Summary
Nós descrevemos um método para construir dispositivos para a cultura 3D e a experimentação com pilhas e os organoids multicelular. Este dispositivo permite a análise de respostas celulares a sinais solúveis em microambientes 3D com gradientes quimioatrativos definidos. Os organóides são melhores do que as células únicas na detecção de entradas barulhentas fracas.
Abstract
Várias limitações de sistemas de cultura de células 2D têm despertou interesse em plataformas de análise e cultura de células 3D, o que seria melhor imitar a complexidade espacial e química dos tecidos vivos e imitar as funções de tecido in vivo. Os recentes avanços nas tecnologias de microfabricação facilitaram o desenvolvimento de ambientes in vitro em 3D em que as células podem ser integradas em uma matriz extracelular bem definida (ECM) e um conjunto definido de biomoléculas solúveis ou matriciais associadas. No entanto, as barreiras tecnológicas limitaram seu uso generalizado em laboratórios de pesquisa. Aqui, descrevemos um método para construir dispositivos simples para a cultura 3D e experimentação com células e organóides multicelulares em microambientes 3D com um gradiente quimioatractivo definido. Nós ilustramos o uso desta plataforma para a análise da resposta de pilhas epithelial e de organóides aos gradientes de fatores de crescimento, tais como o fator de crescimento epidérmico (EGF). Os gradientes de EGF eram estáveis nos dispositivos por diversos dias que conduzem à formação dirigida da filial em organoids da mama. Essa análise permitiu concluir que a detecção coletiva de gradiente por grupos de células é mais sensível versus células individuais. Nós igualmente descrevemos o método da fabricação, que não exige facilidades do photolithography nem técnicas macias avançadas da litografia. Este método será útil para estudar os comportamentos celulares 3D no contexto da análise do desenvolvimento e dos Estados patológicos, incluindo o câncer.
Introduction
No ambiente fisiológico, as células são incorporadas em uma matriz extracelular (ECM) e expostas a uma infinidade de biomoléculas. As interações entre as células e o microambiente circundante regulam processos intracelulares controlando diversos fenótipos, incluindo migração, crescimento, diferenciação e sobrevida1,2. Muito tem sido aprendido sobre os comportamentos celulares em uma cultura de células 2D convencional. Entretanto, com o advento da imagem latente e da experimentação intravital com as pilhas encaixadas em hydrogels 3D, as diferenças importantes em comportamentos da pilha foram reconhecidas nas culturas 2D in vitro simplificadas contra o tecido 3D-como ambientes. Enquanto as células interagem com as fibras de ECM e sentem suas propriedades mecânicas dentro da matriz 3D, a rigidez do material do gel não é uma variável totalmente independente em um sistema in vitro 2D. A dimensionalidade altera a formação de adesão focal, resultando em diferentes morfologia e comportamento celular. Além disso, as células em uma superfície 2D são expostas a menos sinais de sinalização do que as células abertas a todas as direções em 3D.
Essas limitações aumentaram os interesses dos sistemas 3D que representam a complexidade espacial e química dos tecidos vivos e melhor prever as funções in vivo do tecido. Eles foram desenvolvidos em muitas formas de organóides como microestruturas celulares de automontagem para células aleatoriamente intercaladas em ECM3,4. Os recentes avanços nas tecnologias de microfabricação facilitaram o advento de vários tipos de sistemas de cultura 3D5,6,7, 8,9 para o estudo de alterações fenotípicas e respostas celulares a sinais solúveis; no entanto, as barreiras tecnológicas limitam o uso generalizado em laboratórios de pesquisa. Em muitos casos, os processos de fabricação requerem técnicas de fotolitografia e conhecimentos de fundo para litografia suave. Além disso, vários fatores devem ser controlados para construir com sucesso um dispositivo e para conseguir uma função óptima do dispositivo durante um longo período de tempo.
Nosso método descreve como construir um dispositivo 3D PDMS para incorporar células e organóides multicelulares em um microambiente 3D com gradientes quimioatrativos definidos e, em seguida, analisar respostas epiteliais ao EGF10. Nossos dados revelam que a capacidade de organóides para responder a gradientes de EGF superficial surge do acoplamento químico intercelular através de junções de Gap. Sugere o potencial de organóides para a deteção mais precisa de entradas espacially graduadas fracas e ruidosas. O processo da fabricação não exige uma facilidade da sala de limpeza nem técnicas do photolithography. No entanto, o dispositivo 3D PDMS inclui os fatores necessários do ambiente fisiológico 3D. Este método será útil para estudar os comportamentos celulares 3D e tem grande potencial de pesquisa com diferentes tipos de células, quimioattractantes e combinações de ECM.
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Protocol
Todo o trabalho animal foi conduzido de acordo com protocolos revisados e aprovados pelo Comitê institucional de cuidado e uso de animais da Universidade Johns Hopkins, faculdade de medicina.
1. fabricação do dispositivo mesofluídico
- Projete a máscara do molde para o dispositivo de PDMS usando um software do CAD 3D.
- Imprima o molde usando o equipamento do estereolitografia com uma resina resistente térmica.
Nota: os procedimentos aqui descritos foram realizados por um serviço de impressão 3D comercial. - Misture completamente uma solução do monômero de PDMS com o agente de cura em uma relação 10:1. 3 mL de mistura PDMS foi necessária para a fabricação do dispositivo. O volume total depende do número de moldes a serem fabricados.
- Degas a mistura aplicando um vácuo com o uso de um vácuo ou de uma bomba de vácuo da em-casa em um exsicador do vácuo por 1 hora.
- DAB a superfície do molde com uma fita adesiva para remover a poeira, e despeje então a mistura de PDMS ao molde. Se forem introduzidas bolhas no processo, repita a desgaseificação no vácuo. Bolhas presas entre os pilares do molde pode ser removido por picando-los com uma agulha afiada.
Nota: o processo de desgaseificação à temperatura ambiente deve ser feito dentro de 1 hora ou menos. - Cure o PDMS por aquecimento a 80 ° c por 2 horas. Deixe o molde arrefecer à temperatura ambiente.
- Corte o limite entre o molde e o PDMS com uma lâmina e descasque então fora PDMS do molde com cuidado.
- Aparar a peça PDMS para caber o 22 mm x 22 mm lamela e perfurar um furo na entrada.
Observação: o protocolo pode ser pausado aqui. - Limpe a peça PDMS e a lamínula de 22 mm x 22 mm limpando as superfícies com tecidos de baixo-Lint e 70% de etanol. Em seguida, remova partículas de poeira grandes por dabbing com uma fita adesiva.
- Esterilizar a peça de PDMS e a lamínula por autoclavagem (121 ° c por 8 minutos molhados, 15 minutos secos) ou exposição à luz UV por 1 hora.
- Trate a superfície inferior da peça do PDMS e deslize a tampa com o injetor da descarga da Corona por 5 minutos na capa da cultura do tecido e lig-os então junto.
Cuidado: Coloque qualquer material não condutor, como espuma de poliestireno na parte inferior e remova todos os materiais condutores durante este processo. Injete o colagénio no dispositivo imediatamente, dentro de 5 minutos, após o tratamento para aumentar a ligação entre o gel do colagénio e o COVERSLIP de vidro.
2. preparação da pilha: isolação organoid mamária preliminar
Nota: os detalhes da isolação organoid mamária podem ser encontrados em um trabalho precedente11. Qualquer tipo de célula única ou organóide pode ser preparado de acordo com seus próprios protocolos de isolamento/destacamento.
- Mince o tecido da glândula mamária dos camundongos com um bisturi até que o tecido relaxe e agite por 30 min a 37 ° c em 50 mL de solução de colagenase/tripsina (10 mL por rato) em DEME/F12 suplementado com 0,1 g de tripsina, 0,1 g de colagenase , 5 mL de FBS, 250 μL de 1 μg/mL de insulina e 50 μL de 50 μg/mL de gentamicina.
- Centrifugue a solução de colagenase/tripsina a 1.250 x g durante 10 min. Retire o sobrenadante por aspiração. Dispersar células em 10 mL de DMEM/F12, e centrifugar a 1.250 x g por 10 min. Após a remoção de DMEM/F12 por aspiração, resuspenda as células em 4 mL de DMEM/F12 suplementados com 40 μL de DNase (2 unidades/μL).
- Agitar a solução DNase à mão por 2-5 min e, em seguida, centrifugar a 1.250 x g por 10 min.
- Separe organóides de células simples através de quatro centrífugas diferenciais (pulso para 1.250 x g e parar a centrífuga 3-4 s depois que atinge a velocidade pretendida). Entre cada pulso, aspirar o sobrenadante e suspender a pelota em 10 mL de DMEM/F12.
- Resuspender a pelota final na quantidade desejada de meio de crescimento de DMEM/F12 com 1% de penicilina/estreptomicina e 1% de insulina-transferrina-Selenium-X para preparação de colágeno.
3. preparação e injeção de colágeno
Nota: outros tipos de géis ECM podem ser preparados de acordo com seus próprios protocolos de gelação.
- Prepare a solução do tipo I do colagénio (3,78 mg/mL), 10x DMEM, 1 solução de NaOH do N, meio normal do crescimento no gelo.
Nota: Mantenha no gelo até que o procedimento esteja terminado. - Adicione 6 μL de solução de 1 N NaOH, 200 μL de meio de crescimento e 50 μL de 10x DMEM em um tubo de microcentrífuga pré-resfriado e misture a solução completamente.
- Adicione 425 μL de colágeno na solução pré-misturada e misture cuidadosamente com pipetagem.
- Centrifugue a mistura de colágeno brevemente (menos de 5 segundos) para separar e remover bolhas da mistura.
- Mantenha a solução de colágeno neutralizada no gelo por 1 hora para induzir a formação de fibras.
- Adicione 50 μL de suspensão celular na mistura de colágeno e misture completamente.
Nota: a concentração final de colágeno é de 2 mg/mL. - Injete a solução usando 200 μL de Pipet através da entrada do dispositivo PDMS até que toda a câmara seja preenchida. Se a mistura de colágeno transborda através das lacunas de pilares, cortar o excesso de colágeno gel com lâmina cirúrgica afiada após a geladura.
- Mantenha o dispositivo na incubadora a 37 ° c com 5% de CO2 por 1 hora para induzir a geladura.
- Encha os reservatórios de ambos os lados com meio de crescimento e mantenha o dispositivo na incubadora a 37 ° c com 5% de CO2 até que a imagem confocal seja realizada.
4. imagem latente 3D e quantificação
- Instale uma câmara da cultura da imagem latente da vivo-pilha a um microscópio confocal e pré-ajuste a temperatura e o CO2 a 37 ° c e a 5%, respectivamente. Para obter umidade, adicione água no reservatório da câmara e coloque lenços umedecidos na câmara, se necessário.
- Coloque o dispositivo PDMS na câmara e adicione EGF a um dos reservatórios como uma "fonte" do FEG na formação de gradiente. O outro reservatório servirá uma "pia" necessária para o desenvolvimento da distribuição EGF espacialmente graduada. 2,5 nM de EGF foi adicionado na pia para fazer o gradiente de 0,5 nM/mm neste estudo.
- Defina o intervalo de Z-Stack cobrindo o volume de organóides de interesse e iniciar a imagem.
Cuidado: para evitar a fototoxicidade, tente uma intensidade mais baixa do laser na imagem latente Confocal ou use técnicas da imagem latente do multi-fotão. - Reconstruir uma imagem 3D a partir de pilhas de imagens 2D usando um software comercial ou um programa feito medida. Meça o comprimento e o ângulo das filiais que estendem dos organóides ou da migração de pilhas individuais. Aqui, realize a quantificação desenhando um contorno à mão livre ao redor do corpo organoide usando o ImageJ.
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Representative Results
EGF é um regulador essencial da morfogênese ramificando em glândulas mamárias e um quimioatractivo crítico orientando a migração de células epiteliais do peito no crescimento do cancro invasivo. Utilizamos os dispositivos fluílicos mesoscópicos descritos acima para estudar a resposta das células aos gradientes de EGF definidos (Figura 1a, B)10. O dispositivo produz uma área de cultura de 5 mm de largura, 10 mm de comprimento e 1 mm de altura. Os lados da área de cultura são separados de poços abertos por pilares hexagonais, que são usados para prender o ECM líquido e a mistura de células dentro da área de cultura celular através da tensão superficial. Notamos que, dado o tamanho desta cultura 3D, seria muito difícil, caro, e demorado para construir um molde apropriadamente dimensionado por fotolitografia10. Usando uma aplicação nova de uma técnica padrão, o Stereolithography, nós produziu rapidamente e barata o molde. Além disso, ao modificar o delineamento, um gradiente exponencial (Figura 1C, i) ou múltiplos gradientes lineares em um chip (Figura 1C, II) pode ser induzido, bem como um gradiente estável com fluxo contínuo (Figura 1C, III).
Ambos em silico (Figura 2a, B, C) e in vitro (Figura 2D, e, F) os testes demonstraram a formação de um gradiente linear estável de EGF através da área da cultura de pilha que durou aproximadamente dois dias sem reabastecer o ' reservatórios de origem e de afundamento. A difusão dependente do tempo das proteínas foi simulada por meio de um software de multifísica comercializado. A geometria 3D da configuração da câmara foi recriada no software e a concentração média dentro do volume da câmara foi determinada e plotada. Esses resultados sugerem que a EGF, uma proteína 6,4 kDa, pode formar um gradiente estável baseado em difusão dentro do gel de colágeno preparado como descrito acima durante um período de tempo relativamente curto. Nós igualmente determinamos que os perfis similares das proteínas de 1, de 10, e de 150 kDa poderiam ser dados forma usando este método.
Os organóides mamários formaram múltiplas ramificações na presença de 2,5 nM espacialmente uniforme e a formação de ramo não demonstrou viés direcional ao longo de 3 dias (Figura 3a, D). No entanto, se o EGF foi adicionado na forma de um gradiente linear de 0,5 nM/mm, a formação de ramo exibiu um viés direcional significativo (Figura 3B, E). No entanto, não detectamos tal viés para células individuais no mesmo gradiente. A fim determinar se a comunicação multicelular era necessária para a resposta do inclinação, nós exploramos se obstruir junções intercelular da abertura com vários nervos inibidores impediria a formação tendenciosa do ramo. Os inibidores da junção da abertura suprimiram certamente a habilidade dos organóides de responder ao inclinação (Figura 3C, F). Como explorado mais extensivamente no estudo original descrevendo esse método10, esse resultado sustenta a hipótese de que a comunicação por meio de junções de Gap é necessária para a resposta do gradiente de EGF em organoides mamários10.
Figura 1. Dispositivo mesofluídico com gradiente de EGF definido. (A) vista 3D da microplaqueta de PDMS: (i) vista superior e (II) vista dianteira de um molde (unidade: milímetro) (III) uma disposição dos moldes (vermelho) enchida com PDMS (transparente) (IV) câmaras de PDMS empilhado fora do molde (v) um diagrama esquemático de um dispositivo montado (vi) uma imagem real do com gel de colágeno e meio de cultura. (B) um diagrama esquemático da câmara mesofluíica com organóides embutidos em gel de colágeno e reservatórios de alta (vermelha) e baixa (vermelha) concentração de EGF resultando em gradientes de EGF (este número foi modificado de10). (C) projetos potenciais para induzir um gradiente exponencial (i), quatro gradientes lineares diferentes em um chip (II), e um gradiente estável com fluxo contínuo (III). Regiões vermelhas indicam fontes ou pias cheias de meio de cultura e regiões cinzentas indicam câmaras cheias de mistura de gel/células. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Avaliação de gradientes de ligantes em todo o chip. (A) simulação da concentração do ligante através da microplaqueta que mostra perfis do inclinação. Perfis simulados de gradiente de (B) 1 proteína kDa e (C) 70 proteína kDa. (D) imagem do dispositivo com um gradiente linear de 10 kDa Dextran azul usado para visualizar a difusão de EGF. As linhas pontilhadas hexagonais indicam pilares no lado da área do gel. Perfis de gradiente experimental de 1, 10 e 150 kDa dextrano em todo o chip (este número foi modificado de Ellison et al. 201610) (e) após 8 horas e (F) após 48 horas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Resposta celular ao gradiente de EGF. (A) ramificação não direcional de organóides em colágeno com um uniforme 2,5 Nm EGF. (B) ramificação direcional de organóides em colágeno com gradiente linear de 0,5 Nm/mm de EGF. (C) ramificação não direcional de organóides em um gradiente linear de 0,5 Nm/mm de EGF com um bloqueador de junção de Gap. (D-F) Histogramas angulares de direções organoides de ramificação correspondentes a (A)-(C), respectivamente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A fabricação de moldes PDMS foi realizada utilizando um serviço de impressão 3D comercial, mas também pode ser realizada por uma impressora 3D de alta-final em casa. Entre os vários métodos da fabricação 3D, o estereolitografia é recomendado para a geração de molde de alta resolução. Como a cura do PDMS ocorre em uma temperatura alta (80 ° c), os materiais devem ser suficientemente resistentes a termicamente, o que deve ser explicitamente especificado, se a impressão for terceirizada. Uma pós-cura térmica pode ser discutida com a empresa de serviços de impressão para aumentar a resistência térmica da peça. Os detalhes do serviço de impressão e dos materiais são especificados na tabela de materiais.
A propriedade mecânica de PDMS curado depende da temperatura de cura. Se a mistura de PDMS é mantida na temperatura ambiente por muito tempo antes de curar em um forno, torna-se demasiado elástica mesmo depois que a cura completa. Assim, o processo de desgaseificação em temperatura ambiente deve ser feito dentro de 1 hora ou menos. Desgaseificação refere-se a uma aplicação cíclica de vácuo que pode ajudar a remover quaisquer microbolhas dentro PDMS.
O pH da solução de colágeno é crítico não só para a gelação, mas também para a viabilidade celular. Se o colágeno não é neutralizado antes de misturar com as células, a viabilidade celular será baixa. A quantidade de 1 solução de NaOH de N para neutralizar a mistura do colagénio depende do pH da solução original do colagénio e pode ser calculada teòrica. No entanto, recomenda-se adicionar a solução de NaOH à solução de colágeno gradualmente, verificando as leituras de pH do meio usando o indicador vermelho de fenol ou usando fitas de teste de pH.
Degassing o gel é importante durante todo o processo inteiro. Se a forma de bolhas durante a gelação após a mistura de colágeno é injetada no dispositivo, eles também podem ser removidos colocando o dispositivo no gelo por 10 min ou mais. Ao deixar cair a temperatura, o tamanho das bolhas reduz-se e os vazios são ocupados eventualmente pela mistura do gel. O mesmo método pode ser usado quando as bolhas são presas entre pilares após a adição de meio de cultura para os reservatórios.
Utilizamos esta tecnologia para criar dispositivos mesofluílicos que permitam a incorporação de grandes construções multicelulares em um ambiente de matriz extracelular fisiologicamente relevante e integrando-o com gradientes definidos de fatores de crescimento e outros moléculas bioativas. O estereolitografia de alta resolução permitiu que nós produzisse moldes de alta qualidade, de baixo custo. O processo de fabricação não requer instalações de sala limpa, nem técnicas de fotolitografia, e, portanto, permite uma geração simples, mas eficaz de um ambiente 3D para a cultura de células e experimentação, que tem várias vantagens versus o tradicional 2D Experimentação. O dispositivo ilustrado aqui foi projetado para ter uma área de cultura de 5 mm de largura, 10 mm de comprimento e 1 mm de altura. A área de cultura relativamente grande com altura mais espessa permite o crescimento de organóides mesoscopicamente grandes ou esferóides, variando em tamanho de dezenas a centenas de micrômetros. Também permite a análise da morfogênese epitelial ramificada e a análise da migração coletiva e única das células dentro do ambiente 3D. Os lados do dispositivo são poços abertos que permitem o uso de pipetas padrão para mudar a mídia ou para adicionar drogas sem a necessidade de interface complicada com os dispositivos de controle de líquidos, geralmente usado para dispositivos de microfluídico mainstream. Além disso, a configuração simples de uma câmara PDMS e um vidro de cobertura na parte inferior é universalmente compatível com diversos sistemas microscópicos. O uso dos dispositivos mostrou a direção de ramificação tendenciosa da morfogênese no tecido mamário normal, em resposta ao gradiente de EGF imposto como exemplo representativo para o uso do dispositivo. No entanto, este uso também pode ser estendido para diferentes tecidos, fontes celulares, quimioatrativos e drogas para a análise do comportamento celular/tecido em 3D. O uso também pode ser estendido para acomodar modelagem tecidual mais realista, que acomodaria a formação de rede vascular de células individuais dentro do gel, juntamente com a incorporação de outros tipos de células, incluindo os componentes estromal e imunológico mesenquimais e diversos tipos de células epiteliais.
Embora a estereolitografia ofereça a melhor resolução entre as técnicas de impressão 3D, o tamanho mínimo do recurso ainda é limitado a várias dezenas de micrômetros. Portanto, este protocolo não é suficiente para substituir a fotolitografia na fabricação de moldes em uma escala de vários micrômetros. Outra limitação deste protocolo é a profundidade relativamente baixa de imagens de alta qualidade na direção z em comparação com a direção x-y, que é uma questão inerente de construções em escala tecidual de imagem, utilizando microscopia convencional. No entanto, mesmo com essas limitações, o método descrito pode fornecer uma plataforma de análise poderosa e flexível que é fácil de fabricar e usar.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por subsídios à AJE (NSF PD-11-7246, Fundação de pesquisa em câncer de mama (BCRF-17-048) e NCI U54 CA210173) e AL (U54CA209992).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22mm x 22mm coverslip | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Collagen I, Rat | Fisher Scientific | CB-40236 | |
| Collagenease | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| COMSOL Multiphysics 4.2 | COMSOL Inc | Used for simulating diffusion dynamics | |
| 10x DMEM | Sigma-Aldrich | D2429 | |
| DEME/F12 | Thermo Fisher | 11330032 | |
| DNase | Sigma-Aldrich | D4623 | |
| EGF Recombinant Mouse Protein | Thermo Fisher | PMG8041 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life technologies | 16140-071 | |
| Fiji-ImageJ | Used for measuring branching length and angles | ||
| Gentamicin | GIBCO | 5750-060 | |
| IMARIS | Bitplane | ||
| Insulin | Sigma-Aldrich | 19278 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium-X | GIBCO | 51500 | |
| Low-lint tissue | Kimberly-Clark Professional | Kimtech wipe | |
| Mold Material | Proto labs | Accura SL5530 | |
| Mold printing equipment | Proto labs | Stereolithogrphy | Maximum dimension: 127mm x 127mm x 63.5mm, Layer thnickness: 0.0254mm |
| Mold printing Service | Proto labs | Custom | https://www.protolabs.com/ |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| Penicillin/Streptomycin | VWR | 16777-164P | |
| Spinning-disk confocal microscope | Solamere Technology Group | ||
| Sylgard 184 | Electron Microscopy Sciences | 184 SIL ELAST KIT | PDMS kit |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T9935 |
References
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