Summary
Single-Fiber opname is een effectieve elektrofysiologische techniek die toepasbaar is op de centrale en perifere zenuwstelsels. Samen met de voorbereiding van intact DRG met de bijgevoegde sciatische zenuw, het mechanisme van geleiding falen wordt onderzocht. Beide protocollen verbeteren het begrip van de relatie van het perifere zenuwstelsel met pijn.
Abstract
Single-Fiber opname is de laatste decennia een klassieke en effectieve elektrofysiologische techniek geweest vanwege de specifieke toepassing voor zenuwvezels in de centrale en perifere zenuwstelsels. Deze methode is met name van toepassing op dorsale wortel ganglia (DRG), die primaire sensorische neuronen zijn die een pseudo-unipolaire structuur van zenuw processen vertonen. De patronen en kenmerken van de actie potentialen doorgegeven langs axonen zijn beschrijfbare in deze neuronen. De huidige studie gebruikt in vivo single-Fiber opnames om de geleiding falen van de sciatische zenuwen in volledige Freund van adjuvans (CFA) behandelde ratten te observeren. Omdat het onderliggende mechanisme niet kan worden bestudeerd met behulp van in vivo single-Fiber opnames, worden Patch-clamp-opnames van DRG neuronen uitgevoerd op preparaten van intact DRG met de bijgevoegde sciatische zenuw. Deze opnames onthullen een positieve correlatie tussen geleidings falen en de stijgende helling van de nahyperpolarisatie potentiaal (AHP) van DRG-neuronen bij met CFA behandelde dieren. Het protocol voor in vivo enkelvoudige glasvezel opnames maakt de classificatie van zenuwvezels mogelijk via de meting van de geleidings snelheid en het monitoren van abnormale omstandigheden in zenuwvezels bij bepaalde ziekten. Intact DRG met bijgevoegde perifere zenuw maakt observatie van de activiteit van DRG neuronen in de meeste fysiologische omstandigheden. Overtuigend, single-Fiber opname gecombineerd met elektrofysiologische opname van intacte Drg's is een effectieve methode om de rol van geleidings falen tijdens het analgetische proces te onderzoeken.
Introduction
De normale overdracht van informatie langs zenuwvezels garandeert de normale werking van het zenuwstelsel. Abnormale werking van het zenuwstelsel wordt ook weerspiegeld in de elektrische signaaloverdracht van zenuwvezels. Zo kan de mate van demyelinisatie bij centrale demyelineaflaesies worden geclassificeerd via vergelijking van veranderingen in zenuw geleidings snelheid voor en na interventie toepassing1. Het is moeilijk om intracellulair record zenuwvezels, behalve in speciale preparaten zoals de inktvis reus axon2. Daarom is elektrofysiologische activiteit alleen beschrijfbare via de extracellulaire opname van enkelvoudige vezels. Als een van de klassieke elektrofysiologische methoden, heeft single-Fiber opname een langere geschiedenis dan andere technieken. Echter, minder elektrofysiologen grijpen deze methode ondanks de uitgebreide toepassing. Daarom is een gedetailleerde introductie van het standaardprotocol voor de opname van één vezel nodig voor de juiste toepassing.
Hoewel verschillende Patch-clamp technieken moderne elektrofysiologische studie hebben gedomineerd, speelt single-Fiber opname nog steeds een onvervangbaar rol bij het opnemen van de activiteiten van zenuwvezels, vooral vezels die perifeer gevoel overbrengen met hun sensorische cel lichaam gelegen in dorsale wortel ganglion (DRG). Het voordeel van het gebruik van single-Fiber opname hier is dat in vivo Fiber Recording een lange observatietijd biedt met de capaciteit om reacties op natuurlijke stimuli op te nemen in preklinische modellen zonder verstoring van de intracellulaire omgeving3 , 4.
Een toenemend aantal studies in de afgelopen twee decennia heeft onderzocht complexe functies langs zenuwvezels5, en geleiding falen, die wordt gedefinieerd als een staat van mislukte zenuw impuls transmissie langs de axon, was aanwezig in veel verschillende perifere zenuwen6,7. De aanwezigheid van geleidings falen in ons onderzoek diende als een intrinsiek Zelfremmend mechanisme voor de modulatie van aanhoudende Nociceptieve input langs C-vezels8. Dit geleidings falen was significant verzwakt onder de voorwaarden van hyperalgesia4,9. Daarom, gericht op de factoren die betrokken zijn bij conductie falen kan een nieuwe behandeling voor neuropathische pijn vertegenwoordigen. Om het geleidings falen te observeren, moet het afvuren patroon worden geregistreerd en geanalyseerd op basis van opeenvolgend geloosde spikes op basis van single-Fiber opname.
Om het mechanisme van geleidings falen grondig te begrijpen, is het noodzakelijk om de transmissie eigenschappen van de axon te identificeren, of preciezer, de membraan eigenschappen van DRG-neuronen, gebaseerd op hun pseudo-unipolaire anatomische eigenschappen. Veel eerdere studies op dit gebied zijn uitgevoerd op gezien DRG neuronen10,11, die mogelijk niet haalbaar voor het onderzoek van de geleiding falen als gevolg van twee obstakels. Eerste, verschillende mechanische en chemische methoden worden gebruikt in het dissociatie proces te vrije DRG neuronen, die kan resulteren in ongezonde cellen of verander het fenotype/eigenschappen van de neuronen en Verwar de bevindingen. Ten tweede, de bijgevoegde perifere zenuwen zijn in principe verwijderd, en geleiding falen verschijnselen zijn niet waarneembaar in deze preparaten. Daarom is een preparaat van intact DRG neuronen met een bijgevoegde zenuw verbeterd om te voorkomen dat de bovengenoemde obstakels.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het huidige protocol volgde de leidraad voor het beleid van de Amerikaanse volksgezondheid over de humane verzorging en het gebruik van proefdieren, en het Comité voor de ethiek van dierproeven van de vierde militaire medische universiteit keurde het protocol goed.
1. dieren
- Verdeel 24 Sprague-Dawley ratten (4-8 weken oud) in twee groepen. Produceer volledig Freund's adjuvans (CFA) model door intraplantar injectie van 100 μL CFA in één groep van 14 ratten en een andere groep van 10 ratten door behandeling met zoutoplossing.
Let op: alle dieren werden verworven van het dieren centrum van de vierde militaire medische universiteit. Volwassen mannelijke en vrouwelijke Sprague-Dawley ratten (150-200 g) werden gebruikt voor alle procedures, en ratten werden willekeurig toegewezen aan kooien. Er werden twee ratten per kooi ondergebracht onder een licht/donkere cyclus van 12-/12-Hour bij een constante temperatuur (25 ± 1 °C) met vrije toegang tot voedsel en water.
2. in vivo opname met één vezel
- Bereid en desinfecteer alle chirurgische instrumenten (scalpel, pincet, oogheelkundige schaar, schaar, glazen scheidings naald, hecht naald, Bone rongeur) vóór de operatie. Bereid 1 L of 2 L van de normale Ringer extracellulaire oplossing (in mM: NaCl 124, KCl 3, MgSO4 1,3, CACL2 2, NaHCO3 26, nah2PO4 1,25, glucose 15; pH 7,4 en 305 mosm). Bewaren bij 4 °C tot gebruik.
- Anesthetize ratten. Op dag 3 tot en met 7 na CFA-injectie, gebruik intraperitoneale injectie van een gemengde oplossing (1% chloralose en 17% urethaan, 5 mL/kg lichaamsgewicht) om de dieren in een stabiele esthetische conditie te houden tijdens het experiment. Breng indien nodig aanvullende injectie anesthetica aan na controle van de pupillen en de respons op de pijn stimulatie. Monitor en onderhoud een lichaamstemperatuur bij 37 °C.
-
Blootstelling van de heupzenuw romp voor opname
- Snijd de huid en spieren op het ruggedeelte van de dij open. Voer een stompe dissectie langs femur biceps. Isoleer voorzichtig de romp van de heupzenuw met behulp van een oogheelkundige schaar en een glazen scheidings naald. Houd het weefsel nat met de oplossing van Ringer.
- Bevestig het dier op een zelfgemaakte metalen hoepel (3 cm lang, 2 mm brede metalen hoepel met een ijzeren draad van 1 mm in diameter) via het naaien van de huid in de sleuf eromheen. Trek de huid lichtjes omhoog om een vloeistofbad te creëren.
- Bloot 1 cm aan heupzenuw romp aan de proximale zijde. Plaats een klein bruin platform onder de zenuw romp om het contrast te verbeteren en de fijne zenuw stam duidelijk te observeren. Verwarm vloeibare paraffine in een waterbad tot 37 °C en laat het op de bovenkant van de zenuw romp vallen om uitdroging van het oppervlak van de vezel te voorkomen. Verwijder de pia mater spinalis en de dura mater rond de heupzenuw.
-
Opnamesessie
- Selecteer een platina filament (29 μm in diameter) als de opname-elektrode. Verwarm over voor makkelijker molding, en creëer een kleine haak aan het einde. Bevestig de elektrode aan een micro manipulator om de elektrode naar wens te verplaatsen.
- In het bad, plaats een referentie-elektrode in aangrenzende subcutane weefsel. Splits de spinale Dura en de pia mater. Scheid de heup-zenuw in een enkele vezel (15-20 μm in diameter) in de opname pool. Vervolgens haalt u een fijne boom van Axon op en onderbreekt u het proximale uiteinde van de axon op de haak van de opname-elektrode onder een stereoscoop bij een vergroting van 25x.
Opmerking: De net-ontleed filamenten zijn meestal dikker en vereisen verdere scheiding totdat een enkele eenheid kan worden opgenomen. - Identificeer het receptieve veld van een enkele Nociceptieve C-Fiber met behulp van een mechanische stimulus (von Frey haren) en thermische stimulus (kleine katoenen bal met 50-55 °C water). Kort, als het afvuren van zenuwvezels reageren op de mechanische stimuli en warm water, beschouw het dan als een Polymodale Nociceptieve C-Fiber4. Voeg vervolgens twee naald stimulus elektroden (2 mm interval) in de huid van het geïdentificeerde veld voor de levering van elektrische stimuli.
- Toon de golfvorm van een actiepotentiaal op de oscilloscoop en gebruik een computer A/D-bord met een signaal samplefrequentie van 20 kHz om de spikes te versterken en op te nemen.
- Gegevens verzamelen met behulp van software voor gegevensverzameling (tabel met materialen). Sla gegevens op een computer op en analyseer ze later met professionele software (tabel met materialen).
3. meting van het geleidings falen
- Leveren de repetitieve elektrische stimuli (0,8 MS duur, 1.5 x drempel intensiteit) in verschillende frequenties (2 Hz, 5 Hz, 10 Hz) naar een C-Fiber voor 60 s4,8,9. Laat een interval van 10 minuten voor glasvezel om te ontspannen tussen stimuli. Bereken de verhouding van het aantal storingen aan het aantal geleverde repetitieve stimulus pulsen en vermenigvuldig met 100% om de mate van geleidings falen te verkrijgen.
4. bereiding van Iintact DRG bevestigd met Heupzenuw
- Bereid chirurgische gereedschappen en Ringer's extracellulaire oplossing zoals beschreven in stap 2,1.
- Scheid de DRG met de bijgevoegde sciatische zenuw.
- Anesthetiseer de ratten zoals beschreven in stap 2,2 (op dagen 3 tot 7 na CFA-injectie). Snijd het haar op rug en been met schuin scheren schaar, en steriliseren de huid met tinctuur van jodium.
- Voor DRG-belichting opent u eerst de huid van de middenlijn van de rug op het niveau L4 tot L5 segment. Verwijder spieren, het proces van wervelkolom, wervel Board en dwars proces met behulp van een bone rongeur om het ruggenmerg en de DRG lichaam bloot. Bedek het blootgestelde ruggenmerg en DRG met katoen geïnfiltreerd door de normale Ringer extracellulaire oplossing om neurale activiteit te behouden. Stop de bloeding en wis het bloed in de tijd.
- Stel de heup-zenuw uit twee richtingen: Verwijder de botstructuur L4 tot S1 boven de wervel foramen met behulp van een oogheelkundige schaar om de ruggenmerg zenuw die verbonden is met de DRG, die aan het proximale uiteinde van de sciatische zenuw, bloot te leggen. Snijd de huid open om de heupzenuw in de middelste dij bloot te leggen. Scheiden en loskoppelen van de heupzenuw van het distale uiteinde van de zenuw waar het gaat in de spier, en ligate de zenuw stam met chirurgische lijn aan het einde van de zenuw voorafgaand aan het snijden.
- Scheid de heup-zenuw van het onderliggende bindweefsel met behulp van oftalmische schaar via het opheffen van de zenuw ligatie punt. Verwijder de Dura uit het ruggenmerg en scheid de DRG van het onderliggende bindweefsel via het opheffen van de rugwortel totdat het aangrenzende deel van de heupzenuw is bereikt. Dus, isoleren van de hele voorbereiding van DRG met een bijgevoegde heupzenuw.
- Wis het oppervlak van de DRG.
- Verwijder voorzichtig de spinale Dura op de oppervlakken van L4 − L6 DRG met behulp van pincet onder een stereoscoop bij 4x vergroting.
- Plaats de DRG met de bijgevoegde heupzenuw in een glazen buis met 1 mL gemengde enzymen (0,2% proteïnurase en 0,32% Collagenase) en verteren in een waterbad van 37 °C gedurende 15 minuten (blaas lichtjes met een plastic druppelaar met een interval van 5 min).
- Til het uiteinde van de ligatie lijn omhoog en verplaats het preparaat naar een schotel gevuld met een normale Ringer-extracellulaire oplossing om het enzym uit te spoelen. Breng vervolgens de verteerde DRG over naar een recipiënt (Figuur 1a) gevuld met de extracellulaire oplossing voor opname van zuurstofrijk Ringer.
- Opnamesessie
- Bereid intracellulaire oplossing (in mM: kalium gluconaat 120, KCl 18, MgCl2 2, ethyleenglycol-bis (β-aminoethylether)-N, N, n ', N'-tetraazijnzuur [EGTA] 5, Hepes 10, na2-ATP 5, na-GTP 0,4, CACL2 1; pH 7,2 en 300 mosm). Bewaren bij 0 °C tot het gebruik.
- Stabiliseer ganglia met behulp van een segment anker en verbind de zenuwuiteinden met een zuig-stimulerende elektrode (Figuur 1a). Visualiseer en selecteer een DRG-neuron met een water-immersie doelstelling bij 40x vergroting.
- Trek een elektrode (tabel met materialen) en vul deze met intracellulaire oplossing. Plaats de elektrode op de houder en breng de positieve druk in de pipet aan met een eindweerstand van 4-7 MΩ.
- Breng de elektrode dicht bij de cel en raak deze aan. Geef een negatieve druk in de pipet, zodra de GΩ-afdichting is bereikt, stelt u het membraanpotentiaal in op ongeveer-60 mV en stelt u vervolgens de opnamemodus voor de gehele cel in.
- Lever repetitieve stimuli van 5-50 Hz tot de heupzenuw door de zuig elektrode op het scherm voor geleidings falen. Meet de amplitude van de nahyperpolarisatie potentiaal (AHP) van baseline tot piek en de duur van 80% AHP.
Opmerking: Een eenrichtings analyse van variantie (ANOVA; voor meer dan twee groepen) of student t-toets (voor slechts twee groepen) werd gebruikt om de gegevens te analyseren. De gegevens worden weergegeven als gemiddelden ± standaardfout van het gemiddelde (SEM). Het statistisch significante niveau werd vastgesteld op p < 0,05.
- Het experiment beëindigen
- Wanneer de experimentele taak is voltooid terwijl de ratten nog onder verdovings situatie verkeren, worden ratten humaan geëuseerd met een intracardiale injecties van overdosis pentobarbital natrium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De uitkomst van het single-Fiber opname protocol is afhankelijk van de kwaliteit van de vezel dissectie. Het dier voor in vivo experimenten moet in een goede situatie verkeren om de zenuw stam gezond te houden voor gemakkelijk dissectie (zie advies in de sectie discussie). Een drug toepassing bad is nodig in veel gevallen voor de levering van geneesmiddelen op vezels. Figuur 1 illustreert hoe de in vivo single-Fiber opname werd bediend (Figuur 1a) en presenteert een klassieke opname van de SCIATISCHE zenuw van met CFA behandelde dieren (Figuur 1b).
De volgende experimenten onderzochten het bestaan van conductiefalen bij met CFA behandelde dieren. Dit onderzoek was gebaseerd op de veronderstelling dat geleidings falen langs de Nociceptieve C-vezels een veelvoorkomend fenomeen was, en de mate van geleidings falen was significant verzwakt onder omstandigheden van hyperalgesie, die worden ondersteund door onze eerdere studies4,8,9,12. Afbeelding 2a toont aan dat C-Fiber conductie falen werd waargenomen bij normale dieren. Echter, de mate van geleidings falen werd aanzienlijk verminderd na de oprichting van CFA-geïnduceerde hyperalgesia na CFA-injectie in de voet vergeleken met de controle (Figuur 2b). Deze gegevens tonen aan dat de geleiding falen van pijn-relevante Polymodale Nociceptieve C-vezels is verzwakt in het CFA-model van inflammatoire pijn.
Om te onderzoeken intracellulaire mechanisme tijdens de geleiding falen, de voorbereiding van intact DRG met bijgevoegde sciatische zenuw werd gebruikt (Figuur 3a,B). Figuur 3c toont dat binnen de stimulus-serie, spikes in reactie op herhaalde stimuli opgestapeld op de vorige after-hyperpolarisatie potentiaal (AHP) en resulteerde in een afname van de stijgende helling van de volgende AHP (figuur 3c,D ). De aanwezigheid van AHP in kleine DRG neuronen activeert mogelijk hyperpolarisatie-geactiveerde, cyclische nucleotide-gemoduleerde (HCN) kanalen13,14,15. Het cumulatieve effect van AHP speelt een rol bij het optreden van conductiefalen. Daarom veronderstellen we dat het blokkeren van HCN-kanalen het geleidings falen effect aanzienlijk zou verbeteren. Het volgende experiment gebruikt een Blocker van HCN kanalen, ZD7288. Continue opnames onthulde een toename van het geleidings falen in de aanwezigheid van ZD7288 in een concentratieafhankelijke manier. Insets tonen uitgebreide traceringen voor de opgegeven intervallen. Er werd een positieve correlatie waargenomen tussen geleidings falen en de stijgende helling van de AHP in kleine DRG neuronen van met CFA behandelde dieren (figuur 3e).
Figuur 1: in vivo single-Fiber opnames van Rat heup zenuwen. A) schematisch diagram van de opname van één glasvezel van de opnamegebieden (R) (alvorens een filament voor de opname te splitsen, de pia mater spinalis en de dura mater zijn hier verwijderd), drugs toepassing (D), stimulatie (S) en de plaats van CFA Injectie. B) representatieve registratie van een sciatische enkelvoudige vezel die een tonisch vuur patroon exposeert. Dit cijfer is gewijzigd van Wang et al.9 Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: geleidings falen bij met CFA behandelde ratten werd verzwakt vergeleken met controle ratten. A) originele opeenvolgende opnames van enkelvoudige C-vezel flitsen van controle ratten in reactie op een elektrische stimulatie van 10 Hz. Elke 20e sweep wordt getoond (opeenvolgende veegt waren op 2-s intervallen) en weergegeven van boven naar beneden. De inzet toont een representatieve actiepotentiaal. B) opnames van enkelvoudige C-vezels van met CFA geïnjecteerde ratten in reactie op dezelfde stimulatie als in panel A. Dit cijfer is gewijzigd van Wang et al.9. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: meting van C-Fiber conductie falen met behulp van preparaten van intact DRG met bijgevoegde sciatische zenuw. A) schematisch diagram ter illustratie van de opstelling en plaatsing van DRG-preparaten. SE: stimulatie elektrode; SN: sciatische zenuw; FM: fluorescentiemicroscoop; RE: opname-elektrode. B) geheel DRG-specimen waargenomen onder een 40x-weergave werd een micro-elektrode (rechter schaduw) gebruikt voor het patchen van een klein DRG-neuron. C) continue opnames van series die reageren op een stimulatie van 5 Hz onder controle omstandigheden of toediening van verschillende concentraties van ZD7288 in een DRG-neuron met kleine diameter van met CFA behandelde ratten. De inzetstukken tonen uitgebreide traceringen voor de opgegeven opname perioden. Donkere vlekken vertegenwoordigen piek fouten. D) representatieve sporen die worden gebruikt om de stijgende helling van de AHP te meten. De stijgende helling was gelijk aan het amplitude verschil tussen de maximale en minimale AHP-spanningen (mV) gedeeld door de duur (interval van stimuli, in seconden). Het linker paneel illustreert een grotere stijgende helling (vanaf de eerste spoor in paneel C gemarkeerd met "*"), en het rechter paneel toont een kleinere stijgende helling (van de vierde trace in panel C gemarkeerd met "#") na ZD7288 toepassing (125 μM). E) relatie tussen de mate van geleidings falen en de stijgende helling van de AHP in reactie op verschillende concentraties van ZD7288. * en # P < 0,05 vs. controle. Dit cijfer is gewijzigd van Wang et al.9. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hoewel recente studies calcium beeldvorming van DRG-neuronen in vivo16hebben bereikt, blijft het uitvoeren van in vivo Patch-clamp-opnames van individuele DRG-nociceptoren uiterst uitdagend. Daarom is een in vivo single-Fiber aanpak voor het pijn veld van blijvende betekenis. Single-Fiber opname in dit protocol laat objectieve observatie van geleidings falen verschijnselen toe, en de combinatie van deze techniek met het ex vivo preparaat dat in de huidige studie is ontwikkeld, maakt het onderzoek van onderliggende mechanismen in Nociceptor prikkelbaarheid verandert in preklinische modellen. Drie stappen van het single-Fiber opname protocol zijn van cruciaal belang voor succesvolle opnames. Ten eerste is het van cruciaal belang om aandacht te besteden aan de anesthesie van het dier. In uitgebreide in vivo opname experimenten, de lengte van de dunne vezel die is gewikkeld rond de 29 μm platina elektrode is slechts 2-3 mm, die gemakkelijk wordt verstoord tijdens het opnameproces. Als de verdovings toestand niet bijzonder stabiel is, kunnen kleine bewegingen van de dieren leiden tot opname storingen van elektrofysiologische activiteiten. Ten tweede moet het preparaat continu bedekt zijn met paraffine. Het doel van deze manipulatie is het handhaven van de activiteit van de vezels. Een geschikte opname sleuf werd over het algemeen geconstrueerd met behulp van de huid van dieren. Om lekkage van paraffineolie te voorkomen, kan de wand van de sleuf worden versterkt met behulp van superlijm en moet indien nodig paraffineolie worden toegevoegd. De vezel kan niet drogen tijdens de hele test. Ten slotte moet de omgeving rond de zenuw romp gezond onderhouden worden. Er is altijd wat effusie vloeistof aanwezig rond het opnamegebied, en deze effusie is een obstakel voor opnames van goede kwaliteit. De amplitude van de vezel activiteit zal blijven dalen en uiteindelijk niet te onderscheiden zijn van extreme Baseline ruis, wat een opname fout veroorzaakt. Een zelfgemaakte spuit buis is nodig om diep in de bodem van de sleuf te komen om de effusie vloeistof uit te zuigen. Soms is een halfdroge watten bal gedrenkt in zoutoplossing ook nuttig.
In de huidige studie, CFA-model werd toegepast die voet ontsteking en hyperalgesia na CFA-injectie produceert. Om de eigenschappen van perifere afferente ontlading en de onderliggende mechanismen te onderzoeken, werden geen analgetica gebruikt in het experiment, wat een routine praktijk is in pijn onderzoek en is goedgekeurd door het IACUC/ethisch comité. De huidige studie introduceert een in vivo single-Fiber opname techniek om veranderingen in het transmissieproces te observeren die optreden in Nociceptieve C-vezels die worden geleverd met herhaalde elektrische stimuli. Er werd aangetoond dat de mate van geleidings falen significant was verzwakt in hyperalgesic omstandigheden, maar we konden het onderliggende mechanisme niet onderzoeken met behulp van single-Fiber opname vanwege technische problemen bij het opspannen van de pleister C-vezels. Daarom werd het onderzoek naar de relatie tussen geleidings falen en veranderingen in membraanpotentiaal van DRG-neuronen met een kleine diameter gedetecteerd met behulp van de voorbereiding van intact DRG met de bijgevoegde sciatische zenuw. In plaats van single-Fiber opname, Patch-clamp met behulp van dergelijke preparaten verkent AHP-afhankelijke mechanismen voor de productie van geleiding falen. Met behulp van dit protocol, hoewel slechts een paar oppervlakte neuronen kunnen worden geselecteerd, de mate van geleiding falen op het niveau van de DRG neuronen kon nog steeds worden opgenomen, zelfs met de Drug Administration.
DRG heeft twee buitenste membranen: de pia mater spinalis en de dura mater. De dura mater moet worden verwijderd met behulp van haarveer pincet, en de pia mater spinalis moet worden verteerd (matige spijsvertering, niet als serie zoals gebruikt in de isolatie van enkele DRG cellen) om ervoor te zorgen dat de patch-Clamp elektroden het oppervlak van de DRG cellen kunnen bereiken een zegel; anders is het onmogelijk om Patch-clamp opnames te verkrijgen. De huidige aanpak behoudt de perifere zenuw invoer in vergelijking met plakjes DRG plus zenuw en zorgt ervoor dat de patch-klem opname van DRG neuronen gemakkelijk wordt bereikt. Dit protocol heeft brede toepassings perspectieven om het begrip van het perifere zenuwstelsel met betrekking tot pijn te verbeteren, zoals het onderzoeken van elektrofysiologische veranderingen in verschillende DRG-neuronen in verschillende chronische pijn modellen17 ,18 en moleculaire mechanismen die de onderliggende abnormale spontane activiteit in DRG met myelinehoudende of niet-myelinehoudende axonen19,20.
De voorbereiding van intact DRG met bijgevoegde sciatische zenuw gepresenteerd hier heeft vele voordelen in vergelijking met de traditionele gezien ganglion methode, omdat de structuur van de DRG blijft in principe ononderbroken in deze voorbereiding. Daarom simuleert het de reële omstandigheden in vivo en biedt het een voorkeurs microomgeving voor fysiologische activiteit. De bereiding van intacte DRG met bijgevoegde sciatische zenuw produceert minder neuronale schade dan de gezien DRG preparaat omdat het laatste proces meer spijsverteringsenzymen en externe fysieke acties gebruikt (bijv., scheren en blazen van de cellen), die veroorzaakt meer schade aan de cellen. De meeste elektrofysiologische studies zijn nog steeds uitgevoerd op gezien DRG neuronen21,22, en de dissociatie proces zelf beschadigt de cellen, wat resulteert in abnormale hyperexcitaties van neuronen23. Een ander voordeel van dit protocol is dat extracellulaire afferente elektrofysiologische activiteiten ook worden verkregen omdat de zenuw projecties blijven bestaan, waardoor onderzoek kan worden verricht naar interacties tussen afferente spikes en somatische DRG spontaan Lozingen. Tot slot, deze voorbereiding behoudt DRG neuronen en satelliet gliacellen cellen, en alleen DRG neuronen blijven in dissociatie protocollen. Satelliet gliacellen, die essentieel zijn voor het behoud van de micro-omgeving van de DRG, zijn een barrière die individuele DRG neuronen beschermen24, en deze cellen rechtvaardigen verdere studie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de financiering van de National Natural Science Foundation of China (31671089 en 81470060) en het Shaanxi Provincial Social Development Science and Technology Research project (2016SF-250).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments and software used in single fiber recording | |||
| Amplifier | Nihon kohden | MEZ-8201 | Amplification of the electrophysiological signals |
| Bioelectric amplifier monitor | ShangHai JiaLong Teaching instrument factory | SZF-1 | Monitor firing process via sound which is transformed from physiological discharge signal |
| Data acquisition and analysis system | CED | Spike-2 | Software for data acquisition and analysis |
| Electrode manipulator | Narishige | SM-21 | Contro the movement of the electrode as required |
| Hairspring tweezers | A.Dumont | 5# | Separate the single fiber |
| Isolator | Nihon kohden | SS-220J | |
| Memory oscilloscope | Nihon kohden | VC-9 | Display recorded discharge during |
| Experiment | |||
| Stereomicroscope | ZEISS | SV-11 | Have clear observation when separate the local tissue and single fiber |
| Stimulator | Nihon kohden | SEZ-7203 | Delivery of the electrical stimuli |
| Von Frey Hair | Stoelting accompany | Delivery of the mechanical stimuli | |
| Water bath | Scientz biotechnology Co., Ltd. | SC-15 | Heating paroline to maintain at 37 °C |
| Instruments and software used in patch clamp recording | |||
| Amplifier | Axon Instruments | Multiclamp 700B | Monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the stimuli by sending a signal to the electrode |
| Anti-vibration table | Optical Technology Co., Ltd. | Isolates the recording system from vibrations induced by the environment | |
| Camera | Olympus | TH4-200 | See the neurons in bright field; the controlling software allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell |
| Clampex | Axon | Clampex 9.2 | Software for data acquisition and delivery of stimuli |
| Clampfit | Axon | Clampfit 10.0 | Software for data analysis |
| Electrode puller | Sutter | P-97 | Prepare recording pipettes of about 2μm diameter with resistance about 5 to 8 MΩ |
| Glass pipette | Sutter | BF 150-75-10 | |
| Micromanipulator | Sutter | MP225 | Give a precise control of the microelectrode |
| Microscope | Olympus | BX51WI | Upright microcope equipped with epifluorescence for clearly observe the cells which would be patched |
| Origin | Origin lab | Origin 8 | Software for drawing picture |
| Perfusion Pump | BaoDing LanGe Co., Ltd. | BT100-1J | Perfusion of DRG in whole-cell patch clamp |
| Other instruments | |||
| Electronic balance | Sartorius | BS 124S | Weighing reagent |
| pH Modulator | Denver Instrument | UB7 | Adjust pH to 7.4 |
| Solutions/perfusion/chemicals | |||
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | Extracellular solution |
| Chloralose | Shanghai Meryer Chemical Technology Co., Ltd. | M07752 | Mixed solution for Anesthesia |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | SLBQ1885V | Enzyme used for clearing the surface of DRG |
| D (+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Extracellular solution |
| Liquid Paraffin | TianJin HongYan Reagent Co., Ltd. | Maintain fiber wetting | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M7506 | Extracellular solution |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | Extracellular solution |
| Protease | Sigma-Aldrich | 62H0351 | Enzyme used for clearing the surface of DRG |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5671 | Extracellular solution |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | Extracellular solution |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | Extracellular solution |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | Extracellular solution |
| Urethane | Sigma-Aldrich | U2500 | Mixed solution for Anesthesia |
References
- Koski, C. L., et al. Derivation and validation of diagnostic criteria for chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy. Journal of the Neurological Sciences. 277 (1-2), 1-8 (2009).
- Allen, T. J., Knight, D. E. The use of intracellular dialysis to study signal transduction coupling in the squid giant axon. Journal of Neuroscience Methods. 42 (3), 169-174 (1992).
- Schafers, M., Cain, D. Single-fiber recording: in vivo and in vitro preparations. Methods in Molecular Medicine. 99, 155-166 (2004).
- Sun, W., et al. Reduced conduction failure of the main axon of polymodal nociceptive C-fibres contributes to painful diabetic neuropathy in rats. Brain. 135, Pt 2 359-375 (2012).
- Debanne, D. Information processing in the axon. Nature Reviews Neuroscience. 5 (4), 304-316 (2004).
- De Col, R., Messlinger, K., Carr, R. W. Conduction velocity is regulated by sodium channel inactivation in unmyelinated axons innervating the rat cranial meninges. Journal of Physiology. 586 (4), 1089-1103 (2008).
- Debanne, D., Campanac, E., Bialowas, A., Carlier, E., Alcaraz, G. Axon physiology. Physiological Reviews. 91 (2), 555-602 (2011).
- Zhu, Z. R., et al. Conduction failures in rabbit saphenous nerve unmyelinated fibers. Neurosignals. 17 (3), 181-195 (2009).
- Wang, X., et al. A novel intrinsic analgesic mechanism: the enhancement of the conduction failure along polymodal nociceptive C-fibers. Pain. 157 (10), 2235-2247 (2016).
- Smith, T., Al Otaibi, M., Sathish, J., Djouhri, L. Increased expression of HCN2 channel protein in L4 dorsal root ganglion neurons following axotomy of L5- and inflammation of L4-spinal nerves in rats. Neuroscience. 295, 90-102 (2015).
- Zhang, X. L., Albers, K. M., Gold, M. S. Inflammation-induced increase in nicotinic acetylcholine receptor current in cutaneous nociceptive DRG neurons from the adult rat. Neuroscience. 284, 483-499 (2015).
- Zhu, Z. R., et al. Modulation of action potential trains in rabbit saphenous nerve unmyelinated fibers. Neurosignals. 21 (3-4), 213-228 (2013).
- Djouhri, L., Bleazard, L., Lawson, S. N. Association of somatic action potential shape with sensory receptive properties in guinea-pig dorsal root ganglion neurones. Journal of Physiology. 513, 857-872 (1998).
- Fang, X., McMullan, S., Lawson, S. N., Djouhri, L. Electrophysiological differences between nociceptive and non-nociceptive dorsal root ganglion neurones in the rat in vivo. Journal of Physiology. 565, Pt 3 927-943 (2005).
- Young, G. T., Emery, E. C., Mooney, E. R., Tsantoulas, C., McNaughton, P. A. Inflammatory and neuropathic pain are rapidly suppressed by peripheral block of hyperpolarisation-activated cyclic nucleotide-gated ion channels. Pain. 155 (9), 1708-1719 (2014).
- Kim, Y. S., et al. Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
- Fan, N., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. Chronic compression of mouse dorsal root ganglion alters voltage-gated sodium and potassium currents in medium-sized dorsal root ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 106 (6), 3067-3072 (2011).
- Ma, C., et al. Similar electrophysiological changes in axotomized and neighboring intact dorsal root ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 89 (3), 1588-1602 (2003).
- Boucher, T. J., et al. Potent analgesic effects of GDNF in neuropathic pain states. Science. 290 (5489), 124-127 (2000).
- Ma, C., Greenquist, K. W., Lamotte, R. H. Inflammatory mediators enhance the excitability of chronically compressed dorsal root ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 95 (4), 2098-2107 (2006).
- Gong, K., Ohara, P. T., Jasmin, L. Patch Clamp Recordings on Intact Dorsal Root Ganglia from Adult Rats. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
- Schoenen, J., Delree, P., Leprince, P., Moonen, G. Neurotransmitter phenotype plasticity in cultured dissociated adult rat dorsal root ganglia: an immunocytochemical study. Journal of Neuroscience Research. 22 (4), 473-487 (1989).
- Zheng, J. H., Walters, E. T., Song, X. J. Dissociation of dorsal root ganglion neurons induces hyperexcitability that is maintained by increased responsiveness to cAMP and cGMP. Journal of Neurophysiology. 97 (1), 15-25 (2007).
- Hanani, M. Satellite glial cells: more than just rings around the neuron. Neuron Glia Biology. 6 (1), 1-2 (2010).
