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Genetics

लंबे noncoding rnas का उपयोग करके overexpressing जीन सक्रिय crispr

Published: March 1, 2019 doi: 10.3791/59233
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 3, 3, 1, 1
1Vatche and Tamar Manoukian Division of Digestive Diseases, Department of Medicine, University of California, Los Angeles, 2Vatche and Tamar Manoukian Division of Digestive Diseases, Integrated Molecular Technologies (IMT) Core, Department of Medicine, University of California, Los Angeles, 3Division of Hematology and Oncology, Department of Medicine, University of California, Los Angeles

Summary

पारंपरिक cdna आधारित overexpression तकनीकों लंबे noncoding की overexpression के लिए एक सीमित प्रयोज्यता है rnas संभावित कार्यक्षमता के साथ अपने कई ब्याह रूपों के कारण. यह समीक्षा एक लंबे noncoding आरएनए के कई ब्याह वेरिएंट overexpress करने के लिए crispr प्रौद्योगिकी का उपयोग कर एक प्रोटोकॉल की रिपोर्ट ।

Abstract

लांग noncoding आरएनए (lncrna) बायोलॉजी २००७ के बाद से तेजी से बढ़ रही इस क्षेत्र से प्रकाशनों की संख्या के साथ, अनुसंधान के एक नए और रोमांचक क्षेत्र है । इन अध्ययनों से पुष्टि की है कि lncrnas लगभग सभी रोगों में बदल रहे हैं. हालांकि, रोग के संदर्भ में lncrnas के लिए कार्यात्मक भूमिकाओं का अध्ययन प्रोटीन उत्पादों की कमी के कारण मुश्किल रहता है, ऊतक-विशिष्ट अभिव्यक्ति, कम अभिव्यक्ति का स्तर, ब्याह रूपों में जटिलताओं, और प्रजातियों के बीच संरक्षण की कमी. प्रजातियों-विशिष्ट अभिव्यक्ति को देखते हुए, lncrna अध्ययन अक्सर मानव अनुसंधान संदर्भों के लिए प्रतिबंधित कर रहे है जब रोग प्रक्रियाओं का अध्ययन । आणविक स्तर पर lncrnas समारोह के बाद से, lncrnas जीव विज्ञान को काटना करने के लिए एक ही रास्ता है या तो lncrnas को हटाने या lncrnas ओवरएक्सप्रेस और सेलुलर प्रभाव को मापने. इस आलेख में, एक लिखित और कल्पना प्रोटोकॉल को विट्रो में ओवरएक्सप्रेस lncrnas प्रस्तुत किया है । एक प्रतिनिधि प्रयोग के रूप में, भड़काऊ आंत्र रोग के साथ जुड़े एक lncrna, इंटरफेरन गामा एंटीसेंस 1 (ifng-AS1), एक jurkat टी-सेल मॉडल में overexpressed किया जा करने के लिए दिखाया गया है. यह पूरा करने के लिए, सक्रिय संकुल नियमित रूप से interspaced लघु palindromic दोहराता (crispr) तकनीक अंतर्जात जीनोमिक loci पर overexpression सक्षम करने के लिए प्रयोग किया जाता है । सक्रिय crispr तकनीक एक जीन की प्रतिलेखन शुरू साइट के लिए प्रतिलेखन कारकों का एक सेट लक्ष्य, एकाधिक lncrna ब्याह रूपों की एक मजबूत overexpression सक्षम करने से । इस प्रक्रिया के नीचे तीन चरणों में टूट जाएगा, अर्थात् (मैं) गाइड आरएनए (grna) डिजाइन और वेक्टर निर्माण, (द्वितीय) वायरस पीढ़ी और transduction, और (iii) overexpression के लिए कॉलोनी स्क्रीनिंग । इस प्रतिनिधि प्रयोग के लिए, एक से अधिक 20-ifng-AS1 में गुना वृद्धि jurkat टी कोशिकाओं में मनाया गया ।

Introduction

जबकि सबसे जैव चिकित्सा अनुसंधान प्रोटीन-कोडिंग टेप पर ध्यान केंद्रित किया है, लिखित जीन के बहुमत वास्तव में noncoding rnas के होते है (ensembl रिलीज ९३) । वर्तमान अनुसंधान इस क्षेत्र का पता लगाने के लिए शुरुआत है, रोग प्रक्रियाओं में lncrnas पर प्रकाशनों की संख्या के साथ २००७ और २०१७ के बीच तेजी से बढ़ रही1. इन प्रकाशनों का प्रदर्शन है कि कई lncrnas रोग के साथ जुड़े रहे हैं । तथापि, इन lncrnas के आणविक तंत्र के रूप में mrnas की तुलना में उनके विविध कार्यों के कारण अध्ययन करने के लिए मुश्किल हैं. रोग में lncrnas की भूमिका को समझने की समस्या को जटिल, lncrnas अक्सर2rnas कोडिंग की तुलना में निचले स्तर पर व्यक्त कर रहे हैं. इसके अतिरिक्त, lncrnas खराब संरक्षित कर रहे हैं, जो मानव सेल लाइन आधारित तकनीक3में कार्यात्मक अध्ययन को सीमित करता है । इन उपन्यास जीन के तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक विधि यह है कि इन्हें सुसंस्कृत कोशिकाओं में अंतर्जात रूप से अतिअभिव्यक्त किया जाता है । ओवरएक्सप्रेशन अध्ययन विशिष्ट जीन के कार्य के रूप में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करते हैं और शोधकर्ताओं को कुंजी आणविक रास्ते को काटना करने के लिए सक्षम कर सकते हैं ।

एक नई विधि lncrna जीन के प्रतिलेखन को सक्रिय करने के लिए crispr टेक्नोलॉजीज द्वारा शुरू में विकसित gersbach4प्रयोगशाला पर आधारित है । यह प्रोटोकॉल lncrna जीवविज्ञान में उपयोग के लिए और अंय मॉडल प्रणालियों में इन जीन की अभिव्यक्ति के लिए अनुकूलित किया गया है । crispr overexpressing तकनीक में, एक प्रोटीन बुलाया crispr-जुड़े प्रोटीन 9 (Cas9) एक antisense grna के माध्यम से एक डीएनए अनुक्रम की ओर निर्देशित किया जा सकता है कि Cas9 द्वारा मांयता प्राप्त है । आम तौर पर, Cas9 डीएनए दरार पैदा करेगा; हालांकि, Cas9 में परिवर्तन, पहले overexpression तकनीक के लिए विकसित, इस चरण5को निष्क्रिय करें । जब एक transcriptional उत्प्रेरक एक "मृत" Cas9 (dCas9) के लिए जुड़े हुए और सेल लाइनों में transduced है, अंतर्जात lncrnas के overexpression4,6हासिल किया जा सकता है । grna करने के लिए अतिरिक्त संशोधनों के अलावा, अतिरिक्त transcriptional कारकों grna को सक्षम करने के लिए, dCas9 gene सक्रियकरण प्रणाली 10 गुना7की प्रभावकारिता में वृद्धि हुई । महत्वपूर्ण बात, यह है कि transcriptional सक्रियण transcriptional शुरू साइट जीन के लिए करीब निकटता (< 200 बीपी) की आवश्यकता है, जीन से समृद्ध क्षेत्रों में एक विशिष्ट अपरेगुलेशन7को सक्षम करने का प्रदर्शन किया गया था । crispr पीटकर प्रौद्योगिकियों के विपरीत, dCas9 और grna कैसेट के लिए जीनोम में एकीकृत करने की आवश्यकता के लिए कोशिकाओं के लिए कई पीढ़ियों से अधिक एक overexpression बनाए रखने के लिए अनुमति देते हैं । इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए एक विधि को dCas9-और grna-युक्त कैसेट को एकीकृत करने के लिए दाल के वायरस का उपयोग करने के लिए है । एकीकरण के बाद, lncrna जीन अभिव्यक्ति निर्धारित किया जा सकता है ।

इस लेख में, एक जुरकात टी-सेल मॉडल में lncrna ओवरएक्सप्रेशन के लिए एक प्रोटोकॉल का प्रदर्शन किया जाएगा । एक कदम दर कदम प्रक्रिया को दिखाया गया है और यह भी आसंन कोशिकाओं के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

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Protocol

नोट: यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि यह प्रोटोकॉल प्रतिकृति की कमी वाले लेंटिवायरस का उपयोग करता है । केवल उपयुक्त प्रयोगशाला सुरक्षा प्रशिक्षण के बाद वायरल हैंडलिंग प्रदर्शन । सभी मदों और सतहों कि हैंडलिंग के बाद 10 मिनट की एक ंयूनतम के लिए लाइव वायरस के साथ संपर्क में आ ब्लीच । एक डिस्पोजेबल प्रयोगशाला कोट और चेहरा/का प्रयोग करें, साथ ही साथ डबल दस्ताने, हर समय । वायरल प्रमाणीकरण के साथ जैव सुरक्षा स्तर 2 + लैब्स में वायरस काम करते हैं । समर्पित ऊतक संस्कृति डाकू और वायरल काम करने के लिए इनसेबेटर ।

1. वेक्टर डिजाइन और जनरेशन

नोट: grna दृश्यों की पहचान करने के लिए सबसे अच्छा तरीका है ऑनलाइन डिजाइन उपकरण (जैसे, http://crispr-era.stanford.edu) (पूरक चित्रा 1: grna डिजाइन) का उपयोग करने के लिए है । साथ प्रतिनिधि प्रयोग के लिए, एक कंपनी बनाया है और प्रतिनिधि प्रयोग में इस्तेमाल किया grna वैक्टर बनाया । dCas9 प्लाज्मिड भी ऑनलाइन खरीदा गया था ।

  1. grna अनुक्रम न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम के अपस्ट्रीम स्थित है "ngg", जहां "एन" किसी भी न्यूक्लियोटाइड है, जो भी के भीतर है १०० आधार-जोड़े की transcriptional प्रारंभ साइट. खोज आनुवंशिक डेटाबेस जैसे blat (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start) grna अनुक्रम के लिए, सुनिश्चित करें कि वहां समान अनुक्रम के साथ जीनोम में कोई अंय साइटों रहे है बनाने के लिए (पूरक चित्रा 2: blat) । यह सुनिश्चित करेगा कि grna अनुक्रम ब्याज (भारत सरकार) के जीन के लिए अद्वितीय है ।
  2. grna और dCas9 plasmids, जो बैक्टीरियल stubs के रूप में आते हैं, 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर । एक luria शोरबा पर escherichia कोलाई बाहर लकीर (LB) एम्पीसिलिन (पूरक तालिका 1) के साथ आगर प्लेट और ३७ डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात बैक्टीरिया हो जाना ।
  3. एक कॉलोनी उठाओ और एम्पीसिलीन के साथ पौंड की 5 मिलीलीटर में बैक्टीरिया हो जाना (पूरक तालिका 1) रातोंरात, जोरदार एक ३७ डिग्री सेल्सियस इनकोबेटर में थाली मिलाते हुए. अगले दिन, 2 मिलीलीटर बैक्टीरिया को जोड़ने के लिए २०० मिलीलीटर पौंड के साथ एम्पीसिलीन एक 2 एल फ्लास्क में बढ़ जाता है, जोरदार रूप से फ्लास्क को एक ३७ डिग्री सेल्सियस इनकोबेटर में मिलाते हैं ।
  4. 20 मिनट के लिए ३,७२४ एक्स जी पर बैक्टीरिया नीचे स्पिन । मीडिया निकालें और बर्फ पर बैक्टीरिया युक्त ट्यूब रखें ।
  5. निर्माता के प्रोटोकॉल प्रति एक प्लाज्मिड शोधन किट का उपयोग कर बैक्टीरियल डीएनए शुद्ध ।
    नोट:     प्लाज्मिड शोधन किट मालिकाना resuspension बफर, lysis बफर, धोने बफर, समरूप बफर, और रेफरेंस बफर होते हैं ।
    1. बैक्टीरिया के लिए किट से resuspension बफर के 10 मिलीलीटर जोड़ें और समाधान में बैक्टीरिया पिपेट । फिर, जोड़ें 10 मिलीलीटर की lysis बफर किट से सस्पेंड बैक्टीरिया के लिए और उन्हें ट्यूब प्रतिलोम द्वारा मिश्रण. बैक्टीरिया लाइसे करने के लिए 5 मिनट रुको; फिर, किट से लीजड ड बैक्टीरिया के लिए बर्फ ठंडा बेअसर बफर के 10 मिलीलीटर जोड़ें और ट्यूब उलटा करके उन्हें मिश्रण ।
    2. 5 मिनट के लिए समानता बफर के 10 मिलीलीटर के साथ किट से डीएनए कॉलम equilibrate । डीएनए कॉलम फिल्टर में नमूनों डालो और समाधान फिल्टर के माध्यम से पारित करते हैं ।
    3. धो बफर के 30 मिलीलीटर के साथ नमूने 2x धोने और, फिर, एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में 30 मिलीलीटर रेफरेंस बफर के साथ डीएनए elute । धीरे से लेयर १०.५ एमएल के isopropanol पर कमरे के तापमान पर eluted डीएनए पर, ट्यूब पलटे, और तुरंत इसे स्पिन पर १६,२०० एक्स जी के लिए 30 मिनट में 4 ° c.
    4. सतह पर तैरनेवाला निकालें और डीएनए गोली के लिए ७०% इथेनॉल के 1 मिलीलीटर जोड़ें । ट्यूब flicking द्वारा गोली resuspend । यह 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए १६,२०० एक्स जी पर स्पिन और इथेनॉल का सबसे दूर करने के लिए एक २०० μl पिपेट टिप का उपयोग करें । हवा-5 मिनट के लिए गोली सूखी और यह पानी के २०० μl में resuspend, और-20 डिग्री सेल्सियस पर डीएनए की दुकान । अपेक्षित सांद्रता 1 μg/μl > होगी ।

2. वायरस पीढ़ी और कण गिनती

  1. जब dCAS9-युक्त दाल बनाने के लिए तैयार, कोट १०० मिमी ऊतक संस्कृति व्यंजन के साथ 5 मिलीलीटर की ०.०१% पाली-एल-lysine (पूरक तालिका 1). अतिरिक्त तरल को अच्छी तरह से प्लेटों से निकालें और उन्हें जैव सुरक्षा कैबिनेट में कुछ मिनट के लिए हवा-सूखी दें ।
  2. थाली 5 x 106 hek पूर्ण dulbecco के संशोधित ईगल के मध्यम (dmem) (पूरक तालिका 1) के 10 मिलीलीटर में प्रति पकवान कोशिकाओं और 5% सह2के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर उन्हें सेते हैं । अगले दिन, hek 293t व्यंजन से मध्यम निकालें और पूरा dmem के 10 मिलीलीटर जोड़ें ।
  3. गैग/पीओएल (वायरस के घटक) युक्त प्लाज्मिड pmdlg/prre के मिक्स ६.५ μg, ३.५ (वायरस का एक घटक) vsv-g युक्त प्लाज्मिड pMDG2. g के μg, प्लाज्मिड prre के २.५ μg-rev युक्त rev (वायरस का एक घटक), एक लंबे टर्मिनल दोहराने के 10 μg ( ltr)-युक्त grna वेक्टर या एक ltr युक्त dCas9 वेक्टर और ४५० μl की कुल मात्रा में पानी जोड़ें । एक सिरिंज से जुड़ी एक ०.२ μm फिल्टर टिप के माध्यम से मिश्रण फ़िल्टर.
  4. डीएनए के प्रत्येक ट्रांसफेक्शन नमूने के लिए २.५ मीटर cacl2 (पूरक तालिका 1) के ५० μl जोड़ें और धीरे मिश्रण । एक सिरिंज से जुड़ी ०.२ μm फ़िल्टर टिप के माध्यम से कैल्शियम/डीएनए मिश्रण को फ़िल्टर करें । पिपेट ५०० μl of 2x एचबीएस (पूरक तालिका 1) में 5 मिलीलीटर पॉलीस्टाइरीन ट्यूब । ५०० μl डीएनए/cacl2 मिश्रण बिंदुश: और धीरे भंवर जोड़ें । 3 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं ।
  5. डीएनए के 1 मिलीलीटर को धीरे से जोड़ें/प्रत्येक डिश के लिए cacl2/hbs निलंबन । सामग्री को समान रूप से वितरित करने के लिए व्यंजन को तुरंत घूमता है । ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक 5% सह2 इनकोबेटर में रात भर एक पकवान सेते हैं ।
  6. 3 दिन, धीरे से निकालें और व्यंजन से मीडिया को त्यागें । ध्यान से फास्फेट-buffered खारा (pbs) के साथ कोशिकाओं 1x धो लें । 20 एमएम हेप्स और 10 एमएम सोडियम ब्यूटरेट के साथ 6 मिलीलीटर का पूरा dmem सप्लीमेंट जोड़ें । ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5% सह2 इनकोबेटर में 5-6 ज के लिए कोशिकाओं को सेते हैं ।
  7. pbs के साथ 1x कोशिकाओं को धो लें और 20 मिमी hepes के साथ पूरा dmem के 5 मिलीलीटर hepes 293t कोशिकाओं को जोड़ें । ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक 5% सह2 इनकोबेटर में 12 एच रात भर के लिए सेते ।
  8. 4 दिन पर, hek 293t सेल supernatants लीजिए और supernatants फिल्टर । -८० डिग्री सेल्सियस पर 1 मिलीलीटर aliquots फ्रीज ।
  9. जब वायरस का उपयोग करने के लिए तैयार है, गल वायरल कण के एक aliquot वातानुकूलित मीडिया युक्त (चरण २.८ में वर्णित के रूप में संग्रहीत) बर्फ पर । सभी अभिकर्मकों को कमरे के तापमान पर लाएं ।
  10. milliliter प्रति वायरल कणों की संख्या यों तो करने के लिए एक p24 एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (elisa) किट का प्रयोग करें ।
    1. सुआसुत विआयनीकृत पानी के 19 भागों जोड़कर किट से धोने ध्यान देना । २०० एनजी/एमएल करने के लिए किट से सकारात्मक नियंत्रण पतला, के रूप में rmpi १६४० का उपयोग कर, और p24 elisa कमजोर पड़ने तालिका (पूरक तालिका 2) के अनुसार १.५ मिलीलीटर ट्यूबों में मानक वक्र के लिए dilute बनाते हैं ।
    2. सब्सट्रेट रिक्त छोड़कर सभी कुओं के लिए 5% ट्राइटन एक्स-१०० के 20 μl जोड़ें । नकारात्मक नियंत्रण कुओं के लिए rpmi १६४० के २०० μl जोड़ें । नामित कुओं को प्रत्येक मानक (डुप्लिकेट में) के २०० μl जोड़ें ।
    3. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करते हुए, नमूनों के भीतर वायरस की एकाग्रता को मापने, एक मानक वक्र का उपयोग. 1:1000 पर नमूना कमजोर पड़ने शुरू और मात्रा मानक वक्र की सीमा के भीतर होने के लिए आवश्यक के रूप में संशोधित करें । ०.५% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए triton एक्स-१०० के साथ नमूनों को पतला और नामित कुओं के लिए rpmi १६४० में प्रत्येक नमूने के २०० μl जोड़ें. प्लेट सील और यह ३७ डिग्री सेल्सियस पर 2 एच के लिए सेते हैं ।
    4. प्रति अच्छी तरह से 1x धो बफर के ३०० μl साथ प्लेट 6x धो लें । प्लेट को उलटा करके किसी भी अतिरिक्त द्रव को निकालें और कागज तौलिया पर टैप करें । किट से १०० μl डिटेक्टर एंटीबॉडी जोड़ें सब्सट्रेट रिक्त छोड़कर सभी कुओं के लिए । प्लेट को सील करें और इसे ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 ज के लिए सेते हैं । थाली को धोकर, फिर, प्लेट को उलटा करके किसी भी अतिरिक्त तरल पदार्थ को हटा दें और एक पेपर तौलिया पर टैप करें ।
    5. डिटेक्टर एंटीबॉडी को मापने के लिए, उपयोग के 15 मिनट के भीतर स्ट्रेप्टाविडीन-सहिजन peroxidase (एसए-hrp) तैयार करते हैं । एसए-hrp पतला के साथ 1:100 पर एसए-hrp पतला । पतला एसए-hrp अच्छी तरह से मिलाएं और खाली छोड़कर सभी कुओं को १०० μl जोड़ें । सील और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए थाली सेते हैं ।
    6. 1x धोने बफर के साथ थाली धोने और कदम 2.10.4 में के रूप में किसी भी अतिरिक्त तरल दूर नल । का प्रयोग करें ऑर्थो-phenylenediamine (ओपीडी) सब्सट्रेट समाधान, जो peroxidase प्रदान करता है आवश्यक सब्सट्रेट के लिए chemiluminescence उत्पादन, तैयारी के 15 मिनट के भीतर । प्रत्येक थाली के लिए 11 मिलीलीटर सब्सट्रेट के लिए एक ओपीडी टैबलेट का उपयोग करें ।
    7. भंवर ओपीडी समाधान जोरदार इसे पूरी तरह से भंग करने और प्रकाश से बचाने के लिए । रिक्त सहित सभी कुओं के लिए ओपीडी सब्सट्रेट समाधान के १०० μl जोड़ें । एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करना, ४५० एनएम पर अवशोषण को तुरंत पढ़ें, इस 10x को 1 s अंतरालों पर दोहराएं, और औसत माप लें ।

3. dCas9-उपाध्यक्ष६४ transduction

  1. संस् कृति ज्ञकत टी प्रकोष्ठों में पूर्ण dmem में 2 x 106 कोशिकाओं के घनत्व के साथ एक T75 कुप्पी में 15 मिलीलीटर मीडिया । संस्कृति 5% सह2के साथ एक ३७ ° c इनसेबेटर में कोशिकाओं ।
  2. नीचे 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को स्पिन २३३ एक्स जी और, फिर, उंहें कम सीरम मीडिया के 10 मिलीलीटर में resuspend । एक hemocytometer या एक स्वचालित सेल काउंटर के साथ कोशिकाओं की गणना ।
  3. resuspend और प्लेट 1 x 106 एक T75 flask में polybrene (पूरक तालिका 1) के साथ कम सीरम मीडिया के 5 मिलीलीटर में jurkat कोशिकाओं । 1 x 106 dCas9 युक्त hek 293t-वातानुकूलित मीडिया जोड़ें-वायरल कणों युक्त । वायरल कणों की संख्या मोटे तौर पर p24 elisa से गणना की जा सकती है क्योंकि 1 μg/एमएल p24 1 x 107 वायरल कणों के बराबर होती है । 5% सह2के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस इनकुबेटर में बोतल रखो ।

4. चयन और क्लोन निर्माण

  1. तीन दिनों के बाद संक्रमण, 5 मिनट के लिए २३३ एक्स जी में कोशिकाओं नीचे स्पिन और उंहें puromycin (पूरक तालिका 1) के साथ पूरा dmem के 10 मिलीलीटर में resuspend । प्लेट T75 बोतल में कोशिकाओं और उन्हें ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5% सह2के साथ संस्कृति । हर तीसरे दिन, 9 दिनों की अवधि के लिए, नीचे 5 मिनट के लिए २३३ एक्स जी पर कोशिकाओं स्पिन और puromycin के साथ पूरा dmem के साथ मीडिया की जगह ।
  2. एक hemocytometer या एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना । एक ९६-अच्छी तरह से प्लेट पर ऊतक संस्कृति के साथ इलाज किया, थाली १०,००० पूर्ण dmem के १०० μl में कोशिकाओं को पहले कुआं में प्रोमाइसिन के साथ और प्रश्नपत्र पतला 1:1 निम्नलिखित कुओं की सामग्री puromycin के साथ पूरा dmem के साथ । 24 dilutions प्रदर्शन और यह सुनिश्चित करने के लिए कि प्रति अच्छी तरह से कोशिकाओं की एक पर्याप्त संख्या है करने के लिए प्रति थाली 4x दोहराएं । 5% सह2के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते हैं ।
  3. २ २४ में क्लोनी कोशिकाओं का विस्तार-अच्छी तरह से प्लेटों, तो एक 6-अच्छी थाली में, और अंत में एक T75 flask में । आदेश में क्लोन के तीन पर ध्यान केंद्रित करने के लिए, प्लेट 2 x 106 कोशिकाओं के प्रति अच्छी तरह से एक 6-clones के तीन के लिए थाली । प्लेट अन्य तीन कुओं को नियंत्रण के रूप में nontransduced जुळकत कोशिकाओं के साथ । कोशिकाओं को एक सेल कल्चर इनकोबेटर में रातोंरात डाल दें ।
  4. आरएनए निष्कर्षण के लिए, एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आरएनए आइसोलेशन किट का उपयोग करें । कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए २३३ एक्स जी पर कोशिकाओं नीचे स्पिन और मीडिया को हटा दें । lysis बफर के ३५० μl में कोशिकाओं resuspend करने के लिए एक 1 मिलीलीटर पिपेट टिप का उपयोग करें । लीजड ड कोशिकाओं के लिए ७०% इथेनॉल के ३५० μl जोड़ें, एक 1 मिलीलीटर पिपेट के साथ अच्छी तरह से मिश्रण है, और आरएनए कॉलम के लिए नमूना हस्तांतरण ।
  5. 1 मिनट के लिए १०,००० एक्स जी पर lysates स्पिन, प्रवाह के माध्यम से हटाने के लिए, और किट से कॉलम में कम-चिपचिपा धोने बफर के ७०० μl जोड़ें । 1 मिनट के लिए १०,००० एक्स जी पर lysates स्पिन, प्रवाह के माध्यम से हटाने के लिए, और dnase मैं किट से स्तंभ के लिए समाधान के ८० μl जोड़ें; नमूनों को कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए सेते हैं ।
  6. 1 मिनट के लिए १०,००० एक्स जी पर lysates स्पिन, प्रवाह के माध्यम से हटाने के लिए, और स्तंभ के लिए किट से उच्च-चिपचिपा धोने बफर के ७०० μl जोड़ें । 1 मिनट के लिए १०,००० एक्स जी पर lysates स्पिन, प्रवाह के माध्यम से हटाने के लिए, और स्तंभ के लिए कम-चिपचिपा धोने बफर के ७०० μl जोड़ें ।
  7. संग्रह ट्यूब से कॉलम निकालें और इसे एक नए संग्रह ट्यूब पर स्थानांतरित करें । 1 मिनट के लिए १०,००० एक्स जी पर lysates स्पिन और, फिर, एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब के लिए आरएनए कॉलम हस्तांतरण । स्तंभ के लिए पानी की ५० μl जोड़ें और 1 मिनट के लिए १०,००० एक्स जी पर स्पिन ।
  8. आरएनए की एकाग्रता को मापने के लिए स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करें । अपेक्षा एकाग्रता 100-500 एनजी/μl के बीच होने के लिए, 1.9-2.1 के बीच एक 260/280 absorbance के साथ । आरएनए को-८० डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
  9. २५० μl ट्यूबों में, 1 μg का आरएनए, पूरक डीएनए का 4 μl (सीडीआई) संश्लेषण बफर, 1 μl का रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन, और पानी को 20 μl की अंतिम मात्रा में जोड़ें । कोई रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज नियंत्रण शामिल नहीं है । एक थर्मल cycler में, 30 मिनट के लिए ४२ डिग्री सेल्सियस पर cdna synthesize और रिवर्स transcriptase सूचनाको करने के लिए 5 मिनट के लिए ९५ डिग्री सेल्सियस पर । संश्लेषण के बाद पानी के ६० μl के साथ cdna को पतला करना ।
  10. पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रियाओं (pcrs) sybr ग्रीन, cdna के 4 μl, ०.५ μl के फॉरवर्ड प्राइमर (10 μm), और रिवर्स प्राइमर (10 μm) के ०.५ μl युक्त 5 μl वाले तैयार करें । पीसीआर को निम्नानुसार चलाएं: चरण 1 = ९५ ° c 3 मिनट के लिए, चरण 2 = ९५ ° c 10 s के लिए, चरण 3 = ६० ° c 10 s के लिए, और फिर, 30x के लिए चरण 2 और 3 दोहराएं ।
    नोट: dCas9 आगे प्राइमर के लिए अनुक्रम है 5 '-tcgccacagcataaagaaga और dCas9 रिवर्स प्राइमर के लिए अनुक्रम है 5 '-cttttcatggtacgccacct. हाइपोजैन्टाइन फॉस्फोरिबोसिल्ट्रांसट्रांस्टेस 1 (HPRT1) के लिए फॉरवर्ड प्राइमर 5 '-gaccagtcaacaggacat और रिवर्स प्राइमर 5 ' है-gcttgcgaccttgaccatct ।

5. grna transduction, चयन, क्लोन निर्माण, और स्क्रीनिंग

  1. धारा 3 में उल्लिखित के रूप में grna-युक्त वायरस के साथ सत्यापित jurkat-dCas9 कोशिकाओं retransduce. dmem में hygromycin (पूरक तालिका 1) के साथ 10 दिनों के लिए कक्षों का चयन करें । कक्षों को स्पिन करें और मीडिया को हर 3 दिन में बदलें ।
  2. (चरण ४.२ में वर्णित के रूप में) कक्षों की एक सीरियल कमजोरियां निष्पादित करें और (चरण ४.३ में वर्णन किया गया के रूप में) व्यक्तिगत कालोनियों का विस्तार । बिल्कुल के रूप में वर्णित कालोनियों से आरएनए शुद्ध ४.५ और चरण ४.९ में वर्णित के रूप में cdna संश्लेषण करते हैं । भारत सरकार और HPRT1 या एक उचित हाउसकीपिंग जीन के खिलाफ वास्तविक समय पीसीआर प्रदर्शन, इसी तरह इस मामले में, चरण 3 के बाद कुओं प्रत्येक चक्र छवि को छोड़कर, कदम ४.१० में वर्णित पीसीआर के लिए ।
  3. भारत सरकार के8में गुना परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए तुलनात्मक चक्र थ्रेशोल्ड (Ct) विधि का उपयोग करें । संक्षेप में, सापेक्ष प्रतिलिपि स्तर (rtls) की गणना करने के लिए निम्न समीकरण का उपयोग करें: 2-(भारत सरकार की औसत सीटी – हाउसकीपिंग जीन की औसत सीटी). फिर, नियंत्रण नमूनों की तुलना में एक गुना परिवर्तन उत्पन्न करने के लिए नियंत्रण के औसत rtl की गणना और औसत नियंत्रण rtl द्वारा सभी rtl मूल्यों को विभाजित.

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Representative Results

lncrna ifng को ओवरएक्सप्रेस करने के लिए एक दोहरी सदिश प्रणाली-AS1
इस पांडुलिपि में उदाहरण प्रयोग एक jurkat टी सेल मॉडल lncrna ifng-AS19व्यक्त प्रणाली की overexpression है । ifng-AS1 भड़काऊ आंत्र रोग के साथ जुड़े एक lncrna है, कि इंटरफेरन गामा10को विनियमित करने के लिए देखा गया है. ifng-AS1 जीन तीन ब्याह वेरिएंट है कि सभी एक ही transcriptional शुरू साइट (चित्रा 1a) का उपयोग होता है । इसलिए, grna अनुक्रम कि 10 और १०० bp transcriptional प्रारंभ साइट से दूर थे और एक "ngg" अनुक्रम अपस्ट्रीम ifng-AS1 (चित्र 1a) के transcriptional लोकस के लिए Cas9-सक्रिय करने के लिए जटिल निर्देशन के लिए उपयोग किया गया था । एक दो प्लाज्मिड प्रणाली के रूप में कोशिकाओं में या तो dCas9 या grnas/enhancers transduce इस्तेमाल किया गया था एक एकल प्लाज्मिड अकेले वायरल कण पीढ़ी मुश्किल प्लाज्मिड आकार के कारण (चित्रा 1b) बनाता है । डबल transduced कोशिकाओं के चयन को सक्षम करने के लिए, dCas9 वेक्टर एक प्रोमाइसिन (एमिनोन्यूक्लिओसाइड) प्रतिरोध जीन निहित, और grna युक्त प्लाज्मिड एक hygromycin (aminoglycoside) प्रतिरोध जीन निहित. grnas एक MS2 पाड़ अनुक्रम है कि MS2 पाड़ प्रोटीन के लिए grnas बांध सक्षम जुड़े हुए थे । MS2 प्रोटीन के लिए fused ifng-AS17की overexpression बढ़ाने के लिए अतिरिक्त transcriptional activators हैं । इन वैक्टर का उपयोग करना, वायरल कणों को सबसे मानव कोशिका लाइनों में इस overexpression प्रणाली transduce बनाया जा सकता है ।

वायरल हुई टिटरिंग और कॉलोनी की स्क्रीनिंग
dCas9 पैदा करने के बाद-और grna-युक्त plasmids, प्लाज्मिड शुद्धिकरण प्रदर्शन किया गया और मसूर के वायरस बनाए गए थे । के रूप में रेतीवायरस बेतरतीब ढंग से जीनोम में अपने कैसेट को एकीकृत, वायरल कणों की संख्या का एक परिमाणन संभव एकीकरण की संख्या में सक्षम बनाता है । यह पूरा करने के लिए, वातानुकूलित-मीडिया युक्त वायरस एक p24 elisa किट के साथ मापा गया, milliliter प्रति virions की संख्या की गणना के लिए अनुमति दी । मापने के बाद, दोनों वायरल supernatants p24 के लगभग 1 μg/एमएल था, जो की अनुमति दी १०० μl वायरस के उपयोग के लिए jurkat कोशिकाओं transduce. transduction के बाद, एंटीबायोटिक-चयनित कोशिकाओं प्रश्नपत्र पतला था और क्लोन का विस्तार किया गया । Cas9 अभिव्यक्ति तो वास्तविक समय पीसीआर और agarose जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस (चित्रा 2b) द्वारा विश्लेषण किया गया था । चयनित दोनों क्लोन Cas9 अभिव्यक्ति के लिए सकारात्मक थे । mrna अभिव्यक्ति की पुष्टि करने के लिए, रिवर्स ट्रांस्क्रिप्टेज़ cdna प्रतिक्रिया (चित्रा 2b) से छोड़ा गया था । HPRT1 के खिलाफ प्राइमर्स nontransduced कोशिकाओं में आरएनए की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया गया ।

ifng-AS1 जीन अभिव्यक्ति को मापने
एक पैतृक सेल लाइन के रूप में dCas9 क्लोन का प्रयोग, कोशिकाओं या तो एक nontargeting grna युक्त वायरस या एक ifng-AS1 के खिलाफ grna युक्त वायरस के साथ transduced थे । grna transduction, चयन, और क्लोन निर्माण dCas9 सेल लाइन निर्माण के अनुरूप के बाद, ifng-AS1 अभिव्यक्ति overexpression सत्यापित करने के लिए मापा गया था । ifng-AS1 तीन ब्याह वेरिएंट पैदा करता है, जिनमें से प्रत्येक के साथ व्यक्तिगत रूप से पता लगाया जा सकता है प्रतिलिपि-विशिष्ट प्राइमर्स (लाल) या सभी ज्ञात ifng-AS1 transcript (नीला) (चित्रा 3a) के खिलाफ । सभी प्रतिदीप्ति वक्रों को नियंत्रण और ifng-AS1-grna-एक्सप्रेस कोशिकाओं (चित्रा 3b, सी) के बीच एक आधे चक्र के भीतर घातीय चरण (या, सीटी) तक पहुंचने के HPRT1 के साथ घातीय थे । सभी ज्ञात ifng-AS1 टेप के खिलाफ primers ifng-AS1 (चित्रा 3b) में 20 गुना बढ़ जाती है की माप के साथ प्रयोगों के बीच सबसे detectable थे । जबकि 1 और 2 के खिलाफ टेप के खिलाफ प्राइमरों सफलतापूर्वक परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं में प्रवर्धित (pbmcs), इन टेप jurkat कोशिकाओं में detectable नहीं थे (डेटा नहीं दिखाया गया). हालांकि, जब ifng-AS1 की तीसरी प्रतिलिपि केंद्रित आरएनए में detectable था, एक पांच-ifng-AS1 के स्तर में महत्वपूर्ण वृद्धि दस गुना देखा गया था । इन आंकड़ों का सुझाव है कि या तो वैकल्पिक splicing ifng-AS1 की प्राथमिक कोशिकाओं की तुलना में जुळकत कोशिकाओं में मौजूद हैं । ifng के खिलाफ primers-AS1 इस जीन में बड़ी वृद्धि का पता चला, जिससे सक्रिय crispr overexpression प्रणाली मान्य.

Figure 1
चित्रा 1: एक दोहरी वेक्टर प्रणाली lncrna ifng-AS1 ओवरएक्सप्रेस करने के लिए । (क) आईएफएनजी-AS1 जीन संरचना और गाइड आरएनए (grna) बाध्यकारी साइटों और transcriptional शुरू साइट (tss) के बीच संबंध के एक योजनाबद्ध । (ख) grna और dCAS9 वैक्टर की विशेषताएं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: वायरल टिटरिंग और कॉलोनी स्क्रीनिंग । (क) एक उदाहरण p24 के लिए elisa मानक वक्र-युक्त, वातानुकूलित मीडिया । काले डॉट्स मानक नमूने और लाल डॉट्स अज्ञात नमूनों का प्रतिनिधित्व करते हैं । (ख) transducing के बाद, चयन, और पैदा कालोनियों, dCas9 के खिलाफ वास्तविक समय पीसीआर और जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस या तो nontransduced जुळकत कोशिकाओं (माता पिता) या dCas9 transducing क्लोन से आरएनए पर प्रदर्शन किया गया । कोई उल्टे ट्रांस्क्रिप्टेज़ (कोई RT) नियंत्रण नहीं किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: ifng-AS1 जीन अभिव्यक्ति को मापने. (क) प्राइमर सेट्स और ट्रांसक्रिप्ट वेरिएंट के बीच के संबंध का आरेख । लाल तीर ट्रांसक्रिप्ट-विशिष्ट प्राइमर्स का प्रतिनिधित्व करते हैं, जबकि नीले तीर सभी ज्ञात ट्रांस्क्रिप्ट्स के विरुद्ध प्राइमर्स का संकेत देते हैं । (B और C) प्रतिनिधि औसत पीसीआर घटता है और नियंत्रण और ifng-AS1-overexpressing कोशिकाओं के लिए गुना-परिवर्तन quantifications । rfu = सापेक्ष प्रतिदीप्ति इकाइयों । N = 3 प्रति समूह नमूने । माध्य ± SD. *p < ०.०५, * * *p < ०.००१. पी-मानों की गणना के लिए किसी छात्र का टी-टेस्ट किया जाता था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

पूरक चित्रा 1: grna डिजाइन कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक चित्रा 2: blat कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक तालिका 1: समाधान कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

पूरक तालिका 2: एलिसा dilutions कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

इस पांडुलिपि को सक्रिय करने crispr का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है विट्रो में lncrnas overexpress । यह एक विशेष रूप से महत्वपूर्ण तकनीक है जब लंबे समय तक noncoding rnas का अध्ययन के रूप में transcriptomic उत्पाद कार्यात्मक इकाई है. ओवरएक्सप्रेशन के बाद, शोधकर्ता, फिर, बाइंडिंग भागीदारों का अध्ययन करते समय सिग्नल-से-शोर अनुपात को बढ़ाने के लिए इन कोशिकाओं का उपयोग कर सकते हैं और यहां तक कि एलएनसीआरएनएएस के स्तर में वृद्धि के सेलुलर परिणामों को मापने । साथ ही, lncrnas अक्सर सीआईएस-जीन पर कार्य के रूप में, इस अंतर्जात overexpression तकनीक इन घटनाओं का अध्ययन किया जा करने के लिए सक्षम बनाता है11,12.

इस पांडुलिपि grna निर्माण और मसूर की दाल पीढ़ी, transduction, और चयन के लिए एक सामान्यीकृत प्रोटोकॉल पर प्रकाश डाला गया, और एक परिधीय रक्त टी सेल लाइन में lncrna overexpression का एक प्रतिनिधि उदाहरण रेखांकित किया गया था । इसके अतिरिक्त, इस तकनीक को पहले से ही अस्थि-मज्जा में सफल होने के लिए दिखाया गया है-प्रतिरक्षा कोशिकाओं13व्युत्पंन, ंयूरॉंस7, माउस भ्रूण स्टेम सेल14, और गुर्दे उपकला कोशिकाओं4। हालांकि यह प्रोटोकॉल आमतौर पर अधिकांश सेल लाइनों के लिए लागू होता है, लेकिन जिन कोशिकाओं को ट्रांसड्यूस करना मुश्किल होता है, उन्हें उच्च संक्रमण दरों को सक्षम करने के लिए व्यक्तिगत titers की आवश्यकता हो सकती है । इसके अतिरिक्त, यह एंटीबायोटिक मार घटता प्रदर्शन जब नए सेल लाइनों का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है, के रूप में इस प्रोटोकॉल एक सकारात्मक चयन रणनीति का इस्तेमाल करता है ।

नोट की, इस प्रोटोकॉल कई तकनीकी पहलुओं है कि विशेष ध्यान देने की आवश्यकता है । प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और रीयल-टाइम पीसीआर के लिए लगातार पिटिंग Reproducible परिणाम स्थापित करने के लिए महत्वपूर्ण है । संस्करणों में भी छोटे मतभेद अत्यधिक चर मूल्यों का कारण होगा, जिससे व्याख्या मुश्किल बना. एक उचित मात्रात्मक पीसीआर प्राइमर डिजाइन के अलावा, नियंत्रण, नहीं रिवर्स-वास्तविक समय पीसीआर primers के लिए transcriptase नियंत्रण सहित, महत्वपूर्ण है के रूप में वे पुष्टि करते है कि आरएनए मात्रा निर्धारित जा रहा है जीनोमिक डीएनए नहीं है । रीयल-टाइम पीसीआर के लिए हाउसकीपिंग जीन का चयन भी महत्वपूर्ण है ताकि इन प्रयोगों को पर्याप्त रूप से निष्पादित कर सकें । जबकि HPRT1 इस प्रोटोकॉल में चुना गया था, इस तकनीक द्वारा लक्षित हितों के अंय जीन15HPRT1 बदल सकता है । इन कारकों के आधार पर हाउसकीपिंग जीन का सावधानीपूर्वक चयन ध्यान में रखा जाना चाहिए ।

इस प्रोटोकॉल के crispr और विशेष पहलुओं को सक्रिय करने के लिए कुछ कमियां हैं । एक संभावित सीमा अन्य पड़ोसी जीन के रूप में अत्यधिक जीन समृद्ध क्षेत्रों में टेप की अभिव्यक्ति है चालू किया जा सकता है. यह संभव है कि निकट निकटता में पड़ोसी जीन सक्रिय किया जा सकता है और नियंत्रण के लिए यह आकलन किया जाना चाहिए । इसके अलावा, अन्य सीमाओं एक दिए गए डीएनए अनुक्रम के लिए विशेष grnas के लिए बाध्यकारी की कमी शामिल. एकाधिक grnas के चयन अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए उपयुक्त grnas की पहचान करने के लिए आवश्यक हो सकता है. प्रणाली के लिए एक और चेतावनी है कि ब्याज की सेल के लिए कैसेट में प्रवर्तकों ड्राइव क्रम में grnas और dCas9 की अभिव्यक्ति ड्राइव करने की क्षमता है । यहाँ प्रस्तुत अध्ययन के लिए, ज़रकत टी-सेल मॉडल एक सफल ओवरएक्सप्रेशन प्रणाली के लिए इन घटकों की अभिव्यक्ति को ड्राइव करने में सक्षम था ।

आदर्श रूप में, यहां वर्णित प्रोटोकॉल के साथ युग्मित किया जाना चाहिए अंय जानकारी, जैसे कि एकल प्रतिलिपि overexpression डेटा और कार्यात्मक प्रभाव पछाड़ना या पीटकर अध्ययन से, बाद के निष्कर्षों में से किसी के लिए मामला सिलेंडर । यह तकनीक किसी विशेष सेल प्रकार में किसी भी जीन को ओवरएक्सप्रेस करने का दमदार तरीका पेश करती है । इस तरह के गरीब प्रजातियों के संरक्षण के रूप में lncrna जीव विज्ञान की सीमाओं को देखते हुए, तकनीक जैसे यहां वर्णित एक प्रासंगिक सेल प्रकार में अपने समारोह की खोज के लिए महत्वपूर्ण हैं । यह एक lncrna कि भड़काऊ आंत्र रोग पैथोफिजियोलॉजी में फंसाया गया है पर ध्यान केंद्रित अध्ययन लेकिन मानव रोग जीव विज्ञान में अन्य lncrna के समारोह का अध्ययन करने का एक मॉडल के रूप में कार्य करता है.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

C.P. RO1 DK60729 और P30 DK 41301-26 द्वारा समर्थित है । D.P. एक crohn & कोलाइटिस फाउंडेशन (ccfa) कैरियर विकास पुरस्कार, चिकित्सा द्वारा समर्थित है: पाचन रोग अनुसंधान केंद्र (ddrc) DK41301, और ucla नैदानिक और translational विज्ञान संस्थान (ctsi) UL1TR0001881 । ucla वायरोलॉजी कोर एड्स अनुसंधान के केंद्र (cfar) अनुदान 5p30 AI028697 द्वारा वित्त पोषित किया गया । ucla एकीकृत आणविक प्रौद्योगिकियों कोर इलाज/P30 अनुदान DK041301 द्वारा समर्थित किया गया था । इस कार्य का भी उकलआ एड्स संस्थान ने समर्थन किया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ampicillin Fisher Scientific BP1760-5
CaCl2 Sigma Aldrich C1016
cDNA synthesis kit (iScript) BioRad 1708891
dCas9 forward primer Integrated DNA Technologies n/a 5'-TCGCCACAGCATAAAGAAGA 
dCas9 reverse primer Integrated DNA Technologies n/a 5'-CTTTTCATGGTACGCCACCT
dCas9 vector Addgene 50918
DMEM Corning 10013CM
Ethanol Acros Organics 61509-0010
FBS Sigma Aldrich F2442
gRNA plasmid VectorBuilder VB180119-1195qxv
HEK293T cells ATCC  CRL-1573
HEPES Sigma Aldrich H3375
HPRT1 forward primer Integrated DNA Technologies n/a GACCAGTCAACAGGGGACAT 
HPRT1 reverse primer Integrated DNA Technologies n/a GCTTGCGACCTTGACCATCT
Hygromycin B Corning MT3024CR
Isopropanol Fisher Scientific BP2618-500
Jurkat cells ATCC  TIB-152 clone E6-1
L-glutamine Corning 25005Cl
LB agar Fisher Scientific BP1425-500
LB broth Fisher Scientific BP1426-2
Maxi-prep kit (Plasmid Purification Kit) Qiagen 12362
Na2HPO4 Sigma Aldrich NIST2186II
Optimem I reduced serum media  Gibco 31985070
p24 elisa Perkin Elmer NEK050B
PBS Corning 21-040-CMR
Penicillin and Streptomycin Corning 30-002-Cl
pMDG2.G Addgene   #12259
pMDLg/pRRE Addgene  #60488
Poly-L-Lysine Sigma Aldrich P-4832
Polybrene EMD Millipore TR-1003
pRSV-REV Addgene #12253
Puromycin dihydrochloride Sigma Aldrich P8833
RNA purification kit (Aurum RNA mini) BioRad 7326820
Sodium Butyrate Sigma Aldrich B5887
SYBR green (iTaq universal) BioRad 1725122
Triton X-100 Sigma Aldrich X100

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References

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आनुवंशिकी मुद्दा १४५ lncrna crispr ifng-AS1 ओवरएक्सप्रेशन लेंवायरल रीयल-टाइम पीसीआर
लंबे noncoding rnas का उपयोग करके overexpressing जीन सक्रिय crispr
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Rankin, C. R., Treger, J.,… More

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