Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

В естественных условиях применение системы дистанционного управления для манипуляции эндогенного экспрессии генов

Published: March 29, 2019 doi: 10.3791/59235
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, 1
1Center for Epigenetics, Van Andel Research Institute, 2Amgen

Summary

Этот протокол описывает шаги, необходимые для создания модели системы, в которой транскрипции эндогенного гена интереса может управляться условно в живых животных или клеток с использованием расширенной лак репрессор или тет активатор систем.

Abstract

Здесь мы описываем протокол для реализации системы дистанционного управления (Reversible Manipulation of Transcription на Endogenous локусов), которая позволяет контролировать реверсивные и перестраиваемые выражение эндогенные гена интереса к жизни модели систем. Система дистанционного управления использует расширение лак репрессий и тет активации систем для достижения вниз - или upregulation целевых генов в рамках единой биологической системы. Жесткие репрессии может быть достигнуто с репрессор привязки сайтов гибко расположен далеко вниз по течению от сайта начало транскрипции, подавляя транскрипции удлинения. Надежные upregulation может быть достигнуто путем повышения транскрипции гена эндогенного ориентации тет transcriptional активаторы родственных промоутер. Этот элемент управления реверсивные и перестраиваемые выражение можно применять и неоднократно выведены в организмах. Потенции и универсальность системы, как показано для эндогенного Dnmt1 здесь, позволит более точно в естественных условиях функциональный анализ, позволяя расследования функции гена на различных уровнях выражение и путем тестирования обратимости фенотип.

Introduction

Эффективным средством для изучения функции гена в животных моделях были генетический нокаут или трансгенных подходы. Однако выражение регулирование этих подходов дихотомических (вкл. / выкл.), не временных и таким образом не способен показывать полный функциональный спектр гена. Условное Cre/ЛОХП технологии позволили пространственно временных инактивации или активации функции гена, но их дихотомического характера по-прежнему представляют собой ограничения, например клетки летальности и необратимости1,2 , 3. для того чтобы заполнить этот пробел, условная нокдаун подходы были разработаны с использованием тет-индуцируемый или Мирна4регулируется. Однако пробить эффекты остаются предметом озабоченности для RNAi5 и сложно управлять в vivo. Совсем недавно представил более универсальный подход к достижению как вверх, так и Даунрегуляция экспрессии генов эндогенного и продемонстрировали их утилиты6,7 ТРИФОСФАТЫ/Cas опосредованной транскрипционный анализ управления технологии . Однако эффективность ТРИФОСФАТЫ/Cas опосредованной транскрипционный анализ управления пока остается неясным в естественных условиях и обратимости на основе краб репрессий остается быть видели, как сильный репрессии Краб и его взаимодействия протеина KAP1 было показано, чтобы побудить Постоянный ген глушителей8,9.

Для того, чтобы устранить эти ограничения, мы разработали Роман транскрипционный анализ нормативной системы, способной условно контроля экспрессии генов эндогенного в обратимое и перестраиваемые манере в мышах с помощью спроектирован прокариот двоичных транскрипционный анализ 10систем регулирования. Прокариот двоичные транскрипционный анализ систем регулирования с нормативной лигандами, таких как лак и тет, позволили такие обратимые и перестраиваемые выражение управления11,12,13, 14. Однако, неадекватной репрессий потенции текущего бинарных систем препятствует их широкое применение для контроля экспрессии генов эндогенного млекопитающих. Мы разработали систему репрессий расширенной лак достаточно мощным для репрессий эндогенного генов и занятых Роман стратегия ориентации на тет transcriptional активаторы непосредственно организатору родственных эндогенного гена для достижения надежные upregulation (рис. 1)10. С помощью этой технологии мы достигли почти на два порядка выражение управления эндогенного Dnmt1 гена в перестраиваемых, индуцибельной и обратимым образом10. Здесь мы предоставляем пошаговые инструкции для его в естественных условиях применения других генов и с помощью мыши как модель вида организмов.

Figure 1
Рисунок 1 : Обзор системы дистанционного управления. Транскрипции гена эндогенного целевой может регулироваться с помощью инженерных лак репрессор и тет активатор систем. Целевого гена промоутер или Интрон спроектирован, чтобы содержать операторы для жесткой привязки LacIGY репрессор или rtактиватор TA-м2. R означает Repron (Repэскадрон intrна), которая содержит 12 симметричных лак операторы (S) плюс Интрон бета globin частичного кролика. T обозначает оператор тет . Репрессор или активатор/выражаются из ткани конкретной промоутера. Экспрессия гена целевой затем быть обратимо настроены до уровня желаемой выражение администрацией IPTG (изопропиловый β-D-1-тиогалактопиранозид, антагонист LacIGY репрессор) или доксициклин (Dox). Эта цифра была изменена от Lee et al.10пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Перед началом этого протокола, обзор Таблица 1 определить соответствующие шаги для желаемого контроля экспрессии генов. Например, инженер мыши, что позволяет реверсивные Даунрегуляция «Ген X», заполнить разделы 1, 3 и 4 ниже протокол. Также в таблице 1 приведены необходимые компоненты системы дистанционного управления.

Желаемый выражения изменения Репрессии только Активация только Репрессии и активации
Соответствующие разделы протокола 1, 3-4 2-4 1-4
Пульт дистанционного управления последовательность в целевых генов Repron («Репрессии Интрон»; 12 симметричных лак операторы плюс Интрон бета globin частичное кролик) Тет грузовое Repron и тет грузовое
Пульт дистанционного управления последовательность расположения Интрон Промоутер Интрон и промоутер
Активатор/репрессор необходимые для требуемого элемента управления LacIGY репрессор Активатор rtTA м2 LacIGY репрессор и активатор rtTA м2
Регулирования лигандами IPTG Доксициклин IPTG или доксициклин

Таблица 1: Обзор компонентов удаленного управления.

Protocol

Все животные процедуры были проведены с одобрения институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) в университете Южной Калифорнии и научно-исследовательский институт Ван Андел и в соответствии с руководство по уходу и использованию лабораторных животных от национальных институтов здоровья15.

1. изменения гена интереса для репрессий, пульт дистанционного управления

  1. Использование принципов ниже, определить транскрипционно инертных Интрон к 5' концу гена интереса для вставки в Repron последовательности («Repэскадрон intrна «; 12 симметричных лак операторы плюс Интрон бета globin частичное кролика). Знать о альтернативных промоутеров для гена интереса и выбрать Интрон согласно transcript(s) контролироваться (т.е. Интрон, разделяют все стенограммы или один для желаемого транскрипт).
    Примечание: Для генов без Интрон или с одними к 3' концу, вставьте последовательности Repron промоутер (см. ли,10 et al. за подробную процедуру).
    1. Получите геномные последовательности гена интереса.
      1. Перейдите в геноме UCSC Browser16,17и выберите последний проект генома мыши (мыши GRCm38/мм10 на момент публикации), который в настоящее время под вкладкой геномов .
      2. Введите имя или символ гена интереса в адвокатское сословие поиска для просмотра транскрипты гена. Нажмите кнопку go.
      3. Выберите вариант желаемого Транскрипт гена интереса.
      4. Нажмите на символ гена рядом с Стенограмма вариант интерес (символ ранее выбранный текст будет в темной коробке).
      5. Под знаменем последовательности и ссылки на инструменты и базы данных нажмите на ссылку Геномные последовательности .
      6. Для Региона параметры последовательности поиска, выберите только Exons (5' УТР, компакт-диски и 3' УТР), интронов и по умолчанию один FASTA запись на ген. Для Последовательности параметры форматированиявыберите экзонов в верхнем регистре, все остальное в нижнем регистре и Маска повторяет N (скрыть повторяющиеся последовательности). Нажмите кнопку Отправить.
      7. Сохраните эту последовательность, сохраняя верхнюю - и строчные, форматирование, в документ или программу, которая может быть Аннотированная.
    2. Избегайте прерывания островов CpG, что может свидетельствовать о регионах с нормативной функции гена.
      Примечание: Хотя Интрон 5' является предпочтительным для вставки в Repron последовательности, первый Интрон может содержать транскрипционный анализ нормативных элементов, таких как острова CpG (рассматриваются в этом шаге) или усилитель элементов (рассматриваются в шаге 1.1.4), которые следует избегать для Repron вставки.
      1. Под знаменем выражение и регулирование браузера геноме UCSC выберите Показать для Островов CpG трек и нажмите кнопку Обновить.
      2. Масштабирование на 5' интронов, щелкните на каждом острове CpG (показано зеленым цветом на момент публикации, если он присутствует) и выберите Просмотр ДНК для этой функции.
      3. После выбора маски повторяет N, выберите получить ДНК для получения последовательности острова CpG.
      4. Наложение этих последовательностей с исходным файлом последовательности и аннотировать их как intronic регионов, чтобы избежать из-за возможных генов регуляторных функций.
    3. Избегайте прерывания кодирования РНК, в случае, если они имеют функцию регулирования.
      1. Под знаменем генов и Джин предсказания браузера геноме UCSC выберите Показать для трека GENCODE (Ensembl) и нажмите кнопку Обновить.
      2. Масштабирование на 5' интронов, нажмите на каждом некодирующих РНК (показано зеленым цветом на момент публикации, если он присутствует) и получить последовательность ДНК для каждого, нажав на его хромосомных координаты.
      3. В раскрывающемся меню вид выберите ДНКи нажмите кнопку маски повторяет N. Нажмите кнопку получить ДНК.
      4. Наложение этих последовательностей с исходным файлом последовательности и аннотировать их как intronic регионов, чтобы избежать из-за возможных генов регуляторных функций.
    4. Избегайте intronic регионов с enhancer подписей в tissue(s) интерес, такие как H3K4me1, H3K27ac и DNase я Гиперчувствительность18,19,20,21, а также CTCF привязки сайты, которые регулируют усилитель цикла22,23.
      1. Перейдите к кодирование базы данных24,25и выберите значок экспериментов .
      2. Для анализа типа выберите чип seq или DNase-seqи заполнить другие категории (организм, биопроба типаи т.д.) согласно клетки, чтобы быть инженерии.
      3. После выбора компонентов наведите пиктограммы в синем и выберите тот, для которого Просмотреть результаты в списке появляется (пиктограмма слева на момент публикации).
      4. Выберите наборы данных для целей, H3K4me1, H3K27ac, DNase I и CTCF, которые наиболее близко соответствуют клетки, чтобы быть инженерии.
      5. В рамках каждого соответствующего набора данных, перейдите в раздел файлы , убедитесь, что мм10 (или последняя версия генома) и UCSC выбраны и нажмите кнопку " визуализация ".
      6. Теперь в браузере геноме UCSC и масштабирование на 5' интронов гена интереса, нажмите на каждый H3K4me1, H3K27ac, DNase I и CTCF пик в их соответствующих аннотированный пик треков.
      7. Получите последовательность ДНК для каждого региона пик, нажав на его хромосомных координаты.
      8. В раскрывающемся меню вид выберите ДНКи нажмите кнопку маски повторяет N. Нажмите кнопку получить ДНК.
      9. Наложение этих последовательностей с исходным файлом последовательности и аннотировать их как intronic регионов, чтобы избежать из-за возможных генов регуляторных функций.
    5. Избегайте срыва консенсуса сплайсинга последовательности, чтобы не мешать соответствующие сплайсинга экзонов.
      Примечание: Хотя последовательности, необходимых для сращивания проявляются в основном внутри около шести базы к 5' концу Интрон26 и около 60 баз на 3' конца27, желательно, чтобы выбрать большой Интрон, позволяя значительно более широкого поля от этих консенсуса в регионах свести к минимуму вероятность воздействия сплайсинга. Рекомендуется использовать Интрон анализ инструментов, таких как SVM-BPfinder28, для более тщательного анализа потенциальных сращивания последовательностей.
  2. После выявления intronic регионе, что отвечает указанным выше критериям (примером для Dnmt1 в дополнительные данные), экран последовательности, используя онлайн sgRNA дизайн инструмента для выявления sgRNA в регионе с высокой точностью и предсказал оценки эффективности.
    1. Перейдите к онлайн sgRNA дизайн инструмент выбора, таких как CRISPOR29.
    2. Введите последовательность intronic области интереса, укажите соответствующую ссылку генома и выберите желаемый Protospacer прилегающие мотив (PAM). Нажмите кнопку Отправить.
    3. Сортировать предсказал sgRNAs специфика Оценка и выберите один или несколько sgRNAs, которые также имеют высокую эффективность предсказал Оценка29.
      1. Необязательно: Чтобы максимизировать вероятность использования эффективной sgRNA, сначала проверить эффективность расщепления несколько топ скоринг sgRNAs в пробирке пробирного30и приступить к наиболее эффективным sgRNA в естественных условиях.
  3. Дизайн-шаблон ДНК, содержащий ПИТТ (на основе Pronuclear инъекции целевых трансгенез) посадки колодки последовательности, примером в дополнительный Рисунок 1A, B, с обеих сторон в окружении 60-база гомологии оружия, которые соответствуют sgRNA, вырезать сайт31 .
    Примечание: Посадка панель содержит два сайты гетеротипичной loxP (JT15 и Lox2272) и позволяет целевых вставки больших последовательностей через двухэтапный подход; Убедитесь, что узлы этой вставки не создают загадочный соединитель сайтов. Кроме того эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) - на основе стук - в стратегии может использоваться для вставки последовательность Repron напрямую.
  4. Подготовка sgRNA, Cas9 белка и одноцепочечной ДНК (ssDNA) шаблон для посадки колодки и microinject в оплодотворенных яиц (от B6C3F1/J мышей или других желаемых штамм) в соответствии с установленными протоколами32,33.
  5. Экран для мышей с посадкой колодки стук в.
    1. Дизайн дополняет праймеры PCR геномной локус, но за пределами регионов, мишенью гомологии оружия, как показано для Dnmt1 в дополнительном рисунок 1 c. Избегайте повторяющихся genomic последовательностей при проектировании грунтовки.
    2. Извлечь ДНК из хвоста клипы мышей в соответствии с установленными протоколами34.
    3. Использование ПЦР и электрофорез для выявления мышей с посадкой колодки вставки геля.
    4. Подтверждают, что стук в было успешным, последовательность продуктов PCR.
      Примечание: Нежелательные крупные изъятия и перестановки могут быть введены ТРИФОСФАТЫ/Cas935, так тщательно, что скрининг для редактирования пробить рекомендуется, прежде чем приступить35,,3637.
  6. С помощью оплодотворенные яйца от посадки колодки мышей, microinject МСВЗ мРНК38 и трансгенных плазмида, содержащий последовательность Repron, в окружении JTZ17 и Lox2272 рекомбинация сайты31,,3940, 41 согласно установленных методов38,42,43.
  7. Экран для мышей с Repron вставки.
    1. Праймеры PCR дизайн дополняет геномной локус, вне Repron вставки. Избегайте повторяющихся genomic последовательностей при проектировании грунтовки.
    2. Извлечь ДНК из хвоста клипы мышей в соответствии с установленными протоколами34.
    3. Использование ПЦР и электрофорез для выявления мышей с Repron вставки геля.
    4. Подтвердите, что стук в было успешным, последовательность продуктов PCR.

2. Измените гена интереса для upregulation пульт дистанционного управления

  1. Использование принципов ниже, определите область в промоутер гена интереса, что вряд ли возмущают промоутер функция вставки тет оператор последовательности. Знать о альтернативных промоутеров для гена интереса и выбрать промоутер согласно transcript(s) контролироваться (т.е. разделяют все стенограммы или один промоутер для желаемого транскрипт).
    1. Для промоутера интерес получите геномные последовательности.
      1. Перейдите в геноме UCSC Browser16,17и выберите последний проект генома мыши (мыши GRCm38/мм10 на момент публикации), который в настоящее время под вкладкой геномов .
      2. Введите имя или символ гена интереса в адвокатское сословие поиска для просмотра транскрипты гена. Нажмите кнопку go.
      3. Выберите вариант желаемого Транскрипт гена интереса.
      4. Нажмите на символ гена рядом с Стенограмма вариант интерес (ген символ ранее выбранный текст будет в темной коробке).
      5. Под знаменем последовательности и ссылки на инструменты и базы данных нажмите на ссылку Геномные последовательности .
      6. Для Региона параметры последовательности поискавыберите только промоутера/восходящих по 1000 баз. Для Последовательности параметры форматированиявыберите Маску повторяет N (для сокрытия повторяющихся последовательностей). Нажмите кнопку Отправить.
      7. Сохраните этот промоутер последовательность в документ или программу, которая может быть Аннотированная.
    2. Выбор регионов, которые свободны от предполагаемого транскрипции фактор привязки сайтов, как эти последовательности прерывания могут изменить выражение эндогенного гена.
      1. Перейдите в браузере геноме UCSC и открыть последнюю версию генома мыши.
      2. Выше сопоставления и секвенирования знамя выберите трек концентраторы.
      3. Нажмите кнопку мм10 рядом с именем хаб JASPAR 2018 TFBS (или последняя версия JASPAR).
      4. Введите имя или символ гена интереса в адвокатское сословие поиска для просмотра транскрипты гена. Нажмите кнопку go.
      5. Выберите вариант желаемого Транскрипт гена интереса.
      6. Прокрутите вниз до JASPAR 2018 TFBS баннер и щелкните стрелку раскрывающегося списка для выбора желаемого просмотра для трека, например хлюпать. Нажмите кнопку Обновить.
      7. Zoom в регионе промоутер гена интереса и определения регионов, которые являются бесплатными (или относительно свободных) из сайтов связывания фактор транскрипции согласно JASPAR трек. Регистрировать хромосомные координаты этих регионов.
      8. Получите геномные последовательности этих хромосом координат, введя их в адвокатское сословие поиска и нажав кнопку Перейти. В раскрывающемся меню вид выберите ДНКи нажмите кнопку маски повторяет N. Нажмите кнопку получить ДНК.
      9. Наложение этих последовательностей с исходным файлом последовательности и аннотировать их как идеальный промоутер регионов для из-за отсутствия привязки фактор транскрипции.
    3. В рамках этих последовательностей выберите регион perturbable промоутер, вверх по течению, но неподалеку от места начала транскрипции гена интереса.
      Примечание: Вставки, что является слишком близко к транскрипции стартовый сайт может увеличить вероятность ущерба деятельности промоутер, но вставки, что слишком далеко может снизить уровень upregulation. Вставка тет оператор последовательности около 200 basepairs вверх по течению сайта начало транскрипции привело к надежной upregulation двух промоутеров испытания (см. обсуждение)10.
  2. Экран выбранного промоутер региона с помощью онлайн sgRNA дизайн инструмента для определения sgRNA в регионе с высокой специфичности и предсказал эффективности оценки.
    1. Перейдите к онлайн sgRNA дизайн инструмент выбора, таких как CRISPOR29.
    2. Введите последовательность области интереса, укажите соответствующую ссылку генома и выберите желаемый Protospacer прилегающие мотив (PAM). Нажмите кнопку Отправить.
    3. Сортировать предсказал sgRNAs специфика Оценка и выберите один или несколько sgRNAs, которые также имеют высокую эффективность предсказал Оценка29.
      1. Необязательно: Чтобы максимизировать вероятность использования эффективной sgRNA, сначала проверить эффективность расщепления несколько sgRNAs в пробирке пробирного30и приступить к наиболее эффективным sgRNA в естественных условиях.
  3. Дизайн-шаблон ДНК, содержащие тет операторов, на обе стороны в окружении 60-база гомологии оружия, которые соответствуют sgRNA, вырезать сайт31,33.
    Примечание: Количество операторов тет является настраиваемым; вставки двух-четырех тет оператор последовательностей в тандеме ранее было показано, чтобы быть эффективными, но в принципе более операторов желательны для вождения выше выражения. Кроме того ESC-стратегия на основе забивные может использоваться для вставки операторов тет .
    1. Необязательно: Для экспериментальных доказательств, что предлагаемые изменения скорее всего не будет нарушать эндогенного транскрипционный анализ активности гена интереса, клонировать последовательности инженерии промоутер в Светлячок Люцифераза вектор (например pGL3-Basic), и Сравните эффективность оригинального промоутер с помощью Люцифераза пробирного.
  4. Подготовка sgRNA, Cas9 белка и ssDNA шаблон, содержащий оператор последовательности тет и microinject в оплодотворенных яиц (от B6C3F1/J мышей или других желаемых штамм) в соответствии с установленными протоколами32,33.
    Примечание: Ввиду сложности синтеза повторяющиеся последовательности, в vitro транскрипция/обратная транскрипция-подход, основанный на рекомендуется синтезировать ssDNA шаблон от плазмида двуцепочечной ДНК (dsDNA)44. Кроме того шаблон dsDNA может быть использован для микроинъекции, но стук в эффективности может быть снижение45.
  5. Экран для мышей с стук в Тэт операторов.
    1. Праймеры PCR дизайн дополняет геномной локус, за пределами регионов, мишенью гомологии оружия. Избегайте повторяющихся genomic последовательностей при проектировании грунтовки.
    2. Извлечь ДНК из хвоста клипы мышей в соответствии с установленными протоколами34.
    3. Использование ПЦР и электрофорез для выявления мышей с включением тет операторов геля.
    4. Подтверждают, что стук в было успешным, последовательность продуктов PCR.
      Примечание: Нежелательные крупные изъятия и перестановки могут быть введены ТРИФОСФАТЫ/Cas935, так тщательно, что скрининг для редактирования пробить рекомендуется, прежде чем приступить35,,3637.

3. Разработка активатор - и/или репрессор выражая мышей

  1. Определите решительно выражая промоутер для tissue(s) или ячейка типы интерес.
    Примечание: Поиск литературы и ткани-конкретной промоутера базы данных46 может быть полезен для выявления такого промоутера.
  2. Место репрессор предоставленной расширенной лак или последовательность активатор тет по течению желаемого промоутер для создания трансгенных конструкции.
  3. Производят линиями трансгенные мыши, с помощью стандартных процедур трансгенных42,,4347. Кроме того участкам трансгенез подход может использоваться избежать эффектов положение и позволить одной копии трансген вставки31,48.
  4. Распространять учредителей и определить выражения и уровень трансген в потомство каждого учредителя. Выберите строки с надежной выражение в типе(типах), предполагаемой ткани для дальнейшего разведения.
    1. Порода основатели wildtype мышей.
    2. Праймеры PCR дизайн, которые будет обнаруживать вставки активатор или репрессор.
    3. Извлечь ДНК из хвоста клипы потомка в соответствии с установленными протоколами34.
    4. Использование ПЦР и электрофорез для выявления мышей с включением геля.
    5. Подтвердите трансген вставки путем sequencing продуктов PCR.
    6. Повторяйте трансгенных линий.
    7. Пожертвовать несколько щенков из каждой строки и собирать ткани интерес qRT-PCR, иммуногистохимия, и/или Западный blotting проанализировать выражение гена/протеина интереса в типе(типах) целевой ткани.
    8. Выберите строки с сильным выражением в тканях интерес для использования в разделе 4.

4. манипулировать экспрессии генов в естественных условиях

  1. Порода мышей с измененный ген интереса (раздел 1 или 2) с трансгенных мышей от раздела 3 согласно установленным разведение практика49. Для управления максимальное выражение порода мышей homozygosity для модифицированных аллель.
  2. Для возврата или корректировка репрессий целевого гена администрировать IPTG в питьевой воде.
    1. Экспериментально определить дозу IPTG использовать, лечить мышей соответствующие генотип и элементов управления с одним из диапазона доз (рекомендуется, начиная диапазон: 0 – 400 мм ИПТГ) для по крайней мере одной недели50,51. Включают по меньшей мере три мышей в группы лечения и выберите возраст и пол мышей, которые наиболее актуальны для запланированных будущих экспериментов. Примечание: Пар селекции мышей можно лечить с IPTG воды для обеспечения развития воздействие IPTG потомство при желании13, или мышей может начать лечение в любое время после рождения.
      1. Распустить желаемого масса IPTG в стерильной дистиллированной воде в день отправления и перемешать с баром перемешать для 5 минут или до полного растворения.
      2. Оберните бутылку с фольгой и администрировать IPTG воды в бутылке свет защитой. Замените два раза в неделю. Обеспечивают тот же источник воды для получения 0 мм ИПТГ мышей.
      3. После по крайней мере одной недели пожертвовать мышей и анализ экспрессии гена интереса к tissue(s) цели, используя qRT-PCR, иммуногистохимия, и/или Западный blotting.
      4. Определить дозу, которая восстанавливает экспрессии гена интереса к этому wildtype контроля и использовать эту дозу для достижения нормального экспрессии гена в будущих экспериментах.
  3. Для индукции генной upregulation администрировать доксициклин (Dox) в рационе питания.
    1. Экспериментально определить концентрацию Dox распоряжаться, лечить мышей соответствующие генотип и элементов управления с одним из диапазона Dox концентрации (рекомендуется, начиная диапазон: 0 – 5000 мг/кг доксициклин гиклат) для по крайней мере одна неделя52 ,53, включая по меньшей мере три мыши в группе лечения. Приобретения Dox содержащих продуктов питания мыши от коммерческих поставщиков.
      Примечание: Гнездящихся пар мышей можно лечить с помощью Dox продовольствия для обеспечения развития воздействие Dox потомство при желании54,55, или мышей может начать лечение в любое время после рождения.
    2. Замените питание один раз в неделю. Обеспечить же базовый рацион для мышей, получающих Dox бесплатное питание.
    3. После по крайней мере одной недели пожертвовать мышей и анализ экспрессии гена интереса к tissue(s) цели, используя qRT-PCR, иммуногистохимия, и/или Западный blotting.
    4. Определение дозы, которая поднимает экспрессии гена интереса до желаемого уровня и использовать этот дозы для достижения гиперэкспрессия генов в будущих экспериментах.

Representative Results

Репрессии возможностей системы дистанционного управления до настоящего времени было продемонстрировано в два различных подхода. В первом подходе лак репрессор привязки сайтов были вставлены в эндогенного промоутер Dnmt1 гена. В втором подходе, который рекомендуется настоящим Протоколом, репрессор привязки сайтов были вставлены в нижнем Интрон чтобы избежать потенциального риска промоутер функции путем вставки и, таким образом, чтобы упростить применение дистанционного управления системы. Оба подхода привели к успешным репрессий (рис. 2A, B и Рисунок 3A-C)10. Dnmt1 выражение был репрессирован в 15% от нерегулируемого уровня, используя подход на основе промоутер (рисA). Это жесткие репрессии была обращена вспять в зависимости от дозы, рассматривая мышей с различным количеством IPTG (рисA). Наблюдаемые Dnmt1 репрессий был подтвержден на уровне белок иммуноокрашивания (рис. 2B). Мы не выявили каких-либо заметная разница в выражении Dnmt1 между Dnmt1+/ + и мышей Dnmt1Ло Лоу , подтверждающий, что наш оператор вставки лак не нарушается нормальный промоутер Функция10. Интрон-подход на основе достигнутого, более чем 90% репрессий от операторов расположен нескольких kilobases вниз по течению сайта начало транскрипции смягчающих транскрипции удлинение (рис. 3A, B)10. Далее этот подход на основе Интрон был апробирован на семь дополнительных надежных промоутеров (рис. 3C). Из всех протестированных промоутеров было достигнуто неизбежно жесткие репрессии. Было отмечено отсутствие корреляции между уровни остаточного выражения и сильные промоутеров, предполагая, что репрессии против нашей системы на основе Интрон репрессий превышает transcriptional потенции всех надежных промоутеров мы тестировали () Рисунок 3 C).

В естественных условиях upregulation возможностей системы дистанционного управления также была продемонстрирована на Dnmt1 ген. Мы ввели две копии оператора тет в Dnmt1 промоутер, вместе с лак оператор последовательности, чтобы позволить upregulation или Даунрегуляция, в зависимости от которых эффекторных присутствует белка. В ЭСК, содержащий измененные эндогенного Dnmt1 аллеля (Dnmt1LGT) (рис. 4A) были достигнуты надежная upregulation и Даунрегуляция Dnmt1 выражения, недалеко от двух порядков (10% до 650%),10 . Оба положения были полностью обратимо и индуцибельной IPTG и Dox обработками, соответственно (рис. 4A). Мы далее представил Dnmt1LGT изменения в мыши микрофлорой для тестирования в естественных условиях upregulation возможностей системы дистанционного управления. Сильный upregulation Dnmt1 было отмечено из печени, селезенки и почек, в то время как не обнаружено upregulation в самом сердце было отмечено (рис. 4B)7. Шаблон цикла клетки зависимой выражения Dnmt1 и нехватка пролиферативной клетки в сердце могут лежать в основе этого наблюдения10,56. Он по-прежнему следует рассматривать ли это ограничение можно преодолеть путем повышения уровня выражения активатора или количество своих сайтов связывания.

Figure 2
Рисунок 2 : В естественных условиях подавление Dnmt1 , репрессор LacIGY. (A) мышей с операторами лак (LO) вставляется в Dnmt1 промоутер, с или без выражения LacIGY, лечили различных доз IPTG. qRT ПЦР анализ экспрессии Dnmt1 показывает дозозависимый разворота Dnmt1 репрессий в естественных условиях IPTG лечения. Каждый бар представляет данные из различных мыши. Данные представляют собой среднее ± SEM (n = 3). (B) иммуноокрашивания Dnmt1 белка в толстой склепы мышей питьевой воды с или без 160 мм ИПТГ предусмотрено 3 недели. Эта цифра была изменена от Lee et al.10пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 : В естественных условиях и в пробирке репрессии в отношении различных промоутеров системой дистанционного управления. (A) ранняя версия Repron последовательности (R *) был вставлен в Интрон вниз по течению Виллин промоутер в трансгенные мыши Виллин mKate2 (VilmKate2). qRT ПЦР-анализа выражения mKate2 в тонком кишечнике мышей с или без LacIGY репрессор показано. Каждый бар представляет данные из различных мыши. (B) конфокальной mKate2 образы тонкой кишки с и без LacIGY выражение. (C), шесть симметричных лак операторы (S) были вставлены между различными промоутеров и Люцифераза репортер. Репортеры (50 нг/хорошо в 96-луночных плиты) и плазмид репрессор были временно вводят в клетки NIH/3T3 в молярное соотношение 1:1. Люцифераза значения были начисленных 24 ч после transfection. Эти в пробирке данных представляют процент Люцифераза выражение в LacIGY-выражая клеток по отношению к тем выражая нефункциональные ЗСБН (NFlacI). T-тесты были использованы для определения статистической значимости. Данные представляют собой среднее ± SEM (n = 3). P ≤ 0,05, **P ≤ 0.01. Эта цифра была изменена от Lee et al.10пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4 : Вниз - и/или upregulation Dnmt1 выражения в vitro и in vivo. (A) полная система дистанционного управления был разработан в культивированный ЭСК гена ориентации и электропорации подходы. Максимальное подавление Dnmt1 выражения был достигнут без лечения, в то время как максимальная активации было достигнуто путем IPTG и Dox лечения. Данные представляют собой среднее ± SEM (n = 3). P ≤ 0,05, **P ≤ 0.01 (Уэлча t-тесты). (B) в естественных условиях Активация Dnmt1 пульт дистанционного управления системой, как это продемонстрировано иммуноокрашивания Dnmt1 белка в различных тканях от пульта дистанционного управления мышей. ЛГТ аллеля представляет промоутер модификации Dnmt1 содержать лак оператора и тет активатор привязки сайтов. Мышей относились с нормальным или Dox содержащих диеты (5000 мг/кг доксициклин гиклат) на один месяц. Эта цифра была изменена от Lee et al.10пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Supplementary Figure 1
Дополнительные рисунок 1 : Пример посадки колодки вставки в мышиных Dnmt1 Интрон 1. (A) схема шаблона дна для посадки колодки вставки, адаптированный Quadros et al. (2015)31. Сайты гетеротипичной loxP , JT15 и Lox2272, разделенных последовательности коротких распорку (sp) и на каждой стороне в окружении 60-bp, гомологично к целевой области геномной ДНК. (B) образец ДНК шаблон для посадки колодки вставки в Интрон Dnmt1 , используя следующие sgRNA: CTAGTACCACTCCTGTACCG, (которая ориентирована стренги обратного). Выбранный регион intronic был bioinformatically, сообщил шагом 1.1, и sgRNA был определен с помощью CRISPOR29. (C) пример конструкции праймера PCR для оценки вставки посадки колодки. Праймеры PCR были разработаны за пределами гомологии герб шаблон для подтверждения интеграции эндогенного Dnmt1. Ампликон ПЦР wildtype-213 bp; После вставки, он становится 291 bp. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

Важным шагом и потенциальные ограничения системы дистанционного управления является проблемой, связанные с включением репрессор или активатор сайтов связывания не затрагивая экспрессии генов целевой. Наш оригинальный подход репрессий, применительно к Dnmt1 гена, участие вставки лак репрессор привязки сайтов в пределах транскрипционно критических регионах промоутер. Чтобы уменьшить риск затрагивающих функции организатора и таким образом улучшить общую применимость системы дистанционного управления, мы разработали подход на основе Интрон репрессий. Сила нашей расширенной лак системы позволили нам жестко подавлять транскрипцию всех сильными промоутерами, мы протестировали на операторы расположен сотни до нескольких kilobases вниз по течению транскрипции начать сайтов (рис. 3A-C) 10. Важно отметить, что уровень репрессий были независимы от транскрипционный анализ сильных сторон промоутеров (рис. 3A-C)10. Это свидетельствует о том, что репрессии против нашей системы на основе Интрон репрессий превышает транскрипционный анализ прочности протестированных промоутеров. В этот подход на основе Интрон вполне вероятно, что репрессии опосредовано через физические помехи между двумя компонентами, удлинение машины транскрипции и лак подавляющего57. Этот механизм простой репрессий и продемонстрировали надежность метода на основе Интрон может сделать этот подход общеприменимых различных генов, тканей и организмов.

Upregulation системой дистанционного управления требует привязки последовательности transactivator в близости от целевого гена промоутер, который влечет за собой риска промоутер функции. Однако мы обнаружили, что позиция привязки последовательности может быть за пределами транскрипционно критической области. Dnmt1 и EF1α промоутеров были надежно upregulated от операторов тет расположенный пару сотен баз вверх по течению транскрипции начала сайты10. Это расслабленной ограничение значительно уменьшает вероятность затрагивающих промоутер функции целевого гена в отсутствие transactivator. Увеличение числа привязки последовательностей и/или использование более transactivators может помочь дальнейшему сокращению риска, позволяя upregulation от сайтов дальше от места начала транскрипции.

Наша система дистанционного управления обеспечивает элегантный контроль уровня, сроков и местоположения экспрессии генов эндогенные, позволяя для тестирования обратимости фенотип и последствия различных выражений уровней, которые не являются легко достижимыми современные технологии управления выражения в vivo гена. Важно отметить, что в большинстве анализа выражения гена, включая ours, выражение значения представляют средний популяции клеток, среди которых можно найти значительные различия. Эта разнородность может повлиять клеточных процессах, например дифференциация или apoptosis58. Хотя вероятно точность управления выражения гена можно добиться дальнейшего улучшения дополнительной генетической цепи инженерных59, наблюдаемых потенции нашей нынешней системы позволит полезные исследования функции гена во многих биологических контекстах. Кроме того высокая степень специфичности целевой ожидается ввиду сложности оператор последовательности, а также большой эволюционный расстояние между млекопитающих и происхождения видов нормативных компонентов60. Кроме того можно развивать и работает для любого внутреннего гена трансгенные мыши линий подавляющего и активаторов. Например существующие тет transactivator мыши модели могут быть адаптированы для выполнения upregulation целевого гена в тканях желаемого мыши. Мы недавно разработали трансгенные линии, которая может управлять надежные ткани конкретным выражением нашей расширенной лак репрессор в нескольких типов тканей в сочетании с существующими линиями Cre путем введения гена lacIGY в Hipp11 Локус48 под контролем Lox-стоп-Lox элемента (не опубликован). Эта линия существенно облегчит применение тканей специфические системы дистанционного управления.

Джин upregulation системой дистанционного управления обеспечивает ряд преимуществ по сравнению с текущей индуцибельной трансгенных подходы. Она не требует поколение нескольких трансгенных линий для проверки эффектов позиция вставки, как он использует эндогенный Локус. Кроме того этот подход хорошо подходит для upregulation генов с сильным Базовые выражения потому, что он усиливает выражение из уже надежные промоутер, тогда как обычные трансгенные модели полагаются на минимальной вирусных промоутеров. И наконец, ткани специфичности, контроль клеточного цикла и сплайсинга варианты целевого гена могут сохраняться после upregulation наш подход, как он сохраняет элементы естественного регулирования, такие, как врожденное СНГ-регуляторных элементов. Появлением ТРИФОСФАТЫ/Cas опосредованной ген ориентация технологии значительно облегчит применение этой технологии в различных модельных системах.

Disclosures

PWL служит на научных консультативных советов AnchorDx и Progenity, Inc.

Acknowledgments

Мы благодарим конце Доктор Хайди Scrable за ее щедрый подарок млекопитающих ЗСБН гена конструкции клиники Майо (Рочестер, Миннесота), д-р Даниэль Louvard (Institut Curie, Париж, Франция) для предоставления Виллин промоутер и д -р Лори Джексон-Grusby (Детская больница, Бостон, MA) за ее вклад в ранних стадиях развития этой технологии. Мы благодарны за Ву Нэнси д-р и д-р Роберт Maxson за их помощь в создании нокаут и трансгенных мышей. Мы благодарим членов Лэрд лаборатории полезные обсуждения и поддержки. Эта работа была поддержана национальных институтов здравоохранения [R01 CA75090, R01 DA030325, R01 CA157918 и R01 CA212374 для P.W.L. и 1F31CA213897-01A1 на N.A.V.S].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
B6C3F1/J The Jackson Laboratory 100010 https://www.jax.org/strain/100010
Cas9 Protein PNA Bio CP04 http://www.pnabio.com/products/CRISPR_Cas9.htm?gclid=EAIaIQobChMIsoG8pLL33QIVBr7ACh0naQ4dEAAYAiAAEgKyHvD_BwE
CRISPOR Haeussler et al. 2016 http://crispor.tefor.net/
Doxycycline-Containing Mouse Diet Envigo Varies by concentration https://www.envigo.com/products-services/teklad/laboratory-animal-diets/custom-research/doxycycline-diets/
ENCODE Database Stanford University https://www.encodeproject.org/
iCre mRNA synthesis plasmid (pBBI) Addgene 65795 https://www.addgene.org/65795/
IPTG GoldBio I2481C https://www.goldbio.com/search?isSearch=Y&q=iptg
pGL3-Basic Promega E1751 https://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-vectors-and-cell-lines/pgl3-luciferase-reporter-vectors/?catNum=E1751
SVM-BPfinder Regulatory Genomics, Pompeu Fabra University http://regulatorygenomics.upf.edu/Software/SVM_BP/
TiProD: Tissue specific promoter Database Department of Bioinformatics, UMG, University of Göttingen  http://tiprod.bioinf.med.uni-goettingen.de
UCSC Genome Browser University of California Santa Cruz https://genome.ucsc.edu/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jackson-Grusby, L., et al. Loss of genomic methylation causes p53-dependent apoptosis and epigenetic deregulation. Nature Genetics. 27 (1), 31-39 (2001).
  2. David, G., Turner, G. M., Yao, Y., Protopopov, A., DePinho, R. A. mSin3-associated protein, mSds3, is essential for pericentric heterochromatin formation and chromosome segregation in mammalian cells. Genes & Development. 17 (19), 2396-2405 (2003).
  3. Sumi-Ichinose, C., Ichinose, H., Metzger, D., Chambon, P. SNF2beta-BRG1 is essential for the viability of F9 murine embryonal carcinoma cells. Molecular and Cellular Biology. 17 (10), 5976-5986 (1997).
  4. Premsrirut, P. K., et al. A rapid and scalable system for studying gene function in mice using conditional RNA interference. Cell. 145 (1), 145-158 (2011).
  5. Qiu, S., Adema, C. M., Lane, T. A computational study of off-target effects of RNA interference. Nucleic Acids Research. 33 (6), 1834-1847 (2005).
  6. Gilbert, L. A., et al. Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation. Cell. 159 (3), 647-661 (2014).
  7. Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).
  8. Peng, H., Ivanov, A. V., Oh, H. J., Lau, Y. F., Rauscher, F. J. Epigenetic gene silencing by the SRY protein is mediated by a KRAB-O protein that recruits the KAP1 co-repressor machinery. The Journal of Biological Chemistry. 284 (51), 35670-35680 (2009).
  9. Groner, A. C., et al. KRAB-zinc finger proteins and KAP1 can mediate long-range transcriptional repression through heterochromatin spreading. PLOS Genetics. 6 (3), 1000869 (2010).
  10. Lee, K. H., Oghamian, S., Park, J. A., Kang, L., Laird, P. W. The REMOTE-control system: a system for reversible and tunable control of endogenous gene expression in mice. Nucleic Acids Research. 45 (21), 12256-12269 (2017).
  11. Gossen, M., Bonin, A. L., Bujard, H. Control of gene activity in higher eukaryotic cells by prokaryotic regulatory elements. Trends in Biochemical Sciences. 18 (12), 471-475 (1993).
  12. Hu, M. C., Davidson, N. The inducible lac operator-repressor system is functional in mammalian cells. Cell. 48 (4), 555-566 (1987).
  13. Cronin, C. A., Gluba, W., Scrable, H. The lac operator-repressor system is functional in the mouse. Genes & Development. 15 (12), 1506-1517 (2001).
  14. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  15. Council, N. R. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals: Eighth Edition. , The National Academies Press. (2011).
  16. Casper, J., et al. The UCSC Genome Browser database: 2018 update. Nucleic Acids Research. 46 (1), 762-769 (2018).
  17. Church, D. M., et al. Lineage-specific biology revealed by a finished genome assembly of the mouse. PLOS Biology. 7 (5), 1000112 (2009).
  18. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  19. Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
  20. Heintzman, N. D., et al. Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome. Nature Genetics. 39 (3), 311-318 (2007).
  21. Rada-Iglesias, A., et al. A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature. 470 (7333), 279-283 (2011).
  22. Handoko, L., et al. CTCF-mediated functional chromatin interactome in pluripotent cells. Nature Genetics. 43 (7), 630-638 (2011).
  23. Splinter, E., et al. CTCF mediates long-range chromatin looping and local histone modification in the beta-globin locus. Genes & Development. 20 (17), 2349-2354 (2006).
  24. The ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  25. Rosenbloom, K. R., et al. ENCODE data in the UCSC Genome Browser: year 5 update. Nucleic Acids Research. 41, Database issue 56-63 (2013).
  26. Murray, J. I., Voelker, R. B., Henscheid, K. L., Warf, M. B., Berglund, J. A. Identification of motifs that function in the splicing of non-canonical introns. Genome Biology. 9 (6), 97 (2008).
  27. Taggart, A. J., et al. Large-scale analysis of branchpoint usage across species and cell lines. Genome Research. 27 (4), 639-649 (2017).
  28. Corvelo, A., Hallegger, M., Smith, C. W., Eyras, E. Genome-wide association between branch point properties and alternative splicing. PLOS Computational Biology. 6 (11), 1001016 (2010).
  29. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
  30. Grainger, S., et al. CRISPR Guide RNA Validation In Vitro. Zebrafish. 14 (4), 383-386 (2017).
  31. Quadros, R. M., Harms, D. W., Ohtsuka, M., Gurumurthy, C. B. Insertion of sequences at the original provirus integration site of mouse ROSA26 locus using the CRISPR/Cas9 system. FEBS Open Bio. 5, 191-197 (2015).
  32. Harms, D. W., et al. Mouse Genome Editing Using the CRISPR/Cas System. Current Protocols in Human Genetics. 83, (2014).
  33. Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors. Nature Protocols. 13 (1), 195-215 (2018).
  34. Laird, P. W., et al. Simplified mammalian DNA isolation procedure. Nucleic Acids Research. 19 (15), 4293 (1991).
  35. Kosicki, M., Tomberg, K., Bradley, A. Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements. Nature Biotechnology. 36 (8), 765-771 (2018).
  36. Akcakaya, P., et al. In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations. Nature. 561 (7723), 416-419 (2018).
  37. Lazzarotto, C. R., et al. Defining CRISPR-Cas9 genome-wide nuclease activities with CIRCLE-seq. Nature Protocols. 13 (11), 2615-2642 (2018).
  38. Ohtsuka, M., et al. Improvement of pronuclear injection-based targeted transgenesis (PITT) by iCre mRNA-mediated site-specific recombination. Transgenic Research. 22 (4), 873-875 (2013).
  39. Ohtsuka, M., et al. Pronuclear injection-based mouse targeted transgenesis for reproducible and highly efficient transgene expression. Nucleic Acids Research. 38 (22), 198 (2010).
  40. Lee, G., Saito, I. Role of nucleotide sequences of loxP spacer region in Cre-mediated recombination. Gene. 216 (1), 55-65 (1998).
  41. Thomson, J. G., Rucker, E. B., Piedrahita, J. A. Mutational analysis of loxP sites for efficient Cre-mediated insertion into genomic DNA. Genesis. 36 (3), 162-167 (2003).
  42. Cho, A., Haruyama, N., Kulkarni, A. B. Generation of Transgenic Mice. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter Unit-19.11 (2009).
  43. Pu, X. A., Young, A. P., Kubisch, H. M. Production of Transgenic Mice by Pronuclear Microinjection. Methods in Molecular Biology. 1874, 17-41 (2019).
  44. Murgha, Y., et al. Combined in vitro transcription and reverse transcription to amplify and label complex synthetic oligonucleotide probe libraries. Biotechniques. 58 (6), 301-307 (2015).
  45. Quadros, R. M., et al. Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins. Genome Biology. 18 (1), 92 (2017).
  46. Chen, X., Wu, J. M., Hornischer, K., Kel, A., Wingender, E. TiProD: the Tissue-specific Promoter Database. Nucleic Acids Research. 34, Database issue 104-107 (2006).
  47. Haruyama, N., Cho, A., Kulkarni, A. B. Overview: Engineering transgenic constructs and mice. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter Unit-19.10 (2009).
  48. Tasic, B., et al. Site-specific integrase-mediated transgenesis in mice via pronuclear injection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7902-7907 (2011).
  49. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Fundamentals of Breeding and Weaning. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
  50. Wyborski, D. L., DuCoeur, L. C., Short, J. M. Parameters affecting the use of the lac repressor system in eukaryotic cells and transgenic animals. Environmental and Molecular Mutagenesis. 28 (4), 447-458 (1996).
  51. Wyborski, D. L., Short, J. M. Analysis of inducers of the E.coli lac repressor system in mammalian cells and whole animals. Nucleic Acids Research. 19 (17), 4647-4653 (1991).
  52. Traykova-Brauch, M., et al. An efficient and versatile system for acute and chronic modulation of renal tubular function in transgenic mice. Nature Medicine. 14 (9), 979-984 (2008).
  53. Michel, G., Mosser, J., Fauran, F. Serum kinetics of doxycycline polyphosphate in dogs. European Journal of Drug Metabolism and Pharmacokinetics. 4 (1), 43-48 (1979).
  54. Bertocchi, I., et al. Regulatory functions of limbic Y1 receptors in body weight and anxiety uncovered by conditional knockout and maternal care. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (48), 19395-19400 (2011).
  55. Plageman, T. F., Lang, R. A. Generation of an Rx-tTA: TetOp-Cre knock-in mouse line for doxycycline regulated Cre activity in the Rx expression domain. PLOS One. 7 (11), 50426 (2012).
  56. Mollova, M., et al. Cardiomyocyte proliferation contributes to heart growth in young humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1446-1451 (2013).
  57. Ptashne, M. Principles of a switch. Nature Chemical Biology. 7 (8), 484-487 (2011).
  58. Balazsi, G., van Oudenaarden, A., Collins, J. J. Cellular decision making and biological noise: from microbes to mammals. Cell. 144 (6), 910-925 (2011).
  59. Nevozhay, D., Zal, T., Balazsi, G. Transferring a synthetic gene circuit from yeast to mammalian cells. Nature Communications. 4, 1451 (2013).
  60. Labow, M. A., Baim, S. B., Shenk, T., Levine, A. J. Conversion of the lac repressor into an allosterically regulated transcriptional activator for mammalian cells. Molecular and Cellular Biology. 10 (7), 3343-3356 (1990).

Tags

Генетика выпуск 145 транскрипция выражение реверсивные лак репрессор тет активатор Dnmt1 репрессии Джин регулирование индуцибильный
В естественных условиях применение системы дистанционного управления для манипуляции эндогенного экспрессии генов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vander Schaaf, N. A., Oghamian, S.,… More

Vander Schaaf, N. A., Oghamian, S., Park, J. A., Kang, L., Laird, P. W., Lee, K. H. In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression. J. Vis. Exp. (145), e59235, doi:10.3791/59235 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter