Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Neuroscience

Användning av in vivo Single-fiber inspelning och intakt dorsala root ganglion med bifogade ischiasnerven att undersöka mekanismen för överledning misslyckande

doi: 10.3791/59234 Published: August 27, 2019
* These authors contributed equally

Summary

Single-fiber inspelning är en effektiv Elektrofysiologisk teknik som är tillämplig på den centrala och perifera nervsystemet. Tillsammans med beredningen av intakt DRG med den bifogade ischiasnerven, mekanismen för överledning misslyckande undersöks. Båda protokollen förbättrar förståelsen av det perifera nervsystemets relation till smärta.

Abstract

Single-fiber inspelning har varit en klassisk och effektiv Elektrofysiologisk teknik under de senaste decennierna på grund av dess specifika tillämpning för nervfibrer i den centrala och perifera nervsystemet. Denna metod är särskilt tillämplig på dorsala root ganglier (DRG), som är primära sensoriska nervceller som uppvisar en pseudo-unipolär struktur av nerv processer. De mönster och funktioner i åtgärden potentialer passerade längs axoner är inspelningsbara i dessa nervceller. Den nuvarande studien använder in vivo Single-fiber inspelningar för att observera lednings svikt av ischiasnerven i komplett Freunds adjuvans (CFA)-behandlade råttor. Eftersom den bakomliggande mekanismen inte kan studeras med in vivo Single-fiber inspelningar, patch-Clamp-inspelningar av DRG neuroner utförs på preparat av intakt DRG med den bifogade ischiasnerven. Dessa inspelningar avslöjar en positiv korrelation mellan överledning misslyckande och den stigande lutningen av efter-hyperpolarisering potential (AHP) av DRG neuroner i CFA-behandlade djur. Protokollet för in vivo Single fiber-inspelningar tillåter klassificering av nervfibrer via mätning av överledning hastighet och övervakning av onormala förhållanden i nervtrådar i vissa sjukdomar. Intakt DRG med bifogade perifera nerv tillåter observation av aktiviteten av DRG nervceller i de flesta fysiologiska förhållanden. Slutgiltigt, Single-fiber inspelning kombinerat med elektrofysiologiska inspelningen av intakt DRGs är en effektiv metod för att undersöka rollen av överledning misslyckande under den analgetiska processen.

Introduction

Den normala överföringen av information längs nervfibrer garanterar den normala funktionen av nervsystemet. Onormal funktion av nervsystemet återspeglas också i den elektriska signalen överföring av nervfibrer. Till exempel, graden av demyelinisering i centrala demyelinisering lesioner kan klassificeras genom jämförelse av förändringar i nerv överledning hastighet före och efter intervention ansökan1. Det är svårt att intracellulärt spela in nervfibrer, utom i speciella preparat som bläckfisk jätten Axon2. Därför är Elektrofysiologisk aktivitet endast inspelningsbar via den extracellulära inspelningen av enstaka fibrer. Som en av de klassiska elektrofysiologiska metoder, Single-fiber inspelning har en längre historia än andra tekniker. Emellertid, färre Elektrofysiologer gripa denna metod trots dess omfattande tillämpning. Därför behövs en detaljerad introduktion av standardprotokollet för enkel fiber inspelning för dess lämpliga tillämpning.

Även om olika patch-Clamp tekniker har dominerat modern Elektrofysiologisk studie, Single-fiber inspelning spelar fortfarande en oersättlig roll i inspelningen av verksamheten i nervfibrer, särskilt fibrer som sänder perifer känsla med sina sensorisk cellkroppen ligger i dorsala root ganglion (DRG). Fördelen med att använda Single-fiber inspelning här är att in vivo fiber Recording ger en lång observationstid med kapacitet att spela in svar på naturliga stimuli i prekliniska modeller utan störning i den intracellulära miljön3 , 4.

Ett ökande antal studier under de senaste två decennierna har undersökt komplexa funktioner längs nervfibrer5, och överledning misslyckande, som definieras som ett tillstånd av misslyckade nervimpuls överföring längs Axon, var närvarande i många olika perifera nerver6,7. Närvaron av lednings svikt i vår undersökning fungerade som en inneboende självhämmande mekanism för modulering av ihållande nociceptiva input längs C-fibrer8. Detta retledningmisslyckande var signifikant försvagat under förhållanden av hyperalgesi4,9. Därför, inriktning de faktorer som deltar i överledning misslyckande kan representera en ny behandling för neuropatisk smärta. För att observera lednings svikt, bör skott mönstret registreras och analyseras på grundval av sekventiellt urladdade spikar baserade på Single-fiber inspelning.

För att grundligt förstå mekanismen för överledning misslyckande, är det nödvändigt att identifiera överförings egenskaperna hos Axon, eller mer exakt, membran egenskaper DRG neuroner, baserat på deras pseudo-Unipolar anatomiska egenskaper. Många tidigare studier på detta område har utförts på separerade DRG neuroner10,11, som kanske inte är möjligt för utredning av lednings svikt på grund av två hinder. Först, olika mekaniska och kemiska metoder används i dissociation processen för att frigöra DRG nervceller, vilket kan resultera i ohälsosamma celler eller ändra fenotyp/egenskaper av nervceller och blanda ihop resultaten. För det andra är den bifogade perifera nerver i princip bort, och överledning misslyckande fenomen är inte observerbara i dessa preparat. Därför, en beredning av intakt DRG nervceller med en bifogad nerv har förbättrats för att undvika de ovan nämnda hindren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Det nuvarande protokollet följde guiden för USA: s folkhälsopolitik för Human Care och användning av försöksdjur, och kommittén för etik i djurförsök av det fjärde militära medicinska universitetet godkände protokollet.

1. djur

  1. Dela 24 Sprague-Dawley råttor (4-8 veckor gamla) i två grupper. Producera komplett Freund ' s adjuvant (CFA) modell av intraplantar injektion av 100 μL av CFA i en grupp av 14 råttor och en annan grupp av 10 råttor genom behandling med saltlösning.
    Notera: alla djuren förvärvades från djur centrum av det fjärde militära medicinska universitetet. Vuxna manliga och kvinnliga Sprague-Dawley råttor (150-200 g) användes för alla förfaranden, och råttor randomiserades till burar. Två råttor var inhysta per bur under en 12-/12-hour ljus/mörker cykel vid en konstant temperatur (25 ± 1 ° c) med fri tillgång till mat och vatten.

2. in vivo Single-fiber inspelning

  1. Förbered och desinficera alla kirurgiska instrument (skalpell, pincett, oftalmologiska saxar, klippning sax, glas separera nål, sutur nål, ben rongeur) före operationen. Förbered 1 L eller 2 L normal Ringers extracellulära lösning (i mM: NaCl 124, KCl 3, MgSO4 1,3, CaCl2 2, NaHCO3 26, NaH2PO4 1,25, glukos 15; pH 7,4 och 305 mOsm). Förvaras vid 4 ° c fram till användning.
  2. Anesthetize råttor. På dag 3 till 7 efter CFA injektion, Använd intraperitoneal injektion av en blandad lösning (1% kloralose och 17% uretan, 5 mL/kg kroppsvikt) för att hålla djuren i ett stabilt estetiskt tillstånd under experimentet. Applicera ytterligare injektion av anestetika, om nödvändigt, efter att ha kontrollerat eleverna och svaret på smärt stimulering. Övervaka och upprätthålla en kroppstemperatur nära 37 ° c.
  3. Exponering av ischiasnerven stammen för inspelning
    1. Klipp öppna huden och muskler på ryggdelen av låret. Utför en trubbig dissektion längs lår bens biceps. Noggrant isolera ischiasnerven stammen med oftalmisk sax och en glas separation nål. Håll vävnaden våt med hjälp av Ringers lösning.
    2. Fixa djuret på en hemlagad metall båge (3 cm lång, 2 mm bred metall båge med en järn tråd 1 mm i diameter) via sömnad huden i facket runt den. Dra upp huden något så att ett vätske bad.
    3. Exponera 1 cm av ischiasnerven stammen på den proximala sidan. Placera en liten brun plattform under nerven stammen att öka kontrasten och observera den fina nerven stammen klart. Värm flytande paraffin i ett vattenbad till 37 ° c och släppa den på toppen av nerven stammen för att förhindra torkning av ytan av fibern. Ta bort pia mater Spinalis och dura mater runt ischiasnerven.
  4. Inspelningssessionen
    1. Välj en platina-filament (29 μm i diameter) som inspelnings elektrod. Värm över för enklare gjutning, och skapa en liten krok i slutet. Anslut elektroden till en micromanipulator för att flytta elektroden efter behov.
    2. I badet, placera en referenselektrod i angränsande subkutan vävnad. Dela spinal Dura och pia mater. Separera ischiasnerven i en enda fiber (15-20 μm i diameter) i inspelningen poolen. Sedan plocka upp en fin sydda av axon och avbryta proximala änden av axon på kroken av inspelningen elektroden under ett stereoskop på 25x förstoring.
      Anmärkning: De just-dissekerade glödtrådar tenderar att vara tjockare och kräver ytterligare separation tills en enda enhet kan registreras.
    3. Identifiera det receptiva området för en enda nociceptiva C-fiber med hjälp av en mekanisk stimulans (von Frey hårstrån) och termisk stimulans (liten bomullstuss med 50-55 ° c vatten). Kortfattat, om bränning av nerv fiber reagera på mekaniska stimuli och varmvatten, sedan betrakta det som en polymodal nociceptiva C-fiber4. Nästa, infoga två nål stimulans elektroder (2 mm intervall) i huden på det identifierade fältet för leverans av elektriska stimuli.
    4. Visa vågform av en åtgärd potential på oscilloskop och anställa en dator A/D-Board med en signal samplingsfrekvens på 20 kHz för att förstärka och spela in spikar.
    5. Samla in data med hjälp av datainsamlingsprogram (tabell över material). Spara data på en dator och analysera senare med professionell programvara (tabell över material).

3. mätning av Överlednings bortfall

  1. Leverera repetitiva elektriska stimuli (0,8 MS varaktighet, 1.5 x tröskel intensitet) i olika frekvenser (2 Hz, 5 Hz, 10 Hz) till en C-fiber för 60 s4,8,9. Tillåt en 10 min intervall för fiber att slappna av mellan stimuli. Beräkna förhållandet mellan antalet misslyckanden till antalet levererade repetitiva stimulans pulser och multiplicera med 100% för att få graden av överledning misslyckande.

4. beredning av Iintakt DRG fäst med ischiasnerven

  1. Förbered kirurgiska verktyg och Ringers extracellulära lösning som beskrivs i steg 2,1.
  2. Separera DRG med den bifogade ischiasnerven.
    1. Anesthetize råttorna som beskrivs i steg 2,2 (på dag 3 till 7 efter CFA injektion). Skär håret på rygg och ben med skjuvning sax, och sterilisera huden med tinktur av jod.
    2. För DRG-exponering, först klippa öppna huden från mittlinjen av ryggen på segment nivån L4 till L5. Ta bort muskler, processen av ryggraden, Ryggkota, och tvärgående process med hjälp av ett ben rongeur att exponera ryggmärgen och DRG kroppen. Täck den exponerade ryggmärgen och DRG med bomull infiltrerat av normal Ringers extracellulära lösning för att upprätthålla neurala aktivitet. Stoppa blödningen och rensa blodet i tid.
    3. Exponera ischiasnerven från två riktningar: ta bort L4 till S1 benstomme ovanför kotpelaren foramen med hjälp av oftalmologiska sax för att exponera spinal nerven ansluten till DRG som är på den proximala änden av ischiasnerven. Klipp öppna huden för att exponera ischiasnerven på mitten av låret. Separera och koppla ischiasnerven från den distala änden av nerven där det går inne i muskeln, och ligera nerven stammen med kirurgisk linje i slutet av nerven före styckning.
    4. Separera ischiasnerven från den underliggande bindväv med hjälp av oftalmisk sax genom att lyfta av nerven ligering punkt. Ta bort Dura från ryggmärgen och separera DRG från underliggande bindväv genom att lyfta dorsala roten tills den når den intilliggande delen av ischiasnerven. Således isolera hela beredningen av DRG med en bifogad ischiasnerven.
  3. Töm ytan på DRG.
    1. Ta försiktigt bort spinal Dura på ytorna i L4 − L6 DRG med hjälp av pincetter under ett stereoskop på 4x förstoring.
    2. Placera DRG med bifogade ischiasnerven i ett glasrör som innehåller 1 ml blandade enzymer (0,2% proteinas och 0,32% kollagenas) och smälta i en 37 ° c vattenbad för 15 min (Blås något med en plastpipett på ett intervall på 5 min).
    3. Lyft i slutet av ligering linjen och flytta preparatet till en skål fylld med en normal Ringers extracellulära lösning för att tvätta ut enzymet. Överför sedan den smälta DRG till en behållare (figur 1a) fylld med syresatt Ringers extracellulära lösning för inspelning.
  4. Inspelningssessionen
    1. Förbered intracellulär lösning (i mM: kaliumglukonat 120, KCl 18, MgCl2 2, etylenglykol-bis (β-aminoetyleter)-N, N, N ',, N'-tetraättiksyra [EGTA] 5, Hepes 10, na2-ATP 5, Na-GTP 0,4, CaCl2 1; pH 7,2 och 300 mOsm). Håll vid 0 ° c tills användning.
    2. Stabilisera ganglier med hjälp av ett segment ankare och Anslut nervänden till en sug-stimulerande elektrod (figur 1a). Visualisera och välj en DRG neuron med en vatten-Immersion mål på 40x förstoring.
    3. Dra en elektrod (tabell över material) och fyll den med intracellulär lösning. Sätt in elektroden på hållaren och applicera ett positivt tryck i pipetten med ett slutligt motstånd på 4-7 MΩ.
    4. Ta elektrod nära cellen och tryck på den. Ge ett negativt tryck i pipetten, när GΩ-tätningen är nådd, Ställ in membranpotentialen vid ca-60 mV och etablera sedan hel cells inspelningsläge.
    5. Leverera repetitiva stimuli av 5-50 Hz till ischiasnerven genom sug elektrod att skärmen för överledning misslyckande. Mät amplituden av afterhyperpolarization potential (AHP) från baseline till Peak, och 80% AHP varaktighet.
      Anmärkning: Enkelriktad analys av varians (ANOVA; för mer än två grupper) eller Students t-test (för endast två grupper) användes för att analysera data. Data presenteras som medelvärden ± standardfel av medelvärdet (SEM). Den statistiska betydande nivån har fastställts till p < 0,05.
  5. Avsluta experimentet
    1. När den experimentella uppgiften är avslutad medan råttorna är fortfarande under narkos situation, råttor är humant euthanized med en intrakardiell injektioner av överdosering pentobarbital natrium.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Resultatet av Single-fiber inspelnings protokollet beror på kvaliteten på fiber dissektion. Djuret för in vivo experiment måste vara i en bra situation för att hålla nerven stammen friska för lätt dissektion (se råd i diskussionen avsnitt). Ett läkemedel ansökan bad behövs i många fall för läkemedelsleverans på fibrer. Figur 1 illustrerar hur in vivo Single-fiber inspelning användes (figur 1a) och presenterar en klassisk inspelning från ISCHIASNERVEN av CFA-behandlade djur (figur 1b).

Följande experiment undersökte förekomsten av överlednings svikt hos CFA-behandlade djur. Denna undersökning baserades på antagandet att överledning misslyckande längs nociceptiva C-fibrer var ett vanligt fenomen, och graden av överlednings svikt var signifikant försvagades under förhållanden av hyperalgesi, som stöds av vår tidigare studier4,8,9,12. Figur 2A visar att C-fiber lednings svikt observerades hos normala djur. Graden av överlednings svikt minskade dock signifikant efter bildandet av CFA-inducerad hyperalgesi efter CFA-injektion i foten jämfört med kontroll (figur 2b). Dessa data visar att lednings svikt av smärtrelevanta polymodala nociceptiva C-fibrer dämpas i CFA-modellen av inflammatorisk smärta.

För att undersöka intracellulär mekanism under överledning misslyckande, beredning av intakt DRG med bifogade ischiasnerven användes (figur 3a,B). Figur 3c visar att inom stimulus-serien, staplade spikar som svar på repetitiva stimuli upp på den tidigare efter hyperpolarisering potential (AHP) och resulterade i en minskning av den stigande lutningen av följande AHP (figur 3c,D ). Närvaron av AHP i små DRG neuroner potentiellt aktiverar hyperpolarisering-aktiverade, cykliska nukleotid-modulerade (HCN) kanaler13,14,15. Den kumulativa effekten av AHP spelar en roll i förekomsten av överlednings svikt. Därför har vi en hypotes om att blockering av HCN-kanaler avsevärt skulle förbättra lednings feleffekten. I följande experiment används en blockerare av HCN-kanaler, ZD7288. Kontinuerliga inspelningar avslöjade en ökning av överlednings svikt i närvaro av ZD7288 i ett koncentrationsberoende sätt. Insets visar utökade spår för de angivna intervallen. En positiv korrelation mellan överlednings svikt och den stigande sluttningen av AHP i små DRG-neuroner av CFA-behandlade djur observerades (figur 3E).

Figure 1
Figur 1: in vivo Single-fiber inspelningar av råtta ischiasnerven. (A) Schematiskt diagram över enkel fiber inspelning som anger de regioner som ska registreras (R) (innan en glöd tråds delning för inspelning, pia mater Spinalis och dura mater avlägsnades), drog ansökan (D), stimulering (S) och platsen för CFA Injektion. Brepresentativ registrering av en ischiasnerven Single fiber uppvisar en tonic bränning mönster. Denna siffra har ändrats från Wang et al.9 vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: överlednings svikt hos CFA-behandlade råttor försvagades jämfört med kontroll råttor. (A) original inspelningar i följd av enstaka C-fiberfirings från kontroll råttor som svar på 10-Hz elektrisk stimulering. Var 20: e svep visas (på varandra följande svep var i 2-s intervaller) och visas uppifrån och ned. Insetet visar en representativ actionpotential. B) inspelningar av enstaka C-fibrer från CFA-injicerade råttor som svar på samma stimulering som i panel A. Denna siffra har modifierats från Wang et al.9. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: mätning av C-fiber överledning misslyckande med hjälp av preparat av intakt DRG med bifogade ischiasnerven. (A) Schematiskt diagram som illustrerar installationen och placeringen av DRG-preparat. SE: stimulering elektrod; SN: ischiasnerven; FM: fluorescensmikroskop; RE: inspelning elektrod. (B) hela DRG-exemplaret observerades under en 40x-vy, en mikroelektrod (höger skugga) användes för att lappa en liten DRG neuron. (C) kontinuerliga inspelningar av serie bränning svar på 5-Hz stimulering under kontrollförhållanden eller administrering av olika koncentrationer av ZD7288 i en liten diameter DRG NEURON från CFA-behandlade råttor. Inuppsättningarna visar utökade spår för de angivna inspelnings perioderna. Mörka fläckar representerar Spike misslyckanden. Drepresentativa spår som används för att mäta AHP-sluttningen. Den stigande lutningen var lika med amplitud skillnaden mellan den maximala och minsta AHP spänningar (mV) dividerat med varaktighet (intervall av stimuli, i sekunder). Den vänstra panelen illustrerar en större stigande lutning (från första spåret i panel C märkt med "*"), och den högra panelen visar en mindre stigande lutning (från den fjärde spår i panel C märkt med "#") efter ZD7288 ansökan (125 μM). (E) förhållandet mellan graden av överlednings svikt och den stigande lutningen på AHP som svar på olika koncentrationer av ZD7288. * och # P < 0,05 vs. kontroll. Denna siffra har modifierats från Wang et al.9. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Även om nyligen genomförda studier har uppnått kalcium avbildning av DRG neuroner in vivo16, utför in vivo patch-klämma inspelning från enskilda DRG Nociceptorerna fortfarande extremt utmanande. Därför är en in vivo Single-fiber metod för smärt området är av fortsatt betydelse. Single-fiber inspelning i detta protokoll tillåter objektiv observation av överlednings fel fenomen, och kombinationen av denna teknik med ex vivo preparatet som utvecklats i den aktuella studien möjliggör undersökning av bakomliggande mekanismer i nociceptor excitabilitet förändringar i prekliniska modeller. Tre steg i protokollet för enkel fiber inspelning är avgörande för lyckade inspelningar. Först, det är viktigt att uppmärksamma anestesi av djuret. I utarbeta in vivo inspelning experiment, längden på den tunna fiber som är lindade runt 29 μm platina elektroden är endast 2-3 mm, som lätt störs under inspelningsprocessen. Om anestesi villkoret inte är särskilt stabilt, kan små förflyttningar av djuren leda till inspelningsfel i elektrofysiologiska aktiviteter. För det andra måste preparatet kontinuerligt täckas med paraffin. Syftet med denna manipulation är att bibehålla aktiviteten av fibrerna. En lämplig inspelningsplats var i allmänhet konstruerad med hjälp av huden på djur. För att undvika läckage av paraffinolja, kan väggen i facket förstärkas med superlim, och paraffinolja bör tillsättas när det behövs. Fibern kan inte torka under hela provet. Slutligen måste miljön runt nerven stammen vara sunt upprätthålls. Det finns alltid en del utgjutning vätska som finns runt inspelningsområdet, och denna utgjutning är ett hinder för bra kvalitet inspelningar. Amplituden av fiber aktiviteten kommer att fortsätta att sjunka och slutligen bli omöjlig att skilja från extrema baslinje brus, vilket orsakar ett inspelningsfel. En hemlagad spruta röret krävs för att nå djupt in i botten av facket för att suga ut pleurautgjutning vätskan. Ibland är en semidry bomullstuss indränkt i saltlösning också hjälpsam.

I den nuvarande studien tillämpades CFA-modellen som producerar mul inflammation och hyperalgesi efter CFA injektion. För att undersöka egenskaperna hos perifer afferenta urladdning samt bakomliggande mekanismer, inga analgetika användes i experimentet, som är en rutin praxis i smärtforskning och är godkänd av IACUC/etikkommittén. Den nuvarande studien introducerar en in vivo Single-fiber inspelningsteknik för att observera förändringar i överföringsprocessen som sker i nociceptiva C-fibrer försedda med repetitiva elektriska stimuli. Det visades att graden av överlednings svikt var signifikant försvagad i hyperalgesic förhållanden, men vi kunde inte undersöka den bakomliggande mekanismen med hjälp av Single-fiber inspelning på grund av tekniska svårigheter i patch-spänningssystem C-fibrer. Därför undersökningen av sambandet mellan överledning misslyckande och förändringar i membranet potential av små diameter DRG nervceller upptäcktes med hjälp av beredning av intakt DRG med den bifogade ischiasnerven. I stället för Single-fiber inspelning, patch-klämma med hjälp av sådana preparat utforskar AHP-beroende mekanismer för produktion av överledning misslyckande. Med hjälp av detta protokoll, men endast ett fåtal ytan nervceller kunde väljas, graden av överledning misslyckande i nivå med DRG neuroner var fortfarande kunna registreras, även med drogen administrationen.

DRG har två yttre membran: pia mater Spinalis och dura mater. Den dura mater måste avlägsnas med hjälp av hårspring pincett, och pia mater Spinalis måste smältas (måttlig matsmältning, inte som serie som används i isoleringen av enstaka DRG celler) för att säkerställa att plåstret-klämma elektroder kan nå ytan av DRG celler att bilda en tätning; annars är det omöjligt att erhålla patch-Clamp inspelningar. Den nuvarande metoden mer fullständigt bevarar den perifera nerven input jämfört med skivor av DRG plus nerv och säkerställer att plåstret-klämma inspelning av DRG nervceller är lätt uppnås. Detta protokoll har en bred tillämpning utsikter att förbättra förståelsen av det perifera nervsystemet som hänför sig till smärta, såsom undersökning av elektrofysiologiska förändringar i olika DRG nervceller i olika kroniska smärt modeller17 ,18 och molekylära mekanismer underliggande onormal spontan aktivitet i DRG med myelinerade eller lilla axoner19,20.

Beredningen av intakt DRG med bifogade ischiasnerven presenteras här har många fördelar jämfört med den traditionella separerade ganglion metod, eftersom strukturen i DRG förblir i princip obruten i denna beredning. Därför simulerar det verkliga förhållanden in vivo och ger en bättre mikromiljö för fysiologisk aktivitet. Beredningen av intakt DRG med bifogade ischiasnerven producerar mindre neuronala skador än dissocierade DRG beredning eftersom den senare processen använder mer matsmältningsenzymer och yttre fysiska åtgärder (t. ex., klippning och blåsning av cellerna), som orsakar mer skada på cellerna. De flesta elektrofysiologiska studier utförs fortfarande på separerade DRG neuroner21,22, och dissociation processen själv skadar cellerna, vilket resulterar i onormal hyperexcitations av nervceller23. En annan fördel med detta protokoll är att extracellulära afferenta elektrofysiologiska aktiviteter erhålls också eftersom nerv prognoserna kvarstår, vilket möjliggör utredningar av interaktioner mellan afferenta spikar och somatiska DRG spontan Utsläpp. Slutligen, denna beredning bevarar DRG nervceller och satellit gliaceller, och endast DRG neuroner kvar i dissociation protokoll. Satellit gliaceller, som är nödvändiga för att upprätthålla mikromiljön i DRG, är ett hinder som skyddar enskilda DRG neuroner24, och dessa celler motiverar ytterligare studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av finansiering från National Natural Science Foundation i Kina (31671089 och 81470060) och Shaanxi Provincial social Development vetenskap och teknikforskningsprojekt (2016SF-250).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Instruments and software used in single fiber recording
Amplifier Nihon kohden MEZ-8201 Amplification of the electrophysiological signals
Bioelectric amplifier monitor ShangHai JiaLong Teaching instrument factory SZF-1 Monitor firing process via sound which is transformed from physiological discharge signal
Data acquisition and analysis system CED Spike-2 Software for data acquisition and analysis
Electrode manipulator Narishige SM-21 Contro the movement of the electrode as required
Hairspring tweezers A.Dumont 5# Separate the single fiber
Isolator Nihon kohden SS-220J
Memory oscilloscope Nihon kohden VC-9 Display recorded discharge during
Experiment
Stereomicroscope ZEISS SV-11 Have clear observation when separate the local tissue and single fiber
Stimulator Nihon kohden SEZ-7203 Delivery of the electrical stimuli
Von Frey Hair Stoelting accompany Delivery of the mechanical stimuli
Water bath Scientz biotechnology Co., Ltd. SC-15 Heating paroline to maintain at 37 °C
Instruments and software used in patch clamp recording
Amplifier Axon Instruments Multiclamp 700B Monitors the currents flowing through the recording electrode and also controls the stimuli by sending a signal to the electrode
Anti-vibration table Optical Technology Co., Ltd. Isolates the recording system from vibrations induced by the environment
Camera Olympus TH4-200 See the neurons in bright field; the controlling software allows to take pictures and do live camera image to monitor the approach of the electrode to the cell
Clampex Axon Clampex 9.2 Software for data acquisition and delivery of stimuli
Clampfit Axon Clampfit 10.0 Software for data analysis
Electrode puller Sutter P-97 Prepare recording pipettes of about 2μm diameter with resistance about 5 to 8 MΩ
Glass pipette Sutter BF 150-75-10
Micromanipulator Sutter MP225 Give a precise control of the microelectrode
Microscope Olympus BX51WI Upright microcope equipped with epifluorescence for clearly observe the cells which would be patched
Origin Origin lab Origin 8 Software for drawing picture
Perfusion Pump BaoDing LanGe Co., Ltd. BT100-1J Perfusion of DRG in whole-cell patch clamp
Other instruments
Electronic balance Sartorius BS 124S Weighing reagent
pH Modulator Denver Instrument UB7 Adjust pH to 7.4
Solutions/perfusion/chemicals
Calcium chloride Sigma-Aldrich C5670 Extracellular solution
Chloralose Shanghai Meryer Chemical Technology Co., Ltd. M07752 Mixed solution for Anesthesia
Collagenase Sigma-Aldrich SLBQ1885V Enzyme used for clearing the surface of DRG
D (+) Glucose Sigma-Aldrich G7528 Extracellular solution
Liquid Paraffin TianJin HongYan Reagent Co., Ltd. Maintain fiber wetting
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M7506 Extracellular solution
Potassium chloride Sigma-Aldrich P3911 Extracellular solution
Protease Sigma-Aldrich 62H0351 Enzyme used for clearing the surface of DRG
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5671 Extracellular solution
Sodium chloride Sigma-Aldrich S5886 Extracellular solution
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich S0751 Extracellular solution
Sucrose Sigma-Aldrich S0389 Extracellular solution
Urethane Sigma-Aldrich U2500 Mixed solution for Anesthesia

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Koski, C. L., et al. Derivation and validation of diagnostic criteria for chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy. Journal of the Neurological Sciences. 277, (1-2), 1-8 (2009).
  2. Allen, T. J., Knight, D. E. The use of intracellular dialysis to study signal transduction coupling in the squid giant axon. Journal of Neuroscience Methods. 42, (3), 169-174 (1992).
  3. Schafers, M., Cain, D. Single-fiber recording: in vivo and in vitro preparations. Methods in Molecular Medicine. 99, 155-166 (2004).
  4. Sun, W., et al. Reduced conduction failure of the main axon of polymodal nociceptive C-fibres contributes to painful diabetic neuropathy in rats. Brain. 135, Pt 2 359-375 (2012).
  5. Debanne, D. Information processing in the axon. Nature Reviews Neuroscience. 5, (4), 304-316 (2004).
  6. De Col, R., Messlinger, K., Carr, R. W. Conduction velocity is regulated by sodium channel inactivation in unmyelinated axons innervating the rat cranial meninges. Journal of Physiology. 586, (4), 1089-1103 (2008).
  7. Debanne, D., Campanac, E., Bialowas, A., Carlier, E., Alcaraz, G. Axon physiology. Physiological Reviews. 91, (2), 555-602 (2011).
  8. Zhu, Z. R., et al. Conduction failures in rabbit saphenous nerve unmyelinated fibers. Neurosignals. 17, (3), 181-195 (2009).
  9. Wang, X., et al. A novel intrinsic analgesic mechanism: the enhancement of the conduction failure along polymodal nociceptive C-fibers. Pain. 157, (10), 2235-2247 (2016).
  10. Smith, T., Al Otaibi, M., Sathish, J., Djouhri, L. Increased expression of HCN2 channel protein in L4 dorsal root ganglion neurons following axotomy of L5- and inflammation of L4-spinal nerves in rats. Neuroscience. 295, 90-102 (2015).
  11. Zhang, X. L., Albers, K. M., Gold, M. S. Inflammation-induced increase in nicotinic acetylcholine receptor current in cutaneous nociceptive DRG neurons from the adult rat. Neuroscience. 284, 483-499 (2015).
  12. Zhu, Z. R., et al. Modulation of action potential trains in rabbit saphenous nerve unmyelinated fibers. Neurosignals. 21, (3-4), 213-228 (2013).
  13. Djouhri, L., Bleazard, L., Lawson, S. N. Association of somatic action potential shape with sensory receptive properties in guinea-pig dorsal root ganglion neurones. Journal of Physiology. 513, 857-872 (1998).
  14. Fang, X., McMullan, S., Lawson, S. N., Djouhri, L. Electrophysiological differences between nociceptive and non-nociceptive dorsal root ganglion neurones in the rat in vivo. Journal of Physiology. 565, Pt 3 927-943 (2005).
  15. Young, G. T., Emery, E. C., Mooney, E. R., Tsantoulas, C., McNaughton, P. A. Inflammatory and neuropathic pain are rapidly suppressed by peripheral block of hyperpolarisation-activated cyclic nucleotide-gated ion channels. Pain. 155, (9), 1708-1719 (2014).
  16. Kim, Y. S., et al. Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain. Neuron. 91, (5), 1085-1096 (2016).
  17. Fan, N., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. Chronic compression of mouse dorsal root ganglion alters voltage-gated sodium and potassium currents in medium-sized dorsal root ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 106, (6), 3067-3072 (2011).
  18. Ma, C., et al. Similar electrophysiological changes in axotomized and neighboring intact dorsal root ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 89, (3), 1588-1602 (2003).
  19. Boucher, T. J., et al. Potent analgesic effects of GDNF in neuropathic pain states. Science. 290, (5489), 124-127 (2000).
  20. Ma, C., Greenquist, K. W., Lamotte, R. H. Inflammatory mediators enhance the excitability of chronically compressed dorsal root ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 95, (4), 2098-2107 (2006).
  21. Gong, K., Ohara, P. T., Jasmin, L. Patch Clamp Recordings on Intact Dorsal Root Ganglia from Adult Rats. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
  22. Schoenen, J., Delree, P., Leprince, P., Moonen, G. Neurotransmitter phenotype plasticity in cultured dissociated adult rat dorsal root ganglia: an immunocytochemical study. Journal of Neuroscience Research. 22, (4), 473-487 (1989).
  23. Zheng, J. H., Walters, E. T., Song, X. J. Dissociation of dorsal root ganglion neurons induces hyperexcitability that is maintained by increased responsiveness to cAMP and cGMP. Journal of Neurophysiology. 97, (1), 15-25 (2007).
  24. Hanani, M. Satellite glial cells: more than just rings around the neuron. Neuron Glia Biology. 6, (1), 1-2 (2010).
Användning av in vivo Single-fiber inspelning och intakt dorsala root ganglion med bifogade ischiasnerven att undersöka mekanismen för överledning misslyckande
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mao, H., Wang, X., Chen, W., Liu, F., Wan, Y., Hu, S., Xing, J. Use of In Vivo Single-fiber Recording and Intact Dorsal Root Ganglion with Attached Sciatic Nerve to Examine the Mechanism of Conduction Failure. J. Vis. Exp. (150), e59234, doi:10.3791/59234 (2019).More

Mao, H., Wang, X., Chen, W., Liu, F., Wan, Y., Hu, S., Xing, J. Use of In Vivo Single-fiber Recording and Intact Dorsal Root Ganglion with Attached Sciatic Nerve to Examine the Mechanism of Conduction Failure. J. Vis. Exp. (150), e59234, doi:10.3791/59234 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter