Summary
전통적인 cDNA 기반 overexpression 기법 때문에 잠재적인 기능을 가진 그들의 여러 결합 형태 긴 noncoding RNAs의 overexpression에 대 한 제한 적용을 했습니다. 이 리뷰 긴 noncoding RNA의 여러 스플라이스 변종 overexpress CRISPR 기술을 사용 하 여 프로토콜을 보고 합니다.
Abstract
긴 noncoding RNA (lncRNA) 생물학 연구, 2007 년 이후 기 하 급수적으로 성장 하는이 분야에서 간행물의 수의 새롭고 흥미로운 분야 이다. 이러한 연구는 lncRNAs 거의 모든 질병에 변경 되는 것 확인 했습니다. 그러나, 질병의 맥락에서 lncRNAs에 대 한 기능적 역할을 공부 하 고 단백질 제품, 조직의 특정 식, 낮은 식 레벨, 결합 한 형태로, 복잡 한의 부족 종 가운데 보존의 부족으로 어려운 남아 있다. 감안할 때 종의 식, lncRNA 연구는 종종 인간의 연구 컨텍스트 제한 질병 과정 공부를 할 때. LncRNAs는 분자 수준에서 작동, 이므로 lncRNA 생물 해 부 방법 중 하나는 lncRNA를 제거 하거나 overexpress lncRNA 및 측정 세포 효과. 이 문서에서는, 생체 외에서 lncRNAs overexpress을 작성 하 고 시각화 된 프로토콜 제공 됩니다. 대표적인 실험으로는 lncRNA 선 동적인 장 질병, 인터페론 감마 Antisense 1 (IFNG-AS1)와 관련 된 Jurkat T 세포 모델에 overexpressed에 표시 됩니다. 이 위해 활성화 클러스터 정기적으로 interspaced 짧은 구조 반복 (CRISPR) 기술은 overexpression 생 게놈 loci에서 사용할 수 있도록 사용 됩니다. 활성화 CRISPR 기술 대상 transcriptional 시작 사이트 여러 lncRNA 결합 형태의 강력한 overexpression를 활성화 한 유전자의 녹음 방송 요인의 집합. 이 절차 3 단계, 즉 (i) 가이드 RNA (gRNA) 디자인 및 벡터 건설, (ii) 바이러스 생성 및 변환, 및 (iii) 식민지 심사 overexpression에 대 한으로 세분화 될 것 이다. 이 대표적인 실험에 대 한 20-fold 향상 IFNG-AS1 Jurkat T 세포에서에서 관찰 되었다 보다는.
Introduction
가장 생물 의학 연구는 단백질 코딩 성적표를 중점적으로, 베낀된 유전자의 대다수는 실제로 noncoding RNAs (합 자료 93)의 구성 됩니다. 현재 연구는 2007 년과 20171사이 기 하 급수적으로 상승 하는 질병 과정에서 lncRNAs에 간행물의 수와 함께이 필드를 탐험 시작 됩니다. 이 간행물은 많은 lncRNAs 질병와 관련 된 보여 줍니다. 그러나,이 lncRNAs의 분자 메커니즘은 mRNAs에 비해 그들의 다양 한 기능으로 인해 공부 하기가 어렵습니다. LncRNAs 질병에서의 역할 이해의 문제를 다중, lncRNAs 주로 코딩 RNAs2보다 하위 수준에 표시 됩니다. 또한, lncRNAs는 가난 하 게 보존, 인간의 세포 라인 기반 기술3기능 연구를 제한 하. 이 비 발한 유전자의 메커니즘을 연구 한 방법은 endogenously 경작된 한 세포에 overexpress 것입니다. Overexpression 학문 특정 한 유전자의 기능으로 중요 한 정보를 제공 하 고 연구원은 주요 분자 경로 해 부를 수 있도록 수 있습니다.
LncRNA 유전자의 전사를 활성화 하는 새로운 방법은 게르 바흐 연구소4에 의해 처음 개발 하는 CRISPR 기술을 기반으로 합니다. 이 프로토콜은 lncRNA 생물학에서 사용 하 고 다른 모델 시스템에서이 유전자의 표현에 대 한 적응 되었습니다. 기술 overexpressing CRISPR에서 CRISPR 관련 단백질 9 (Cas9) 이라고 불리는 단백질 Cas9에 의해 인식 되는 센스 gRNA 통해 DNA 시퀀스를 향해 이동 수 있습니다. 일반적으로, Cas9 DNA 분열;을 유발 한다 그러나, Cas9, 이전 overexpression 기술에 대 한 개발에 변이이 단계5를 비활성화 합니다. "죽은" Cas9에 transcriptional 활성 제를 융합 하는 때 (dCas9) 셀 라인으로 불리고, lncRNAs의 생 overexpression 수 달성된4,6. DCas9 유전자 활성화 시스템의 효능을 증가 하는 gRNA, gRNA에 바인딩할 추가 transcriptional 요소 사용에 대 한 추가 수정 추가 사진7. 중요 한 것은, 그것 transcriptional 활성화 근접에서는 시연 했다 (< 200 bp)는 transcriptional 시작 사이트 유전자, 유전자 풍부한 지역7에 특정 upregulation를 사용. CRISPR 녹아웃 기술, 달리 dCas9 및 gRNA 카세트는 여러 세대에 걸쳐 overexpression를 유지 하기 위해 셀 수 있도록 게놈으로 통합 될 필요가 있다. 이를 위해 한 가지 방법은 dCas9 및 gRNA 포함 된 카세트를 통합 lentiviruses를 사용 하는 것입니다. 통합 후 lncRNA 유전자 발현을 확인할 수 있습니다.
이 문서에서는, lncRNA overexpression Jurkat T 세포 모델에 대 한 프로토콜 시연 됩니다. 단계별 절차는 표시 되 고 또한 부착 셀에 적용할 수 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
참고: 이 프로토콜에서는 복제 불충분 한 lentiviruses 중요 하다. 적절 한 실험실 안전 훈련 후에 바이러스 처리를 수행 합니다. 모든 항목 및 표면 처리 후 최소 10 분에 대 한 라이브 바이러스 접촉에 표 백제. 사용 일회용 랩 코트와 얼굴/눈 보호로 이중 장갑, 항상. Biosafety 수준 2 + 실험실 바이러스 인증 바이러스 작업을 수행 합니다. 바이러스 성 일 조직 문화 후드와 인큐베이터를 칩니다.
1. 벡터 디자인 및 생성
참고: GRNA 시퀀스를 식별 하는 가장 좋은 방법은 온라인 설계 도구 (예: http://crispr-era.stanford.edu)을 사용 하는 것입니다 (보충 그림 1: gRNA 디자인). 함께 대표적인 실험에 대 한 회사는 설계 및 대표 실험에 사용 된 gRNA 벡터를 만든. DCas9 플라스 미드 또한 온라인 구입 했다.
- GRNA 순서는 뉴클레오티드 순서 "NGG", 여기서 "N"은 또한 transcriptional 시작 사이트의 100의 기본적인 쌍은 어떤 뉴클레오티드의 상류 위치 이다. GRNA 시퀀스 비슷한 시퀀스 게놈에 있는 다른 사이트 되도록 BLAT (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start) 같은 유전자 데이터베이스 검색 (보충 그림 2: 공격기). 이렇게 하면 gRNA 시퀀스 (GOI)의 유전자에 고유 하다는 것.
- 4 ° c.에 세균성 명세서로 서 gRNA와 dCas9 플라스 저장 국물 (파운드) 천 암 피 실린 (보충 표 1)와 함께 접시 하 고 37 ° c.에 하룻밤 박테리아 성장 Luria에 대장균 에 밖으로 행진
- 식민지를 선택 하 고 37 ° C 배양 기에서 접시를 적극적으로 떨고 암 피 실린 (보충 표 1),와 파운드의 5 mL에 박테리아를 성장. 다음 날, 추가의 2 mL 암 피 실린과 파운드의 200 mL에 박테리아가 적극적으로 37 ° C 배양 기에서 하룻밤 플라스 크를 흔들어 2 L 플라스 크에 성장.
- 3,724 x g 20 분 제거 미디어에 박테리아와 장소 얼음에 박테리아를 포함 하는 튜브 아래로 회전 합니다.
-
제조 업체의 프로토콜 당 플라스 미드 정화 키트를 사용 하 여 세균성 DNA를 정화.
참고: 소유 물의 resuspension 버퍼, 세포의 용 해 버퍼, 워시 버퍼, 재래식 버퍼 및 차입 버퍼를 포함 하는 플라스 미드 정화 장비.- 물의 resuspension 버퍼의 10 mL 키트에서 박테리아를 피펫으로 박테리아에 추가 솔루션. 그런 다음, 키트에서 resuspended 박테리아 세포의 용 해 버퍼의 10 mL를 추가 하 고 튜브를 거꾸로 하 여 그들을 혼합. 5 분; 박테리아를 lyse 기다립니다 다음, lysed 박테리아 키트에서 차가운 중화 버퍼의 10 mL를 추가 하 고 튜브를 거꾸로 하 여 그들을 믹스.
- 재래식 5 분 부 DNA 열에 샘플 필터 고 필터를 통과 하는 솔루션에 대 한 버퍼의 10 mL와 키트에서 DNA 열 equilibrate
- 워시 샘플 2의 30 mL x 버퍼를 세척 하 고, 다음, 15 mL 원뿔 튜브에 차입 버퍼의 30 mL와 함께 DNA elute. 소 프로 파 놀 eluted DNA에 실 온에서의 10.5 mL를 천천히 레이어, 튜브, 반전 및 즉시 16200 x g 4 ° c.에 30 분에서 그것을 회전합니다
- 제거는 상쾌한 고 DNA 펠 릿을 70% 에탄올의 1 mL를 추가 합니다. 튜브를 터치 하 여 펠 릿을 resuspend. 16200 x g 4 ° C에서 10 분에서 그것을 회전 하 고 200 μ 피펫으로 팁을 사용 하 여 에탄올의 대부분을 제거. 5 분 동안 펠 릿 건조 하 고 물, 200 μ에 resuspend-20 ° c.에 DNA를 저장 예상된 농도 됩니다 > 1 μ g/μ.
2. 바이러스 생성 및 입자 수
- 때를 포함 하는 dCAS9 lentivirus를 만드는 준비, 100 m m 조직 문화 요리 0.01% 폴 리-L-리 신 (보충 표 1)의 5 mL와 코트. 철저 하 게 격판덮개에서 과잉 액체를 제거 하 고 그들이 biosafety 캐비닛에 몇 분 동안 공기가 건조.
- 플레이트 5 x 106 HEK 293T 세포 완전 한 Dulbecco의 10 mL에 접시 당이 글의 중간 (DMEM) (보충 표 1)을 수정 하 고 하룻밤 5% CO2와 37 ° C에서 품 어. 다음 날, HEK 293T 요리에서 매체를 제거 하 고 완전 한 DMEM의 10 mL을 추가.
- 플라스 미드 pMDLg/pRRE 개 그/폴 (바이러스의 구성 요소), 포함 된의 μ g 믹스 6.5 VSV G (바이러스의 구성 요소)를 포함 하는 플라스 미드 pMDG2.G의 3.5 μ g 2.5 µ g 포함 하는 플라스 미드 pRSV-레 브의 계 (바이러스의 구성 요소), 긴 단말기 반복 (10 μ g LTR)-벡터 gRNA 벡터 또는 LTR 포함 된 dCas9를 포함 하 고 450 μ의 전체 볼륨에 물을 추가. 0.2 µ m 필터 팁 주사기에 부착을 통해 혼합물을 필터링 합니다.
- DNA의 각 transfection 샘플을 2.5 M CaCl2 (보충 표 1)의 50 µ L을 추가 하 고 부드럽게 혼합. 0.2 µ m 필터 팁 주사기에 연결 된 통해 칼슘/DNA 혼합물을 필터링 합니다. 피펫으로 500 µ L의 5 mL 폴리스 티 렌 튜브에 2 x HBS (보충 표 1). 추가 500 µ L DNA/CaCl2 믹스 dropwise 부드럽게 소용돌이. 3 분 동안 실 온에서 품 어.
- 천천히 각 접시를 DNA/CaCl2/HBS 서 스 펜 션의 1 mL를 추가 합니다. 즉시 요리를 균등 하 게 내용을 소용돌이 친다. 37 ° c.에 5% CO2 배양 기에서 하룻밤 각 접시를 품 어
- 3 일에 천천히 제거 하 고 요리에서 미디어를 삭제. 신중 하 게 씻어 세포 1 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)와 x. 완전 한 DMEM 20 mM HEPES와 10mm 나트륨 낙 산 염 보충의 6 mL를 추가 합니다. 37 ° c.에 5% CO2 배양 기에서 5-6 h에 대 한 셀을 품 어
- 1 세포를 씻어 PBS 가진 x HEK 293T 세포에 20 mm HEPES 완전 한 DMEM의 5 mL을 추가. 37 ° c.에 5% CO2 배양 기에서 하룻밤 12 h에 대 한 품 어
- 하루에 4, HEK 293T 세포 supernatants 수집 하 고 필터링 하는 상쾌한. 1 mL aliquots-80 ° c.에 고정
- 때 사용 하는 바이러스, 바이러스 성 입자를 포함 하는의 약 수를 녹여 준비 얼음에 (에서 설명한 단계 2.8로 저장 된) 미디어를 조절. 실내 온도에 모든 시 약을 가져다.
-
P24 Enzyme-Linked Immunosorbent 분석 결과 (ELISA) 키트를 사용 하 여 계량 밀리 리터 당 바이러스 입자의 수 있습니다.
- 이온을 제거 된 증류수의 19 부분을 추가 하 여 키트에서 세척 농축액을 희석. 키트에서 긍정적인 컨트롤 200 ng/mL을 희석, 희석제, 및 확인 RMPI 1640을 사용 하 여 1.5 mL에 표준 곡선에 대 한 희석 튜브는 p24 따라 ELISA 희석 표 (보충 표 2).
- 추가 5%의 20 μ 빈 기판 제외 하 고 모든 우물에 트라이 톤 X-100. 부정적인 통제 우물에 RPMI 1640의 200 μ를 추가 합니다. 지정 된 웰 스를 (중복)에서 각 표준의 200 μ를 추가 합니다.
- 분 광 광도 계를 사용 하 여 표준 곡선을 사용 하 여 샘플 내의 바이러스의 농도 측정. 1:1,000에서 샘플 희석을 시작 하 고 표준 곡선의 범위 내에 있을 필요에 따라 볼륨을 수정 합니다. 0.5%의 최종 농도에 Triton X-100와 샘플을 희석 하 고 지정 된 웰 스 RPMI 1640에 각 샘플의 200 μ를 추가 합니다. 접시를 봉인 하 고 37 ° c.에 2 h에 그것을 품 어
- 6 접시를 씻고 잘 당 워시 버퍼 x 1의 300 μ x. 접시를 반전 하 고 종이 수건에 그것을 활용 하 여 모든 초과 액체를 제거 합니다. 키트에서 빈 기판 제외 하 고 모든 우물 검출기 항 체의 100 μ를 추가 합니다. 접시를 봉인 하 고 37 ° c.에 1 시간을 위해 그것을 품 어 접시를 세척 하 고, 다음, 접시를 반전 하 고 종이 수건에 그것을 활용 하 여 어떤 과잉 액체를 제거.
- 검출기 항 체를 측정 하기 위하여 사용의 15 분 이내 streptavidin 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP SA)를 준비 합니다. SA-HRP 희석제와 1: 100에 SA HRP를 희석. 희석된 SA HRP를 철저 하 게 혼합 하 고 추가 100 μ 빈 제외 하 고 모든 우물. 밀봉 하 고 상 온에서 30 분 동안 접시를 품 어.
- 워시 버퍼 x 1 접시를 세척 하 고 멀리 단계 2.10.4에서 어떤 초과 액체를 누릅니다. 직교 phenylenediamine (OPD) 기판 솔루션 제공는 과산화 효소 화학 준비 15 분 이내를 생산 하기 위해 필요한 기질을 사용 합니다. 한 OPD 타블렛 기판 희석제의 11 mL를 사용 하 여 각 접시.
- 완전히 녹이 고 빛 으로부터 보호를 적극적으로 OPD 솔루션 소용돌이. 공백을 포함 하 여 모든 우물에 OPD 기판 솔루션의 100 μ를 추가 합니다. 사용 하는 분 광 광도 계, 450에서 흡 광도 읽고 nm는 즉시 1 s 간격이 10 배를 반복 하 고 평균 측량을가지고 가십시오.
3. dCas9-부사장64 변환
- 완전 한 DMEM 미디어의 15 mL에 2 x 106 세포의 밀도와 T75 플라스 크에 있는 문화 Jurkat T 세포. 5% CO2와 37 ° C 배양 기에서 세포 문화.
- 233 x g 에 5 분에 대 한 셀 아래로 회전 시키십시오 그리고, 다음, 감소 된 혈 청 미디어의 10 ml에서 그들을 resuspend. hemocytometer 또는 자동화 된 셀 카운터 셀을 계산 합니다.
- Resuspend 및 polybrene (보충 표 1) T75 플라스 크에 감소 된 혈 청 미디어의 5 mL에 1 x 106 Jurkat 세포 접시. 1 x 106 바이러스 성 입자를 포함 하는 dCas9 포함 된 HEK 293T 조절 미디어를 추가 합니다. 바이러스 성 입자의 수는 p24에서 대략 계산할 수 있다 ELISA 1 μ g/mL p24 같음 1 x 107 바이러스 성 입자 때문에. 5% CO2배양 기 37 ° C에에서는 플라스 크를 넣어.
4. 선택 하 고 복제 생성
- 3 일 후 감염, 233 x g 5 분에 셀 아래로 회전 하 고 완전 한 DMEM puromycin (보충 표 1)와 10 mL에 그들을 resuspend. T75 플라스 크에 세포 격판덮개 그리고 5% CO2와 37 ° C에서 문화. 9 일 동안 3 매일 5 분 233 x g 에서 셀 아래로 회전 하 고 puromycin와 완전 한 DMEM 미디어 바꿉니다.
- hemocytometer 또는 자동화 된 셀 카운터를 사용 하 여 셀을 계산 합니다. 조직 문화 치료 96 잘 접시에 처음에 puromycin와 완전 한 DMEM의 100 μ 접시 10000 셀 잘하고 직렬 희석 1:1 완벽 한 DMEM puromycin와 함께 다음 우물의 내용을. 수행 24 희석 하 고 잘 당 세포의 충분 한 숫자 인지 확인 하기 위해 접시 당 4 x이를 반복 합니다. 5% CO2와 37 ° C에서 세포를 품 어.
- 2 개의 24-잘 접시로 6 잘 플레이트에 그리고 결국 T75 플라스 크에 클론 세포를 확장 합니다. 위해 클론, 클론의 3 6 잘 플레이트의 잘 당 플레이트 2 x 106 세포의 3에 초점. 컨트롤로 nontransduced Jurkat 세포와 다른 3 개의 우물을 접시. 넣어 셀 셀 문화 인큐베이터에서 하룻밤.
- RNA 추출, 상용 RNA 격리 키트를 사용 하 여. 실 온에서 5 분 동안 233 x g 에서 셀 아래로 회전 시키십시오 하 고 미디어를 제거 합니다. 1 mL 피펫으로 팁을 사용 하 여 세포 세포의 용 해 버퍼의 350 μ에 resuspend. Lysed 세포에 70% 에탄올의 350 μ를 추가 하 고 1 mL 피펫으로 철저 하 게 혼합 한 RNA 열 샘플을 전송.
- 1 분 x 10000 g 에서 lysates 스핀, 흐름을 통해 제거 하 고 추가 낮은 엄중 워시 버퍼의 700 μ 키트에서 열. 1 분 x 10000 g 에서 lysates 스핀, 흐름을 통해 제거 하 고 DNase의 80 µ L을 추가 내가 열; 키트에서 솔루션 실 온에서 15 분 동안 품 어 샘플을 보자.
- 1 분 x 10000 g 에서 lysates 스핀, 흐름을 통해 제거 하 고 열에는 키트에서 높은 엄중 워시 버퍼의 700 µ L를 추가. 1 분 x 10000 g 에서 lysates 스핀, 흐름을 통해 제거 하 고 열을 낮은 엄중 워시 버퍼의 700 µ L를 추가.
- 컬렉션 튜브에서 열을 제거 하 고 새로운 컬렉션 튜브에 그것을 전송. 10000 x g 1 분 동안에 lysates 회전 하 고, 다음, 1.5 mL 튜브에 RNA 열을 전송. 1 분 동안 10000 x g 에서 스핀을 물 50 µ L를 추가 합니다.
- RNA의 농도 측정 하는 분 광 광도 계를 사용 합니다. 100-500 ng / µ L, 1.9-2.1 사이 260/280 흡 광도와 사이 농도 기대 합니다. -80 ° c.에 RNA를 저장
- 250 µ L에서 튜브, RNA, DNA (cDNA) 합성 버퍼 보완의 4 µ L, 역전사의 1 µ L의 1 µ g를 추가 하 고 20 µ L의 최종 볼륨을 물 아무 역전사 컨트롤을 포함 합니다. 열 cycler에서 cDNA는 역전사 비활성화를 5 분 동안 95 ° C와 30 분 동안 42 ° C에 음성 합성. 합성 후 물 60 µ L로 cDNA를 희석.
- 중 합 효소 연쇄 반응 (PCRs) SYBR 녹색의 5 µ L, cDNA의 4 µ L, 0.5 µ L의 앞으로 뇌관 (10 µ M), 그리고 반전 뇌관 (10 µ M)의 0.5 µ L을 포함 준비. PCR를 다음과 같이 실행: 1 = 95 ℃ 3 분에 대 한 단계, 단계 2 = 95 ° C 10 s, 단계 3 = 60 ° C에 대 한 10, 고 후, 반복 2 단계와 3 단계 30 x에 대 한.
참고: dCas9 앞으로 뇌관을 위한 순서는 5'-TCGCCACAGCATAAAGAAGA 그리고 dCas9 반전 뇌관을 위한 순서는 5'-CTTTTCATGGTACGCCACCT. Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1)에 대 한 앞으로 뇌관 5'-GACCAGTCAACAGGGGACAT 이며 역 뇌관은 5'-GCTTGCGACCTTGACCATCT.
5. gRNA 변환, 선택, 복제 생성, 및 심사
- 섹션 3에에서 명시 된 포함 하는 gRNA 바이러스 검증된 Jurkat dCas9 셀을 retransduce. 10 일 동안 DMEM hygromycin (보충 표 1)과 셀 선택 합니다. 셀 아래로 회전 시키십시오 그리고 미디어 3 일 마다 변경.
- 셀의 직렬 희석 (4.2 단계에서 설명)를 수행 하 고 (단계 4.3에서에서와 같이) 개별 식민지를 확장 합니다. 4.5 단계에서 설명한 대로 식민지에서 RNA를 정화 하 고 cDNA 합성 단계 4.9에에서 설명 된 대로 수행 합니다. GOI에 대 한 실시간 PCR을 수행 하 고 HPRT1 또는 유사 하 게 PCR 적절 한 내부 관리 유전자 단계 4.10에서 설명한 제외 하 고이 경우에, 웰 스 각 3 단계 후에 순환 하는 이미지.
- GOI8배 변화를 확인 하기 위해 비교 주기 임계값 (Ct) 메서드를 사용 합니다. 간단히, 다음과 같은 방정식을 사용 하 여 상대 성적 수준 (RTLs) 계산: 2-(Ct의 GOI 평균-평균 내부 관리 유전자의 Ct). 그런 다음, 컨트롤의 평균 RTL을 계산 하 고 평균 제어 컨트롤 샘플에 비해 배 변화를 생성 하는 RTL 모든 RTL 값을 나누어.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Overexpress lncRNA IFNG-AS1 듀얼 벡터 시스템
이 원고에 예제 실험 lncRNA IFNG AS19표현 Jurkat T 세포 모델 시스템의 overexpression입니다. IFNG-AS1 인터페론 감마10규제를 본 선 동적인 장 질병과 관련 된 하는 lncRNA입니다. IFNG-AS1 유전자는 모두 동일한 transcriptional 시작 사이트 (그림 1A)를 사용 하는 3 개의 결합 이체를 포함 합니다. 따라서, transcriptional 시작 사이트에서 10와 100 bp와 상류 "NGG" 시퀀스를 했다 gRNA 시퀀스 감독 Cas9 활성화 복잡 한 transcriptional 로커 스의 IFNG-AS1 (그림 1A)을 위해 이용 되었다. 2-플라스 미드 시스템 transduce dCas9 또는 gRNAs/강화 셀으로 단일 플라스 미드로 혼자 하 게 바이러스 성 입자 생성 (그림 1B) 플라스 미드 크기 때문에 어려운 사용 되었다. 더블 불리고 셀 선택 영역을 사용 하려면 dCas9 벡터 puromycin (aminonucleoside) 저항 유전자를 포함 하 고 gRNA를 포함 하는 플라스 미드 hygromycin (aminoglycoside) 저항 유전자를 포함. gRNAs는 gRNAs에 바인딩할 MS2 비 계 단백질 활성화 MS2 비 계 시퀀스에 융합 했다. MS2 융합 단백질은 IFNG AS17의 overexpression를 향상 시키기 위해 추가 transcriptional 활성 제. 이러한 벡터를 사용 하 여, 바이러스 성 입자는 가장 인간의 세포 라인으로이 overexpression 시스템 transduce를 만들 수 있습니다.
바이러스 성 titering 및 식민지 심사
생성 dCas9 및 gRNA 포함 하는 플라스 미드, 플라스 미드 담긴 수행한 후에 lentiviruses 만들어진. Lentiviruses 게놈에 무작위로 그들의 카세트를 통합로 바이러스 입자의 수의 부 량 수 최소한 가능한 통합의 번호. 이 위해 조절-미디어-포함 된 바이러스는 p24로 측정 되었다 ELISA 키트, 밀리 리터 당 virions의 수의 계산에 대 한 허용. 측정, 후 두 바이러스 supernatants 거의 1 µ g/mL p24, 바이러스 transduce Jurkat 세포를 100 µ L의 사용을 허용 했다. 변환, 후 항생제 선택 된 셀은 직렬로 희석 하 고 클론 확장 되었다. Cas9 식 다음 실시간 PCR 및 agarose 젤 전기 이동 법 (그림 2B)에 의해 분석 되었다. 두 클론 선택 Cas9 식에 대 한 긍정적인 했다입니다. 확인 하려면 mRNA 식, 역전사 cDNA 반응 (그림 2B)에서 생략 되었다. HPRT1에 대 한 프라이 머 nontransduced 세포에 있는 RNA의 존재를 확인 하기 위해 사용 되었다.
IFNG-AS1 유전자 발현을 측정
부모 셀 라인으로 복제는 dCas9를 사용 하 여, 셀 nontargeting gRNA 포함 된 바이러스 또는 IFNG AS1에 대 한 gRNAs를 포함 하는 바이러스로 불리고 있었다. GRNA 변환, 선택, dCas9 셀 라인 창조에 유사 클론 생성 후 IFNG AS1 식 overexpression 확인을 측정 했다. IFNG-AS1 사본 특정 뇌관 (빨간색) 또는 모든 알려진된 IFNG AS1 성적표 (블루) (그림 3A)에 대 한 각각의 개별적으로 검출 될 수 있다 3 개의 결합 이체를 생성 합니다. 모든 형광 곡선 HPRT1 도달 제어 및 IFNG AS1 gRNA 표현 셀 (그림 3BC) 사이 지 수 단계 (또는 코네티컷) 반 내 순환 지 수 있었다. 모든 알려진된 IFNG AS1 성적 증명서에 대 한 프라이 머 IFNG-AS1 (그림 3B)에 20-fold 증가의 측정 실험 사이 가장 감지 했다. 프라이 머 1과 2에 대 한 녹취 록에 대 한 말 초 혈액 단 셀 (PBMCs)에 성공적으로 증폭, 하는 동안 이러한 성적표에에서 되지 않았다 감지 Jurkat 세포 (데이터 표시 되지 않음). 그러나 때 IFNG AS1의 세 번째 사본은 집중된 RNA에서 감지 했다는 5-IFNG-AS1 레벨에 10 배로 크게 증가를 보였다. 이러한 데이터 중 대체 IFNG-AS1 Jurkat 세포 존재 일차 전지에 비해에서 접합 것이 좋습니다. IFNG AS1에 대 한 프라이 머 그로 인하여 활성화 CRISPR overexpression 시스템의 유효성을 검사 하는이 유전자에 큰 증가 발견.
그림 1: 듀얼 벡터 시스템 overexpress lncRNA IFNG-AS1. (A) A IFNG AS1 유전자 구조와 가이드 RNA (gRNA) 바인딩 사이트와 transcriptional 시작 사이트 (TSS)의 관계의 회로도 (B) gRNA 및 dCAS9 벡터의 기능. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 바이러스 titering 및 식민지 심사. (A) 예 p24 ELISA lentivirus 포함, 바른 미디어에 대 한 표준 곡선. 검은 점 표준 샘플 나타내고 빨간색 도트 알 수 없는 샘플. (B) 시험, 선택, 및 식민지, 실시간 PCR 및 dCas9에 대 한 젤 전기 이동 법을 생성 (보호자) 중 nontransduced Jurkat 세포에서 RNA 또는 dCas9 불리고 클론에 수행한 후. 아니 역전사 (없음 RT) 컨트롤 수행 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: IFNG AS1 유전자 발현 측정. (A) A 뇌관 세트 및 사본 이체 사이 관계의 도표. 빨간색 화살표 파란색 화살표 표시에 대 한 모든 알려진된 내용은 뇌관 동안 대 본 특정 뇌관을 나타냅니다. (B 와 C) 대표 평균 PCR 곡선 그리고 제어 및 IFNG AS1 overexpressing 세포에 대 한 변경 배 quantifications. RFU = 상대 형광 단위. N = 그룹 당 3 샘플. ± Sd. 의미 *p < 0.05, * * *p < 0.001. 학생의 t-테스트 p를 계산 하는 데 사용 되었습니다-값. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 그림 1: gRNA 디자인 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 그림 2: 공격기 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 표 1: 솔루션 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
보충 표 2: ELISA 희석 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이 원고는 생체 외에서 lncRNAs overexpress를 CRISPR를 활성화 사용 하 여 프로토콜을 선물 한다. 이 긴 noncoding RNAs transcriptomic 제품 기능 단위는 공부를 할 때 특히 중요 한 기술입니다. Overexpression, 후 연구원 수, 다음, 사용 하 여 이러한 셀 바인딩 파트너를 공부를 할 때 신호 대 잡음 비율을 증가 하 여도 세포 lncRNAs의 증가 수준 결과 측정. 또한, lncRNAs 자주 독립-유전자, 행동으로이 생 overexpression 기술을 공부11,12되도록 이러한 이벤트 가능 합니다.
이 원고 gRNA 창조 및 lentivirus 생성, 변환, 및 선택, 일반화 된 프로토콜을 강조 하 고 말 초 혈액 T 세포 라인에에서 lncRNA overexpression의 대표적인 예를 들어 설명 했다. 또한,이 기술은 이미 뼈 골 수 유래 면역 세포13, 신경7, 마우스 배아 줄기 세포14및 신장 상피 세포4에서 성공 하려면 표시 되었습니다. 이 프로토콜은 일반적으로 대부분의 셀 라인에 대 한 적용, 하는 동안 셀 transduce 어려운 높은 감염 속도 하기 위해서 개별 titers 필요할 수 있습니다. 또한, 그것은이 프로토콜 긍정적인 선택 전략을 활용 하 여 새로운 세포 선을 사용 하는 경우 항생제 죽 일 곡선을 수행 해야 합니다.
참고,이 프로토콜에 특별 한 주의 필요로 하는 여러 가지 기술적인 측면 있다. 재현 가능 하 고 일관 된 실시간 PCR를 위한 pipetting 재현할 결과 설정 중요 하다. 볼륨도 작은 차이 매우 변수 값, 그로 인하여 어렵게 해석 될 수 있습니다. 적절 한 양이 많은 PCR 뇌관 디자인 뿐만 아니라 컨트롤, 실시간 PCR 뇌관에 대 한 없음 역전사 제어를 포함 하 여 그들은 계량 되 고 RNA 게놈 DNA 아니다는 것을 확인으로 중요 하다. 실시간 PCR 위한 내부 관리 유전자의 선택도 적절 하 게 이러한 실험을 수행 하기 위해 중요 하다. HPRT1은이 프로토콜에서 선택 되었다, 그러나이 기술에 의해 표적으로 하는 관심사의 다른 유전자 HPRT115변경할 수 있습니다. 이러한 요인에 따라 내부 관리 유전자의 신중한 선택은 고려 사항으로 취해야 한다.
CRISPR을 활성화 하 고이 프로토콜의 특정 측면을 몇 가지 단점이 있다. 한 잠재적인 제한 다른 인접 유전자 켜져 수로 높은 유전자 풍부한 지역에서 성적 표현 이다. 가까이에 유전자 이웃 활성화 될 수 있습니다 및 컨트롤이를 평가 하기 위해 수행 해야 가능 하다. 또한, 다른 한계는 주어진된 DNA 시퀀스에 특정 gRNAs에 대 한 바인딩의 부족을 포함합니다. 여러 개의 gRNAs의 선택 드라이브 식에 적절 한 gRNA를 식별 하기 위해 필요할 수 있습니다. 시스템에 또 다른 경고는 관심의 셀 드라이브는 gRNAs와 dCas9의 식을 위해 카세트에 발기인을 드라이브 하는 능력을가지고 있다. 여기에 제시 된 연구, Jurkat T 세포 모델 이러한 구성 요소는 성공적인 overexpression 시스템에 대 한의 식을 드라이브 수 있었습니다.
이상적으로, 여기에 설명 된 프로토콜 단일 사본 overexpression 데이터 등 후속 연구 결과 대 한 사건을 강화 하기 위해 최저 또는 녹아웃 연구에서 기능적 효과 확실 다른 정보를 결합 한다. 이 기술은 특정 세포 유형에 서 어떤 유전자 overexpressing의 강력한 방법을 제공 합니다. LncRNA 생물학, 불 쌍 한 종족 보존 등의 한계를 감안할 때 여기에 설명 된 것과 같은 기법 관련 셀 종류에 그들의 기능을 탐구 하는 중요 한 있습니다. 이 연구는 선 동적인 장 질병 이상에 연루 되어 있다 하지만 인간의 질병 생물학에 있는 다른 lncRNAs의 기능 연구의 모델 역할을 한 lncRNA에 집중 했다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
C.P.는 RO1 DK60729 및 P30 DK 41301-26에 의해 지원 됩니다. D.P.는 크 론 & Colitis 재단 (CCFA) 경력 개발 상, 치료에 의해 지원 됩니다: 소화기 질환 연구 센터 (DDRC) DK41301, 그리고 UCLA 임상 및 변환 과학 연구소 (CTSI) UL1TR0001881. Ucla의 바이러스학 코어로는 센터의 에이즈 연구 (CFAR) 투자 되었다 5 P 30 AI028697를 부여. 핵심 치료/P30에 의해 지원 되었다 UCLA 통합 분자 기술 DK041301를 부여 합니다. 이 작품 또한 UCLA 에이즈 연구소에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016 | |
| cDNA synthesis kit (iScript) | BioRad | 1708891 | |
| dCas9 forward primer | Integrated DNA Technologies | n/a | 5'-TCGCCACAGCATAAAGAAGA |
| dCas9 reverse primer | Integrated DNA Technologies | n/a | 5'-CTTTTCATGGTACGCCACCT |
| dCas9 vector | Addgene | 50918 | |
| DMEM | Corning | 10013CM | |
| Ethanol | Acros Organics | 61509-0010 | |
| FBS | Sigma Aldrich | F2442 | |
| gRNA plasmid | VectorBuilder | VB180119-1195qxv | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-1573 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| HPRT1 forward primer | Integrated DNA Technologies | n/a | GACCAGTCAACAGGGGACAT |
| HPRT1 reverse primer | Integrated DNA Technologies | n/a | GCTTGCGACCTTGACCATCT |
| Hygromycin B | Corning | MT3024CR | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618-500 | |
| Jurkat cells | ATCC | TIB-152 | clone E6-1 |
| L-glutamine | Corning | 25005Cl | |
| LB agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | |
| LB broth | Fisher Scientific | BP1426-2 | |
| Maxi-prep kit (Plasmid Purification Kit) | Qiagen | 12362 | |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | NIST2186II | |
| Optimem I reduced serum media | Gibco | 31985070 | |
| p24 elisa | Perkin Elmer | NEK050B | |
| PBS | Corning | 21-040-CMR | |
| Penicillin and Streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| pMDG2.G | Addgene | #12259 | |
| pMDLg/pRRE | Addgene | #60488 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma Aldrich | P-4832 | |
| Polybrene | EMD Millipore | TR-1003 | |
| pRSV-REV | Addgene | #12253 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma Aldrich | P8833 | |
| RNA purification kit (Aurum RNA mini) | BioRad | 7326820 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| SYBR green (iTaq universal) | BioRad | 1725122 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 |
References
- Miao, Y., et al. Trends of long noncoding RNA research from 2007 to 2016: a bibliometric analysis. Oncotarget. 8 (47), 83114-83127 (2017).
- Derrien, T., et al. The GENCODE v7 catalog of human long noncoding RNAs: analysis of their gene structure, evolution, and expression. Genome Research. 22 (9), 1775-1789 (2012).
- Johnsson, P., Lipovich, L., Grander, D., Morris, K. V. Evolutionary conservation of long non-coding RNAs; sequence, structure, function. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (3), 1063-1071 (2014).
- Perez-Pinera, P., et al. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Maeder, M. L., et al. CRISPR RNA-guided activation of endogenous human genes. Nature Methods. 10 (10), 977-979 (2013).
- Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Gomez, J. A., et al. The NeST long ncRNA controls microbial susceptibility and epigenetic activation of the interferon-gamma locus. Cell. 152 (4), 743-754 (2013).
- Padua, D., et al. A long noncoding RNA signature for ulcerative colitis identifies IFNG-AS1 as an enhancer of inflammation. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 311 (3), G446-G457 (2016).
- Collier, S. P., Henderson, M. A., Tossberg, J. T., Aune, T. M. Regulation of the Th1 genomic locus from Ifng through Tmevpg1 by T-bet. Journal of Immunology. 193 (8), 3959-3965 (2014).
- Kotake, Y., et al. Long non-coding RNA ANRIL is required for the PRC2 recruitment to and silencing of p15(INK4B) tumor suppressor gene. Oncogene. 30 (16), 1956-1962 (2011).
- Gilbert, L. A., et al. Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation. Cell. 159 (3), 647-661 (2014).
- Cheng, A. W., et al. Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system. Cell Research. 23 (10), 1163-1171 (2013).
- Matouskova, P., et al. Reference genes for real-time PCR quantification of messenger RNAs and microRNAs in mouse model of obesity. PLoS One. 9 (1), e86033 (2014).
