' reservoarer. Den tidsavhengige spredningen av proteinene ble simulert ved hjelp av en kommersialisert Multiphysics programvare. Den 3D geometri av kammeret konfigurasjonen ble gjenskapt på programvaren og den gjennomsnittlige konsentrasjonen i kammeret volumet ble bestemt og plottet. Disse resultatene antydet at EGF, et 6,4 kDa-protein, kan danne en stabil diffusjon basert gradient i kollagen gel fremstilt som beskrevet ovenfor over en relativt kort tidsperiode. Vi har også fastslått at lignende profiler av proteiner på 1, 10 og 150 kDa kan dannes ved hjelp av denne metoden.
Bryst organoids dannet flere grener i nærvær av romlig uniform 2,5 nM EGF og gren dannelse viste ingen retningsbestemt bias over 3 dager (figur 3a, D). Men hvis EGF ble lagt i form av en lineær gradient på 0,5 nM/mm, gren formasjon vist en betydelig retningsbestemt bias (figur 3b, E). Vi oppdaget imidlertid ingen slik skjevhet for enkeltceller i samme gradering. For å avgjøre om flercellede kommunikasjon var nødvendig for gradient respons, vi utforsket om blokkering intercellulære gap veikryss med ulike hemmere ville hindre partisk gren dannelse. Gapet knutepunkt hemmere faktisk undertrykt evnen til organoids å svare på gradient (figur 3c, F). Som utforsket mer omfattende i den opprinnelige studien som beskriver denne metoden10, støtter dette resultatet hypotesen om at kommunikasjonen gjennom gapet veikryss er nødvendig for EGF gradient respons i bryst organoids10.
Figur 1. Mesofluidic enhet med definert EGF-gradering. (A) 3D-visning av PDMS-chip: (i) topp visning og (II) front visning av en mold (enhet: mm) (III) en rekke former (rød) fylt med PDMS (transparent) (IV) PDMS kamre pilled av fra mold (v) et skjematisk diagram av en sammensatt enhet (vi) et reelt bilde av enheten fylle med kollagen gel og kultur medium. (B) et skjematisk diagram av mesofluidic kammer med organoids innebygd i en kollagen gel og reservoarer av høy (rød) og lav (rød) EGF konsentrasjon som RESULTERER i EGF graderinger (dette tallet er endret fra10). (C) potensielle design for å indusere en eksponentiell gradient (i), fire forskjellige lineære graderinger i en chip (II), og en stabil gradient med kontinuerlig flyt (III). Røde områder indikerer kilder eller vasker fylt med kultur medium og grå områder indikerer kamre fylt med gel/celler blanding. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Evaluering av ligand graderinger over brikken. (A) simulering av ligand konsentrasjon over chip viser gradient profiler. Simulerte graderings profiler av (B) 1 KDA protein og (C) 70 KDA protein. (D) bilde av enheten med en lineær gradering av 10 KDa Dextran Blue brukes til å visualisere SPREDNINGEN av EGF. Sekskantede stiplede linjer indikere søyler på siden av gel området. Eksperimentelle graderings profiler på 1, 10 og 150 kDa dextran over brikken (dette tallet er endret fra Ellison et al. 201610) (E) etter 8 timer og (F) etter 48 timer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Cellular respons på EGF gradient. (A) ikke-retningsbestemt forgrening av organoids i kollagen med en ensartet 2,5 NM EGF. (B) retningsbestemt forgrening av organoids i kollagen med en lineær stigning på 0,5 nM/mm av EGF. (C) ikke-retningsbestemt forgrening av organoids i en lineær stigning på 0,5 nM/mm av EGF med et gap Junction blocker. (D-F) Kantete histogrammer av organoid forgrening retninger tilsvarende (A)-(C), henholdsvis. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fabrikasjon av PDMS muggsopp ble utført ved hjelp av en kommersiell 3D-utskrift service, men kan også oppnås ved en high end 3D-skriver i huset. Blant forskjellige 3D fabrikasjon metoder, Stereolithography anbefales for høy resolution mold generasjon. Fordi PDMS herding oppstår ved høy temperatur (80 ° c), bør materialene være tilstrekkelig termisk motstandsdyktig, noe som bør være eksplisitt spesifisert, Hvis utskriften er outsourcet. En termisk post-kur kan diskuteres med trykkeriet selskapet å øke termisk motstand av den delen. Detaljene for trykkeriet og materialene er angitt i materialfortegnelsen.
Den mekaniske egenskapen av herdet PDMS avhenger av herding temperatur. Hvis PDMS blandingen holdes ved romtemperatur i lang tid før herding i en ovn, blir det for elastisk selv etter fullstendig herding. Dermed bør avgassing prosessen ved romtemperatur gjøres innen 1 time eller mindre. Avgassing refererer til en syklisk anvendelse av vakuum som kan bidra til å fjerne eventuelle mikro-bobler i PDMS.
PH i kollagen løsningen er kritisk ikke bare for gelation, men også for celle levedyktighet. Hvis kollagen ikke er nøytralisert før du blander med celler, vil cellen levedyktigheten være lav. Mengden av 1 N NaOH løsning for å nøytralisere kollagen blandingen avhenger av pH i den opprinnelige kollagen løsning, og det kan beregnes teoretisk. Det anbefales imidlertid å legge til NaOH løsningen til kollagen løsningen gradvis, sjekke pH målinger av mediet ved hjelp av fenol rød indikator eller ved hjelp av pH-testing kassetter.
Avgassing gelen er viktig gjennom hele prosessen. Hvis boblene dannes under gelation etter at kollagen blandingen er injisert i enheten, kan de også fjernes ved å plassere enheten på isen i 10 min eller mer. Ved å slippe temperaturen, størrelsen på boblene reduserer og hulrom er til slutt okkupert av gel blanding. Den samme metoden kan brukes når bobler er fanget mellom søyler etter å ha lagt kultur medium til reservoarene.
Vi brukte denne teknologien til å lage mesofluidic enheter som tillater innebygging av store multi-cellulære konstruksjoner i en fysiologisk relevant ekstracellulære matrise miljø og integrere det med definerte graderinger av vekstfaktorer og andre oppløselige bioaktive molekyler. Høyoppløselig Stereolithography tillot oss å produsere høy kvalitet, lav pris former. Den fabrikasjon prosessen krever ikke renrom anlegg eller Foto litografi teknikker, og dermed gir en enkel, men effektiv generasjon av en 3D-miljø for cellekultur og eksperimentering, som har flere fordeler kontra den tradisjonelle 2D Eksperimentering. Enheten illustrert her var designet for å ha et kulturområde på 5 mm bred, 10 mm lang, og 1 mm høy. Det relativt store kulturområdet med tykkere høyde tillater vekst av mesoscopically store organoids eller spheroids, som varierer i størrelse fra titalls til hundrevis av mikrometer. Den tillater også analyse av utvidet epitel morphogenesis, og analyse av kollektiv og enkelt celle migrasjon i 3D-miljøet. Sidene av enheten er åpne brønner som tillater bruk av standard Pipetter for å endre Media eller legge til medikamenter uten behov for kompliserte grensesnitt med væske kontroll enheter, vanligvis brukt for ordinære mikrovæskebasert enheter. Videre er den enkle konfigurasjonen av et PDMS kammer og et dekkglass på bunnen universelt kompatibel med ulike mikroskopiske systemer. Bruken av enhetene viste partisk forgrening retning av morphogenesis i normale brystvevet, som svar på pålagt EGF gradient som et representativt eksempel for bruk av enheten. Imidlertid kan denne bruken også utvides til ulike vev, celle kilder, chemoattractants, og medikamenter for analyse av celle/vev atferd i 3D. Bruken kan også utvides til å imøtekomme mer realistisk vev modellering, som ville imøtekomme vaskulær nettverk formasjon fra individuelle celler innenfor gel sammen med innlemme av andre celletyper, inkludert mesenchymal stromal og uimottakelig komponenter og ulike epitel celletyper.
Selv om Stereolithography tilbyr den fineste oppløsningen blant 3D-utskrift teknikker, er minimum funksjons størrelse fortsatt begrenset til flere titalls mikrometer. Derfor er denne protokollen ikke tilstrekkelig til å erstatte Foto litografi i fabrikere muggsopp i en skala fra flere mikrometer. En annen begrensning av denne protokollen er relativt lav dybde av høy kvalitet Imaging i z retning i forhold til x-y retning, som er en iboende spørsmålet om Imaging vev skala konstruksjoner, ved hjelp av konvensjonelle mikroskopi. Men selv med disse begrensningene, den beskrevne metoden kan gi en kraftig og fleksibel analyseplattform som er enkel å dikte og bruke.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd til AJE (NSF PD-11-7246, Breast Cancer Research Foundation (BCRF-17-048), og NCI U54 CA210173) og AL (U54CA209992).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22mm x 22mm coverslip | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Collagen I, Rat | Fisher Scientific | CB-40236 | |
| Collagenease | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| COMSOL Multiphysics 4.2 | COMSOL Inc | Used for simulating diffusion dynamics | |
| 10x DMEM | Sigma-Aldrich | D2429 | |
| DEME/F12 | Thermo Fisher | 11330032 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D4623 | |
| EGF Recombinant Mouse Protein | Thermo Fisher | PMG8041 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 16140-071 | |
| Fiji-ImageJ | Used for measuring branching length and angles | ||
| Gentamicin | GIBCO | 5750-060 | |
| IMARIS | Bitplane | ||
| Insulin | Sigma-Aldrich | 19278 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X | GIBCO | 51500 | |
| Low-lint tissue | Kimberly-Clark Professional | Kimtech wipe | |
| Mold Material | Proto labs | Accura SL5530 | |
| Mold printing equipment | Proto labs | Stereolithogrphy | Maximum dimension: 127mm x 127mm x 63.5mm, Layer thnickness: 0.0254mm |
| Mold printing Service | Proto labs | Custom | https://www.protolabs.com/ |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| Penicillin/Streptomycin | VWR | 16777-164P | |
| Spinning-disk confocal microscope | Solamere Technology Group | ||
| Sylgard 184 | Electron Microscopy Sciences | 184 SIL ELAST KIT | PDMS kit |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9935 |
References
- Humphrey, J. D., Dufresne, E. R., Schwartz, M. A. Mechanotransduction and extracellular matrix homeostasis. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 15 (12), 802-812 (2014).
- Schwartz, M. A., Schaller, M. D., Ginsberg, M. H. Integrins: emerging paradigms of signal transduction. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 11, 549-599 (1995).
- Yin, X., et al. Engineering Stem Cell Organoids. Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).
- Doyle, A. D., Carvajal, N., Jin, A., Matsumoto, K., Yamada, K. M. Local 3D matrix microenvironment regulates cell migration through spatiotemporal dynamics of contractility-dependent adhesions. Nature Communications. 6, 8720 (2015).
- Meyvantsson, I., Beebe, D. J. Cell culture models in microfluidic systems. Annual Review of Analytical Chemistry (Palo Alto, Calif). 1, 423-449 (2008).
- Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).
- Zervantonakis, I. K., et al. Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (34), 13515-13520 (2012).
- Barkefors, I., Thorslund, S., Nikolajeff, F., Kreuger, J. A fluidic device to study directional angiogenesis in complex tissue and organ culture models. Lab on a Chip. 9 (4), 529-535 (2009).
- Hou, Z., et al. Time lapse investigation of antibiotic susceptibility using a microfluidic linear gradient 3D culture device. Lab on a Chip. 14 (17), 3409-3418 (2014).
- Ellison, D., et al. Cell-cell communication enhances the capacity of cell ensembles to sense shallow gradients during morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), E679-E688 (2016).
- Nguyen-Ngoc, K. V., et al. 3D culture assays of murine mammary branching morphogenesis and epithelial invasion. Methods in Molecular Biology. 1189, 135-162 (2015).
