Summary
Die Singlefaseraufzeichnung ist eine effektive elektrophysiologische Technik, die auf das zentrale und periphere Nervensystem anwendbar ist. Zusammen mit der Vorbereitung der intakten DRG mit dem angeschlossenen Ischiasnerv wird der Mechanismus des Leitungsversagens untersucht. Beide Protokolle verbessern das Verständnis der Beziehung des peripheren Nervensystems mit Schmerzen.
Abstract
Die Singlefaseraufzeichnung war in den letzten Jahrzehnten aufgrund ihrer spezifischen Anwendung für Nervenfasern im zentralen und peripheren Nervensystem eine klassische und effektive elektrophysiologische Technik. Diese Methode ist besonders auf dorsale Wurzelganglien (DRG) anwendbar, die primäre sensorische Neuronen sind, die eine pseudo-unipolare Struktur von nervenaufworastrien Prozessen aufweisen. Die Muster und Merkmale der Aktionspotentiale, die entlang von Axonen weitergegeben werden, sind in diesen Neuronen nachweisbar. Die vorliegende Studie verwendet in vivo Singlefaser-Aufnahmen, um das Leitungsversagen von Ischiasnerven bei vollständig Freunds adjuvant (CFA)-behandelten Ratten zu beobachten. Da der zugrunde liegende Mechanismus nicht mit in vivo Singlefaser-Aufnahmen untersucht werden kann, werden Patch-Clamp-Aufnahmen von DRG-Neuronen auf Präparaten intakter DRG mit dem angeschlossenen Ischiasnerv durchgeführt. Diese Aufnahmen zeigen eine positive Korrelation zwischen Leitungsversagen und der steigenden Steigung des Nachhyperpolarisationspotenzials (AHP) von DRG-Neuronen bei CFA-behandelten Tieren. Das Protokoll für in vivo Einzelfaser-Aufnahmen ermöglicht die Klassifizierung von Nervenfasern über die Messung der Leitungsgeschwindigkeit und die Überwachung von abnormalen Erkrankungen in Nervenfasern bei bestimmten Krankheiten. Intaktes DRG mit angeschlossenem peripheren Nerv ermöglicht die Beobachtung der Aktivität von DRG-Neuronen unter den meisten physiologischen Bedingungen. Abschließend ist die Singlefaseraufzeichnung in Kombination mit der elektrophysiologischen Aufzeichnung intakter DRGs eine effektive Methode, um die Rolle des Leitungsversagens während des analgetischen Prozesses zu untersuchen.
Introduction
Die normale Übertragung von Informationen entlang der Nervenfasern garantiert die normale Funktion des Nervensystems. Abnormale Funktion des Nervensystems spiegelt sich auch in der elektrischen Signalübertragung von Nervenfasern wider. Beispielsweise kann der Grad der Demyelination bei zentralen Demyelinationenläsionen durch Vergleich von Veränderungen der Nervenleitungsgeschwindigkeit vor und nach der Intervention anwendung1klassifiziert werden. Es ist schwierig, Nervenfasern intrazellulär aufzuzeichnen, außer bei speziellen Präparaten wie dem Tintenfischriesen Axon2. Daher ist die elektrophysiologische Aktivität nur über die extrazelluläre Aufzeichnung einzelner Fasern beschreibbar. Als eine der klassischen elektrophysiologischen Methoden hat die Singlefaseraufzeichnung eine längere Geschichte als andere Techniken. Allerdings greifen trotz ihrer umfangreichen Anwendung weniger Elektrophysiologen nach dieser Methode. Daher ist eine detaillierte Einführung des Standardprotokolls für die Singlefaseraufzeichnung für die entsprechende Anwendung erforderlich.
Obwohl verschiedene Patch-Clamp-Techniken die moderne elektrophysiologische Studie dominiert haben, spielt die Singlefaseraufzeichnung immer noch eine unersetzliche Rolle bei der Aufzeichnung der Aktivitäten von Nervenfasern, insbesondere Fasern, die periphere Empfindungen mit ihren Sinneszellkörper in Dorsalwurzelganglion (DRG). Der Vorteil der Verwendung von Singlefaser-Aufzeichnung hier ist, dass in vivo Faseraufzeichnung bietet eine lange Beobachtungszeit mit der Fähigkeit, Reaktionen auf natürliche Reize in präklinischen Modellen ohne Störung der intrazellulären Umgebung3 , 4.
Eine zunehmende Anzahl von Studien in den letzten zwei Jahrzehnten hat komplexe Funktionen entlang der Nervenfasern untersucht5, und Leitungsversagen, das als ein Zustand der erfolglosen Nervenimpulsübertragung entlang des Axons definiert ist, war in vielen verschiedenen periphere Nerven6,7. Das Vorhandensein von Leitungsversagen in unserer Untersuchung diente als intrinsischer Selbsthemmungsmechanismus für die Modulation persistenter nozizeptiver Eingaben entlang der C-Fasern8. Dieser Leitungsfehler wurde unter Bedingungen der Hyperalgesie4,9signifikant abgeschwächt. Daher kann die Ausrichtung auf die Faktoren, die an einem Leitungsversagen beteiligt sind, eine neue Behandlung für neuropathische Schmerzen darstellen. Um Leitungsfehler zu beobachten, sollte das Brennmuster auf der Grundlage sequenziell entladener Spitzen auf der Grundlage von Singlefaseraufzeichnungen aufgezeichnet und analysiert werden.
Um den Mechanismus des Leitungsversagens gründlich zu verstehen, ist es notwendig, die Transmissionseigenschaften des Axons, genauer gesagt, die Membraneigenschaften von DRG-Neuronen zu identifizieren, basierend auf ihren pseudo-unipolaren anatomischen Eigenschaften. Viele frühere Studien in diesem Bereich wurden an dissoziierten DRG-Neuronen10,11durchgeführt, die für die Untersuchung von Leitungsversagen aufgrund von zwei Hindernissen möglicherweise nicht durchführbar sind. Zunächst werden verschiedene mechanische und chemische Methoden im Dissoziationsprozess verwendet, um DRG-Neuronen zu befreien, was zu ungesunden Zellen führen oder den Phänotyp/die Eigenschaften der Neuronen verändern kann und die Befunde verwirrt. Zweitens werden die angeschlossenen peripheren Nerven im Grunde entfernt, und Leitungsversagen Phänomene sind in diesen Präparaten nicht beobachtbar. Daher wurde eine Vorbereitung von intakten DRG-Neuronen mit einem angeschlossenen Nerv verbessert, um die oben genannten Hindernisse zu vermeiden.
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Protocol
Das aktuelle Protokoll folgte dem Leitfaden für die Politik des United States Public Health Service zur humanen Pflege und Verwendung von Labortieren, und das Komitee für die Ethik von Tierversuchen der Vierten Militärmedizin-Universität billigte das Protokoll.
1. Tiere
- Teilen Sie 24 Sprague-Dawley-Ratten (4-8 Wochen alt) in zwei Gruppen auf. Produzieren Sie das vollständige Freund-Adjuvans-Modell (CFA) durch intraplantare Injektion von 100 l CFA in einer Gruppe von 14 Ratten und einer weiteren Gruppe von 10 Ratten durch Behandlung mit Kochsaline.
HINWEIS: Alle Tiere wurden vom Tierzentrum der Vierten Militärmedizinischen Universität erworben. Erwachsene männliche und weibliche Sprague-Dawley-Ratten (150-200 g) wurden für alle Verfahren verwendet, und Ratten wurden zufällig Käfigen zugeordnet. Zwei Ratten wurden pro Käfig unter einem 12-/12-stündigen Licht-/Dunkelzyklus bei konstanter Temperatur (25 x 1 °C) mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser untergebracht.
2. In Vivo Single-Faser-Aufnahme
- Bereiten und desinfizieren Sie alle chirurgischen Instrumente (Skalpell, Pinzette, Augenschere, Scherenschere, Glastrennnadel, Nahtnadel, Knochenrongeur) vor der Operation. Bereiten Sie 1 L oder 2 L der normalen Ringer-Extrazelllösung vor (in mM: NaCl 124, KCl 3, MgSO4 1.3, CaCl2 2, NaHCO3 26, NaH2PO4 1.25, Glucose 15; pH 7.4 und 305 mOsm). Bei 4 °C bis zum Gebrauch lagern.
- Anästhesisieren Ratten. Verwenden Sie an den Tagen 3 bis 7 nach der CFA-Injektion eine intraperitoneale Injektion einer gemischten Lösung (1% Chloralose und 17% Urethan, 5 ml/kg Körpergewicht), um die Tiere während des Experiments in einem stabilen ästhetischen Zustand zu halten. Wenden Sie zusätzliche Injektion von Anästhetika, falls erforderlich, nach der Überprüfung der Schüler und die Reaktion auf Schmerzstimulation. Überwachen und halten Sie eine Körpertemperatur in der Nähe von 37 °C.
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Exposition des Ischias-Nervenstamms zur Aufnahme
- Die Haut und den Muskel auf dem dorsalen Teil des Oberschenkels aufschneiden. Führen Sie eine stumpfe Sezierung entlang femoralen Bizeps. Isolieren Sie den Ischiasnervenstamm sorgfältig mit einer Augenschere und einer Glastrennnadel. Halten Sie das Gewebe mit Ringers Lösung nass.
- Fixieren Sie das Tier auf einem hausgemachten Metallreifen (3 cm lang, 2 mm breit Metallreifen mit einem Eisendraht 1 mm Durchmesser) über das Nähen der Haut in den Schlitz um sie herum. Ziehen Sie die Haut leicht nach oben, um ein flüssiges Bad zu etablieren.
- 1 cm Ischiasnervenstamm an der proximalen Seite aussetzen. Legen Sie eine kleine braune Plattform unter den Nervenstamm, um den Kontrast zu verstärken und den feinen Nervenstamm deutlich zu beobachten. Spülen Sie flüssiges Paraffin in einem Wasserbad auf 37 °C und lassen Sie es auf die Oberseite des Nervenstammes fallen, um eine Trocknung der Faseroberfläche zu verhindern. Entfernen Sie die Pia mater spinalis und dura mater um den Ischiasnerv.
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Aufnahmesitzung
- Wählen Sie ein Platin-Filament (29 m Durchmesser) als Aufnahmeelektrode aus. Erhitzen Sie sich für ein einfacheres Formen, und erstellen Sie einen kleinen Haken ganz am Ende. Befestigen Sie die Elektrode an einem Mikromanipulator, um die Elektrode nach Bedarf zu bewegen.
- Legen Sie im Bad eine Referenzelektrode in das angrenzende Unterhautgewebe. Teilen Sie die Spinaldura und die Pia mater. Trennen Sie den Ischiasnerv im Aufnahmebecken in eine einzige Faser (15-20 m Durchmesser). Nehmen Sie dann eine feine Faszikel von Axon und hängen Sie das proximale Ende des Axons am Haken der Aufnahmeelektrode unter einem Stereoskop bei 25-facher Vergrößerung aus.
HINWEIS: Die gerade sezierten Filamente sind tendenziell dicker und erfordern eine weitere Trennung, bis eine einzelne Einheit aufgezeichnet werden kann. - Identifizieren Sie das empfängliche Feld einer einzelnen nozizeptiven C-Faser mit einem mechanischen Reiz (Von Frey-Haar) und thermischen Reizen (kleine Baumwollkugel mit 50-55 °C Wasser). Kurz, wenn das Abfeuern von Nervenfasern auf die mechanischen Reize und heißes Wasser reagieren, dann betrachten Sie es als polymodales Nozizeptiv C-Faser4. Als nächstes legen Sie zwei Nadelstimuluselektroden (2 mm Intervall) in die Haut des identifizierten Feldes für die Abgabe von elektrischen Reizen ein.
- Zeigen Sie die Wellenform eines Aktionspotentials auf Oszilloskop an und verwenden Sie eine Computer-A/D-Platine mit einer Signalabtastungsrate von 20 kHz, um die Spitzen zu verstärken und aufzuzeichnen.
- Sammeln von Daten mithilfe von Datenerfassungssoftware (Tabelle der Materialien). Speichern Sie Daten auf einem Computer und analysieren Sie später mit professioneller Software (Tabelle der Materialien).
3. Messung des Leitungsversagens
- Liefern Sie die sich wiederholenden elektrischen Reize (0,8 ms Dauer, 1,5x Schwellenintensität) in verschiedenen Frequenzen (2 Hz, 5 Hz, 10 Hz) an eine C-Faser für 60 s4,8,9. Lassen Sie ein 10 min Intervall für Faser zwischen den Reizen zu entspannen. Berechnen Sie das Verhältnis der Anzahl der Ausfälle zur Anzahl der gelieferten repetitiven Impulsimpulse und multiplizieren Sie sich mit 100%, um den Grad des Leitungsversagens zu erhalten.
4. Vorbereitung der Iintact DRG mit Ischiasnerv befestigt
- Bereiten Sie chirurgische Werkzeuge und Ringers extrazelluläre Lösung vor, wie in Schritt 2.1 beschrieben.
- Trennen Sie die DRG mit dem angeschlossenen Ischiasnerv.
- Anästhetisieren Sie die Ratten wie in Schritt 2.2 beschrieben (an den Tagen 3 bis 7 nach cfA-Injektion). Schneiden Sie das Haar auf Rücken und Bein mit Schere, und sterilisieren Sie die Haut mit Tinktur von Jod.
- Bei DRG-Exposition die Haut zunächst von der Mittellinie des Rückens auf der Segmentebene L4 bis L5 aufschneiden. Entfernen Sie Muskeln, den Prozess der Wirbelsäule, Wirbelbrett, und Transverderprozess mit einem Knochen rongeur, um das Rückenmark und DRG Körper auszusetzen. Bedecken Sie das exponierte Rückenmark und DRG mit Baumwolle, die von der extrazellulären Lösung von Ringer infiltriert wird, um die neuronale Aktivität aufrechtzuerhalten. Stoppen Sie die Blutung und löschen Sie das Blut rechtzeitig.
- Setzen Sie den Ischiasnerv aus zwei Richtungen aus: Entfernen Sie die Knochenstruktur L4 bis S1 oberhalb des Wirbelforamens mit einer ophthalmologischen Schere, um den mit DRG verbundenen Spinalnerv, der sich am proximalen Ende des Ischiasnervs befindet, freizulegen. Die Haut aufschneiden, um den Ischiasnerv am mittleren Oberschenkel freizulegen. Trennen und trennen Sie den Ischiasnerv vom distalen Ende des Nervs, wo er in den Muskel geht, und ligaten Sie den Nervenstamm mit chirurgischer Linie am Ende des Nervs vor dem Schneiden.
- Trennen Sie den Ischiasnerv mit einer ophthalmologischen Schere durch Heben des Nervenligationspunktes vom darunter liegenden Bindegewebe. Entfernen Sie die Dura aus dem Rückenmark und trennen Sie das DRG vom darunter liegenden Bindegewebe, indem Sie die Rückenwurzel heben, bis sie den angrenzenden Teil des Ischiasnervs erreicht. So isolieren Sie die gesamte Vorbereitung von DRG mit einem angeschlossenen Ischiasnerv.
- Löschen Sie die Oberfläche der DRG.
- Entfernen Sie die Spinaldura auf den Oberflächen des L4-L6 DRG vorsichtig mit einer Pinzette unter einem Stereoskop bei 4-facher Vergrößerung.
- Das DRG mit angeschlossenem Ischiasnerv in ein Glasrohr geben, das 1 ml gemischte Enzyme (0,2% Proteinase und 0,32% Kollagennase) enthält, und 15 min in einem 37 °C-Wasserbad verdauen (mit einem Plastiktropfen im Abstand von 5 min leicht blasen).
- Heben Sie das Ende der Ligationslinie an und bewegen Sie die Zubereitung auf eine Schale, die mit einer normalen ringer extrazellulären Lösung gefüllt ist, um das Enzym auszuwaschen. Dann übertragen Sie das verdautdronierte DRG in einen Behälter (Abbildung1A), gefüllt mit sauerstoffhaltiger Ringer-Extrazelllösung zur Aufnahme.
- Aufnahmesitzung
- Bereiten Sie intrazelluläre Lösung (in mM: Kaliumgluconat 120, KCl 18, MgCl2 2, Ethylenglykol-bis(-Aminoethylether)-N,N,N',N'-Tetraessigsäure [EGTA] 5, HEPES 10, Na2-ATP 5, Na-GTP 0.4, CaCl2 1; pH 7.2 und 300 mOsm). Halten Sie bei 0 °C bis zur Anwendung.
- Ganglien mit einem Scheibenanker stabilisieren und Nervenende mit einer saugstimulierenden Elektrode verbinden (Abbildung 1A). Visualisieren und wählen Sie ein DRG-Neuron mit einem Wasser-Immersionsobjektiv bei 40-facher Vergrößerung aus.
- Ziehen Sie eine Elektrode (Materialtabelle) und füllen Sie sie mit intrazellulärer Lösung. Elektrode auf haltern und positiven Druck in die Pipette mit einem Endwiderstand von 4-7 M anführen.
- Elektrode in die Nähe der Zelle bringen und berühren. Geben Sie einen Unterdruck in der Pipette, sobald die G-Dichtung erreicht ist, stellen Sie das Membranpotential auf etwa -60 mV und legen Sie dann den Ganzzellaufnahmemodus fest.
- Liefern Sie sich wiederholende Reize von 5-50 Hz an den Ischiasnerv durch die Saugelektrode, um auf Leitungsversagen zu überprüfen. Messen Sie die Amplitude des Nachhyperpolarisationspotenzials (AHP) von der Basislinie bis zum Peak und die AHP-Dauer von 80 %.
HINWEIS: Zur Analyse der Daten wurde eine einwegige Varianzanalyse (ANOVA; für mehr als zwei Gruppen) oder der T-Test des Schülers (für nur zwei Gruppen) verwendet. Die Daten werden als Mittel dargestellt, der Standardfehler des Mittelwerts (SEM) ist. Der statistisch signifikante Wert wurde auf p < 0,05 festgelegt.
- Beenden des Experiments
- Wenn die experimentelle Aufgabe beendet ist, während die Ratten noch unter Narkosesituation sind, werden Ratten human mit einer intrakardialen Injektion von Überdosis Pentobarbital-Natrium eingeschläfert.
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Representative Results
Das Ergebnis des Single-Faser-Aufnahmeprotokolls hängt von der Qualität der Fasersektion ab. Das Tier für In-vivo-Experimente muss in einer guten Situation sein, um den Nervenstamm gesund zu halten, um eine einfache Zerlegung zu erhalten (siehe Rat schlagesinimt im Diskussionsteil). Ein Drogenanwendungsbad ist in vielen Fällen für die Medikamentenabgabe auf Fasern erforderlich. Abbildung 1 zeigt, wie die In-vivo-Einzelfaseraufzeichnung betrieben wurde (Abbildung 1A) und zeigt eine klassische Aufnahme vom Ischiasnerv von CFA-behandelten Tieren (Abbildung 1B).
Die folgenden Experimente untersuchten das Vorhandensein eines Leitungsversagens bei CFA-behandelten Tieren. Diese Untersuchung beruhte auf der Annahme, dass ein Leitungsversagen entlang der nozizeptiven C-Fasern ein häufiges Phänomen war und der Grad des Leitungsversagens unter Bedingungen der Hyperalgesie signifikant abgeschwächt wurde, die von unseren vorherige Studien4,8,9,12. Abbildung 2A zeigt, dass bei normalen Tieren ein C-Faser-Leitungsversagen beobachtet wurde. Der Grad des Leitungsversagens wurde jedoch nach der Etablierung einer CFA-induzierten Hyperalgesie nach CFA-Injektion in den Fuß im Vergleich zur Kontrolle signifikant reduziert (Abbildung 2B). Diese Daten zeigen, dass das Leitungsversagen schmerzrelevanter polymodaler nozizeptiver C-Fasern im CFA-Modell von entzündlichen Schmerzen abgeschwächt wird.
Zur Untersuchung des intrazellulären Mechanismus während des Leitungsversagens wurde die Herstellung eines intakten DRG mit angeschlossenem Ischiasnerv verwendet (Abbildung 3A,B). Abbildung 3C zeigt, dass sich innerhalb der Stimulusreihe Spitzen als Reaktion auf sich wiederholende Reize auf das vorherige Nachhyperpolarisationspotential (AHP) anhäuften und zu einer Abnahme der steigenden Steigung des folgenden AHP führten (Abbildung3C,D ). Das Vorhandensein von AHP in kleinen DRG-Neuronen aktiviert potenziell hyperpolarisationsaktivierte, zyklische Nukleotid-modulierte (HCN) Kanäle13,14,15. Die kumulative Wirkung von AHP spielt eine Rolle beim Auftreten eines Leitungsversagens. Daher gehen wir davon aus, dass das Blockieren von HCN-Kanälen den Verhaltensfehlereffekt erheblich verstärken würde. Das folgende Experiment verwendete einen Blocker von HCN-Kanälen, ZD7288. Kontinuierliche Aufnahmen ergaben eine Zunahme des Leitungsversagens in Gegenwart von ZD7288 in konzentrationsabhängiger Weise. Eingaben zeigen erweiterte Ablaufverfolgungen für die angegebenen Intervalle an. Es wurde eine positive Korrelation zwischen Leitungsversagen und der steigenden Steigung des AHP bei kleinen DRG-Neuronen von CFA-behandelten Tieren beobachtet (Abbildung 3E).
Abbildung 1: In vivo Einzelfaseraufnahmen von Ratten-Ischiasnerven. (A) Schematische Darstellung der Einzelfaseraufzeichnung, die die Aufnahmebereiche (R) angibt (vor dem Aufspalten eines Filaments für die Aufnahme wurden hier die Pia mater spinalis und dura mater entfernt), die Arzneimittelanwendung (D), die Stimulation (S) und der Ort der CFA infektion. (B) Repräsentative Aufzeichnung einer Ischias-Einzelfaser mit einem Tonfeuermuster. Diese Abbildung wurde von Wang et al.9geändert.Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Das Leitungsversagen bei CFA-behandelten Ratten wurde im Vergleich zu Kontrollratten abgeschwächt. (A) Original aufeinanderfolgende Aufnahmen einzelner C-Faser-Feuerungen von Kontrollratten als Reaktion auf die elektrische Stimulation von 10 Hz. Jeder 20. Sweep wird angezeigt (aufeinanderfolgende Sweeps waren in 2-s-Intervallen) und von oben nach unten angezeigt. Der Einset zeigt ein repräsentatives Aktionspotenzial. (B) Aufnahmen einzelner C-Fasern von CFA-injizierten Ratten als Reaktion auf die gleiche Stimulation wie in Panel A. Diese Zahl wurde von Wang et al.9geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Messung des C-Faserleitungsversagens mit Präparaten intakter DRG mit angeschlossenem Ischiasnerv. (A) Schematisches Diagramm, das die Einrichtung und Platzierung von DRG-Vorbereitungen veranschaulicht. SE: Stimulationselektrode; SN: Ischiasnerv; FM: Fluoreszenzmikroskop; RE: Aufnahmeelektrode. (B) Ganze DRG-Proben, die unter einer 40-fachen Ansicht beobachtet wurden, wurde eine Mikroelektrode (rechter Schatten) zum Patchen eines kleinen DRG-Neurons verwendet. (C) Kontinuierliche Aufzeichnungen von Serien-Feuerreaktionen auf 5-Hz-Stimulation unter Kontrollbedingungen oder Verabreichung unterschiedlicher Konzentrationen von ZD7288 in einem DRG-Neuron mit kleinem Durchmesser von CFA-behandelten Ratten. Die Einschnitte zeigen erweiterte Ablaufverfolgungen für die angegebenen Aufzeichnungszeiträume an. Dunkle Flecken stellen Spike-Fehler dar. (D) Repräsentative Spuren zur Messung der steigenden Steigung des AHP. Die steigende Steigung entsprach der Amplitudendifferenz zwischen der maximalen und minimalen AHP-Spannung (mV) geteilt durch Die Dauer (Intervall der Reize, in Sekunden). Der linke Bereich zeigt eine größere steigung (von der ersten Spur in Panel C mit "*" markiert), und das rechte Panel zeigt eine kleinere ansteigende Steigung (von der vierten Spur in Panel C mit der Aufschrift "A" markiert) nach ZD7288 Anwendung (125 'M). (E) Zusammenhang zwischen dem Grad des Leitungsversagens und der steigenden Steigung des AHP als Reaktion auf unterschiedliche Konzentrationen von ZD7288. * und P < 0,05 vs. Steuerung. Diese Zahl wurde von Wang et al.9geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Obwohl neuere Studien Kalzium-Bildgebung von DRG-Neuronen in vivo16erreicht haben, bleibt die Durchführung von in vivo Patch-Clamp-Aufnahmen von einzelnen DRG-Nozizeptoren äußerst anspruchsvoll. Daher ist ein in vivo Singlefaser-Ansatz für das Schmerzfeld von anhaltendem Bedeutung. Die Einzelfaseraufzeichnung im vorliegenden Protokoll ermöglicht eine objektive Beobachtung von Leitungsversagensphänomenen, und die Kombination dieser Technik mit der in der aktuellen Studie entwickelten Ex-vivo-Präparation ermöglicht die Untersuchung der zugrunde liegenden Mechanismen in Nociceptor Erregbarkeitsänderungen in präklinischen Modellen. Drei Schritte des Single-Faser-Aufnahmeprotokolls sind entscheidend für erfolgreiche Aufnahmen. Erstens ist es wichtig, auf die Anästhesie des Tieres zu achten. In aufwendigen In-vivo-Aufnahmeexperimenten beträgt die Länge der dünnen Faser, die um die 29-m-Platinelektrode gewickelt ist, nur 2-3 mm, was während des Aufnahmevorgangs leicht gestört wird. Wenn der Anästhetikum nicht besonders stabil ist, können winzige Bewegungen der Tiere zu Fehlschlägen elektrophysiologischer Aktivitäten führen. Zweitens muss die Zubereitung kontinuierlich mit Paraffin abgedeckt werden. Der Zweck dieser Manipulation ist es, die Aktivität der Fasern zu erhalten. Ein geeigneter Aufnahmeschlitz wurde in der Regel mit der Haut von Tieren konstruiert. Um Paraffinölaustritte zu verhindern, kann die Wand des Schlitzes mit Superkleber verstärkt werden, und Paraffinöl sollte bei Bedarf hinzugefügt werden. Die Faser kann während des gesamten Tests nicht trocknen. Schließlich muss die Umgebung um den Nervenstamm gesund gepflegt werden. Es gibt immer etwas Ergussflüssigkeit rund um den Aufnahmebereich, und dieser Erguss ist ein Hindernis für gute Aufnahmen. Die Amplitude der Faseraktivität wird weiter abnehmen und letztlich nicht mehr von extremen Ausgangsgeräuschen zu unterscheiden sein, die einen Aufzeichnungsfehler verursachen. Ein hausgemachtes Spritzenrohr ist erforderlich, um tief in den Boden des Schlitzes zu greifen, um die Ergussflüssigkeit auszusaugen. Manchmal ist auch eine halbtrockene, in Saline getränkte Baumwollkugel hilfreich.
In der vorliegenden Studie wurde ein CFA-Modell angewendet, das Fußentzündungen und Hyperalgesie nach CFA-Injektion produziert. Um die Eigenschaften der peripheren afferenten Entladung sowie der zugrunde liegenden Mechanismen zu untersuchen, wurden in dem Experiment keine Analgetika verwendet, was eine Routinepraxis in der Schmerzforschung ist und von der IACUC/Ethikkommission zugelassen ist. Die vorliegende Studie führt eine in vivo Singlefaser-Aufnahmetechnik ein, um Veränderungen im Übertragungsprozess zu beobachten, die in nozizeptiven C-Fasern auftreten, die mit sich wiederholenden elektrischen Reizen versehen sind. Es wurde gezeigt, dass der Grad des Leitungsversagens bei hyperalgetischen Bedingungen signifikant abgeschwächt wurde, aber wir konnten den zugrunde liegenden Mechanismus nicht mit Singlefaser-Aufzeichnung untersuchen, da es technische Schwierigkeiten bei der Patch-Klemmung gab. C-Fasern. Daher wurde die Untersuchung des Zusammenhangs zwischen Leitungsversagen und Veränderungen des Membranpotenzials von DRG-Neuronen mit kleinem Durchmesser mithilfe der Vorbereitung intakter DRG mit dem angeschlossenen Ischiasnerv nachgewiesen. Anstelle der Singlefaseraufzeichnung untersucht Patch-Clamp mit solchen Präparaten AHP-abhängige Mechanismen zur Herstellung von Leitungsfehlern. Mit diesem Protokoll, obwohl nur wenige Oberflächenneuronen ausgewählt werden konnten, war der Grad des Leitungsversagens auf der Ebene der DRG-Neuronen noch in der Lage, aufgezeichnet werden, auch mit der Verabreichung des Medikaments.
DRG haben zwei äußere Membranen: die Pia mater spinalis und dura mater. Die Dura mater muss mit einer Fußfeder-Pinzette entfernt werden, und die Pia mater spinalis muss verdaut werden (moderate Verdauung, nicht so Reihenwie sie bei der Isolierung einzelner DRG-Zellen verwendet werden), um sicherzustellen, dass die Patch-Clamp-Elektroden die Oberfläche der DRG-Zellen erreichen können, um sich zu bilden. ein Siegel; andernfalls ist es unmöglich, Patch-Clamp-Aufnahmen zu erhalten. Der aktuelle Ansatz bewahrt den peripheren Nerveneingang im Vergleich zu DRG-Segmenten und Nerven vollständiger und sorgt dafür, dass die Patch-Clamp-Aufnahme von DRG-Neuronen problemlos erreicht werden kann. Dieses Protokoll hat breite Anwendungsperspektiven, um das Verständnis des peripheren Nervensystems in Bezug auf Schmerzen zu verbessern, wie die Untersuchung von elektrophysiologischen Veränderungen in verschiedenen DRG-Neuronen in verschiedenen chronischen Schmerzmodellen17 ,18 und molekulare Mechanismen, die einer abnormalen spontanen Aktivität in DRG mit myelinierten oder nicht myelinierten Axonen19,20zugrunde liegen.
Die Hier vorgestellte Herstellung des intakten DRG mit angeschlossenem Ischiasnerv hat gegenüber der traditionellen dissoziierten Ganglienmethode viele Vorteile, da die Struktur der DRG in dieser Zubereitung grundsätzlich ungebrochen bleibt. Daher simuliert es reale Bedingungen in vivo und bietet eine bevorzugte Mikroumgebung für physiologische Aktivität. Die Herstellung von intaktem DRG mit angeschlossenem Ischiasnerv verursacht weniger neuronale Schäden als die dissoziierte DRG-Präparation, da letzteres Verfahren mehr Verdauungsenzyme und externe physikalische Handlungen (z. B. Scheren und Blasen der Zellen) verwendet, die verursacht mehr Schäden an den Zellen. Die meisten elektrophysiologischen Studien werden immer noch an dissoziierten DRG-Neuronen21,22durchgeführt, und der Dissoziationsprozess selbst schädigt die Zellen, was zu abnormalen Hypererrezitationen der Neuronenführt 23. Ein weiterer Vorteil dieses Protokolls ist, dass auch extrazelluläre afferent elektrophysiologische Aktivitäten erhalten werden, weil die Nervenprojektionen erhalten bleiben, was Untersuchungen von Wechselwirkungen zwischen affegenen Spitzen und somatischem DRG spontan ermöglicht. Einleitungen. Schließlich bewahrt dieses Präparat DRG-Neuronen und Satelliten-Gliazellen, und nur DRG-Neuronen bleiben in Dissoziationsprotokollen. Satelliten-Gliazellen, die für die Aufrechterhaltung der Mikroumgebung der DRG unerlässlich sind, sind eine Barriere, die einzelne DRG-Neuronen24schützt, und diese Zellen rechtfertigen weitere Untersuchungen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Fördermittel der National Natural Science Foundation of China (31671089 und 81470060) und des Shaanxi Provincial Social Development Science and Technology Research Project (2016SF-250) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments and software used in single fiber recording | |||
| Amplifier | Nihon kohden | MEZ-8201 | Amplification of the electrophysiological signals |
| Bioelectric amplifier monitor | ShangHai JiaLong Teaching instrument factory | SZF-1 | Monitor firing process via sound which is transformed from physiological discharge signal |
| Data acquisition and analysis system | CED | Spike-2 | Software for data acquisition and analysis |
| Electrode manipulator | Narishige | SM-21 | Contro the movement of the electrode as required |
| Hairspring tweezers | A.Dumont | 5# | Separate the single fiber |
| Isolator | Nihon kohden | SS-220J | |
| Memory oscilloscope | Nihon kohden | VC-9 | Display recorded discharge during |
| Experiment | |||
| Stereomicroscope | ZEISS | SV-11 | Have clear observation when separate the local tissue and single fiber |
| Stimulator | Nihon kohden | SEZ-7203 | Delivery of the electrical stimuli |
| Von Frey Hair | Stoelting accompany | Delivery of the mechanical stimuli | |
| Water bath | Scientz biotechnology Co., Ltd. | SC-15 | Heating paroline to maintain at 37 °C |
| Instruments and software used in patch clamp recording | |||
| Amplifier | Axon Instruments | Multiclamp 700B | Monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the stimuli by sending a signal to the electrode |
| Anti-vibration table | Optical Technology Co., Ltd. | Isolates the recording system from vibrations induced by the environment | |
| Camera | Olympus | TH4-200 | See the neurons in bright field; the controlling software allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell |
| Clampex | Axon | Clampex 9.2 | Software for data acquisition and delivery of stimuli |
| Clampfit | Axon | Clampfit 10.0 | Software for data analysis |
| Electrode puller | Sutter | P-97 | Prepare recording pipettes of about 2μm diameter with resistance about 5 to 8 MΩ |
| Glass pipette | Sutter | BF 150-75-10 | |
| Micromanipulator | Sutter | MP225 | Give a precise control of the microelectrode |
| Microscope | Olympus | BX51WI | Upright microcope equipped with epifluorescence for clearly observe the cells which would be patched |
| Origin | Origin lab | Origin 8 | Software for drawing picture |
| Perfusion Pump | BaoDing LanGe Co., Ltd. | BT100-1J | Perfusion of DRG in whole-cell patch clamp |
| Other instruments | |||
| Electronic balance | Sartorius | BS 124S | Weighing reagent |
| pH Modulator | Denver Instrument | UB7 | Adjust pH to 7.4 |
| Solutions/perfusion/chemicals | |||
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | Extracellular solution |
| Chloralose | Shanghai Meryer Chemical Technology Co., Ltd. | M07752 | Mixed solution for Anesthesia |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | SLBQ1885V | Enzyme used for clearing the surface of DRG |
| D (+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Extracellular solution |
| Liquid Paraffin | TianJin HongYan Reagent Co., Ltd. | Maintain fiber wetting | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | Extracellular solution |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | Extracellular solution |
| Protease | Sigma-Aldrich | 62H0351 | Enzyme used for clearing the surface of DRG |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5671 | Extracellular solution |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | Extracellular solution |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | Extracellular solution |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | Extracellular solution |
| Urethane | Sigma-Aldrich | U2500 | Mixed solution for Anesthesia |
References
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