Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

Gene aktive CRISPR kullanarak uzun kodlamayan RNA'ların overexpressing

Published: March 1, 2019 doi: 10.3791/59233

Summary

Geleneksel overexpression cDNA tabanlı teknikleri sınırlı uygulanabilirliği için potansiyel işlevselliği ile birden çok ek yeri formlarını nedeniyle uzun kodlamayan RNA'ların overexpression var. Bu inceleme birden çok ek yeri değişik-in uzun kodlamayan RNA overexpress için CRISPR teknolojisini kullanan bir iletişim kuralı bildirir.

Abstract

Uzun kodlamayan RNA (lncRNA) Biyoloji Araştırma yayınları 2007 yılından bu yana katlanarak büyüyen bu alandan sayısı ile yeni ve heyecan verici bir alandır. Bu çalışmalar lncRNAs hemen hemen tüm hastalıklarda değişmiş doğruladı. Ancak, lncRNAs hastalığı bağlamında için işlevsel roller eğitim eksikliği protein ürünleri, doku özgü ifade, düşük ifade düzeyleri, splice formları karmaşıklığı ve türler arasında koruma eksikliği nedeniyle zor kalır. Species-specific ifade göz önüne alındığında, lncRNA çalışmalar genellikle hastalık süreçleri okurken insan araştırma bağlamları için kısıtlanır. LncRNAs moleküler düzeyde işlev beri lncRNA Biyoloji incelemek için bir yol lncRNA kaldırmak veya lncRNA ve ölçü hücresel etkileri overexpress etmektir. Bu makalede, lncRNAs tüp bebek overexpress için bir yazılı ve görüntülenmeyecektir protokol sunulmuştur. Temsil edici bir deney olarak, inflamatuvar barsak hastalığı, Interferon gama Antisens 1 (IFNG-AS1) ile ilişkili bir lncRNA bir Jurkat T-hücre modeli overexpressed gösterildi. Bunu yapmak için aktive kümelenmiş düzenli olarak interspaced kısa palindromik yineler (CRISPR) tekniği overexpression endojen genomik loci, etkinleştirmek için kullanılır. Aktive CRISPR tekniği transkripsiyon faktörleri lncRNA splice yükseltgen sağlam bir overexpression sağlayan bir gen transkripsiyon başlangıç siteye birtakım hedefler. Bu yordamı üç adım, yani (i) Kılavuzu RNA (gRNA) tasarım ve vektör inşaat, (ii) virüs üretimi ve iletimi ve (III) koloni tarama overexpression için içine bölünmüş. Temsilcisi bu deneme için bir IFNG-AS1 Jurkat T hücrelerinde 20-fold geliştirme gözlendi büyüktür.

Introduction

En Biyomedikal Araştırma protein kodlayıcı transkript üzerinde odaklanmıştır iken, kopya etmek genler çoğunluğu aslında kodlamayan RNA'ların (Ensembl yayın 93) oluşur. Mevcut araştırma lncRNAs katlanarak 2007 2017 ve1arasında yükselen hastalığı süreçlerde yayın numarasıyla bu alanı keşfetmeye başlıyor. Bu yayınların birçok lncRNAs hastalığı ile ilişkili olduğunu gösterir. Ancak, bu lncRNAs moleküler mekanizmaları ile karşılaştırıldığında mRNA'ların farklı işlevleri nedeniyle çalışma zordur. LncRNAs hastalığında rolünün anlaşılması sorunu bileşik, lncRNAs çoğunlukla RNA'ların2kodlama daha alt seviyelerde ifade edilir. Ayrıca, lncRNAs kötü, hangi insan-cep-satır-tabanlı teknikleri3fonksiyonel çalışmalar sınırlar korunmuş. Roman bu genlerin mekanizması çalışmaya bir yöntem endogenously onları kültürlü hücrelerde overexpress sağlamaktır. Overexpression çalışmaları belirli genler işlevi hakkında önemli bilgileri sağlar ve araştırmacılar anahtar moleküler yolları incelemek için etkinleştirin.

LncRNA genlerin transkripsiyon etkinleştirmek için yeni bir yöntem başlangıçta Gersbach laboratuvar4tarafından geliştirilen CRISPR teknolojileri temel alır. Bu iletişim kuralı kullanmak üzere lncRNA Biyoloji ve diğer model sistemleri bu genlerin ifade için adapte edilmiştir. Teknik overexpressing CRISPR içinde CRISPR ilişkili protein 9 (Cas9) adı verilen bir protein DNA dizisi ile Cas9 tarafından tanınan bir antianlamlı gRNA doğru yönlendirilmiş olabilirsiniz. Normalde, Cas9 DNA bölünme neden; Ancak, daha önce için overexpression tekniği, gelişmiş değil Cas9, mutasyonların bu adım5devre dışı bırakın. Ne zaman bir transkripsiyon harekete geçirmek için bir "ölü" Cas9 erimiş (dCas9) ve hücre satır içine transduced, elde4,6lncRNAs endojen overexpression olabilir. GRNA için bağlamak ek transkripsiyon faktörleri etkinleştirme gRNA, ek değişiklikler ek dCas9 gen harekete geçirmek sistem etkinliği arttı 10 kat7. Önemlisi, yakın bir konumda istemek transkripsiyon harekete geçirmek gösterilmiştir (< 200 bp) transkripsiyon için site genler, belirli bir upregulation gen zengini alanları7etkinleştirme başlatın. CRISPR nakavt teknolojileri farklı olarak, dCas9 ve gRNA kaset hücreler bir overexpression birden fazla kuşaklara korumak için izin vermek için genom entegre edilecek gerek. Bunu başarmak için bir yöntem lentiviruses dCas9 ve gRNA içeren kaset tümleştirmek için kullanmaktır. Entegrasyon sonra lncRNA gen ekspresyonu belirlenebilir.

Bu makalede, lncRNA overexpression Jurkat T-hücre modeli için bir protokol gösterilecektir. Adım adım bir yordam gösterilir ve aynı zamanda yapisan hücrelerine adapte edilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Not: Bu protokol çoğaltma-eksik lentiviruses kullandığını unutmamak gerekir. Uygun laboratuvar güvenlik eğitimi sonra viral işleme gerçekleştirin. Tüm öğeleri ve işleme sonra en az 10 dk canlı virüs temas yüzeyleri çamaşır suyu. Kullanım tek kullanımlık laboratuvar mont ve yüz/göz koruma yanı sıra çift eldiven, her zaman. Biyogüvenlik seviye 2 + laboratuarlar viral sertifika ile Virus görevi gerçekleştirin. Doku kültürü davlumbaz ve kuluçka viral çalışmaya adamak.

1. vektör Tasarım ve üretimi

Not: GRNA serileri tanımlamak için en iyi yolu online tasarım araçları (örneğin, http://crispr-era.stanford.edu) kullanmaktır (tamamlayıcı şekil 1: gRNA tasarım). Eşlik eden temsilcisi deneme için bir şirket tasarlanmış ve oluşturulan temsilcisi deneyde kullanılan gRNA vektörel çizimler. DCas9 plazmid Ayrıca online satın alınmıştır.

  1. GRNA sıra akıntıya karşı nükleotid dizisi "NGG", "N" aynı zamanda 100 base-çift içinde transkripsiyon başlangıç sitenin herhangi bir nükleotit nerede, yer alır. Orada benzer dizileri ile genom yok diğer site emin olmak için gRNA sırası için genetik veritabanları BLAT (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start) gibi arama (tamamlayıcı Şekil 2: BLAT). Bu gRNA sıra faiz (GOI) gen için benzersiz olduğundan emin olun.
  2. 4 ° C'de bakteri taslakları olarak gelir gRNA ve dCas9 plazmid depolamak Escherichia coli dışarı çizgi üzerinde suyu (LB) agar Ampisilin ile (ek tablo 1) plaka ve bakteri 37 ° C'de gecede büyümek bir Luria
  3. Bir koloni almak ve şiddetle plaka 37 ° C kuluçka makinesine sallayarak bakteri LB 5 ml ile Ampisilin (ek tablo 1) bir gecede büyümek. Ertesi gün, 2 mL ekleyin bakteri LB 200 ml Ampisilin ile büyümek şiddetle 37 ° C kuluçka gecede şişeye sallayarak bir 2 L şişesi.
  4. Spin aşağı yeri buzda bakteri içeren tüp ve bakteri 3,724 x g 20 dk. Kaldır medya için de.
  5. Bakteriyel DNA bir plazmid arıtma kit başına üreticinin iletişim kuralı kullanarak arındırmak.
    Not:
    özel resuspension tampon, lizis arabellek, yıkama arabellek, denge arabellek ve elüsyon tampon plazmid arıtma setleri içerir.
    1. Resuspension arabellek 10 mL teçhizat--dan bakteri ve damlalıklı bakteri çözüm içine ekleyin. Sonra 10 mL lizis arabellek Seti'nden resuspended bakteri ve onları tüp ters çevirme karıştırın. Bakterileri parçalayıcı için 5 dakika bekleyin; sonra buz gibi nötralizasyon arabellek 10 mL Seti'nden lysed bakteri ve onları tüp ters çevirme karıştırın.
    2. Kit 5 dk. örnekleri DNA sütuna filtre ve filtre üzerinden geçmek çözüm izin dökmek için denge arabellek 10 mL ile DNA sütundan equilibrate.
    3. Örnekleri 2 yıkama x 30 mL ile yıkama arabellek ve sonra DNA ile 15 mL konik tüp arabellekte elüsyon 30 mL elute. Yavaş yavaş isopropanol eluted DNA üzerine oda sıcaklığında 10.5 mL katman, tüp ters çevir ve hemen 16,200 x g 4 ° C'de 30 dk için de spin
    4. Süpernatant çıkarın ve 1 mL % 70 etanol DNA Pelet ekleyin. Pelet tüp flicking tarafından resuspend. 16,200 x g 4 ° C'de 10 dakika için de sıralayacağız ve 200 μL damlalıklı bahşiş etanol çoğunu kaldırmak için kullanın. 5 min için Pelet kurumasına ve su 200 μL içinde resuspend ve DNA-20 ° C'de depolayın Beklenen konsantrasyonu olacak > 1 μg/μL.

2. virüs üretimi ve parçacık sayısı

  1. DCAS9 içeren lentivirus oluşturmak hazır olduğunuzda 100 mm doku kültürü yemekleri ile 5 mL % 0,01 Poli-L-lizin (ek tablo 1) de kat. Aşırı sıvı iyice plakalar kaldır ve onlara bir kaç dakika içinde bir biyogüvenlik kabini için air-dry.
  2. Yemeğin tam Dulbecco'nın 10 ml başına plaka 5 x 106 HEK 293T hücre kartal orta (DMEM) (ek tablo 1) değiştirilebilir ve onları gecede %5 CO237 ° C'de kuluçkaya. Ertesi gün, orta HEK 293T yemeklerini kaldırmak ve tam DMEM 10 mL ekleyin.
  3. Plazmid pMDLg/pRRE gag/pol (virüs bileşenleri), içeren Mix 6.5 μg VSV-G (virüsün bileşeni), içeren plazmid pMDG2.G 3,5 μg plazmid pRSV-Rev içeren 2,5 µg Rev (virüsün bileşeni), bir uzun terminal tekrar (10 μg LTR)-vektör gRNA vektör veya LTR içeren bir dCas9 içeren ve bir toplam 450 μL birime su ekleyin. Karışım 0.2 µm filtre bir şırıngaya bağlı bahşiş aracılığıyla filtre.
  4. 2.5 M CaCl2 (ek tablo 1) 50 µL DNA her transfection örneği ekleyin ve karışımı yavaşça. Kalsiyum/DNA karışımı 0.2 µm filtre bir şırıngaya bağlı bahşiş aracılığıyla filtre. Damlalıklı 500 µL 5 mL polistren tüp içine 2 x HBS (ek tablo 1). 500 µL DNA/CaCl2 mix dropwise ve yavaşça girdap ekleyin. 3 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
  5. Yavaş yavaş DNA/CaCl2/HBS süspansiyon 1 mL her yemek için ekleyin. Hemen içeriği eşit dağıtmak için yemekler girdap. Her yemeğin 37 ° C'de % 5 CO2 kuluçka geceleme kuluçkaya
  6. Günde 3, yavaş yavaş kaldırmak ve bulaşıkları medyadan atın. Dikkatli bir şekilde hücreleri 1 yıkama x fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) ile. Tam DMEM 20 mM HEPES ve 10 mM sodyum bütrat ile 6 mL ekleyin. 5-6 h 37 ° C'de % 5 CO2 kuluçka için hücreleri kuluçkaya
  7. Hücreleri 1 yıkama x PBS ile ve 5 mL 20 mM HEPES ile tam DMEM de HEK 293T hücrelere ekleme. 12 h 37 ° C'de % 5 CO2 kuluçka geceleme için kuluçkaya
  8. Günde 4, HEK 293T hücre supernatants toplamak ve süpernatant filtre. 1 mL aliquots-80 ° C'de dondurmak
  9. Hazır olduğunuzda virüs kullanmak, bir aliquot (açıklandığı adım 2.8 olarak depolanan) klimalı ortamları buzda içeren viral parçacık çözülme. Tüm reaktifler oda sıcaklığına getirmek.
  10. P24 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) kiti mililitre başına viral parçacıkların sayısı ölçmek için kullanın.
    1. Yıkama konsantresi Takımı'ndan 19 bölümleri deiyonize distile su ekleyerek sulandırmak. Takımı'ndan olumlu denetim 200 ng/ml seyreltik, RMPI 1640 eritici ve yapmak kullanarak dilutions 1,5 ml standart eğri için tüpler göre p24 ELISA seyreltme tablosu (ek tablo 2).
    2. %5 20 μL eklemek belgili tanımlık substrate boş dışında bütün wells için Triton X-100. RPMI 1640 200 μL negatif kontrol wells için ekleyin. Her standardında (yinelenen) 200 μL belirlenen wells için ekleyin.
    3. Bir Spektrofotometre kullanarak, standart bir eğri kullanarak örnekleri içinde virüs konsantrasyonu ölçmek. 1:1,000, Numune dilüsyonu başlatmak ve birimin standart eğri aralığı içinde olmak için gerektiği gibi değiştirin. Triton X-100 son konsantrasyonu % 0,5 örnekleriyle sulandırmak ve her örneğinin 200 μL RPMI 1640 yılında belirlenen wells için ekleyin. Plaka mühür ve 37 ° C'de 2 h için kuluçkaya
    4. 6 tabak yıkama x 1 şey başına yıkama arabellek x 300 μL ile. Herhangi bir aşırı sıvı plaka ters çevirme ve kağıt havlu üzerinde dokunarak çıkarın. Dedektör antikor 100 μL teçhizat--dan belgili tanımlık substrate boş dışında bütün wells ekleyin. Plaka mühür ve 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya Plaka yıkama ve ardından plaka ters çevirme ve kağıt havlu üzerinde dokunarak tarafından herhangi bir aşırı sıvı kaldırın.
    5. Dedektör antikor ölçmek amacıyla streptavidin horseradish peroksidaz (SA-HRP) kullanım 15 dakika içinde hazır olun. SA-HRP 1: 100 ile SA-HRP seyreltici, seyreltik. Seyreltilmiş SA-HRP iyice karıştırın ve boş dışında bütün wells 100 μL ekleyin. Mühür ve oda sıcaklığında 30 dk plaka kuluçkaya.
    6. 1 yıkama arabellek x ile tabak yıkama ve uzak adım 2.10.4 olduğu gibi herhangi bir aşırı sıvı dokunun. Kemiluminesan, hazırlık 15 dk içinde üretmek için gerekli yüzeylerde peroksidaz sağlar ortho-boya (OPD) substrat çözeltisi kullanın. Bir OPD tablet 11 mL substrat Dilüent için her plaka için kullanın.
    7. Girdap OPD çözüm şiddetle tamamen erimesi ve ışıktan korumak için. 100 μL OPD substrat çözeltisi, boş da dahil olmak üzere tüm wells için ekleyin. 450 Absorbans okumak bir Spektrofotometre kullanarak nm hemen, bu 10 x 1 s aralıklarla tekrarlayın ve ortalama ölçüm almak.

3. dCas9 -VP64 iletim

  1. Kültür Jurkat T hücreleri bir T75 şişesi yoğunluklu medya 15 mL 2 x 106 hücrelerinin içinde tam DMEM. 37 ° C kuluçka %5 CO2hücre kültür.
  2. Spin aşağı vasıl 233 x g 5 min için hücreleri ve sonra onları indirimli serum medya 10 mL resuspend. Bir hemasitometre veya bir otomatik hücre sayaç içeren hücreleri saymak.
  3. Resuspend ve polybrene (ek tablo 1) bir T75 şişesi ile indirimli serum medya 5 mL 1 x 106 Jurkat hücrelerde plakası. 1 x 106 dCas9 içeren viral parçacıkların içeren HEK 293T klimalı ortam ekleyin. Viral parçacıkların sayısı p24 kabaca hesaplanabilir ELISA 1 μg/mL p24 1 x 107 viral parçacıkların eşittir çünkü. 37 ° C kuluçka %5 CO2şişe koymak.

4. seçim ve klon oluşturma

  1. Üç gün sonrası enfeksiyon, 233 x g 5 min için de hücreleri aşağı spin ve onları puromisindir (ek tablo 1) ile tam DMEM 10 ml resuspend. T75 şişeler hücrelerde plaka ve onları %5 CO237 ° C'de kültür. 9 günlük bir süre için üçüncü her gün vasıl 233 x g 5 min için hücreleri aşağı spin ve ortamı ile puromisindir tam DMEM ile değiştirin.
  2. Bir hemasitometre veya bir otomatik hücre sayaç kullanarak hücreleri saymak. Doku kültürü ile tedavi bir 96-şey plaka üzerinde tam DMEM 100 μL plaka 10.000 hücrelerde ilk puromisindir ile 1:1 tam DMEM puromisindir ile aşağıdaki Wells'le içeriğini de ve seri olarak sulandırmak. 24 dilutions gerçekleştirmek ve bu 4 x plaka başına bir şey başına hücre sayısı yeterli olduğundan emin olmak için yineleyin. %5 CO237 ° C'de hücreler kuluçkaya.
  3. Klonal hücreleri iki 24-şey tabak, sonra 6-şey plaka içine ve sonunda bir T75 şişesi içine genişletin. Üç klonların, plaka 2 x 106 hücre, bir 6-şey tabak iyi üç klonların başına odaklanmak için. Diğer üç kuyu nontransduced Jurkat hücrelerle denetimleri plaka. Hücreleri gecede bir hücre kültür kuluçka makinesine koy.
  4. RNA ayıklama için piyasada bulunan bir RNA izolasyon kit kullanın. Spin aşağı vasıl 233 x g oda sıcaklığında 5 min için hücreleri ve medyayı çıkarın. 1 mL damlalıklı ipucu lizis arabelleği 350 μL hücrelerde resuspend için kullanın. 350 μL % 70 etanol lysed hücrelere ekleme, 1 mL damlalıklı ile iyice karıştırın ve örnek RNA sütuna aktarmak.
  5. Lysates 10.000 x g 1 dk. için de spin, akışı aracılığıyla kaldırın ve düşük-sıkılık yıkama arabelleği 700 μL seti için sütun ekleyin. Lysates 10.000 x g 1 dk. için de spin, akışı aracılığıyla kaldırın ve Dnaz 80 µL ekleyin ben çözüm Takımı'ndan sütun; 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya örnekleri ver.
  6. Lysates 10.000 x g 1 dk. için de spin, akışı aracılığıyla kaldırın ve yüksek-sıkılık yıkama arabelleği 700 µL seti için sütun ekleyin. Lysates 10.000 x g 1 dk. için de spin, akışı sayesinde kaldırmak ve 700 µL düşük-sıkılık yıkama arabelleği sütun ekleyin.
  7. Ve yeni bir koleksiyon tüp transfer sütun koleksiyon tüpünden çıkarın. Lysates 10.000 x g 1 dk. için de spin ve ardından RNA sütun bir 1,5 mL tüp aktarın. Sütun ve 10.000 x g 1 dk. için spin 50 µL su ekleyin.
  8. Bir Spektrofotometre RNA konsantrasyonunu ölçmek için kullanın. 100-500 ng/µL, 1.9-2.1 arasında 260/280 Absorbans ile arasında olmak için konsantrasyon bekliyoruz. RNA-80 ° C'de depolayın
  9. 250 µL tüpler, RNA, tamamlayıcı DNA (cDNA) sentezi arabelleği 4 µL, ters transkriptaz 1 µL 1 µg ekleyin ve son hacmi 20 µL. su hiçbir ters transkriptaz denetimleri içerir. Bir termal cycler içinde cDNA 30 dk 42 ° C'de ve ters transkriptaz devre dışı bırakabilirsiniz 5 min için 95 ° C'de sentez. CDNA 60 µL su ile sonra sentez sulandırmak.
  10. Polimeraz zincir reaksiyonları (PCR) içeren SYBR yeşil 5 µL, cDNA 4 µL, 0.5 µL ileri astar (10 µM) ve ters astar (10 µM) 0.5 µL hazırlayın. PCR aşağıdaki gibi çalıştırın: 1 = 95 ° C 3 min için adım, 2 = 95 ° C için 10 adım s, adım 3 = 60 ° C 10 s ve o zaman, tekrar adım 2 ve 3 30 x için.
    Not: DCas9 ileri astar için sıra 5'-TCGCCACAGCATAAAGAAGA ve dCas9 ters astar için sıra 5'-CTTTTCATGGTACGCCACCT. Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) için ileriye doğru astar 5'-GACCAGTCAACAGGGGACAT ve ters astar 5'-GCTTGCGACCTTGACCATCT.

5. gRNA iletim, seçimi, klon oluşturma ve tarama

  1. Doğrulanmış Jurkat-dCas9 hücreleri ile virüs gRNA içeren madde 3 te belirtildiği gibi retransduce. Hücreleri DMEM içinde 10 gün boyunca hygromycin ile (ek tablo 1) seçin. Hücreleri aşağı spin ve medya 3 günde değiştirin.
  2. Bir seri seyreltme hücre (4.2 adımda anlatıldığı gibi) gerçekleştirmek ve bireysel koloniler (4.3 adımda anlatıldığı gibi) genişletin. RNA kolonilerden tam olarak 4.5 adımda anlatıldığı gibi arındırmak ve 4,9 adımda anlatıldığı gibi cDNA sentez gerçekleştirin. GOI karşı gerçek zamanlı PCR gerçekleştirmek ve HPRT1 veya bir uygun temizlik gene aynı şekilde PCR ile 4.10, adımda anlatılan bu durumda, adım 3 sonra kuyu her döngüsü görüntü hariç.
  3. GOI8kat değişiklik belirlemek için karşılaştırmalı döngüsü eşik (Ct) yöntemini kullanın. Kısaca, göreli transkript düzeyleri (RTLs) hesaplamak için aşağıdaki denklemi kullanın: 2-(GOI Ct ortalama-Ct temizlik gen ortalama). O zaman, denetimlerin ortalama RTL hesaplamak ve tüm RTL değerleri ortalama denetim kontrol örnekleri karşılaştırıldığında bir kat değişiklik oluşturmak için RTL bölün.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

LncRNA IFNG-AS1 overexpress için bir ikili vektör sistemi
LncRNA IFNG-AS19ifade Jurkat T-hücre modeli sistemi overexpression bu el yazması olarak örnek deneydir. IFNG-AS1 Interferon gama10düzenleyen görülen iltihabi bağırsak hastalığı ile ilişkili bir lncRNA var. IFNG-AS1 gene aynı transkripsiyon başlangıç site (şekil 1A) hepimize üç ek yeri değişik içerir. Bu nedenle, 10 ve 100 bp transkripsiyon başlangıç sitesinden ve akıntıya karşı "NGG" dizisi vardı gRNA dizileri Cas9 aktive tesisin IFNG-AS1 (şekil 1A) transkripsiyon locus yönetmenlik için kullanılmıştır. Ya dCas9 ya da gRNAs/arttırıcılar hücrelere bir tek plazmid tek başına yapar viral parçacık üretimi plazmid büyüklüğü nedeniyle (şekil 1B) zor transduce için kullanılan bir iki-plazmid sistemi. Çift transduced hücrelerin seçimini etkinleştirmek için dCas9 vektör bir puromisindir (aminonucleoside) direnç gen, ve gRNA içeren plazmid bir hygromycin (aminoglikosite) direnç gen bulunan. gRNAs için gRNAs bağlamak MS2 iskele protein etkin bir MS2 iskele diziye erimiş. MS2 için erimiş protein IFNG-AS17overexpression geliştirmek için ek transkripsiyon harekete geçirmek vardır. Bu vektörler kullanarak, viral parçacıkların en insan hücre hatları bu overexpression sistemi transduce için oluşturulabilir.

Viral titering ve koloni tarama
Sonra dCas9 ve gRNA içeren plazmid üreten, plazmid purifications gerçekleştirilen ve lentiviruses oluşturulmuştur. Lentiviruses rastgele kendi kaset genom entegre., bir miktar viral parçacıkların sayının en azından etkinleştirilir entegrasyonlar mümkün sayısı. Bunu yapmak için virüs şartına ortamı içeren bir p24 ile ölçüldü ELISA kiti, virions mililitre başına sayısı hesaplanması için izin. Ölçme sonra her iki viral supernatants neredeyse 1 µg/mL Jurkat hücre transduce şunun 100 µL kullanımına izin p24 vardı. İletim sonra antibiyotik Seçili hücreleri seri olarak seyreltilmiş ve klonlar genişletildi. Cas9 ifade sonra gerçek zamanlı PCR ve özel Jel Elektroforez (şekil 2B) tarafından analiz edildi. Seçili her iki klon Cas9 ifade için olumlu idi. MRNA ifade doğrulamak için ters transkriptaz cDNA reaksiyon (şekil 2B) ihmal. Astar HPRT1 karşı RNA nontransduced hücrelerdeki varlığını doğrulamak için kullanılmıştır.

IFNG-AS1 gen ekspresyonu ölçme
DCas9 kullanarak bir ebeveyn hücre satır olarak klonlar, hücre nontargeting gRNA içeren virüs ya da gRNAs karşı IFNG-AS1 içeren bir virüs ile transduced. GRNA iletim, seçim ve klon oluşturma dCas9 hücre satırı oluşturmaya benzer sonra IFNG-AS1 ifade overexpression doğrulamak için ölçüldü. IFNG-AS1 her biri ayrı ayrı transkript özgü astar (kırmızı) ya da bilinen IFNG-AS1 transkriptlerinizin (mavi) (şekil 3A) karşı tespit edilebilir üç ek yeri değişik üretir. Tüm Floresans eğrileri üssel faz (veya, Ct) içinde bir buçuk kontrol ve IFNG-AS1-gRNA-ifade hücreler (3B rakamC) arasında geçiş yapmak HPRT1 ulaşan ile üstel. Astar bilinen IFNG-AS1 transkriptlerinizin karşı en 20-fold IFNG-AS1 (şekil 3B) artışlar ölçümleri ile deneyler arasında tespit edildi. Astar transkript 1 ve 2 karşı karşı başarıyla periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs) güçlendirilmiş iken, bu Tutanaklar Jurkat hücrelerinde (veri gösterilmez) tespit değildi. Ancak, IFNG-AS1 üçüncü transkript konsantre RNA tespit iken, beş-on kat önemli IFNG-AS1 düzeylerinde artış için görüldü. Bu verileri IFNG-AS1 hücreleri yok Jurkat Primer hücre için karşılaştırıldığında, her iki Alternatif işlenim göstermektedir. Astar IFNG-AS1 karşı büyük artışlar böylece aktive CRISPR overexpression sisteminizi doğrulama bu gen algılandı.

Figure 1
Şekil 1: lncRNA IFNG-AS1 overexpress için bir ikili vektör sistemi. (A) A şematik IFNG-AS1 gen yapısı ve Kılavuzu RNA (gRNA) bağlayıcı siteleri ve transkripsiyon başlangıç sitesi (TDH) arasındaki ilişki. (B) şekil-in gRNA ve dCAS9 vektörel çizimler. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: Viral titering ve koloni tarama. (A) bir örnek p24 ELISA standart eğri lentivirus içeren, klimalı ortam için. Siyah noktalar temsil standart örnek ve bilinmeyen örnekleri kırmızı nokta. (Transducing, seçme ve koloniler, gerçek zamanlı PCR ve dCas9 karşı Jel Elektroforez üreten RNA (ebeveyn) ya nontransduced Jurkat hücrelerden veya dCas9 transduced klonlar yapıldı sonraB). Ters transkriptaz (Hayır RT) denetim yapıldı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: IFNG-AS1 gen ekspresyonu ölçme. (A) A diyagramı astar setleri ve transkript çeşitler arasındaki ilişkinin. Mavi oklar astar bilinen transkriptlerinizin karşı gösterir sırasında Kırmızı oklar transkript özgü astar, temsil eder. (B ve C) temsilcisi ortalama PCR eğrileri ve kat-değişiklik quantifications denetim ve IFNG AS1 overexpressing hücreler için. RFU = göreli Floresans birimleri. N = 3 örnek grup /. ± SD demek *p < 0,05, ***p < 0,001. Öğrenci'nin t-testi phesaplamak için kullanılan-değerleri. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tamamlayıcı şekil 1: gRNA tasarım Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Tamamlayıcı Şekil 2: BLAT Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Ek tablo 1: çözümler Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Ek tablo 2: ELISA dilutions Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu el yazması CRISPR aktive lncRNAs tüp bebek overexpress kullanmak için bir protokol sunar. Transcriptomic ürün işlevsel birim olduğu gibi uzun kodlamayan RNA'ların okurken bu özellikle önemli bir tekniktir. Overexpression sonra araştırmacı, bu hücreler bağlama ortakları okurken sinyal-gürültü oranı artırmak ve bile lncRNAs, daha yüksek düzeyde hücresel sonuçlarını ölçmek için kullanabilirsiniz. Ayrıca, lncRNAs sık sık CIS-genler üzerinde hareket gibi bu endojen overexpression teknik eğitimi11,12olduğu için bu olayları sağlar.

Bu el yazması gRNA oluşturma ve lentivirus üretimi, iletimi ve seçim için Genelleştirilmiş bir protokol vurgular ve periferik kan T hücre lncRNA overexpression temsil edici bir örnek sıraladı. Ayrıca, bu teknik bağışıklık hücreleri kemik iliği türevi13, nöronlar7, fare embriyonik kök hücre14ve böbrek epitel hücreleri4başarılı olmak için zaten kanıtlanmıştır. Bu protokolü çoğu hücre hatlarında genellikle geçerli olmakla birlikte, transduce zor olan hücreler daha yüksek enfeksiyon oranları etkinleştirmek için bireysel titreleri gerektirebilir. Ayrıca, bu iletişim kuralı bir pozitif seçim stratejisi kullanır yeni hücre hatları, kullanırken antibiyotik öldürmek eğrileri gerçekleştirmek önemlidir.

Not, bu iletişim kuralının özel dikkat gerektirir birkaç teknik yönleri vardır. Tekrarlanabilir ve tutarlı için gerçek zamanlı PCR pipetting tekrarlanabilir sonuçlar kurmak için çok önemlidir. Cilt olarak bile küçük farklılıklar son derece değişken değerleri, dolayısıyla yorumu zor hale neden olur. Bir uygun kantitatif PCR astar tasarım yanı sıra, denetimler, gerçek zamanlı PCR astar için Hayır transkriptaz denetimi de dahil olmak üzere sayısal RNA genomik DNA değil onaylamak gibi kritik öneme sahiptir. Temizlik genlerin seçimi gerçek zamanlı PCR için de yeterince bu deneyler gerçekleştirmek için önemlidir. HPRT1 bu protokol için seçildi iken, diğer genler bu tekniği ile hedeflenen çıkarlarının HPRT115değiştirebilir. Bu etkene bağlı temizlik genlerin dikkatli bir seçim göz önüne alınmalıdır.

CRISPR harekete geçirmek için ve belirli yönleri ile bu iletişim kuralı birkaç dezavantajları vardır. Diğer komşu genlerin açık olabilir gibi bir potansiyel sınırlama transkript son derece gen zengini bölgelerde ifadesidir. Bu genlerin birbirine yakın komşu etkinleştirilebilir ve denetimleri-meli var olmak kılınmak bu değerlendirmek için mümkündür. Buna ek olarak, belirli bir DNA dizisi için belirli gRNAs için bağlama eksikliği diğer sınırlamaları içerir. Birden çok gRNAs seçim sürücü ifade için uygun gRNA tanımlamak için gerekli olabilir. Başka bir uyarı sistemine ilgi cep rehberleri kaset içinde gRNAs ve dCas9 ifadesi sürücü için sürücü için kapasitesine sahip olmasıdır. Burada sunulan çalışmalar için Jurkat T-hücre modeli ifade başarılı overexpression sistemi için bu bileşenlerin götürmek mümkün.

İdeal olarak, burada açıklanan protokol tek transkript overexpression veri ve herhangi bir sonraki bulgular için durum artırmak için devirme veya nakavt çalışmalar, fonksiyonel etkileri gibi diğer destekleyici bilgilerle eşleştirilmiş olabilir. Bu teknik herhangi bir gen belirli bir hücreye overexpressing sağlam bir yol sunar. LncRNA biyoloji, zavallı türlerin koruma gibi sınırlamaları verilen gibi burada da açıklanan teknikleri kendi işlevleriyle ilgili hücre türleri keşfetmek için kritik öneme sahiptir. Bu çalışmada İnflamatuar bağırsak hastalığı patofizyolojisi karıştığı olmuştur, ancak diğer lncRNAs insan hastalık Biyoloji işlev okuyan bir model olarak hizmet veren bir lncRNA üzerinde duruldu.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

C.P. RO1 DK60729 ve P30 DK 41301-26 tarafından desteklenir. D.P. bir Crohn & kolit Vakfı (CCFA) kariyer geliştirme Ödülü tarafından tedavi desteklenmektedir: sindirim hastalıkları Araştırma Merkezi (DDRC) DK41301 ve UCLA klinik ve çevirim Bilim Enstitüsü (CTSI) UL1TR0001881. UCLA Viroloji çekirdek Merkezi, AIDS Araştırma (CFAR tarafından) finanse edildi 5 P 30 AI028697 verin. UCLA entegre moleküler çekirdek tedavi/P30 tarafından desteklenen teknolojilerin DK041301 verin. Bu eser de UCLA AIDS Enstitüsü tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ampicillin Fisher Scientific BP1760-5
CaCl2 Sigma Aldrich C1016
cDNA synthesis kit (iScript) BioRad 1708891
dCas9 forward primer Integrated DNA Technologies n/a 5'-TCGCCACAGCATAAAGAAGA 
dCas9 reverse primer Integrated DNA Technologies n/a 5'-CTTTTCATGGTACGCCACCT
dCas9 vector Addgene 50918
DMEM Corning 10013CM
Ethanol Acros Organics 61509-0010
FBS Sigma Aldrich F2442
gRNA plasmid VectorBuilder VB180119-1195qxv
HEK293T cells ATCC  CRL-1573
HEPES Sigma Aldrich H3375
HPRT1 forward primer Integrated DNA Technologies n/a GACCAGTCAACAGGGGACAT 
HPRT1 reverse primer Integrated DNA Technologies n/a GCTTGCGACCTTGACCATCT
Hygromycin B Corning MT3024CR
Isopropanol Fisher Scientific BP2618-500
Jurkat cells ATCC  TIB-152 clone E6-1
L-glutamine Corning 25005Cl
LB agar Fisher Scientific BP1425-500
LB broth Fisher Scientific BP1426-2
Maxi-prep kit (Plasmid Purification Kit) Qiagen 12362
Na2HPO4 Sigma Aldrich NIST2186II
Optimem I reduced serum media  Gibco 31985070
p24 elisa Perkin Elmer NEK050B
PBS Corning 21-040-CMR
Penicillin and Streptomycin Corning 30-002-Cl
pMDG2.G Addgene   #12259
pMDLg/pRRE Addgene  #60488
Poly-L-Lysine Sigma Aldrich P-4832
Polybrene EMD Millipore TR-1003
pRSV-REV Addgene #12253
Puromycin dihydrochloride Sigma Aldrich P8833
RNA purification kit (Aurum RNA mini) BioRad 7326820
Sodium Butyrate Sigma Aldrich B5887
SYBR green (iTaq universal) BioRad 1725122
Triton X-100 Sigma Aldrich X100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Miao, Y., et al. Trends of long noncoding RNA research from 2007 to 2016: a bibliometric analysis. Oncotarget. 8 (47), 83114-83127 (2017).
  2. Derrien, T., et al. The GENCODE v7 catalog of human long noncoding RNAs: analysis of their gene structure, evolution, and expression. Genome Research. 22 (9), 1775-1789 (2012).
  3. Johnsson, P., Lipovich, L., Grander, D., Morris, K. V. Evolutionary conservation of long non-coding RNAs; sequence, structure, function. Biochimica et Biophysica Acta. 1840 (3), 1063-1071 (2014).
  4. Perez-Pinera, P., et al. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).
  5. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  6. Maeder, M. L., et al. CRISPR RNA-guided activation of endogenous human genes. Nature Methods. 10 (10), 977-979 (2013).
  7. Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).
  8. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).
  9. Gomez, J. A., et al. The NeST long ncRNA controls microbial susceptibility and epigenetic activation of the interferon-gamma locus. Cell. 152 (4), 743-754 (2013).
  10. Padua, D., et al. A long noncoding RNA signature for ulcerative colitis identifies IFNG-AS1 as an enhancer of inflammation. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 311 (3), G446-G457 (2016).
  11. Collier, S. P., Henderson, M. A., Tossberg, J. T., Aune, T. M. Regulation of the Th1 genomic locus from Ifng through Tmevpg1 by T-bet. Journal of Immunology. 193 (8), 3959-3965 (2014).
  12. Kotake, Y., et al. Long non-coding RNA ANRIL is required for the PRC2 recruitment to and silencing of p15(INK4B) tumor suppressor gene. Oncogene. 30 (16), 1956-1962 (2011).
  13. Gilbert, L. A., et al. Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation. Cell. 159 (3), 647-661 (2014).
  14. Cheng, A. W., et al. Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system. Cell Research. 23 (10), 1163-1171 (2013).
  15. Matouskova, P., et al. Reference genes for real-time PCR quantification of messenger RNAs and microRNAs in mouse model of obesity. PLoS One. 9 (1), e86033 (2014).

Tags

Genetik sayı: 145 lncRNA CRISPR IFNG-AS1 overexpression lentiviral gerçek zamanlı PCR
Gene aktive CRISPR kullanarak uzun kodlamayan RNA'ların overexpressing
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rankin, C. R., Treger, J.,More

Rankin, C. R., Treger, J., Faure-Kumar, E., Benhammou, J., Anisman-Posner, D., Bollinger, A. E., Pothoulakis, C., Padua, D. M. Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR. J. Vis. Exp. (145), e59233, doi:10.3791/59233 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter