Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

전도 실패의 메커니즘을 검사하기 위해 연결된 Sciatic 신경을 가진 생체 내 단일 섬유 기록 및 손상되지 않은 등철 루트 신경절의 사용

doi: 10.3791/59234 Published: August 27, 2019
* These authors contributed equally

Summary

단일 섬유 기록은 중추 및 말초 신경계에 적용할 수 있는 효과적인 전기 생리학적 기술입니다. 부착 된 동골 신경과 함께 손상되지 않은 DRG의 준비와 함께 전도 실패의 메커니즘을 검사합니다. 두 프로토콜 모두 말초 신경계의 통증과의 관계에 대한 이해를 향상시킵니다.

Abstract

단일 섬유 기록은 중추 및 말초 신경계의 신경 섬유에 대한 특정 응용 프로그램 때문에 지난 수십 년 동안 고전적이고 효과적인 전기 생리학적 기술이었습니다. 이 방법은 신경 과정의 의사 단극 구조를 나타내는 기본 감각 뉴런인 등쪽 뿌리 신경절(DRG)에 특히 적용됩니다. 축색을 따라 전달 된 행동 전거의 패턴과 특징은 이러한 뉴런에서 기록 할 수 있습니다. 본 연구는 완전한 Freund의 보조제 (CFA) 처리 된 쥐에서 심막 신경의 전도 실패를 관찰하기 위해 생체 내 단일 섬유 기록을 사용합니다. 기본 메커니즘은 생체 내 단일 섬유 기록을 사용하여 연구 할 수 없기 때문에, DRG 뉴런의 패치 클램프 기록은 부착 된 sciatic 신경과 그대로 DRG의 준비에 수행됩니다. 이 기록은 CFA 처리한 동물에 있는 DRG 뉴런의 전도 실패그리고 후 과분극 전위 전위 (AHP)의 상승 경사 사이 긍정적인 상관관계를 밝힙니다. 생체 내 단일 섬유 기록을 위한 프로토콜은 특정 질병에 있는 신경 섬유에 있는 전도 속도의 측정 및 감시를 통해 신경 섬유의 분류를 허용합니다. 부착 된 말초 신경과 그대로 DRG는 대부분의 생리 적 조건에서 DRG 뉴런의 활성을 관찰 할 수 있습니다. 결정적으로, 손상되지 않은 DRGs의 전기 생리학적 기록과 결합된 단일 섬유 기록은 진통 과정 동안 전도 실패의 역할을 검사하는 효과적인 방법입니다.

Introduction

신경 섬유를 따라 정보의 정상적인 전송은 신경계의 정상적인 기능을 보장합니다. 신경계의 비정상적인 기능은 또한 신경 섬유의 전기 신호 전송에 반영됩니다. 예를 들어, 중앙 탈수질 병변에서의 탈수초화 정도는 개입 적용 전후의 신경 전도 속도의변화의 비교를 통해 분류될 수 있다 1. 오징어 거대 축2와 같은 특별한 준비를 제외하고는 세포내 신경 섬유를 기록하기가어렵습니다. 따라서, 전기 생리활성은 단일 섬유의 세포외 기록을 통해서만 기록할 수 있다. 고전 전기 생리학적 방법 중 하나로서, 단일 섬유 기록은 다른 기술보다 더 긴 역사를 가지고 있다. 그러나 광범위한 적용에도 불구하고이 방법을 파악하는 전기 생리학자는 적습니다. 따라서, 단일 섬유 기록을 위한 표준 프로토콜의 상세한 도입은 그것의 적당한 신청을 위해 필요합니다.

다양한 패치 클램프 기술이 현대 전기 생리학 연구를 지배했지만, 단일 섬유 기록은 여전히 신경 섬유의 활동, 특히 주변 감각을 전달하는 섬유의 활동을 기록하는 데 대체 할 수없는 역할을합니다. 등지 뿌리 신경절 (DRG)에 위치한 감각 세포 체. 여기서 단일 섬유 기록을 사용하는 장점은 생체 내 섬유 기록이 세포 내 환경의 장애 없이 전임상 모델에서 자연 자극에 대한 반응을 기록할 수 있는 용량으로 긴 관찰 시간을 제공한다는 것입니다3 , 4.

지난 2 년간 연구의 증가 수는 신경 섬유를 따라복잡한 기능을 검사했다 5, 그리고 전도 실패, 이는 축을 따라 실패 신경 충동 전송의 상태로 정의, 많은 다른존재했다 말초 신경6,7. 우리의 조사에서 전도 실패의 존재는 C 섬유8을따라 지속적인 nociceptive 입력의 변조를 위한 본질적인 자기 억제 기계장치로 봉사했습니다. 이러한 전도 장애는 과민증4,9의조건하에서 현저히 감쇠되었다. 따라서, 전도 실패에 관여하는 인자를 표적으로 하는 것은 신경병성 통증에 대한 새로운 치료를 나타낼 수 있다. 전도 실패를 관찰하기 위해 단일 섬유 기록에 기초하여 순차적으로 배출된 스파이크를 기준으로 소성 패턴을 기록하고 분석해야 합니다.

전도 실패의 메커니즘을 철저히 이해하려면 의사 단극 성 해부학 적 특성에 따라 축축한 축색의 전송 특성, 또는 보다 정확하게 DRG 뉴런의 막 특성을 식별해야합니다. 이 필드에 있는 많은 이전 연구 결과는 2개의 장애물때문에 전도 실패의 조사를 위해 가능하지 않을 지도 모르다 해리된 DRG 신경 10,11에실행되었습니다. 첫째, 다양한 기계적 및 화학적 방법은 DRG 뉴런을 무료로 해리 과정에서 사용되며, 이는 건강에 해로운 세포를 초래하거나 뉴런의 표현형 / 특성을 변경하고 결과를 혼란스럽게 할 수 있습니다. 둘째, 부착 된 말초 신경은 기본적으로 제거되고 전도 실패 현상은 이러한 준비에서 관찰 할 수 없습니다. 따라서, 부착된 신경을 가진 손상되지 않은 DRG 뉴런의 제제는 상기 장애물을 피하기 위해 개선되었다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

현재 의정서는 미국 공중 보건 서비스의 실험실 동물 의인도적 관리 및 사용에 대한 정책에 대한 가이드를 따랐으며, 제 4 군사 의과 대학의 동물 실험 윤리위원회는 이 프로토콜을 승인했습니다.

1. 동물

  1. 24마리의 스프라그-다울리 쥐(4-8주)를 두 그룹으로 나눕니다. 14마리의 쥐와 식염수를 치료하여 10마리의 쥐10마리의 또 다른 그룹에서 CFA 100 μL의 내란타르 주입에 의한 완전한 Freund의 보조제(CFA) 모델을 생산합니다.
    참고 : 모든 동물은 제 4 군사 의과 대학의 동물 센터에서 인수되었다. 성인 수컷 과 암컷 스프라그-다울리 쥐(150-200 g)를 모든 시술에 사용하였고, 쥐를 임의로 케이지에 배정하였다. 2마리의 쥐를 케이지 당 12-/12시간 의 빛/암흑 주기 하에서 일정한 온도(25±1°C)에서 보관하고 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있도록 하였다.

2. 생체 내 단일 섬유 기록

  1. 수술 전에 모든 수술 기구(메스, 핀셋, 안과 가위, 전단 가위, 유리 분리 바늘, 봉합사 바늘, 뼈 rongeur)를 준비하고 소독하십시오. 정상 링거 의 세포 외 용액 1 L 또는 2 L을 준비하십시오 (MM : NaCl 124, KCl 3, MgSO4 1.3, CaCl2 2, NaHCO3 26, NaH2PO4 1.25, 포도당 15, pH 7.4 및 305 mOsm). 사용할 때까지 4°C에서 보관하십시오.
  2. 쥐를 마취. CFA 주사 후 3일에서 7일까지, 실험 중에 동물을 안정된 미적 상태로 유지하기 위해 혼합 용액(1% 클로랄로오스 및 17% 우레탄, 5 mL/kg 체중)의 복강 내 주사를 사용한다. 필요한 경우 동공과 통증 자극에 대한 반응을 확인한 후 마취제를 보충 주입하십시오. 37 °C 근처의 체온을 모니터링하고 유지합니다.
  3. 기록을 위한 자골 신경 트렁크의 노출
    1. 허벅지의 등도 부분에 피부와 근육을 열어 잘라. 대퇴 이두근을 따라 무딘 해부를 수행합니다. 안과 가위와 유리 분리 바늘을 사용하여 좌골 신경 트렁크를 조심스럽게 분리하십시오. 링거의 용액을 사용하여 조직을 젖은 상태로 유지하십시오.
    2. 수제 금속 후프 (3cm 길이, 철 와이어 1mm 직경 2mm)에 동물을 고정하여 피부를 주변의 슬롯에 바느질하십시오. 유체 목욕을 설정하도록 피부를 약간 위로 당깁니다.
    3. 근측에 1cm의 근위신경 트렁크를 노출시다. 콘트라스트를 향상시키고 미세 신경 트렁크를 명확하게 관찰하기 위해 신경 트렁크 아래에 작은 갈색 플랫폼을 놓습니다. 수조에서 액체 파라핀을 37°C로 가열하고 섬유 표면의 건조를 방지하기 위해 신경 트렁크 의 상단에 떨어 뜨립니다. 골반 신경 주위의 피아 마터 척추와 경막 미를 제거합니다.
  4. 레코딩 세션
    1. 기록 전극으로서 백금 필라멘트(직경 29 μm)를 선택합니다. 쉽게 성형을 위해 가열하고 맨 끝에 작은 후크를 만듭니다. 필요에 따라 전극을 이동시키기 위해 마이크로 조작기에 전극을 부착합니다.
    2. 욕조에서 참조 전극을 인접한 피하 조직에 놓습니다. 척추 두라와 피아 메이터를 분할합니다. 자골 신경을 기록 풀에서 단일 섬유 (직경 15-20 μm)로 분리합니다. 그런 다음, 축삭의 미세한 근막을 집어 들고 25배 배율로 스테레오스코프 하에서 기록 전극의 후크에 축삭의 근측 끝을 중단시낸다.
      참고: 방금 해부된 필라멘트는 두껍고 단일 단위가 기록될 때까지 추가 분리가 필요합니다.
    3. 기계적 자극(Von Frey hairs) 및 열 자극(50-55°C의 물을 가진 작은 면공)을 사용하여 단일 노치셉트 C-섬유의 수용 분야를 식별합니다. 간단히, 신경 섬유의 발사가 기계적 자극 및 뜨거운 물에 반응하는 경우, 다음 다모달 nociceptive C-섬유로 간주4. 다음으로, 전기 자극의 전달을 위해 확인된 필드의 피부에 2개의 바늘 자극 전극(2 mm 간격)을 삽입한다.
    4. 오실로스코프에서 동작 전위파형을 표시하고 20kHz의 신호 샘플링 속도로 컴퓨터 A/D 보드를 사용하여 스파이크를 증폭하고 기록합니다.
    5. 데이터 수집소프트웨어(자료표)를사용하여 데이터를 수집합니다. 컴퓨터에 데이터를 저장하고 나중에 전문 소프트웨어(재료 표)로 분석할 수 있습니다.

3. 전도 고장 측정

  1. 반복적인 전기 자극(0.8 ms 지속 시간, 1.5x 임계값 강도)을 다른 주파수(2Hz, 5 Hz, 10Hz)에서 60s 4,8,9에대한 C-섬유에 전달합니다. 섬유질이 자극 사이를 이완할 수 있도록 10분 간격으로 두도록 하십시오. 전달된 반복 자극 펄스 수에 대한 고장 횟수의 비율을 계산하고 100%를 곱하여 전도 실패 정도를 얻습니다.

4. 골반 신경으로 부착 된 온난 DRG의 준비

  1. 2.1단계에서 설명한 대로 수술 도구와 링거의 세포외 용액을 준비하십시오.
  2. 부착 된 동골 신경으로 DRG를 분리하십시오.
    1. 단계 2.2에 설명 된 대로 쥐를 마 사 체 (일에 3 받는 번째 7 CFA 주입 후). 전단 가위로 등과 다리의 머리카락을 자르고 요오드 팅크로 피부를 살균하십시오.
    2. DRG 노출의 경우 먼저 L4에서 L5 세그먼트 수준으로 뒤쪽의 중간선에서 피부를 엽니다. 척수와 DRG 몸을 노출하기 위해 뼈 rongeur를 사용하여 근육, 척추, 척추 보드 및 횡방향 과정을 제거합니다. 노출된 척수와 DRG를 일반 링거의 세포외 용액에 침투하여 신경 활동을 유지합니다. 출혈을 멈추고 제 시간에 혈액을 지웁히하십시오.
    3. 두 방향에서 좌골 신경을 노출: 좌골 신경의 근측 끝에 있는 DRG에 연결된 척추 신경을 노출하기 위하여 안과 가위를 사용하여 척추 포어맨 위에 L4를 S1 뼈 구조물을 제거하십시오. 중간 허벅지에 자세 신경을 노출하는 피부를 엽니 다. 분리 하고 근육 안쪽으로 가는 신경의 말단에서 절단 신경을 분리하고, 절단하기 전에 신경의 끝에 외과 선으로 신경 트렁크를 분리합니다.
    4. 신경 결찰 점의 리프팅을 통해 안과 가위를 사용하여 근본적인 결합 조직에서 좌골 신경을 분리하십시오. 척수에서 경막대를 제거하고 척추 신경의 인접한 부분에 도달 할 때까지 등뼈 뿌리를 들어 올려 기본 결합 조직에서 DRG를 분리합니다. 따라서 부착 된 동골 신경으로 DRG의 전체 준비를 분리하십시오.
  3. DRG의 표면을 지웁습니다.
    1. 4배 배율로 스테레오스코프 아래에 핀셋을 사용하여 L4−L6 DRG 표면의 척추 경구를 조심스럽게 제거하십시오.
    2. 혼합 효소 1 mL (0.2 % 단백질 효소 및 0.32 % 콜라게나아제)를 포함하는 유리 튜브에 부착 된 sciatic 신경으로 DRG를 넣고 37 °C 수조에서 15 분 동안 소화하십시오 (5 분 간격으로 플라스틱 드롭퍼로 약간 불어).
    3. 결찰 선의 끝을 들어 올리고 효소를 씻어 일반 링거의 세포 외 용액으로 채워진 접시에 준비를 이동합니다. 그런 다음 소화된 DRG를 녹음용 산소링어의 세포외 용액으로 채워진 용기(그림1A)로 옮긴다.
  4. 레코딩 세션
    1. 세포 내 용액 준비 (mM : 칼륨 글루코네이트 120, KCl 18, MgCl2 2, 에틸렌 글리콜-비스(β-aminoethyl ether)-N,N,N', N'-테트라아세트산 [EGTA] 5, HEPES 10, Na 2-ATP 5, Na-GTP 0.4, CaCl2 1; pH 7.2 및 300 mosm). 사용할 때까지 0°C에서 유지하십시오.
    2. 슬라이스 앵커를 사용하여 중추를 안정시키고 신경 끝을 흡입 자극 전극에 연결합니다(그림1A). 40배 배율로 수몰입 목표를 가진 DRG 뉴런을 시각화하고 선택합니다.
    3. 전극(재료표)을 당겨 세포내 용액으로 채웁니다. 홀더에 전극을 삽입하고 4-7 MΩ의 최종 저항으로 파이펫에 양압을 가합니다.
    4. 전극을 셀 가까이에 가져와서 만지십시오. GΩ 씰에 도달하면 파이펫에 음압을 주고 멤브레인 전위를 약 -60 mV로 설정한 다음 전체 셀 기록 모드를 설정합니다.
    5. 흡입 전극을 통해 5-50 Hz의 반복적인 자극을 심질 신경에 전달하여 전도 실패를 가합니다. 기준선에서 피크까지의 과과분극 전위 전위 전위(AHP)의 진폭과 80% AHP 지속 시간을 측정합니다.
      참고: 분산의 단방향 분석(ANOVA; 두 개 이상의 그룹에 대해) 또는 학생의 t-검정(두 그룹에 대해서만)을 사용하여 데이터를 분석했습니다. 데이터는 평균(SEM)의 ±표준 오차를 의미로 제시한다. 통계적 유의 수준은 p< 0.05로 설정되었다.
  5. 실험 종료
    1. 쥐가 마취 상황에서 여전히 실험 작업을 완료하면, 쥐는 과다 복용 펜토 바르 비탈 나트륨의 심장 내 주사로 인도적으로 안락사된다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

단일 섬유 기록 프로토콜의 결과는 섬유 해질의 품질에 따라 달라집니다. 생체 내 실험을위한 동물은 쉽게 해부를 위해 신경 트렁크를 건강하게 유지하는 좋은 상황에 있어야합니다 (토론 섹션의 조언 참조). 섬유에 약물 전달을 위해 많은 경우에 약물 응용 프로그램 목욕이 필요합니다. 1은 생체 내 단일 섬유 기록이 어떻게 작동되었는지를 도시하고(도1A)CFA 처리된 동물의 근막 신경으로부터 하나의 고전적인 기록을 제시한다(도1B).

다음 실험은 CFA 처리 된 동물에서 전도 실패의 존재를 조사했다. 이 조사는 nociceptive C 섬유를 따라 전도 실패가 일반적인 현상이었다는 가정에 근거를 두었고, 전도 실패의 정도는 우리의 지원되는 hyperalgesia의 조건 하에서 현저하게 감쇠되었습니다. 이전연구 4, 8,9,12. 도 2A는 C-섬유 전도 실패가 정상 동물에서 관찰되었다는 것을 나타낸다. 그러나, CFA 유도 과민증의 확립 후 CFA 유도 과민증이 대조군과 비교하여 발에주사된 후 전도 실패의 정도가 현저히 감소하였다(도 2B). 이러한 데이터는 염증성 통증의 CFA 모델에서 통증 관련 다각적 인 다각적 인 C 섬유의 전도 실패가 감쇠된다는 것을 보여줍니다.

전도 실패 시 세포내 기전을 검사하기 위해, 부착된 동골 신경을 이용한손상되지 않은 DRG의 제제를 사용하였다(도3A,B). 그림 3C는 자극 시리즈 내에서, 이전의 과극분극 전위 전위(AHP)에 쌓인 반복적인 자극에 대한 반응으로 스파이크가 증가하고 다음 AHP(그림3C,D)의 상승 경사의 감소를 초래함을 나타낸다. ). 작은 DRG 뉴런에서 AHP의 존재는 잠재적으로 과분극 활성화, 순환 뉴클레오티드 조절 (HCN) 채널13,14,15를활성화한다. AHP의 누적 효과는 전도 실패의 발생에 중요한 역할을합니다. 따라서 HCN 채널을 차단하면 전도 실패 효과가 크게 향상될 것이라고 가정했습니다. 다음 실험은 HCN 채널ZD7288의 차단제를 사용했다. 연속 기록은 농도 의존적 방식으로 ZD7288의 존재에서 전도 실패의 증가를 밝혔다. Inset은 지정된 간격에 대한 확장된 추적을 표시합니다. CFA 처리된 동물의 작은 DRG 뉴런에서 전도 실패와 AHP의 상승 경사사이의 긍정적인 상관관계가 관찰되었다(도 3E).

Figure 1
그림 1: 쥐 근막 신경의 생체 내 단일 섬유 기록. (A) 기록(R)을 위한 영역을 나타내는 단일 섬유 기록의 회로도 도면(기록을 위한 필라멘트를 분할하기 전에, 피아 마더 척추및 경구 마더는 여기에서 제거하였다), 약물 적용(D), 자극(S), 및 CFA 부위 사출. (B) 토닉 소성 패턴을 나타내는 단섬유 단일 섬유의 대표적인 기록. 이 그림은 Wang 등에서 수정되었습니다.9이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 

Figure 2
도 2: CFA 처리된 랫트에서전도 부전은 대조군 랫트에 비해 감쇠되었다. (A) 10Hz 전기 자극에 반응하여 대조군 쥐로부터 단일 C-섬유 발사의 원래 연속 기록. 모든 20번째 스윕이 표시되고(연속 스윕은 2-s 간격으로) 위에서 아래로 표시됩니다. 인세트는 대표적인 작업 잠재력을 보여줍니다. (B) 패널 A에서와 동일한 자극에 반응하여 CFA 주입 된 쥐로부터 단일 C 섬유의 기록. 이 그림은 왕 외 에서 수정되었습니다9. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 부착된 동골 신경을 가진 손상되지 않은 DRG의 제제를 이용한 C-섬유 전도 실패의 측정. (A) DRG 제제의 설정 및 배치를 보여주는 회로도 다이어그램. SE: 자극 전극; SN: 자생 신경; FM: 형광 현미경; RE: 레코딩 전극. (b) 전체 DRG 시편을 40x 뷰 하에서 관찰하고, 마이크로전극(오른쪽 그림자)을 작은 DRG 뉴런을 패칭하는데 사용하였다. (C) CFA 처리 된 랫트로부터의 소직경 DRG 뉴런에서 ZD7288의 상이한 농도의 제어 조건 또는 투여 하에서 5-Hz 자극에 대한 일련의 발사 반응의 연속 기록. inset에는 지정된 기록 기간에 대한 확장된 추적이 표시됩니다. 다크 스팟은 스파이크 실패를 나타냅니다. (D) AHP의 상승 경사를 측정하는 데 사용되는 대표적인 트레이스. 상승 경사는 최대 및 최소 AHP 전압(mV) 사이의 진폭 차이를 지속 시간(자극 간격, 초)으로 나눈 값과 동일합니다. 왼쪽 패널은 "*"로 표시된 패널 C의 첫 번째 트레이스에서 더 큰 상승 경사를 보여 주며, 오른쪽 패널은 ZD7288 응용 프로그램(125 μM) 후에 더 작은 상승 경사(패널 C의 네 번째 추적에서 "#"로 표시된 패널 C의 네 번째 추적)를 보여 줍니다. (E) ZD7288의 상이한 농도에 응하여 전도 실패의 정도와 AHP의 상승 기울기 사이의 관계. * 및 # P < 0.05 대 제어. 이 그림은 왕 외 에서 수정되었습니다9. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

최근 연구는 생체 내에서 DRG 뉴런의 칼슘 이미징을 달성했지만16,개별 DRG nociceptors에서 생체 패치 클램프 기록을 수행하는 것은 매우 어려운 남아있다. 따라서, 통증 분야에 대한 생체 내 단일 섬유 접근법은 지속적으로 중요하다. 본 프로토콜에서 단일 섬유 기록은 전도 실패 현상의 객관적인 관찰을 허용하고, 현재 연구에서 개발 된 생체 전 제제와이 기술의 조합은 기본 메커니즘의 검사를 허용 전임상 모델에서 노시셉터 흥분성 변화. 단일 파이버 레코딩 프로토콜의 세 단계는 성공적인 레코딩에 매우 중요합니다. 첫째, 동물의 마취에주의를 기울이는 것이 중요합니다. 정교한 생체 내 기록 실험에서, 29 μm 백금 전극 주위에 감싸는 얇은 섬유의 길이는 2-3 mm에 불과하며, 이는 기록 과정에서 쉽게 방해된다. 마취 상태가 특히 안정적이지 않은 경우 동물의 작은 움직임은 전기 생리 학적 활동의 기록 실패로 이어질 수 있습니다. 둘째, 준비는 지속적으로 파라핀으로 덮여 있어야합니다. 이 조작의 목적은 섬유의 활성을 유지하는 것입니다. 적절한 기록 슬롯은 일반적으로 동물의 피부를 사용하여 구성되었다. 파라핀 오일 누출을 방지하기 위해, 슬롯의 벽은 슈퍼 접착제를 사용하여 강화 될 수있다, 파라핀 오일은 필요할 때마다 추가해야합니다. 전체 테스트 중에 섬유를 건조할 수 없습니다. 마지막으로, 신경 트렁크 주위의 환경은 건강하게 유지되어야합니다. 기록 영역 주위에 항상 약간의 삼출액이 존재하며,이 삼출액은 좋은 품질의 녹음을위한 장애물입니다. 섬유 활성의 진폭은 계속 감소하고 궁극적으로 기록 실패를 일으키는 극단적인 기준선 노이즈와 구별될 수 없게 됩니다. 홈메이드 주사기 튜브는 유출액을 빨아들이기 위해 슬롯 의 바닥 깊숙이 도달해야합니다. 때로는 식염수에 담근 세미 드라이 면공도 도움이됩니다.

본 연구에서, CFA 모델은 CFA 주입 다음 발 염증 과민증을 생산하는 적용되었다. 말초 구심성 분비물의 특성과 근본적인 메커니즘을 조사하기 위해 통증 연구에서 일상적인 관행이며 IACUC / 윤리위원회의 승인을받은 실험에서 진통제가 사용되지 않았습니다. 본 연구는 반복적인 전기 자극을 제공하는 비자성 C-섬유에서 발생하는 투과 과정의 변화를 관찰하기 위해 생체 내 단일 섬유 기록 기술을 소개합니다. 전도 실패의 정도가 고달전체 조건에서 현저히 감쇠되었지만 패치 클램핑의 기술적 어려움으로 인해 단일 섬유 기록을 사용하여 기본 메커니즘을 조사할 수 없었습니다. C 섬유. 따라서, 소직경 DRG 뉴런의 전도 실패와 막 전위 변화 사이의 관계에 대한 조사는 부착된 동골 신경과 함께 손상되지 않은 DRG의 제제를 사용하여 검출되었다. 단일 섬유 기록 대신, 이러한 제제를 사용하는 패치 클램프는 전도 실패의 생산을 위한 AHP 의존적 메커니즘을 탐구합니다. 이 프로토콜을 사용 하 여, 비록 몇 가지 표면 뉴런을 선택할 수 있습니다., DRG 뉴런의 수준에서 전도 실패의 정도는 여전히 기록 될 수 있었다, 심지어 약물 투여와.

DRG에는 두 개의 외부 막이 있습니다: 피아 마더 척추와 경막 마더. 경막미터는 헤어스프링 핀셋을 사용하여 제거해야 하며, 패치 클램프 전극이 DRG 세포의 표면에 도달할 수 있도록 피아 메이터 척추(단일 DRG 세포의 격리에 사용되는 대로 직렬로 사용되지 않음)를 소화해야 합니다. 인장; 그렇지 않으면 패치 클램프 기록을 얻을 수 없습니다. 현재 의 접근 방식은 DRG 플러스 신경의 조각에 비해 말초 신경 입력을 더 완벽하게 보존하고 DRG 뉴런의 패치 클램프 기록이 쉽게 달성되도록 보장합니다. 이 프로토콜은 다른 만성 통증 모델에서 상이한 DRG 뉴런의 전기 생리학적 변화에 대한 조사와 같은 통증에 관련된 말초 신경계의 이해를 향상시키기 위한 광범위한 응용 가능성을 가지고있습니다 17 ,18 및 분자 메커니즘은 myelinated 또는 myelinated 축축제19,20와DRG에서 비정상적인 자발적 활성을 기본으로.

여기에 제시된 연결된 근막 신경을 갖는 손상되지 않은 DRG의 제제는 전통적인 해리된 신경절 방법에 비해 많은 장점을 가지고 있는데, 이는 DRG의 구조가 이 제제에서 기본적으로 깨지지 않은 상태로 남아 있기 때문이다. 따라서 생체 내 실제 조건을 시뮬레이션하고 생리 활성에 대한 바람직한 미세 환경을 제공합니다. 부착 된 심근 신경을 가진 손상되지 않은 DRG의 제제는 후자의 과정이 더 많은 소화 효소와 외부 물리적 인 행동 (예 : 세포의 전단 및 송풍)을 사용하기 때문에 해리 된 DRG 준비보다 신경 손상을 덜 생성합니다. 세포에 더 많은 손상을 입힙니다. 대부분의 전기생리학적 연구는 여전히 해리된 DRG 뉴런21,22,및 해리 과정 자체가 세포를 손상시키며, 이는 뉴런23의비정상적인 과흥분을 초래한다. 이 프로토콜의 또 다른 장점은 세포 외 구심성 전기 생리활성이 신경 돌기 때문에 얻어지며, 이는 구심성 스파이크와 체세포 DRG 자발적 사이의 상호 작용을 조사 할 수 있다는 것입니다. 방전. 마지막으로, 이 제제는 DRG 뉴런과 위성 신경교 세포를 보존하고, 오직 DRG 뉴런만이 해리 프로토콜에 남아 있다. DRG의 미세 환경을 유지하는 데 필수적인 위성 신경교 세포는 개별 DRG 뉴런24를보호하는 장벽이며,이 세포는 추가 연구를 보증합니다.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgments

이 사업은 중국 국립자연과학재단(31671089 및 81470060)과 산시성 사회개발과학기술연구사업(2016SF-250)의 지원으로 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Instruments and software used in single fiber recording
Amplifier Nihon kohden MEZ-8201 Amplification of the electrophysiological signals
Bioelectric amplifier monitor ShangHai JiaLong Teaching instrument factory SZF-1 Monitor firing process via sound which is transformed from physiological discharge signal
Data acquisition and analysis system CED Spike-2 Software for data acquisition and analysis
Electrode manipulator Narishige SM-21 Contro the movement of the electrode as required
Hairspring tweezers A.Dumont 5# Separate the single fiber
Isolator Nihon kohden SS-220J
Memory oscilloscope Nihon kohden VC-9 Display recorded discharge during
Experiment
Stereomicroscope ZEISS SV-11 Have clear observation when separate the local tissue and single fiber
Stimulator Nihon kohden SEZ-7203 Delivery of the electrical stimuli
Von Frey Hair Stoelting accompany Delivery of the mechanical stimuli
Water bath Scientz biotechnology Co., Ltd. SC-15 Heating paroline to maintain at 37 °C
Instruments and software used in patch clamp recording
Amplifier Axon Instruments Multiclamp 700B Monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the stimuli by sending a signal to the electrode
Anti-vibration table Optical Technology Co., Ltd. Isolates the recording system from vibrations induced by the environment
Camera Olympus TH4-200 See the neurons in bright field; the controlling software allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell
Clampex Axon Clampex 9.2 Software for data acquisition and delivery of stimuli
Clampfit Axon Clampfit 10.0 Software for data analysis
Electrode puller Sutter P-97 Prepare recording pipettes of about 2μm diameter with resistance about 5 to 8 MΩ
Glass pipette Sutter BF 150-75-10
Micromanipulator Sutter MP225 Give a precise control of the microelectrode
Microscope Olympus BX51WI Upright microcope equipped with epifluorescence for clearly observe the cells which would be patched
Origin Origin lab Origin 8 Software for drawing picture
Perfusion Pump BaoDing LanGe Co., Ltd. BT100-1J Perfusion of DRG in whole-cell patch clamp
Other instruments
Electronic balance Sartorius BS 124S Weighing reagent
pH Modulator Denver Instrument UB7 Adjust pH to 7.4
Solutions/perfusion/chemicals
Calcium chloride Sigma-Aldrich C5670 Extracellular solution
Chloralose Shanghai Meryer Chemical Technology Co., Ltd. M07752 Mixed solution for Anesthesia
Collagenase Sigma-Aldrich SLBQ1885V Enzyme used for clearing the surface of DRG
D (+) Glucose Sigma-Aldrich G7528 Extracellular solution
Liquid Paraffin TianJin HongYan Reagent Co., Ltd. Maintain fiber wetting
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M7506 Extracellular solution
Potassium chloride Sigma-Aldrich P3911 Extracellular solution
Protease Sigma-Aldrich 62H0351 Enzyme used for clearing the surface of DRG
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5671 Extracellular solution
Sodium chloride Sigma-Aldrich S5886 Extracellular solution
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich S0751 Extracellular solution
Sucrose Sigma-Aldrich S0389 Extracellular solution
Urethane Sigma-Aldrich U2500 Mixed solution for Anesthesia

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Koski, C. L., et al. Derivation and validation of diagnostic criteria for chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy. Journal of the Neurological Sciences. 277, (1-2), 1-8 (2009).
  2. Allen, T. J., Knight, D. E. The use of intracellular dialysis to study signal transduction coupling in the squid giant axon. Journal of Neuroscience Methods. 42, (3), 169-174 (1992).
  3. Schafers, M., Cain, D. Single-fiber recording: in vivo and in vitro preparations. Methods in Molecular Medicine. 99, 155-166 (2004).
  4. Sun, W., et al. Reduced conduction failure of the main axon of polymodal nociceptive C-fibres contributes to painful diabetic neuropathy in rats. Brain. 135, Pt 2 359-375 (2012).
  5. Debanne, D. Information processing in the axon. Nature Reviews Neuroscience. 5, (4), 304-316 (2004).
  6. De Col, R., Messlinger, K., Carr, R. W. Conduction velocity is regulated by sodium channel inactivation in unmyelinated axons innervating the rat cranial meninges. Journal of Physiology. 586, (4), 1089-1103 (2008).
  7. Debanne, D., Campanac, E., Bialowas, A., Carlier, E., Alcaraz, G. Axon physiology. Physiological Reviews. 91, (2), 555-602 (2011).
  8. Zhu, Z. R., et al. Conduction failures in rabbit saphenous nerve unmyelinated fibers. Neurosignals. 17, (3), 181-195 (2009).
  9. Wang, X., et al. A novel intrinsic analgesic mechanism: the enhancement of the conduction failure along polymodal nociceptive C-fibers. Pain. 157, (10), 2235-2247 (2016).
  10. Smith, T., Al Otaibi, M., Sathish, J., Djouhri, L. Increased expression of HCN2 channel protein in L4 dorsal root ganglion neurons following axotomy of L5- and inflammation of L4-spinal nerves in rats. Neuroscience. 295, 90-102 (2015).
  11. Zhang, X. L., Albers, K. M., Gold, M. S. Inflammation-induced increase in nicotinic acetylcholine receptor current in cutaneous nociceptive DRG neurons from the adult rat. Neuroscience. 284, 483-499 (2015).
  12. Zhu, Z. R., et al. Modulation of action potential trains in rabbit saphenous nerve unmyelinated fibers. Neurosignals. 21, (3-4), 213-228 (2013).
  13. Djouhri, L., Bleazard, L., Lawson, S. N. Association of somatic action potential shape with sensory receptive properties in guinea-pig dorsal root ganglion neurones. Journal of Physiology. 513, 857-872 (1998).
  14. Fang, X., McMullan, S., Lawson, S. N., Djouhri, L. Electrophysiological differences between nociceptive and non-nociceptive dorsal root ganglion neurones in the rat in vivo. Journal of Physiology. 565, Pt 3 927-943 (2005).
  15. Young, G. T., Emery, E. C., Mooney, E. R., Tsantoulas, C., McNaughton, P. A. Inflammatory and neuropathic pain are rapidly suppressed by peripheral block of hyperpolarisation-activated cyclic nucleotide-gated ion channels. Pain. 155, (9), 1708-1719 (2014).
  16. Kim, Y. S., et al. Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain. Neuron. 91, (5), 1085-1096 (2016).
  17. Fan, N., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. Chronic compression of mouse dorsal root ganglion alters voltage-gated sodium and potassium currents in medium-sized dorsal root ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 106, (6), 3067-3072 (2011).
  18. Ma, C., et al. Similar electrophysiological changes in axotomized and neighboring intact dorsal root ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 89, (3), 1588-1602 (2003).
  19. Boucher, T. J., et al. Potent analgesic effects of GDNF in neuropathic pain states. Science. 290, (5489), 124-127 (2000).
  20. Ma, C., Greenquist, K. W., Lamotte, R. H. Inflammatory mediators enhance the excitability of chronically compressed dorsal root ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 95, (4), 2098-2107 (2006).
  21. Gong, K., Ohara, P. T., Jasmin, L. Patch Clamp Recordings on Intact Dorsal Root Ganglia from Adult Rats. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
  22. Schoenen, J., Delree, P., Leprince, P., Moonen, G. Neurotransmitter phenotype plasticity in cultured dissociated adult rat dorsal root ganglia: an immunocytochemical study. Journal of Neuroscience Research. 22, (4), 473-487 (1989).
  23. Zheng, J. H., Walters, E. T., Song, X. J. Dissociation of dorsal root ganglion neurons induces hyperexcitability that is maintained by increased responsiveness to cAMP and cGMP. Journal of Neurophysiology. 97, (1), 15-25 (2007).
  24. Hanani, M. Satellite glial cells: more than just rings around the neuron. Neuron Glia Biology. 6, (1), 1-2 (2010).
전도 실패의 메커니즘을 검사하기 위해 연결된 Sciatic 신경을 가진 생체 내 단일 섬유 기록 및 손상되지 않은 등철 루트 신경절의 사용
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mao, H., Wang, X., Chen, W., Liu, F., Wan, Y., Hu, S., Xing, J. Use of In Vivo Single-fiber Recording and Intact Dorsal Root Ganglion with Attached Sciatic Nerve to Examine the Mechanism of Conduction Failure. J. Vis. Exp. (150), e59234, doi:10.3791/59234 (2019).More

Mao, H., Wang, X., Chen, W., Liu, F., Wan, Y., Hu, S., Xing, J. Use of In Vivo Single-fiber Recording and Intact Dorsal Root Ganglion with Attached Sciatic Nerve to Examine the Mechanism of Conduction Failure. J. Vis. Exp. (150), e59234, doi:10.3791/59234 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter