Summary
La registrazione a fibra singola è una tecnica elettrofisiologica efficace applicabile al sistema nervoso centrale e periferico. Insieme alla preparazione della DRG intatta con il nervo sciatico attaccato, viene esaminato il meccanismo di guasto della conduzione. Entrambi i protocolli migliorano la comprensione del rapporto del sistema nervoso periferico con il dolore.
Abstract
La registrazione a fibra singola è stata una tecnica elettrofisiologica classica ed efficace negli ultimi decenni a causa della sua applicazione specifica per le fibre nervose nei sistemi nervosi centrali e periferici. Questo metodo è particolarmente applicabile ai gangli della radice dorsale (DRG), che sono neuroni sensoriali primari che presentano una struttura pseudo-unipolare dei processi nervosi. I modelli e le caratteristiche dei potenziali di azione passati lungo gli assoni sono registrati in questi neuroni. Il presente studio utilizza registrazioni in singola fibra in vivo per osservare il fallimento della conduzione dei nervi sciatici nei ratti trattati con adiuvazione di Freund (CFA) completati. Poiché il meccanismo sottostante non può essere studiato utilizzando registrazioni in vivo a singola fibra, le registrazioni patch-clamp dei neuroni DRG vengono eseguite sui preparati di DRG intatto con il nervo sciatico collegato. Queste registrazioni rivelano una correlazione positiva tra l'insufficienza di conduzione e la pendenza crescente del potenziale post-iperpolarizzazione (AHP) dei neuroni DRG negli animali trattati con CFA. Il protocollo per le singole fibre grafiche in vivo consente la classificazione delle fibre nervose attraverso la misurazione della velocità di conduzione e il monitoraggio di condizioni anomale nelle fibre nervose in determinate malattie. La DRG intatta con nervo periferico attaccato consente l'osservazione dell'attività dei neuroni DRG nella maggior parte delle condizioni fisiologiche. La registrazione a fibra singola in modo conclusivo combinato con la registrazione elettrofisiologica dei DRG intatti è un metodo efficace per esaminare il ruolo del fallimento della conduzione durante il processo analgesico.
Introduction
La normale trasmissione di informazioni lungo le fibre nervose garantisce la normale funzione del sistema nervoso. Il funzionamento anomalo del sistema nervoso si riflette anche nella trasmissione del segnale elettrico delle fibre nervose. Ad esempio, il grado di demielinazione nelle lesioni di demielinazione centrale può essere classificato mediante il confronto dei cambiamenti nella velocità di conduzione nervosa prima e dopo l'intervento applicazione1. È difficile registrare intracellulare le fibre nervose, tranne che in preparazioni speciali come l'assone gigante dei calamari2. Pertanto, l'attività elettrofisiologica è registrabile solo tramite la registrazione extracellulare di singole fibre. Come uno dei metodi elettrofisiologici classici, la registrazione a fibra singola ha una storia più lunga rispetto ad altre tecniche. Tuttavia, meno elettrofisiologi che afferrano questo metodo nonostante la sua ampia applicazione. Pertanto, per la sua applicazione appropriata è necessaria un'introduzione dettagliata del protocollo standard per la registrazione a fibra singola.
Anche se varie tecniche patch-clamp hanno dominato lo studio elettrofisiologico moderno, la registrazione a fibra singola svolge ancora un ruolo insostituibile nella registrazione delle attività delle fibre nervose, in particolare le fibre che trasmettono sensazioni periferiche con la loro corpo cellulare sensoriale situato nel ganglione della radice dorsale (DRG). Il vantaggio di utilizzare la registrazione a fibra singola qui è che la registrazione in fibra in vivo fornisce un lungo tempo di osservazione con la capacità di registrare le risposte agli stimoli naturali in modelli preclinici senza disturbo dell'ambiente intracellulare3 , 4.
Un numero crescente di studi negli ultimi due decenni ha esaminato funzioni complesse lungo le fibre nervose5, e il fallimento di conduzione, che è definito come uno stato di trasmissione dell'impulso nervoso infruttuoso lungo l'assone, era presente in molti diversi nervi periferici6,7. La presenza di fallimento di conduzione nella nostra indagine è servita come un meccanismo intrinseco autoinibitorio per la modulazione dell'input nocicettivo persistente lungo le fibre C8. Questo fallimento di conduzione è stato significativamente attenuato in condizioni di iperalgesia4,9. Pertanto, il targeting dei fattori coinvolti nell'insufficienza di conduzione può rappresentare un nuovo trattamento per il dolore neuropatico. Per osservare il fallimento della conduzione, il modello di cottura deve essere registrato e analizzato sulla base di picchi scaricati in sequenza in base alla registrazione a fibra singola.
Per comprendere a fondo il meccanismo di fallimento della conduzione, è necessario identificare le proprietà di trasmissione dell'assone, o più precisamente, le proprietà della membrana dei neuroni DRG, in base alle loro proprietà anatomiche pseudo-unipolari. Molti studi precedenti in questo campo sono stati eseguiti su neuroni DRG dissociati10,11, che potrebbero non essere fattibili per lo studio del fallimento della conduzione a causa di due ostacoli. In primo luogo, vari metodi meccanici e chimici vengono utilizzati nel processo di dissociazione per liberare i neuroni DRG, che può provocare cellule malsane o alterare il fenotipo / proprietà dei neuroni e confondere i risultati. In secondo luogo, i nervi periferici attaccati sono fondamentalmente rimossi, e i fenomeni di guasto di conduzione non sono osservabili in questi preparati. Pertanto, una preparazione di neuroni DRG intatti con un nervo attaccato è stato migliorato per evitare gli ostacoli di cui sopra.
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Protocol
L'attuale protocollo segue la Guida per la politica del Servizio Sanitario Pubblico degli Stati Uniti sulla cura umana e l'uso degli animali da laboratorio, e il Comitato per l'etica degli esperimenti sugli animali della Quarta Università Medica Militare ha approvato il protocollo.
1. Animali
- Dividere 24 ratti Sprague-Dawley (4-8 settimane) in due gruppi. Produci il modello completo di adiuvante di Freund (CFA) mediante iniezione intraplantara di 100 Gradi l di CFA in un gruppo di 14 ratti e un altro gruppo di 10 ratti per trattamento con salina.
NOTA: Tutti gli animali sono stati acquisiti dal Centro Animali della Quarta Università Militare di Medicina. I ratti Maschi adulti e Femmine Sprague-Dawley (150-200 g) sono stati utilizzati per tutte le procedure, e i ratti sono stati assegnati casualmente alle gabbie. Due ratti sono stati alloggiati per gabbia sotto un ciclo di luce/buio di 12 ore e mezza ad una temperatura costante (25 1 gradi centigradi) con libero accesso al cibo e all'acqua.
2. In Vivo Registrazione in fibra singola
- Preparare e disinfettare tutti gli strumenti chirurgici (scalpel, pinzette, forbici oftalmiche, forbici da tosatura, ago di separazione del vetro, ago di sutura, rongeur osseo) prima dell'intervento. Preparare 1 L o 2 L della normale soluzione extracellulare di Ringer (in mM: NaCl 124, KCl 3, MgSO4 1.3, CaCl2 2, NaHCO3 26, NaH2PO4 1.25, glucosio 15; pH 7.4 e 305 mOsm). Conservare a 4 gradi centigradi fino all'uso.
- Anestesizza i ratti. Nei giorni da 3 a 7 dopo l'iniezione di CFA, utilizzare l'iniezione intraperitoneale di una soluzione mista (1% di cloralo e 17% di uretano, 5 mL/kg di peso corporeo) per mantenere gli animali in una condizione estetica stabile durante l'esperimento. Applicare l'iniezione supplementare di anestetici, se necessario, dopo aver controllato le pupille e la risposta alla stimolazione del dolore. Monitorare e mantenere una temperatura corporea vicino a 37 gradi centigradi.
-
Esposizione del tronco nervoso sciatico per la registrazione
- Tagliare aprire la pelle e il muscolo sulla parte dorsale della coscia. Eseguire una dissezione smussata lungo bicipiti femorali. Isolare con attenzione il tronco nervoso sciatico utilizzando forbici oftalmiche e un ago di separazione del vetro. Mantenere il tessuto bagnato utilizzando la soluzione Ringer.
- Fissare l'animale su un cerchio di metallo fatto in casa (3 cm di lunghezza, 2 mm di larghezza telaio metallico con un filo di ferro 1 mm di diametro) cucendo la pelle nella fessura intorno ad esso. Tirare la pelle leggermente in modo da stabilire un bagno fluido.
- Esporre 1 cm di tronco nervoso sciatico sul lato prossimale. Posizionare una piccola piattaforma marrone sotto il tronco nervoso per migliorare il contrasto e osservare chiaramente il tronco nervoso fine. Riscaldare la paraffina liquida in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi e farla cadere sulla parte superiore del tronco nervoso per evitare l'essiccazione della superficie della fibra. Rimuovere il pia mater spinalis e dura mater intorno al nervo sciatico.
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seduta di registrazione
- Selezionare come elettrodo di registrazione un filamento di platino (29 m di diametro). Riscaldare per modellare più facilmente e creare un piccolo gancio alla fine. Fissare l'elettrodo a un micromanipolatore per spostare l'elettrodo in base alle esigenze.
- Nella vasca da bagno, posizionare un elettrodo di riferimento nel tessuto sottocutaneo adiacente. Dividere la dura spinale e il pia mater. Separare il nervo sciatico in un'unica fibra (15-20 m di diametro) nella piscina di registrazione. Quindi, prendere un fine fascino di assone e sospendere l'estremità prossimale dell'assone sul gancio dell'elettrodo di registrazione sotto uno stereoscopio a 25x ingrandimento.
NOT: I filamenti appena sezionati tendono ad essere più spessi e richiedono un'ulteriore separazione fino a quando non può essere registrata una singola unità. - Identificare il campo ricettivo di una singola fibra C nocicettiva utilizzando uno stimolo meccanico (peli di Von Frey) e uno stimolo termico (piccolo batuffolo di cotone con 50-55 gradi centigradi). In breve, se la cottura della fibra nervosa risponde agli stimoli meccanici e all'acqua calda, considerala come una fibra C nocicettiva polimodale4. Successivamente, inserire due elettrodi stimolatori ago (intervallo 2 mm) nella pelle del campo identificato per la consegna di stimoli elettrici.
- Visualizzare la forma d'onda di un potenziale d'azione su oscilloscopio e utilizzare una scheda A/D del computer con una frequenza di campionamento del segnale di 20 kHz per amplificare e registrare i picchi.
- Raccogliere dati utilizzando il software di acquisizione dati (Tabella dei materiali). Salvare i dati su un computer e analizzarli in un secondo momento con software professionale (Tabella dei materiali).
3. Misurazione del fallimento della conduzione
- Consegnare gli stimoli elettrici ripetitivi (durata 0,8 ms, intensità soglia 1,5x) in frequenze diverse (2 Hz, 5 Hz, 10 Hz) a una fibra C per 60 s4,8,9. Lasciare un intervallo di 10 min per la fibra per rilassarsi tra gli stimoli. Calcolare il rapporto tra il numero di errori e il numero di impulsi di stimolo ripetitivo consegnati e moltiplicare per 100% per ottenere il grado di fallimento della conduzione.
4. Preparazione di Iintact DRG attaccato con nervi sciatico
- Preparare gli strumenti chirurgici e la soluzione extracellulare di Ringer come descritto al passaggio 2.1.
- Separare il DRG con il nervo sciatico attaccato.
- Anestesizzare i ratti come descritto al punto 2.2 (Nei giorni da 3 a 7 dopo l'iniezione CFA). Tagliare i capelli sulla schiena e sulla gamba con le forbici di tosatura e sterilizzare la pelle con tintura di iodio.
- Per l'esposizione DRG, prima tagliare la pelle dalla linea mediana della schiena a livello del segmento L4 a L5. Rimuovere i muscoli, il processo di colonna vertebrale, scheda vertebrale, e il processo trasversale utilizzando un rongeur osseo per esporre il midollo spinale e corpo DRG. Coprire il midollo spinale esposto e la DRG con i cotoni infiltrati dalla normale soluzione extracellulare di Ringer per mantenere l'attività neurale. Fermare l'emorragia e cancellare il sangue in tempo.
- Esporre il nervo sciatico da due direzioni: rimuovere il l'L4 alla struttura ossea S1 sopra il forame vertebrale utilizzando forbici oftalmiche per esporre il nervo spinale collegato alla DRG che si trova all'estremità sciatica prossimale del nervo sciatico. Tagliare aprire la pelle per esporre il nervo sciatico alla coscia centrale. Separare e scollegare il nervo sciatico dall'estremità distale del nervo dove va all'interno del muscolo, e silegare il tronco nervoso con la linea chirurgica alla fine del nervo prima del taglio.
- Separare il nervo sciatico dal tessuto connettivo sottostante utilizzando forbici oftalmiche tramite il sollevamento del punto di legatura nervosa. Rimuovere la dura dal midollo spinale e separare il DRG dal tessuto connettivo sottostante sollevando la radice dorsale fino a raggiungere la parte adiacente del nervo sciatico. Così, isolare l'intera preparazione di DRG con un nervo sciatico attaccato.
- Cancellare la superficie del DRG.
- Rimuovere con attenzione la dura spinale sulle superfici di L4-L6 DRG utilizzando una pinzetta sotto uno stereoscopio con ingrandimento 4x.
- Posizionare il DRG con il nervo sciatico attaccato in un tubo di vetro contenente 1 mL di enzimi misti (0,2% di proteinasi e 0,32% collagenasi) e digerire in un bagno d'acqua a 37 gradi per 15 min (soffiare leggermente con un contagocce di plastica ad un intervallo di 5 min).
- Sollevare l'estremità della linea di legatura e spostare la preparazione in un piatto riempito con la normale soluzione extracellulare di Ringer per lavare l'enzima. Quindi trasferire il DRG digerito in un contenitore (Figura 1A) riempito con la soluzione extracellulare di Ringer ossigenato per la registrazione.
- seduta di registrazione
- Preparare la soluzione intracellulare (in mM: gluconato di potassio 120, KCl 18, MgCl2 2, etilene glicol-bis(etere-aminoethyl)-N,N,N',N'-tetraacetic acid [EGTA] 5, HEPES 10, Na2-ATP 5, Na-GTP 0.4, CaCl2 1; pH 7.2 e 300 mOsm). Mantenere a 0 gradi centigradi fino all'uso.
- Stabilizzare i gangli utilizzando un'ancora a fette e collegare l'estremità del nervo a un elettrodo stimolante per l'aspirazione (Figura 1A). Visualizza e seleziona un neurone DRG con un obiettivo di immersione in acqua a ingrandimento 40x.
- Tirare un elettrodo (Tabella dei materiali) e riempirlo con soluzione intracellulare. Inserire l'elettrodo sul supporto e applicare una pressione positiva nella pipetta con una resistenza finale di 4-7 M.
- Avvicina l'elettrodo alla cella e toccalo. Dare una pressione negativa nella pipetta, una volta raggiunta la guaritura di G, impostare il potenziale della membrana a circa -60 mV e quindi stabilire la modalità di registrazione a tutta cell.
- Fornire stimoli ripetitivi di 5-50 Hz al nervo sciatico attraverso l'elettrodo di aspirazione per lo screening per il guasto di conduzione. Misurare l'ampiezza del potenziale post-iperpolarizzazione (AHP) dalla linea di base al picco e la durata di 80% AHP.
NOT: Per analizzare i dati è stata utilizzata l'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA; per più di due gruppi) o il test t di Student (solo per due gruppi). I dati sono presentati come mezzi : errore standard della media (SEM). Il livello di significatività statistica è stato fissato a p < 0,05.
- Terminare l'esperimento
- Quando il compito sperimentale è terminato mentre i ratti sono ancora in situazione anestetica, i ratti sono umanamente eutanasiati con iniezioni intracardiache di sodio pentobarbitale overdose.
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Representative Results
L'esito del protocollo di registrazione a fibra singola dipende dalla qualità della dissezione della fibra. L'animale per gli esperimenti in vivo deve essere in una buona situazione per mantenere il tronco nervoso sano per una facile dissezione (vedi consigli nella sezione discussione). Un bagno di applicazione farmaco è necessario in molti casi per la somministrazione di farmaci sulle fibre. La figura 1 illustra come è stata gestita la registrazione in a fibra singola in vivo (Figura 1A) e presenta una registrazione classica dal nervo sciatico degli animali trattati con CFA (Figura 1B).
I seguenti esperimenti hanno studiato l'esistenza di un fallimento della conduzione negli animali trattati con CFA. Questa indagine si basava sull'ipotesi che il fallimento della conduzione lungo le nocicettive fibre C fosse un fenomeno comune, e il grado di fallimento della conduzione era significativamente attenuato in condizioni di iperalgesia, che sono supportate dalla nostra studi precedenti4,8,9,12. La figura 2A mostra che il fallimento della conduzione della fibra C è stato osservato negli animali normali. Tuttavia, il grado di insufficienza di conduzione è stato ridotto in modo significativo dopo l'istituzione di iperalgesia indotta da CFA dopo l'iniezione di CFA nel piede rispetto al controllo (Figura 2B). Questi dati dimostrano che l'insufficienza di conduzione delle fibre Nocettive polimodali rilevanti per il dolore è attenuata nel modello CFA del dolore infiammatorio.
Per esaminare il meccanismo intracellulare durante il guasto alla conduzione, è stata utilizzata la preparazione di DRG intatto con nervo sciatico attaccato (Figura 3A,B). La figura 3C mostra che all'interno della serie di stimoli, i picchi in risposta agli stimoli ripetitivi accumulati sul precedente potenziale post-iperpolarizzazione (AHP) e hanno provocato una diminuzione della pendenza in aumento del seguente AHP (Figura 3C,D ). La presenza di AHP in piccoli neuroni DRG attiva potenzialmente canali di 13,14,15. L'effetto cumulativo di AHP svolge un ruolo nel verificarsi di fallimento di conduzione. Pertanto, abbiamo ipotizzato che bloccare i canali HCN avrebbe migliorato significativamente l'effetto di fallimento della conduzione. Il seguente esperimento ha utilizzato un blocco dei canali HCN, il D7288. Le registrazioni continue hanno rivelato un aumento del fallimento della conduzione in presenza di D7288 in modo dipendente dalla concentrazione. I rientri mostrano le tracce espanse per gli intervalli specificati. È stata osservata una correlazione positiva tra il fallimento della conduzione e il versante crescente dell'AHP nei piccoli neuroni DRG degli animali trattati con CFA (Figura3E).
Figura 1: Registrazioni in vivo in fibra singola di nervi sciatici di ratto. (A) Schema grafico schematico della registrazione a fibra singola che indica le regioni per la registrazione (R) (prima di dividere un filamento per la registrazione, il pia mater spinalis e dura mater sono stati rimossi qui), applicazione di farmaci (D), stimolazione (S), e il sito di CFA Iniezione. (B) Registrazione rappresentativa di una singola fibra sciatica che presenta un modello di cottura tonico. Questa cifra è stata modificata da Wang et al.9 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Il guasto alla conduzione nei ratti trattati con CFA è stato attenuato rispetto ai ratti di controllo. (A) Registrazioni originali consecutive di singole cotture a fibra C da ratti di controllo in risposta alla stimolazione elettrica da 10 Hz. Ogni 20 sweep viene visualizzato (le sweep consecutive erano a intervalli di 2 gradi) e visualizzate dall'alto verso il basso. L'insetto mostra un potenziale d'azione rappresentativo. (B) Registrazioni di singole fibre C da ratti iniettati da CFA in risposta alla stessa stimolazione del pannello A. Questa cifra è stata modificata da Wang etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Misurazione della mancanza di conduzione in fibra C utilizzando preparati di DRG intatto con nervo sciatico attaccato. (A) Diagramma schematico che illustra l'impostazione e il posizionamento dei preparati DRG. SE: elettrodo di stimolazione; SN: nervo sciatico; FM: microscopio a fluorescenza; RE: elettrodo di registrazione. (B) L'intero esemplare di DRG osservato sotto una vista 40x, è stato utilizzato un microelettrodo (ombra destra) per l'applicazione di patch a un piccolo neurone DRG. (C) Registrazioni continue delle risposte di attivazione in serie a stimolazione a 5 Hz in condizioni di controllo o di somministrazione di diverse concentrazioni di D7288 in un neurone DRG di piccolo diametro proveniente da ratti trattati con CFA. I rientri mostrano tracce espanse per i periodi di registrazione specificati. Le macchie scure rappresentano guasti ai picchi. (D) Tracce rappresentative utilizzate per misurare la pendenza in aumento dell'AHP. La pendenza in aumento era uguale alla differenza di ampiezza tra le tensioni AHP massime e minime (mV) divise per durata (intervallo di stimoli, in secondi). Il pannello di sinistra illustra una pendenza in aumento più grande (dalla prima traccia nel pannello C contrassegnata con il simbolo "z") e il pannello di destra mostra una pendenza in aumento più piccola (dalla quarta traccia nel pannello C contrassegnata con "") dopo l'applicazione di D7288 (125M). (E) Relazione tra il grado di fallimento della conduzione e l'aumento del pendio dell'AHP in risposta alle diverse concentrazioni di D7288. < 0,05 rispetto al controllo. Questa cifra è stata modificata da Wang etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Anche se studi recenti hanno ottenuto l'imaging del calcio dei neuroni DRG in vivo16, l'esecuzione della registrazione in vivo di morsetti da singoli nocicettori DRG rimane estremamente impegnativa. Pertanto, un approccio in vivo a fibra singola per il campo del dolore è di continua importanza. La registrazione a fibra singola nel presente protocollo consente l'osservazione oggettiva dei fenomeni di guasto della conduzione, e la combinazione di questa tecnica con la preparazione ex vivo sviluppata nell'attuale studio consente l'esame dei meccanismi sottostanti cambiamenti di eccitabilità dei nocicettori nei modelli preclinici. Tre fasi del protocollo di registrazione a fibra singola sono fondamentali per la corretta registrazione. In primo luogo, è fondamentale prestare attenzione all'anestesia dell'animale. In elaborati esperimenti di registrazione in vivo, la lunghezza della fibra sottile che viene avvolta intorno all'elettrodo di platino di 29 m è solo 2-3 mm, che è facilmente interferibile durante il processo di registrazione. Se la condizione anestetica non è particolarmente stabile, piccoli movimenti degli animali possono portare a guasti di registrazione delle attività elettrofisiologiche. In secondo luogo, la preparazione deve essere continuamente coperta con paraffina. Lo scopo di questa manipolazione è quello di mantenere l'attività delle fibre. Un adeguato slot di registrazione è stato generalmente costruito utilizzando la pelle degli animali. Per evitare perdite di olio di paraffina, la parete della fessura può essere rafforzata utilizzando super colla, e l'olio di paraffina deve essere aggiunto quando necessario. La fibra non può asciugarsi durante l'intero test. Infine, l'ambiente intorno al tronco nervoso deve essere mantenuto in modo sano. C'è sempre qualche liquido di effusione presente intorno all'area di registrazione, e questa effusione è un ostacolo per registrazioni di buona qualità. L'ampiezza dell'attività della fibra continuerà a diminuire e, in ultima analisi, diventerà indistinguibile dal rumore di base estremo, che causa un guasto di registrazione. Un tubo di siringa fatto in casa è necessario per raggiungere in profondità nella parte inferiore della fessura per succhiare il liquido di effusione. A volte, un batuffolo di cotone semi- asciutto in salina è anche utile.
Nel presente studio, è stato applicato un modello CFA che produce infiammazione del piede e iperalgesia dopo l'iniezione di CFA. Al fine di studiare le proprietà del discarico afferente periferico e dei meccanismi sottostanti, nell'esperimento non sono stati utilizzati analgesici, che è una pratica di routine nella ricerca sul dolore ed è approvata dal comitato IACUC/Etica. Il presente studio introduce una tecnica di registrazione in singola fibra in vivo per osservare le alterazioni del processo di trasmissione che si verificano in fibre C nocicettive dotate di stimoli elettrici ripetitivi. È stato dimostrato che il grado di guasto della conduzione è stato significativamente attenuato in condizioni iperalgesiche, ma non è stato possibile studiare il meccanismo sottostante utilizzando la registrazione a fibra singola a causa di difficoltà tecniche nel bloccaggio delle patch Fibre C. Pertanto, lo studio della relazione tra fallimento della conduzione e cambiamenti nel potenziale della membrana dei neuroni DRG di piccolo diametro è stato rilevato utilizzando la preparazione di DRG intatto con il nervo sciatico attaccato. Invece della registrazione a fibra singola, il morsetto utilizzando tali preparazioni esplora i meccanismi dipendenti da AHP per la produzione di guasti di conduzione. Utilizzando questo protocollo, anche se solo pochi neuroni di superficie potrebbero essere selezionati, il grado di insufficienza di conduzione a livello di neuroni DRG era ancora in grado di essere registrato, anche con la somministrazione di droga.
DRG hanno due membrane esterne: il pia mater spinalis e dura mater. Il dura mater deve essere rimosso utilizzando pinzette per la molla per capelli, e il pia mater spinalis deve essere digerito (digestione moderata, non come serie utilizzata nell'isolamento di singole cellule DRG) per garantire che gli elettrodi patch-clamp possano raggiungere la superficie delle cellule DRG per formarsi un sigillo; in caso contrario, è impossibile ottenere registrazioni patch-clamp. L'approccio attuale conserva più completamente l'input nervoso periferico rispetto alle fette di DRG più il nervo e assicura che la registrazione patch-clamp dei neuroni DRG sia facilmente raggiungibile. Questo protocollo ha ampie prospettive applicative per migliorare la comprensione del sistema nervoso periferico che riguarda il dolore, come lo studio dei cambiamenti elettrofisiologici in diversi neuroni DRG in diversi modelli di dolore cronico17 ,18 e meccanismi molecolari alla base di un'attività spontanea anormale nella DRG con assoni mielinati o non mielinati19,20.
La preparazione di DRG intatto con nervo sciatico attaccato qui presentato ha molti vantaggi rispetto al metodo tradizionale ganglio dissociato, perché la struttura della DRG rimane fondamentalmente ininterrotta in questa preparazione. Pertanto, simula condizioni reali in vivo e fornisce un microambiente preferibile per l'attività fisiologica. La preparazione di DRG intatto con nervo sciatico attaccato produce meno danni neuronali rispetto alla preparazione dissociata DRG perché quest'ultimo processo utilizza più enzimi digestivi e azioni fisiche esterne (ad esempio, taglio e soffiaggio delle cellule), che provoca più danni alle cellule. La maggior parte degli studi elettrofisiologici sono ancora eseguiti su neuroni DRG dissociati21,22, e il processo di dissociazione stesso danneggia le cellule, che si traduce in ipereccitazioni anomale dei neuroni23. Un altro vantaggio di questo protocollo è che le attività elettrofisiologiche extracellulari afferenti sono ottenute anche perché le proiezioni nervose rimangono, il che consente di investigare le interazioni tra picchi afferenti e DRG somatici spontanei Scarichi. Infine, questa preparazione conserva i neuroni DRG e le cellule gliali del satellite, e solo i neuroni DRG rimangono nei protocolli di dissociazione. Le cellule gliali terrestri, che sono essenziali per mantenere il microambiente della DRG, sono una barriera che protegge i singoli neuroni DRG24, e queste cellule meritano ulteriori studi.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti della National Natural Science Foundation of China (31671089 e 81470060) e del Shaanxi Provincial Social Development Science and Technology Research Project (2016SF-250).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments and software used in single fiber recording | |||
| Amplifier | Nihon kohden | MEZ-8201 | Amplification of the electrophysiological signals |
| Bioelectric amplifier monitor | ShangHai JiaLong Teaching instrument factory | SZF-1 | Monitor firing process via sound which is transformed from physiological discharge signal |
| Data acquisition and analysis system | CED | Spike-2 | Software for data acquisition and analysis |
| Electrode manipulator | Narishige | SM-21 | Contro the movement of the electrode as required |
| Hairspring tweezers | A.Dumont | 5# | Separate the single fiber |
| Isolator | Nihon kohden | SS-220J | |
| Memory oscilloscope | Nihon kohden | VC-9 | Display recorded discharge during |
| Experiment | |||
| Stereomicroscope | ZEISS | SV-11 | Have clear observation when separate the local tissue and single fiber |
| Stimulator | Nihon kohden | SEZ-7203 | Delivery of the electrical stimuli |
| Von Frey Hair | Stoelting accompany | Delivery of the mechanical stimuli | |
| Water bath | Scientz biotechnology Co., Ltd. | SC-15 | Heating paroline to maintain at 37 °C |
| Instruments and software used in patch clamp recording | |||
| Amplifier | Axon Instruments | Multiclamp 700B | Monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the stimuli by sending a signal to the electrode |
| Anti-vibration table | Optical Technology Co., Ltd. | Isolates the recording system from vibrations induced by the environment | |
| Camera | Olympus | TH4-200 | See the neurons in bright field; the controlling software allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell |
| Clampex | Axon | Clampex 9.2 | Software for data acquisition and delivery of stimuli |
| Clampfit | Axon | Clampfit 10.0 | Software for data analysis |
| Electrode puller | Sutter | P-97 | Prepare recording pipettes of about 2μm diameter with resistance about 5 to 8 MΩ |
| Glass pipette | Sutter | BF 150-75-10 | |
| Micromanipulator | Sutter | MP225 | Give a precise control of the microelectrode |
| Microscope | Olympus | BX51WI | Upright microcope equipped with epifluorescence for clearly observe the cells which would be patched |
| Origin | Origin lab | Origin 8 | Software for drawing picture |
| Perfusion Pump | BaoDing LanGe Co., Ltd. | BT100-1J | Perfusion of DRG in whole-cell patch clamp |
| Other instruments | |||
| Electronic balance | Sartorius | BS 124S | Weighing reagent |
| pH Modulator | Denver Instrument | UB7 | Adjust pH to 7.4 |
| Solutions/perfusion/chemicals | |||
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | Extracellular solution |
| Chloralose | Shanghai Meryer Chemical Technology Co., Ltd. | M07752 | Mixed solution for Anesthesia |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | SLBQ1885V | Enzyme used for clearing the surface of DRG |
| D (+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Extracellular solution |
| Liquid Paraffin | TianJin HongYan Reagent Co., Ltd. | Maintain fiber wetting | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | Extracellular solution |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | Extracellular solution |
| Protease | Sigma-Aldrich | 62H0351 | Enzyme used for clearing the surface of DRG |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5671 | Extracellular solution |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | Extracellular solution |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | Extracellular solution |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | Extracellular solution |
| Urethane | Sigma-Aldrich | U2500 | Mixed solution for Anesthesia |
References
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