Summary
التقنيات التقليدية المستندة إلى كدنا overexpression انطباقاً محدودا overexpression الكشف فضله منذ فترة طويلة بسبب أشكالها لصق متعددة مع الوظائف المحتملة. هذا الاستعراض تقارير بروتوكول باستخدام تكنولوجيا كريسبر إلى أوفيريكسبريس متعددة المتغيرات لصق الحمض النووي الريبي فضله منذ وقت طويل.
Abstract
منذ فترة طويلة فضله الحمض النووي الريبي (لنكرنا) البيولوجيا حقل جديد ومثير للبحوث، مع عدد المنشورات من هذا الحقل تزايد أضعافاً مضاعفة منذ عام 2007. هذه الدراسات قد أكدت على أن يتم تغيير لنكرناس في تقريبا جميع الأمراض. بيد دراسة الأدوار الوظيفية لنكرناس في سياق المرض لا يزال صعباً بسبب عدم وجود منتجات البروتين، التعبير الخاصة بالانسجة، مستويات منخفضة من التعبير، والتعقيدات في لصق الأشكال، وعدم الحفظ فيما بين الأنواع. نظراً للتعبير إبلاغها، دراسات لنكرنا غالباً ما تنحصر في سياقات البحوث البشرية عند دراسة عمليات المرض. حيث تعمل لنكرناس على المستوى الجزيئي، هو طريقة واحدة لتشريح الأحياء لنكرنا إزالة لنكرنا أو أوفيريكسبريس لنكرنا وقياس آثار الخلوية. ويرد في هذه المادة، بروتوكول مكتوب وتصور أوفيريكسبريس لنكرناس في المختبر. كتجربة ممثل، يرد لنكرنا المرتبطة بمرض التهاب الأمعاء، انترفيرون غاما Antisense 1 (إيفنج-AS1)، أن overexpressed في نموذج جوركات تي خلية. لإنجاز هذا، استخدام التقنية يكرر المتناوب القصير إينتيرسباسيد بانتظام (كريسبر) بتفعيل متفاوت المسافات لتمكين أوفيريكسبريشن في المكاني الجينوم الذاتية. التقنية كريسبر تفعيل الأهداف مجموعة من عوامل النسخ إلى موقع بدء النسخي الجينات، تمكن overexpression قوية متعددة الأشكال لصق لنكرنا. هذا الإجراء سيتم تقسيمها إلى ثلاث خطوات، هي: (ط) دليل الحمض النووي الريبي (جرنة) التصميم وناقلات البناء والجيل (الثاني) فيروس وتوصيل والفرز (ثالثا) مستعمرة ل overexpression. لهذه التجربة التمثيلية، أكبر مما لوحظ تعزيز برنامج في IFNG-AS1 في خلايا تي جوركات.
Introduction
حين ركزت البحوث الطبية الحيوية الأكثر على نصوص ترميز البروتين، يتألف غالبية الجينات يدون فعلا الكشف فضله (الإصدار انسيمبل 93). البحث الحالي هو بداية لاستكشاف هذا المجال، مع عدد المنشورات بشأن لنكرناس في عمليات المرض ترتفع أضعافاً مضاعفة بين 2007 و 20171. هذه المنشورات تبين أن الكثير من لنكرناس ترتبط بالمرض. ومع ذلك، يصعب الآليات الجزيئية لهذه لنكرناس من الدراسة بسبب وظائفها المتنوعة بالمقارنة مع مرناس. مما يضاعف من مشكلة فهم دور لنكرناس في المرض، لنكرناس غالباً ما يعبر عنها مستويات أدنى من الترميز الكشف2. بالإضافة إلى ذلك، لنكرناس هي سيئة حفظت، مما يحد من الدراسات الفنية في تقنيات الإنسان-خط-يستند إلى الخلية3. أسلوب واحد لدراسة إليه هذه الجينات الجديدة اندوجينوسلي أوفيريكسبريس لهم في الخلايا المستزرعة. الدراسات overexpression يمكن أن توفر معلومات أساسية بشأن الوظيفة الجينات محددة وتمكن الباحثين من تشريح المسارات الجزيئية الرئيسية.
يستند أسلوب جديد لتفعيل نسخ جينات لنكرنا كريسبر التقنيات المتقدمة في البداية المختبرات جيرسباتش4. هذا البروتوكول قد تم تكييفها للاستخدام في علم الأحياء لنكرنا و للتعبير عن هذه الجينات في نظم نموذجية أخرى. في كريسبر overexpressing تقنية، بروتين يسمى البروتين المرتبطة كريسبر 9 (Cas9) يمكن أن توجه نحو تسلسل الحمض النووي عن طريق جرنة العقاقير يتم التعرف عليه بواسطة Cas9. عادة، سوف تحفز Cas9 الانقسام والحمض النووي؛ ومع ذلك، إلغاء الطفرات في Cas9، سبق أن وضعت لهذه التقنية أوفيريكسبريشن، هذه الخطوة5. عندما يتم تنصهر فيها منشط النسخي Cas9 "ميتة" (dCas9)، ويمكن أن overexpression الذاتية من لنكرناس ترانسدوسيد في خطوط الخلايا، حققت4،6. إضافة تعديلات إضافية لجرنا، تمكين عوامل النسخي إضافية لربط جرنا، زيادة كفاءة نظام التنشيط الجيني dCas9 إذ7. الأهم من ذلك، اتضح أن يتطلب التنشيط النسخي مقربة (< 200 شركة بريتيش بتروليوم) النسخي ابدأ الجينات الموقع، تمكن من أوبريجوليشن محددة في المناطق الغنية جين7. خلافا لتكنولوجيات بالضربة القاضية كريسبر، أشرطة dCas9 وجرنة بحاجة إلى أن تدمج في الجينوم للسماح للخلايا للاحتفاظ أوفيريكسبريشن على مدى أجيال متعددة. أسلوب واحد لتحقيق هذا الهدف استخدام لينتيفيروسيس لدمج الأشرطة التي تحتوي على dCas9 وجرنة. بعد التكامل، يمكن تحديد التعبير الجيني لنكرنا.
في هذه المقالة، سوف يتجلى بروتوكول أوفيريكسبريشن لنكرنا في نموذج جوركات تي خلية. إجراء خطوة بخطوة ويمكن تكييفها أيضا للخلايا ملتصقة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: من المهم ملاحظة أن هذا البروتوكول يستخدم lentiviruses تفتقر إلى النسخ المتماثل. تنفيذ معالجة الفيروسية إلا بعد التدريب على السلامة مختبر المناسبة. بليتش جميع البنود والأسطح التي تأتي في اتصال مع فيروسات حية للحد أدنى من 10 دقيقة بعد المناولة. استخدام حماية الوجه/العين ومعطف معمل المتاح، فضلا عن قفازات مزدوج، في جميع الأوقات. أداء عمل الفيروس في السلامة الأحيائية المستوى 2 + مختبرات مع شهادة الفيروسية. أهدى أغطية زراعة الأنسجة وحاضنات الأعمال الفيروسية.
1. ناقلات تصميم و توليد
ملاحظة: أفضل طريقة لتحديد تسلسل جرنة لاستخدام أدوات التصميم على الإنترنت (على سبيل المثال، http://crispr-era.stanford.edu) (تكميلية الشكل 1: تصميم جرنة). للتجربة التمثيلية المصاحبة، شركة تصميم وإنشاء ناقلات جرنة المستخدمة في تجربة تمثيلية. كما تم شراء بلازميد dCas9 على الإنترنت.
- تسلسل جرنة يقع المنبع لتسلسل النوكليوتيدات "نج"، حيث "N" هو أي النوكليوتيدات، الذي أيضا ضمن أزواج قاعدة 100 موقع النسخي ابدأ. البحث في قواعد البيانات الوراثية مثل بلاط (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start) للتسلسل جرنة، للتأكد من أن هناك لا مواقع أخرى في الجينوم مع تسلسل مماثلة (تكميلية الشكل 2: بلاط). وهذا سيضمن أن تسلسل جرنا فريدة من نوعها للجينات للفائدة (غوي).
- تخزين والبلازميدات جرنة و dCas9، التي تأتي كبذرة البكتيرية، عند 4 درجة مئوية. متواصلة من الإشريكيّة القولونية في لوريا أجار مرق (رطل) لوحة مع الأمبيسلّين (تكميلية الجدول 1) وتنمو هذه البكتيريا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
- اختيار مستعمرة وتنمو البكتيريا في 5 مل رطل مع الأمبيسلّين (تكميلية الجدول 1) بين عشية وضحاها، قوة تهز اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية. وفي اليوم التالي إضافة 2 مل من البكتيريا إلى 200 مل رطل مع الأمبيسلّين تنمو في قارورة 2 لتر، قوة تهز قارورة بين عشية وضحاها في حاضنة 37 درجة مئوية.
- تدور إلى أسفل بالبكتيريا في س 3,724 ز لإزالة الوسائط 20 دقيقة ومكان الأنبوب الذي يحتوي على البكتيريا على الجليد.
-
تنقية الحمض النووي البكتيري باستخدام مجموعة أدوات تنقية بلازميد الواحدة والبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
ملاحظة: مجموعات تنقية بلازميد يحتوي على المخزن المؤقت لاستثارة الملكية وتحلل المخزن المؤقت والمخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي، والمخزن المؤقت للموازنة وشطف المخزن المؤقت.- إضافة 10 مل من المخزن المؤقت لاستثارة من الطقم للبكتيريا وبيبيت البكتيريا في الحل. ثم أضف 10 مل من المخزن المؤقت لتحلل من الطقم للبكتيريا ريسوسبينديد ومزجها بعكس الأنبوب. انتظر 5 دقائق للبكتيريا؛ ثم أضف 10 مل من المخزن المؤقت لتحييد المثلج من الطقم للبكتيريا ليسيد ومزجها بعكس الأنبوب.
- حجته العمود الحمض النووي من هذه المجموعة مع 10 مل من المخزن المؤقت للموازنة لأدنى 5 صب العينات في العمود الحمض النووي تصفية واسمحوا أن الحل يمر من خلال عامل تصفية.
- تغسل العينات 2 x مع 30 مل من يغسل المخزن المؤقت، وثم الوت الحمض النووي مع 30 مل من المخزن المؤقت شطف في أنبوب مخروطي 15 مل. طبقة 10.5 مل الكحول في درجة حرارة الغرفة على الحمض النووي الوتيد ببطء وعكس الأنبوب فورا أنها تدور في 16,200 س ز لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- إزالة المادة طافية وإضافة 1 مل إيثانول 70% إلى بيليه الحمض النووي. ريسوسبيند بيليه خلال يسددها الأنبوب. أنها تدور في 16,200 س ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية واستخدام تلميح بيبيت 200 ميكروليتر لإزالة معظم الإيثانول. ريسوسبيند أنه في 200 ميكروليتر من المياه، أيردري بيليه لمدة 5 دقائق وتخزين الحمض النووي في-20 درجة مئوية. وسيكون تركيز المتوقعة > 1 ميكروغرام/ميكروليتر.
2-الفيروسات الجيل و الجسيمات العد
- عندما تكون جاهزاً لإنشاء لينتيفيروس التي تحتوي على dCAS9، معطف أطباق زراعة الأنسجة 100 ملم مع 5 مل من 0.01 ٪ بولي-L-يسين (تكميلية الجدول 1). إزالة السائل الزائد تماما من اللوحات والسماح لهم أيردري لبضع دقائق في مجال السلامة الأحيائية مجلس الوزراء.
- لوحة 5 × 106 HEK 293T الخلايا من كل طبق في 10 مل من إكمال دولبيكو تعديل المتوسطة النسر (دميم) (تكميلية الجدول 1) واحتضانها لهم بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع شركة 5%2. وفي اليوم التالي إزالة المتوسطة من الأطباق 293T HEK وإضافة 10 مل دميم كاملة.
- ميكروغرام 6.5 مزيج من بلازميد بمدلج/بري تتضمن هفوة/pol (مكونات الفيروس)، 3.5 ميكروغرام من pMDG2.G بلازميد يحتوي على منظمة-ز (مكون من الفيروس)، 2.5 ميكروغرام المحتوية على برسف Rev بلازميد Rev (مكون من الفيروس)، 10 ميكروغرام المحطة منذ فترة طويلة (تكرار لتر)--التي تحتوي على ناقل جرنة أو dCas9 التي تحتوي على لتر ناقل وإضافة المياه إلى إجمالي حجم 450 ميكروليتر. قم بتصفية الخليط من خلال تلميح فلتر 0.2 ميكرون تعلق بحقنه.
- إضافة 50 ميليلتر من 2.5 م كاكل2 (تكميلية الجدول 1) إلى كل تعداء عينة من الحمض النووي وتخلط برفق. قم بتصفية الخليط الكالسيوم/الحمض النووي من خلال تلميح فلتر 0.2 ميكرون تعلق بحقنه. بيبيت 500 ميليلتر x HBS 2 (تكميلية الجدول 1) في أنبوب البوليستيرين 5 مل. قم بإضافة 500 ميليلتر الحمض النووي/كاكل2 ميكس دروبويسي ولطف دوامة. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق.
- ببطء أضف 1 مل من الحمض النووي/كاكل2/HBS تعليق لكل طبق. فورا عباب الأطباق توزيع المحتويات بشكل متساو. احتضان كل طبق بين عشية وضحاها في 5% CO2 حاضنة في 37 درجة مئوية.
- في يوم 3، ببطء إزالة وتجاهل وسائل الإعلام من الأطباق. أغسل بعناية الخلايا 1 x مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). إضافة 6 مل دميم كاملة وتستكمل مع 20 مم هيبيس و butyrate الصوديوم 10 ملم. احتضان الخلايا ح 5 – 6 في 5% CO2 حاضنة في 37 درجة مئوية.
- تغسل الخلايا 1 x مع برنامج تلفزيوني وإضافة 5 مل دميم كاملة مع 20 مم حبيس إلى خلايا HEK 293T. احتضانها ح 12 بين عشية وضحاها في 5% CO2 حاضنة في 37 درجة مئوية.
- في يوم 4، جمع supernatants خلية 293T HEK وتصفية المادة طافية. تجميد مختبرين 1 مل في-80 درجة مئوية.
- عندما تكون جاهزاً لاستخدام الفيروس، وذوبان الجليد قاسمة الجسيمات الفيروسية التي تحتوي على تكييف وسائل الإعلام (تخزين كما هو موضح في الخطوة 2.8) على الجليد. إحضار جميع المواد الكاشفة لدرجة حرارة الغرفة.
-
استخدام أدوات مقايسة الممتز Enzyme-Linked (ELISA) p24 لقياس عدد الجسيمات الفيروسية في المليلتر.
- تمييع الركاز يغسل من الطقم بإضافة أجزاء 19 من المياه المقطرة. تضعف السيطرة الإيجابية من الطقم إلى 200 نانوغرام/ملليلتر، استخدام 1640 رمبي مخفف، وجعل أنابيب تخفيف للمنحنى المعياري في 1.5 مل وفقا p24 أليسا تمييع الجدول (تكميلية الجدول 2).
- إضافة 20 ميكروليتر من 5% X-100 تريتون لجميع الآبار إلا الركيزة فارغة. إضافة 200 ميكروليتر من 1640 ربمي لآبار المراقبة السلبية. إضافة 200 ميكروليتر من كل معيار (في تكرار) للآبار المعينة.
- باستخدام جهاز المطياف الضوئي، قياس تركيز الفيروس في العينات، باستخدام منحنى قياسي. بدء تمييع عينة في 1:1,000 وتعديل حجم حسب الاقتضاء، بغية أن تكون ضمن نطاق المنحنى المعياري. تمييع العينات مع X-100 تريتون إلى تركيز نهائي من 0.5% وإضافة 200 ميكروليتر من كل عينة في RPMI 1640 إلى الآبار المعينة. ختم اللوحة واحتضان من أجل ح 2 في 37 درجة مئوية.
- أغسل لوحة 6 x مع 300 ميكروليتر 1 × أغسل المخزن المؤقت لكل بئر. قم بإزالة أي السوائل الزائدة بعكس اللوحة والتنصت على أنه على منشفة ورقية. إضافة 100 ميكروليتر من الكشف عن الأجسام المضادة من الطقم لجميع الآبار إلا الركيزة فارغة. ختم اللوحة واحتضان من أجل ح 1 في 37 درجة مئوية. أغسل اللوحة، وثم إزالة أي السوائل الزائدة بعكس اللوحة والتنصت على أنه على منشفة ورقية.
- ولقياس الأجسام المضادة كاشف، إعداد ستريبتافيدين-الفجل البيروكسيديز (SA-HRP) خلال 15 دقيقة من الاستخدام. تمييع سا-برنامج الصحة الإنجابية في 1: 100 مع مخفف سا-برنامج الصحة الإنجابية. مزيج المخفف سا-برنامج الصحة الإنجابية جيدا وإضافة 100 ميكروليتر إلى جميع الآبار باستثناء الفارغة. ختم واحتضان لوحة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- أغسل اللوحة مع 1 × المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي واضغط بعيداً من أي سائل الزائدة كما في الخطوة 2.10.4. استخدم الحل الركيزة اورثو phenylenediamine (العيادات الخارجية)، التي تنص على البيروكسيديز ركائز ضرورية لإنتاج تشيميلومينيسسينسي، في غضون 15 دقيقة من إعداد. استخدم حبة واحدة من العيادات الخارجية لمل 11 من الركازة مادة لكل لوحة.
- دوامة الحل العيادات الخارجية بقوة حله تماما وحمايتها من الضوء. إضافة 100 ميكروليتر من العيادات الخارجية الركيزة الحل لجميع الآبار، بما في ذلك الفراغ. استخدام جهاز المطياف الضوئي، قراءة امتصاص 450 نانومتر فورا، كرر هذا x 10 فترات s 1، وتأخذ بقياس متوسط.
3-dCas9-نائب الرئيس64 توصيل
- الخلايا T جوركات الثقافة في دميم كاملة في قارورة T75 مع كثافة 2 × 106 خلايا في 15 مل من وسائل الإعلام. ثقافة الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5% CO2.
- وتدور أسفل الخلايا لمدة 5 دقائق في 233 س ز ، ثم، ريسوسبيند منهم في 10 مل من المصل انخفاض وسائل الإعلام. عد الخلايا مع هيموسيتوميتير أو عداد الآلي خلية.
- ريسوسبيند ولوحة 1 × 106 جوركات الخلايا في 5 مل من المصل انخفاض وسائل الإعلام مع بوليبريني (تكميلية الجدول 1) في قارورة T75. إضافة وسائط الإعلام المكيفة 293T HEK الذي يحتوي على 1 × 106 المحتوية على dCas9 من الجسيمات الفيروسية. ويمكن حساب عدد الجسيمات الفيروسية تقريبا من p24 أليسا لأن 1 ميكروغرام/مل p24 يساوي 1 × 107 الجسيمات الفيروسية. وضعت في قوارير في حاضنة 37 درجة مئوية مع شركة 5%2.
4-اختيار و استنساخ إنشاء
- ثلاثة أيام بعد الإصابة، تدور أسفل الخلايا في 233 س ز لمدة 5 دقائق وريسوسبيند لهم في 10 مل دميم كاملة مع بوروميسين (تكميلية الجدول 1). لوحة الخلايا في قوارير T75 والثقافة لهم عند 37 درجة مئوية مع شركة 5%2. تدور أسفل الخلايا في 233 س ز لمدة 5 دقائق كل يوم ثالث، لمدة 9 أيام، واستبدال وسائط الإعلام مع دميم كاملة مع بوروميسين.
- عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير أو عداد الآلي خلية. على لوحة 96-جيدا التعامل مع زراعة الأنسجة، لوحة خلايا 10,000 في 100 ميكروليتر من دميم كاملة مع بوروميسين في الأول جيدا ومتسلسل تمييع 1:1 محتويات الآبار التالية مع دميم كاملة مع بوروميسين. إجراء تخفيف 24 وكرر هذا x 4 للوحة الواحدة بغية ضمان وجود عدد كاف من الخلايا كل بئر. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع شركة 5%2.
- توسيع نطاق خلايا الاستنساخ إلى اثنين 24-جيدا لوحات، ثم إلى لوحة 6-جيدا، وفي نهاية المطاف إلى قارورة T75. بغية التركيز على ثلاثة من الحيوانات المستنسخة، لوحة 2 × 106 خلايا كل من لوحة 6-جيدا جيدا لثلاثة من النسخ. لوحة الآبار الثلاثة الأخرى مع نونترانسدوسيد جوركات الخلايا كعناصر تحكم. وضع الخلايا في حاضنة ثقافة خلية بين عشية وضحاها.
- لاستخراج الحمض النووي الريبي، استخدم مجموعة عزل الحمض النووي الريبي متاحة تجارياً. زيادة ونقصان لأسفل الخلايا في 233 س ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وقم بإزالة الوسائط. استخدام تلميح بيبيت 1 مل إلى ريسوسبيند الخلايا في ميكروليتر 350 من تحلل المخزن المؤقت. إضافة 350 ميكروليتر من الإيثانول 70% في الخلايا ليسيد ومزيج دقيق مع بيبيت 1 مل ونقل العينة إلى العمود بالجيش الملكي النيبالي.
- تدور ليساتيس في س 10,000 ز لمدة 1 دقيقة وإزالة التدفق من خلال إضافة ميكروليتر 700 يغسل التقشف المنخفضة المخزن المؤقت من الطقم إلى العمود. تدور ليساتيس في س 10,000 ز لمدة 1 دقيقة وإزالتها في التدفق من خلال إضافة 80 ميليلتر من الدناز أنا الحل من الطقم إلى العمود؛ واسمحوا العينات احتضانها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- تدور ليساتيس في س 10,000 ز لمدة 1 دقيقة وإزالتها في التدفق من خلال إضافة 700 ميليلتر من المخزن المؤقت للغسيل عالية-التشدد من الطقم إلى العمود. تدور ليساتيس في س 10,000 ز لمدة 1 دقيقة وإزالتها في التدفق من خلال إضافة ميليلتر 700 يغسل التقشف المنخفضة المخزن المؤقت إلى العمود.
- إزالة العمود من أنبوب جمع وتحويلها إلى أنبوب جمع جديدة. وتدور ليساتيس في 10,000 س ز لمدة 1 دقيقة، ثم قم بنقل العمود الحمض النووي الريبي لأنبوب 1.5 مل. إضافة 50 ميليلتر من المياه إلى العمود وتدور في 10,000 س ز لمدة 1 دقيقة.
- استخدام جهاز المطياف الضوئي لقياس تركيز الجيش الملكي النيبالي. تتوقع تركيز بما بين 100-500 نانوغرام/ميليلتر، مع امتصاص 260/280 بين 1.9-2.1. مخزن الجيش الملكي النيبالي في-80 درجة مئوية.
- في 250 ميليلتر الأنابيب، إضافة 1 ميكروغرام من الجيش الملكي النيبالي، 4 ميليلتر من المخزن المؤقت لتوليف الحمض النووي (كدنا) مكملة، 1 ميليلتر من المنتسخة العكسية، ومن المياه إلى وحدة تخزين نهائي من 20 ميليلتر. تتضمن أية عناصر تحكم المنتسخة العكسية. في cycler حرارية، توليف كدنا 42 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة وإلى 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لإلغاء تنشيط المنتسخة العكسية. تمييع كدنا مع 60 ميليلتر من الماء بعد التوليف.
- إعداد بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (تقارير إتمام المشروعات) التي تحتوي على 5 ميليلتر من سيبر الخضراء، 4 ميليلتر من كدنا، 0.5 ميليلتر من التمهيدي إلى الأمام (10 ميكرومتر)، و 0.5 ميليلتر لعكس التمهيدي (10 ميكرون). تشغيل بكر النحو التالي: الخطوة 1 = 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، الخطوة 2 = 95 درجة مئوية لمدة 10 ق، الخطوة 3 = 60 درجة مئوية ل 10 s، وبعد ذلك، كرر الخطوات 2 و 3 ل 30 x.
ملاحظة: التسلسل للتمهيدي إلى الأمام dCas9 5 '--تكجككاكاجكاتااجاجا والتسلسل للتمهيدي عكس dCas9 5'--كتتتكاتجتاكجككاككت. التمهيدي إلى الأمام هيبوكسانثيني فوسفوريبوسيلترانسفيريز 1 (HPRT1) 5 '--جاككاجتكاكاجججاكات وعكس التمهيدي 5'--جكتجكجاككتجاككاتكت.
5-جرنا توصيل، والتحديد، واستنساخ إنشاء، والفرز
- ريترانسدوسي الخلايا جوركات-dCas9 تم التحقق من صحتها مع الفيروسات المحتوية على جرنا كما هو مبين في الباب 3. حدد الخلايا في دميم مع هيجروميسين (تكميلية الجدول 1) لمدة 10 أيام. زيادة ونقصان لأسفل الخلايا وتغيير وسائل الإعلام كل 3 أيام.
- أداء تسلسلي إضعاف الخلايا (كما هو موضح في الخطوة 4، 2) وتوسيع المستعمرات الفردية (كما هو موضح في الخطوة 4، 3). تنقية الحمض النووي الريبي من المستعمرات بالضبط كما هو موضح في الخطوة 4، 5 وإجراء توليف كدنا كما هو موضح في الخطوة 4.9. إجراء PCR الوقت الحقيقي ضد حكومة الهند و HPRT1 أو جينات مناسبة التدبير المنزلي، وبالمثل لبكر هو موضح في الخطوة 4، 10، في هذه الحالة، باستثناء صورة الآبار كل دورة بعد الخطوة 3.
- استخدم الأسلوب عتبة (Ct) دورة النسبية لتحديد تغيير غوي8إضعاف. بإيجاز، تستخدم المعادلة التالية لحساب مستويات نسخة النسبي (RTLs): 2-(متوسط Ct غوي – متوسط الأشعة المقطعية للجينات التدبير المنزلي). ثم حساب متوسط RTL لعناصر التحكم والقسمة جميع RTL قيم عنصر التحكم متوسط RTL لتوليد تغيير إضعاف مقارنة بالعينات السيطرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نظام مزدوج متجه أوفيريكسبريس لنكرنا إيفنج-AS1
هذه التجربة مثال في هذه المخطوطة هو أوفيريكسبريشن جوركات تي خلية نموذج نظام الإعراب عن لنكرنا إيفنج-AS19. إيفنج-AS1 هو لنكرنا المرتبطة بمرض التهاب الأمعاء، التي شهدت تنظيم "انترفيرون غاما"10. جين إيفنج-AS1 يحتوي على ثلاثة متغيرات لصق كافة استخدام نفس الموقع ابدأ النسخي (الشكل 1A). ولذلك، استخدمت متواليات جرنة التي كانت بي بي 10 و 100 بعيداً عن الموقع ابدأ النسخي وتسلسل "نج" المنبع لتوجيه المجمع Cas9-تفعيل محور النسخي IFNG-AS1 (الشكل 1A). تم استخدام نظام بلازميد اثنين ترانسدوسي dCas9 أو جرناس/القدرة على داخل الخلايا كما بلازميد واحد وحدة يجعل الجسيمات الفيروسية جيل صعبة بسبب حجم بلازميد (الشكل 1B). لتمكين تحديد الخلايا ترانسدوسيد مزدوجة، الواردة متجه dCas9 مورثة مقاومة بوروميسين (أمينونوكليوسيدي)، والوارد بلازميد المحتوية على جرنا مورثة مقاومة هيجروميسين (امينوغليكوزيد). كانت تنصهر جرناس لتسلسل سقالة MS2 تمكين البروتين سقالة MS2 لربط جرناس. تنصهر فيها MS2 بالبروتين المنشط النسخي إضافية لتعزيز overexpression IFNG-AS17. باستخدام هذه الناقلة، يمكن إنشاء الجسيمات الفيروسية ترانسدوسي هذا النظام أوفيريكسبريسيون في خطوط الخلايا البشرية الأكثر.
تيتيرينج الفيروسية وفحص مستعمرة
بعد توليد البلازميدات المحتوية على dCas9 وجرنة، وتنقية بلازميد أجريت وتم إنشاؤها لينتيفيروسيس. كما lentiviruses إدماج عشوائياً على أشرطة الكاسيت في الجينوم، يتيح إجراء تقييم كمي لعدد الجسيمات الفيروسية الأقل عدد ممكن من التكامل. لتحقيق هذا الهدف، تم قياس مكيفة وسائل الإعلام-التي تحتوي على الفيروسات مع p24 مجموعة أليسا، مما يتيح لحساب عدد فيريونس في المليلتر. بعد قياس، كان كلا supernatants الفيروسية تقريبا 1 ميكروغرام/مل من p24، مما يسمح باستخدام 100 ميليلتر من الفيروس إلى الخلايا جوركات ترانسدوسي. بعد توصيل، متسلسل قد تضعف الخلايا المحددة من المضادات الحيوية وتم توسيع الحيوانات المستنسخة. وقد تم تحليل التعبير Cas9 ثم بكر في الوقت الحقيقي والتفريد [اغروس] هلام (الشكل 2). كل استنساخ المحدد كانت إيجابية بالنسبة للتعبير Cas9. لتأكيد التعبير مرناً، أسقطت المنتسخة العكسية من رد الفعل كدنا (الشكل 2). واستخدمت كبسولة تفجير ضد HPRT1 للتأكد من وجود الحمض النووي الريبي في الخلايا نونترانسدوسيد.
قياس التعبير الجيني إيفنج-AS1
استخدام dCas9 استنساخ كخط خلية أبوية، وكانت ترانسدوسيد الخلايا مع أحد فيروسات التي تحتوي على جرنة نونتارجيتينج أو فيروسات التي تحتوي على جرناس ضد إيفنج-AS1. بعد توصيل جرنة واختيار وإنشاء نسخة مماثلة لإنشاء خط الخلية dCas9، وتم قياس التعبير إيفنج-AS1 للتحقق من أوفيريكسبريشن. وتنتج إيفنج-AS1 المتغيرات لصق ثلاثة، كل منها يمكن الكشف على حدة مع الإشعال الخاصة بنسخة (أحمر) أو ضد جميع النصوص IFNG-AS1 المعروفة (أزرق) (الشكل 3A). وكانت جميع الأسفار المنحنيات الأسية مع بلوغ HPRT1 الأسى المرحلة (أو Ct) داخل نصف دورة بين إيفنج-AS1-جرنة-الإعراب عن خلايا (الشكل 3، ج) والتحكم. كبسولة تفجير ضد جميع النصوص IFNG-AS1 المعروفة كانت آخر يمكن كشفها بين التجارب مع قياسات لبرنامج الزيادات في IFNG-AS1 (الشكل 3B). بينما كبسولة تفجير ضد محاضر ضد 1 و 2 بنجاح تضخم في خلايا الدم المحيطية وحيدات النوى (ببمكس)، هذه النصوص لم تكن قابلة للكشف في الخلايا جوركات (البيانات لا تظهر). بيد عند النسخة الثالثة من إيفنج-AS1 تم كشفها في تركيز الحمض النووي الريبي، خمس-إلى عشرة إضعاف زيادة كبيرة في مستويات IFNG-AS1 شوهدت. تشير هذه البيانات إلى أما الربط بديلة من إيفنج-AS1 في جوركات خلايا موجودة بالمقارنة مع الخلايا الأولية. كبسولة تفجير ضد إيفنج-AS1 الكشف عن الزيادات الكبيرة في هذه الجينات، وبالتالي التحقق من صحة النظام overexpression كريسبر تفعيل.
رقم 1: نظام مزدوج متجه أوفيريكسبريس لنكرنا إيفنج-AS1. (A) A التخطيطي الهيكل الجيني إيفنج-AS1 والعلاقة بين دليل مواقع ربط الحمض النووي الريبي (جرنة) وموقع بدء النسخي (TSS). (ب) ملامح ناقلات جرنة و dCAS9. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: تيتيرينج الفيروسية وفحص مستعمرة. (أ) سبيل مثال p24 أليسا المنحنى المعياري لوسائل الإعلام التي تحتوي على لينتيفيروس، ومكيفة. تمثل عينات قياسية من النقاط السوداء والحمراء ونقاط العينات غير معروف. (ب) بعد ترانسدوسينج، واختيار، وإنشاء المستعمرات، بكر في الوقت الحقيقي والتفريد جل ضد dCas9 أجريت على الحمض النووي الريبي من أما الخلايا جوركات نونترانسدوسيد (الوالدين) أو استنساخ ترانسدوسيد dCas9. وأجريت أية عناصر تحكم المنتسخة العكسية (أي RT). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: قياس التعبير الجيني إيفنج-AS1. (أ) بالرسم التخطيطي العلاقة بين مجموعات التمهيدي ونسخة من المتغيرات. تمثل الأسهم الحمراء الإشعال الخاصة بنسخة، بينما تشير الأسهم الزرقاء كبسولة تفجير ضد جميع النصوص المعروفة. (ب وج) الممثل متوسط بكر المنحنيات وتجليد-تغيير كوانتيفيكيشنز للتحكم والخلايا إيفنج-AS1-أوفيريكسبريسينج. رفو = وحدات fluorescence النسبي. N = 3 عينات كل مجموعة. يعني ± التنمية المستدامة. *ف < 0.05، * * *ف < 0.001. طالب t-تم استخدام اختبار لحساب فالقيم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
تكميلية الشكل 1: تصميم جرنة اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
تكميلية الشكل 2: بلاط اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
تكميلية الجدول 1: حلول اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
تكميلية الجدول 2: تخفيف أليسا اضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويعرض هذه المخطوطة على بروتوكول لاستخدام تنشيط كريسبر إلى أوفيريكسبريس لنكرناس في المختبر. هذا أسلوب أهمية خاصة عند دراسة الكشف فضله منذ فترة طويلة كمنتج ترانسكريبتوميك هو وحدة وظيفية. بعد أوفيريكسبريشن، الباحث، ثم استخدام هذه الخلايا لزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء عند دراسة الشركاء ملزمة وحتى قياس عواقب الخلوية لمستويات متزايدة من لنكرناس. بالإضافة إلى ذلك، كثيرا ما فعلها لنكرناس في رابطة الدول المستقلة-الجينات، يتيح هذا الأسلوب overexpression الذاتية هذه الأحداث أن درس11،12.
هذه المخطوطة يسلط الضوء على بروتوكول معمم لإنشاء جرنة وجيل لينتيفيروس، وتوصيل والتحديد، ومبين مثال ممثل من أوفيريكسبريشن لنكرنا في دم المحيطي خط الخلية T. بالإضافة إلى ذلك، وقد تم توضيح هذه التقنية لتكون ناجحة في13من الخلايا المناعية المستمدة من نخاع العظام والخلايا العصبية7، الماوس الخلايا الجذعية الجنينية14والكلى الخلايا الظهارية4. في حين أن هذا البروتوكول تنطبق بصورة عامة لمعظم خطوط الخلايا، قد تتطلب الخلايا التي من الصعب أن ترانسدوسي التتر الفردية فيما يتعلق بتمكين أعلى معدلات الإصابة. بالإضافة إلى ذلك، من المهم تنفيذ المنحنيات تقتل المضادات الحيوية عند استخدام خطوط الخلايا الجديدة، كما يستخدم هذا البروتوكول استراتيجية انتقاء إيجابية.
من المذكرة، هذا البروتوكول له العديد من الجوانب التقنية التي تتطلب اهتماما خاصا. استنساخه ويتفق بيبيتينج ل PCR الوقت الحقيقي أمر بالغ الأهمية إنشاء النتائج استنساخه. سوف يسبب الاختلافات الصغيرة حتى في وحدات تخزين قيم المتغيرات عالية، مما يجعل تفسير الصعب. بالإضافة إلى تصميم التمهيدي PCR كمية مناسبة، عناصر التحكم، بما في ذلك عنصر التحكم لا-عكس-المنتسخة للإشعال PCR الوقت الحقيقي، حاسمة لأنها تؤكد أن الجيش الملكي النيبالي يجري تحديده كمياً ليس الحمض النووي. اختيار الجينات التدبير المنزلي ل PCR الوقت الحقيقي مهم أيضا من أجل إجراء هذه التجارب على نحو كاف. في حين تم اختيار HPRT1 في هذا البروتوكول، قد يغير جينات أخرى من المصالح المستهدفة بهذا الأسلوب HPRT115. اختيار دقيق للجينات التدبير الإداري استناداً إلى هذه العوامل يجب أن تؤخذ في الاعتبار.
وهناك عدد قليل من العيوب لتفعيل كريسبر وجوانب معينة من هذا البروتوكول. حد محتمل واحد هو تعبير عن المحاضر في المناطق العالية الغنية جين كجينات أخرى مجاورة ويمكن أن تكون قيد التشغيل. فمن الممكن أن قد يتم تنشيط المجاورة الجينات على مقربة والضوابط ينبغي أن يقوم على تقييم هذا. وباﻹضافة إلى ذلك، وقيود أخرى تشمل الافتقار إلى الملزم جرناس خاصة لتسلسل الحمض النووي معين. قد يلزم اختيار جرناس متعددة لتحديد جرنة المناسبة للتعبير بالسيارة. تحذير آخر للنظام أن خلية اهتمام القدرة على محرك المروجين في الأشرطة من أجل محرك التعبير عن جرناس و dCas9. للدراسات المقدمة هنا، كان نموذج جوركات تي خلية قادرة على محرك التعبير عن هذه المكونات لنظام أوفيريكسبريشن ناجحة.
ومن الناحية المثالية، ينبغي أن يقترن البروتوكول الموصوفة هنا معلومات داعمة أخرى، مثل البيانات overexpression نسخة واحدة والآثار الفنية من دراسات ضربة قاضية أو الضربة القاضية، لتعزيز الحال بالنسبة لأي من النتائج اللاحقة. هذا الأسلوب يوفر وسيلة قوية ل overexpressing أي الجينات في نوع خلية معينة. نظراً لمحدودية علم الأحياء لنكرنا، مثل حفظ الأنواع الفقيرة، تقنيات مثل الموضحة هنا الحاسمة لاستكشاف وظيفتها في أنواع الخلايا ذات الصلة. ركزت هذه الدراسة على أحد لنكرنا التي قد تورط في الفيزيولوجيا المرضية مرض التهاب الأمعاء ولكن يخدم كنموذج لدراسة وظيفة أخرى لنكرناس في بيولوجيا الأمراض البشرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
س. ب. معتمد من قبل RO1 DK60729 و P30 DK 41301-26. موانئ دبي معتمد بواسطة كرون والتهاب القولون مؤسسة (معدل) تنمية جائزة مهنة، علاج: مركز بحوث أمراض الجهاز الهضمي (درك) DK41301، والسريرية من جامعة كاليفورنيا ومعهد العلوم متعدية الجنسيات (كتسي) UL1TR0001881. الأساسية علم الفيروسات في جامعة كاليفورنيا بتمويل من مركز أبحاث الإيدز (كفار) منح AI028697 5 ف 30. منح "جامعة كاليفورنيا المتكاملة التكنولوجيات الجزيئية" الأساسية وأيده علاج/P30 DK041301. وأيد هذا العمل أيضا معهد الإيدز في جامعة كاليفورنيا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016 | |
| cDNA synthesis kit (iScript) | BioRad | 1708891 | |
| dCas9 forward primer | Integrated DNA Technologies | n/a | 5'-TCGCCACAGCATAAAGAAGA |
| dCas9 reverse primer | Integrated DNA Technologies | n/a | 5'-CTTTTCATGGTACGCCACCT |
| dCas9 vector | Addgene | 50918 | |
| DMEM | Corning | 10013CM | |
| Ethanol | Acros Organics | 61509-0010 | |
| FBS | Sigma Aldrich | F2442 | |
| gRNA plasmid | VectorBuilder | VB180119-1195qxv | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-1573 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| HPRT1 forward primer | Integrated DNA Technologies | n/a | GACCAGTCAACAGGGGACAT |
| HPRT1 reverse primer | Integrated DNA Technologies | n/a | GCTTGCGACCTTGACCATCT |
| Hygromycin B | Corning | MT3024CR | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618-500 | |
| Jurkat cells | ATCC | TIB-152 | clone E6-1 |
| L-glutamine | Corning | 25005Cl | |
| LB agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | |
| LB broth | Fisher Scientific | BP1426-2 | |
| Maxi-prep kit (Plasmid Purification Kit) | Qiagen | 12362 | |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | NIST2186II | |
| Optimem I reduced serum media | Gibco | 31985070 | |
| p24 elisa | Perkin Elmer | NEK050B | |
| PBS | Corning | 21-040-CMR | |
| Penicillin and Streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| pMDG2.G | Addgene | #12259 | |
| pMDLg/pRRE | Addgene | #60488 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma Aldrich | P-4832 | |
| Polybrene | EMD Millipore | TR-1003 | |
| pRSV-REV | Addgene | #12253 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma Aldrich | P8833 | |
| RNA purification kit (Aurum RNA mini) | BioRad | 7326820 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| SYBR green (iTaq universal) | BioRad | 1725122 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 |
References
- Miao, Y., et al. Trends of long noncoding RNA research from 2007 to 2016: a bibliometric analysis. Oncotarget. 8 (47), 83114-83127 (2017).
- Derrien, T., et al. The GENCODE v7 catalog of human long noncoding RNAs: analysis of their gene structure, evolution, and expression. Genome Research. 22 (9), 1775-1789 (2012).
- Johnsson, P., Lipovich, L., Grander, D., Morris, K. V. Evolutionary conservation of long non-coding RNAs; sequence, structure, function. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (3), 1063-1071 (2014).
- Perez-Pinera, P., et al. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Maeder, M. L., et al. CRISPR RNA-guided activation of endogenous human genes. Nature Methods. 10 (10), 977-979 (2013).
- Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Gomez, J. A., et al. The NeST long ncRNA controls microbial susceptibility and epigenetic activation of the interferon-gamma locus. Cell. 152 (4), 743-754 (2013).
- Padua, D., et al. A long noncoding RNA signature for ulcerative colitis identifies IFNG-AS1 as an enhancer of inflammation. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 311 (3), G446-G457 (2016).
- Collier, S. P., Henderson, M. A., Tossberg, J. T., Aune, T. M. Regulation of the Th1 genomic locus from Ifng through Tmevpg1 by T-bet. Journal of Immunology. 193 (8), 3959-3965 (2014).
- Kotake, Y., et al. Long non-coding RNA ANRIL is required for the PRC2 recruitment to and silencing of p15(INK4B) tumor suppressor gene. Oncogene. 30 (16), 1956-1962 (2011).
- Gilbert, L. A., et al. Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation. Cell. 159 (3), 647-661 (2014).
- Cheng, A. W., et al. Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system. Cell Research. 23 (10), 1163-1171 (2013).
- Matouskova, P., et al. Reference genes for real-time PCR quantification of messenger RNAs and microRNAs in mouse model of obesity. PLoS One. 9 (1), e86033 (2014).
