Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

Uzaktan kumandalı sistem in vivo uygulama için işleme endojen gen ekspresyonu

Published: March 29, 2019 doi: 10.3791/59235

Summary

Bu iletişim kuralı canlı hayvan veya gelişmiş lac önleyici ve/veya tet harekete geçirmek sistemleri kullanarak hücreleri içinde ilgi endojen bir gen transkripsiyonu koşullu olarak kontrol edilebilir bir modeli sistemi oluşturmak için gereken adımları açıklar.

Abstract

Burada biz için ters çevrilebilir ve akort ifade kontrolünü sağlayan uzaktan kumanda sistemi (Reversible Manipulation of Transcription Endogenous loci,), uygulama için bir iletişim kuralı tanımlamak bir yaşam ilgi endojen gen sistemleri model. Uzaktan kumanda sistemi aşağı - ya da upregulation bir hedef genin tek bir biyolojik sistem içinde elde etmek için gelişmiş lac baskı ve tet aktivasyon sistemleri kullanır. Sıkı baskı esnek bulunan sitelerde bağlama önleyici elde edilebilir çok transkripsiyon uzama inhibe bir transkripsiyon başlangıç sitesine aşağı. Sağlam upregulation soydaş organizatörü için tet transkripsiyon aktivatörleri hedefleyerek endojen bir gen transkripsiyonu güçlendirerek elde edilebilir. Bu geri dönüşümlü ve akort ifade denetimi uygulanan ve canlılar arasında art arda çekilmiş. Güç ve çok yönlülük endojen Dnmt1 için burada gösterildiği gibi sistem daha kesin içinde vivo fonksiyonel analiz araştırma çeşitli ifade düzeylerde gen işlevinin etkinleştirilmesi ve reversibility in test sağlayacak bir fenotip.

Introduction

Genetik nakavt veya transgenik yaklaşımlar hayvan modellerinde gen işlevini öğrenmek için etkili yol olmuştur. Ancak, bu yaklaşımlarla ifade Yönetmeliği (açık/kapalı) ayrılmalar, geçici olmayan ve böylece bir gen tam fonksiyonel yelpazesini belirleme yeteneğine sahip değildir. Koşullu Cre/MoxP teknolojileri spatio-temporal inactivation veya gen fonksiyon aktivasyonu sağladı ama ayrılmalar doğaları hücre ölümcül ve irreversibility1,2 gibi sınırlamalar oluşturmaya devam ediyor , 3. bu boşluğu doldurmak için tetkullanarak koşullu devirme yaklaşımlar geliştirilmiştir-shRNA veya miRNA4düzenlenir. Ancak, hedef kapalı efektleri RNAi5 için bir endişe kalır ve içinde vivo. kontrol etmek zor oldu Daha yakın zamanlarda, CRISPR/CA-aracılı transkripsiyon kontrolü teknolojileri hem yukarı - ve endojen gen ekspresyonu downregülasyon ulaşmak daha çok yönlü bir yaklaşım tanıttı ve kendi araçları6,7 gösterdi . Ancak, transkripsiyon kontrolü CRISPR/CA-aracılı etkinliğini henüz vivo, belirsizdir ve reversibility KRAB tabanlı baskı KRAB görüldü, güçlü baskı gerekmektedir ve onun etkileşen protein KAP1 ikna etmek için gösterilen kalıcı gene8,9susturmak.

Bu sınırlamaları gidermek için bir roman transkripsiyon düzenleyici sistem koşullu olarak bir tersinir endojen gen ifadesinde kontrol yetenekli geliştirdiğimiz ve fare kullanarak ayarlanabilir şekilde prokaryotik ikili transkripsiyon mühendislik düzenleyici sistemleri10. Prokaryotik ikili transkripsiyon düzenleyici sistemleri ile lac ve tet, gibi düzenleyici ligandlar böyle tersinir etkin ve akort ifade kontrol11,12,13, 14. ancak, geçerli ikili sistemler yetersiz baskı potens endojen gen ekspresyonu memelilerde kontrol etmek için onların geniş kabulü engelledi. Biz bir gelişmiş lac baskı sistemi yeterince güçlü endojen genler baskı için geliştirilen ve tet transkripsiyon aktivatörleri ulaşmak için doğrudan soydaş organizatörü endojen bir gen için hedefleme yeni bir strateji istihdam sağlam upregulation (şekil 1)10. Bu teknoloji ile neredeyse iki büyüklük ifade kontrolünü endojen Dnmt1 gene bir akort, indüklenebilir ve geri dönüşümlü bir şekilde10elde ettik. Burada diğer genler ve fare modeli tür olarak kullanarak organizmalar içinde vivo uygulanması için adım adım yönergeler sağlar.

Figure 1
Resim 1 : Uzaktan kumandalı sistem bakış. Bir endojen hedef gen transkripsiyonu mühendislik lac önleyici ve tet harekete geçirmek sistemleri kullanarak düzenlenmiş olması. Hedef gen Düzenleyici veya intron sıkı bağlama LacIGY önleyici ve/veya rtiçin işleçler içeren şekilde tasarlanmıştır TA-M2 harekete geçirmek. R Repron (Repression intrüzerinde), bir kısmi tavşan beta-globin intron 12 simetrik lac operatörleri (S) içeren gösterir. T tet işleç gösterir. Önleyici ve/veya harekete geçirmek/doku özgü organizatörü ifade edilir. Hedef gen ifadesinin ardından geri dönülebilir olarak istenen ifade seviyeye IPTG (izopropil β-D-1-thiogalactopyranoside, LacIGY önleyici bir antagonist) veya Doxycycline (Dox) yönetimi tarafından ayarlanan. Bu rakam Lee ve ark.10değiştirildiBu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Bu iletişim kuralı başlamadan önce Tablo 1 gen ekspresyonu istediğiniz denetim için ilgili adımları tanımlamak için gözden geçirin. Örneğin, "Gen x" tersine çevrilebilir downregülasyon sağlar bir fare mühendis için bölümler 1, 3 ve 4 / tamamlamak Protokolü aşağıda. Tablo 1 de uzaktan kumanda sisteminin gerekli bileşenleri özetler.

İstenen ifadeyi Değiştir Sadece baskı Yalnızca etkinleştirme Baskı ve harekete geçirmek
Protokolü'nün ilgili bölümleri 1, 3-4 2-4 1-4
Hedef geni gerekli uzaktan kumanda sırası Repron ("Baskı intron"; 12 simetrik lac operatörleri artı bir kısmi tavşan beta-globin intron) Tet operator(s) Repron ve Tet operator(s)
Uzaktan kumandalı sıra konumu İntron Organizatörü İntron & organizatörü
Harekete geçirmek/önleyici istediğiniz denetim için gerekli LacIGY önleyici rtTA-M2 harekete geçirmek LacIGY önleyici ve rtTA-M2 aktivatör
Düzenleyici ligandlar IPTG Doksisiklin IPTG ve/veya Doxycycline

Tablo 1: Uzaktan kumandalı bileşenleri bakış.

Protocol

Tüm hayvan yordamları kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) ile University of Southern California ve Van Andel Araştırma Enstitüsü ve kılavuz ile uyumlu onay bakım ve kullanım laboratuvar hayvanları ile yapılmıştır Sağlık15Ulusal Enstitüleri.

1. uzaktan kumanda baskı için ilgi gen değiştirme

  1. Aşağıdaki, yönergeleri kullanarak sonuna doğru 5' gen ekleme Repron sırası için ilgi transcriptionally inert bir intron belirleyin ("Repression intrüzerinde"; 12 simetrik lac operatörleri artı bir kısmi tavşan beta-globin intron). Gen ilgi için alternatif rehberleri dikkat ve kontrol edilebilir transcript(s) göre bir intron seçin (yani bir intron transkriptlerinizin veya kişi tarafından paylaşılan istenen bir transkript özgü).
    Not: bir intron olmadan veya olanlar 3' sonuna doğru genler için Repron sıra organizatörü yerleştirin (Lee, vd.10 ayrıntılı bir yordam için bkz:).
    1. Genomik sırası için gen ilgi edinin.
      1. UCSC Genom tarayıcı16,17' ye gidin ve en son taslağı olan şu anda genleri sekmesi altında fare genomunun (fare GRCm38/mm10) yayın zamanda seçin.
      2. Adı veya simge faiz gen gen için transkript görüntülemek için Ara Çubuğu'na girin. Git' i tıklatın.
      3. İstenen transkript değişken faiz gen için seçin.
      4. (Daha önce seçilen transkript sembolü bir karanlık kutu içinde olacak) faiz transkript türevi yanındaki gen simgesini tıklatın.
      5. Sırası ve araçlara ve veritabanları bağlantılar bayrağı altında Genomik sıra bağlantısını tıklatın.
      6. Sıra alma bölge seçenekleri, yalnızca ekzonlar seçin (5' UTR, CD, 3'utr), intron ve varsayılan Gen başına bir FASTA kayıt. Sıra biçimlendirme seçenekleri, ekzonlar büyük harf, küçük harf içinde her şeyi ve Maske tekrarlar N için (tekrarlayan dizileri gizlemek için) seçin. Sonra Gönder' i tıklatın.
      7. Bu sıra üst korumalıdır, kaydetmek ve biçimlendirme, bir belge veya açıklamalı programında küçük harf.
    2. Gen düzenleyici fonksiyonu ile bölgeleri gösterebilir CpG Adaları kesinti kaçının.
      Not: bir intron 5' Repron sıra sokmak için tercih olsa da, ilk intron transkripsiyon düzenleyici elemanlarının (Bu adımda muayene) CpG Adaları gibi ve Repron için kaçınılması gereken olan (Adım 1.1.4 muayene) artırıcı öğeler içerebilir ekleme.
      1. UCSC Genom tarayıcı ifade ve yönetmelik bayrağı altında CpG Adaları parça için göster ' i seçin ve Yenile' yi tıklatın.
      2. 5' intron üzerinde yakınlaştırma, her CpG Adası (Yayın varsa sırasında yeşil renkle gösterilmiştir) tıklatın ve Görünümü DNA örneği almak için bu özelliğiseçin.
      3. N için maske tekrarlarCpG Adası sıra elde etmek için DNA elde seçtikten sonra.
      4. Bu DNA dizileri orijinal sıra dosyasıyla yerleşimi ve bunlar mümkün gen düzenleyici işlevleri nedeniyle önlemek için intronic bölgeleri olarak açıklama.
    3. -Dibi takdirde onlar-si olmak bir düzenleyici işlevi RNA'ların, kodlamayan kesinti kaçının.
      1. Genler ve gen Öngörüler bayrağı altında UCSC Genom tarayıcı, GENCODE (Ensembl) izlemek için göster ' i seçin ve Yenile' yi tıklatın.
      2. 5' intron üzerinde yakınlaştırma, her kodlamayan RNA (Yayın varsa sırasında yeşil renkle gösterilmiştir) tıklayın ve DNA dizisi her kromozom koordinatlarını tıklayarak elde edilir.
      3. Görünüm aşağı açılan menüsünde, DNAseçin ve N için maske tekrarlar' ı tıklatın. O zaman DNA al' ı tıklatın.
      4. Bu DNA dizileri orijinal sıra dosyasıyla yerleşimi ve bunlar mümkün gen düzenleyici işlevleri nedeniyle önlemek için intronic bölgeleri olarak açıklama.
    4. İntronic tissue(s) H3K4me1, H3K27ac ve Dnaz gibi ilgi imzalarında artırıcı bölgeleriyle önlemek ben aşırı duyarlılık18,19,20,21, hem de CTCF bağlama siteler,22,23döngü artırıcı düzenleyen.
      1. ENCODE veritabanı24,25için gidin ve deneyler simgesini seçin.
      2. Tahlil türü için ChIP-seq veya Dnaz seqseçin ve diğer kategoriler (organizma, Biosample türü, vb) mühendislik hücrelere göre doldurmak.
      3. Özellik seçimi sonra mavi sembollerin üzerine gelin ve Liste olarak sonuçları görüntüle (Yayın zamanda en soldaki piktogram) görüntülendiği seçin.
      4. H3K4me1, H3K27ac, Dnaz ait hedefleri için veri kümelerini seçin ben ve en iyi biçimde uyuşacak mühendislik hücrelere CTCF.
      5. İlgili her veri kümesi içinde dosyalar bölümüne gidin, o mm10 (veya en son genom sürümü) doğrulamak ve UCSC seçilir ve görsel öğe düğmesini tıklatın.
      6. Şimdi UCSC Genom tarayıcı ve 5' intron faiz gen üzerinde yakınlaştırma, tıklatın her H3K4me1, H3K27ac, Dnaz ben ve CTCF tepe ilgili ek açıklama eklenen tepe parçalarını.
      7. DNA dizisi her tepe bölgesi için kromozom koordinatlarını tıklayarak elde edilir.
      8. Görünüm aşağı açılan menüsünde, DNAseçin ve N için maske tekrarlar' ı tıklatın. O zaman DNA al' ı tıklatın.
      9. Bu DNA dizileri orijinal sıra dosyasıyla yerleşimi ve bunlar mümkün gen düzenleyici işlevleri nedeniyle önlemek için intronic bölgeleri olarak açıklama.
    5. Uçbirleştirme dizileri çok uygun ekzonlar Uçbirleştirme ile müdahale değil, fikir birliği bozulma kaçının.
      Not: Uçbirleştirme için gereken serilerini büyük ölçüde sınırlı olan, ancak sonunda 5' bir intron altı üslerini26 ve 3' yaklaşık 60 üslerini27, bu önemli ölçüde daha geniş kenar boşlukları için izin büyük bir intron seçmek için tavsiye edilir Uçbirleştirme etkileyen olasılığını en aza indirmek için fikir birliği bölgeler. SVM-BPfinder28gibi intron analiz araçların kullanılması olası splice dizileri daha ayrıntılı bir analiz için önerilir.
  2. Tanımlayan sonra (olarak örneği Dnmt1 için ek veri), yukarıdaki kriterleri karşılayan bir online sgRNA kullanılarak sırası ekran intronic bir bölge tasarım aracı yüksek özgüllük ile bölgede bir sgRNA tespit etmek ve tahmin verimlilik puanları.
    1. Seçim, CRISPOR29gibi bir online sgRNA tasarım aracı gidin.
    2. İlgi intronic bölgesinin sırasını girin, ilgili başvuru genom belirtin ve istenen Protospacer bitişik motifi (PAM) seçin. Gönder' i tıklatın.
    3. Tahmin edilen sgRNAs özgüllük skora göre sıralamak ve aynı zamanda yüksek bir tahmin edilen verim29Puan edinildi var bir veya daha fazla sgRNAs seçin.
      1. İsteğe bağlı: etkili bir sgRNA kullanma olasılığını en üst düzeye çıkarmak için önce bir tüp bebek tahlil30' u çeşitli üst puanlama sgRNAs bölünme etkinliğini test ve içinde vivo en verimli sgRNA ile devam edin.
  3. Pad sýrasýný, örneği ek şekil 1A, Bsitesi31 kesmek sgRNA karşılık 60-base homoloji silah her iki tarafta çevrili, açılış bir PITT (hedef Transgenesis Pronuclear enjeksiyon tabanlı) içeren bir DNA şablonu tasarlama .
    Not: İniş pisti iki heterotypic loxP site (JT15 ve Lox2272) içerir ve büyük sıraları iki adımlı bir yaklaşımla hedeflenen ekleme sağlar; Bu ekleme kavşak şifreli splice siteleri oluşturmak değil emin olun. Alternatif olarak, bir embriyonik kök hücre (ESC) - tabanlı tak - strateji Repron sıra doğrudan eklemek için kullanılabilir.
  4. SgRNA, Cas9 protein ve tek iplikçikli DNA (ssDNA) şablonu için iniş pisti hazırlamak ve döllenmiş yumurta (B6C3F1/J fareler veya istenen diğer zorlanma) göre kurulan iletişim kuralları32,33içine microinject.
  5. Açılış paneli knock bileşenini ile fareler için ekran.
    1. Tasarım PCR astar tamamlayıcı genomik odağı için ama Dnmt1 tamamlayıcı şekil 1 ciçin gösterildiği homoloji kollarından hedef bölgeleri dışında. Tekrarlayan genom dizileri astar tasarlarken kaçının.
    2. DNA kurulan iletişim kuralları34göre farelerin kuyruk klipleri ayıklamak.
    3. Fare ile bir açılış defteri ekleme tanımlamak için Elektroforez jel ve PCR kullanın.
    4. Knock-in PCR ürünleri sıralama tarafından başarıyla yüklendiğini doğrulayın.
      Not: İstenmeyen büyük silme ve düzenlemeler CRISPR/Cas935, hedef kapalı düzenlemek için tarama devam etmeden35,36,37önce tavsiye edilir çok dikkatli tarafından tanıttı olabilir.
  6. Döllenmiş yumurta açılış pad fare kullanarak, iCre mRNA38 ve JTZ17 ve Lox2272 rekombinasyon siteleri31,39,40tarafından, çevrili Repron sıra içeren bir transgenik plazmid microinject yöntemleri38,42,43 41 göre kurulan.
  7. Repron ekleme ile fareler için ekran.
    1. Tasarım PCR astar tamamlayıcı Repron dışında genomik odağı yerleştirin. Tekrarlayan genom dizileri astar tasarlarken kaçının.
    2. DNA kurulan iletişim kuralları34göre farelerin kuyruk klipleri ayıklamak.
    3. Fareler Repron ekleme ile tanımlamak için Elektroforez jel ve PCR kullanın.
    4. Knock-in PCR ürünleri sıralama tarafından başarılı olduğunu onaylayın.

2. gene upregulation uzaktan kumanda için ilgi değiştirin

  1. Aşağıdaki yönergeleri kullanarak, organizatörü işlev ekleme tet operatör dizileri üzerine huzursuz düşüktür faiz gen düzenleyici bir bölgede belirleyin. Gen ilgi için alternatif rehberleri dikkat ve kontrol edilebilir bir organizatörü transcript(s) göre seçin (yani bir organizatörü transkriptlerinizin veya kişi tarafından paylaşılan istenen bir transkript özgü).
    1. Genomik sıra faiz organizatörü için edinin.
      1. UCSC Genom tarayıcı16,17' ye gidin ve en son taslağı olan şu anda genleri sekmesi altında fare genomunun (fare GRCm38/mm10) yayın zamanda seçin.
      2. Adı veya simge faiz gen gen için transkript görüntülemek için Ara Çubuğu'na girin. Git' i tıklatın.
      3. İstenen transkript değişken faiz gen için seçin.
      4. (Daha önce seçilen transkript gen sembolü bir karanlık kutu içinde olacak) faiz transkript türevi yanındaki gen simgesini tıklatın.
      5. Sırası ve araçlara ve veritabanları bağlantılar bayrağı altında Genomik sıra bağlantısını tıklatın.
      6. Sıra alma bölge seçenekleri, yalnızca organizatörü/Upstream 1000 ile üsleriseçin. Sıra biçimlendirme seçenekleri, (tekrarlayan dizileri gizlemek için) Maskesi tekrarlar N için seçin. Sonra Gönder' i tıklatın.
      7. Bu organizatörü sırası belge ve açıklamalı programı içinde kaydedebilirsiniz.
    2. Ücretsiz olarak sözde transkripsiyon faktörü bağlayıcı siteleri bu dizilere rahatsız olarak, seçim bölgeleri endojen gen ekspresyonu değiştirebilir.
      1. UCSC Genom tarayıcı için gidin ve fare genom son sürümünü açın.
      2. Eşleme ve sıralama afiş, hub'ları takipseçin.
      3. Mm10 yanındaki JASPAR 2018 TFBS (veya en son JASPAR sürümü) hub adını tıklatın.
      4. Adı veya simge faiz gen gen için transkript görüntülemek için Ara Çubuğu'na girin. Git' i tıklatın.
      5. İstenen transkript değişken faiz gen için seçin.
      6. JASPAR 2018 TFBS afiş aşağı ilerleyin ve ezmekgibi izlemek istediğiniz görüntüleme seçeneği seçmek için açılır liste okunu tıklatın. Yenile' yi tıklatın.
      7. Faiz gen organizatörü bölgesine yakınlaştırma ve transkripsiyon faktörü bağlayıcı siteleri JASPAR parça göre ücretsizdir (veya nispeten free) bölgeleri tanımlar. Bu bölgeler kromozom koordinatlarını kaydedin.
      8. Bu kromozom koordinatlar genomik dizisi onları arama çubuğuna yazarak tıklatıp Git' i edinin. Görünüm aşağı açılan menüsünde, DNAseçin ve N için maske tekrarlar' ı tıklatın. O zaman DNA al' ı tıklatın.
      9. Bu DNA dizileri orijinal sıra dosyasıyla yerleşimi ve bunlar transkripsiyon faktörü bağlayıcı olmaması nedeniyle hedeflemek için ideal organizatörü bölgeleri olarak açıklama.
    3. Bu DNA dizileri içinde akıntıya karşı ama ilgi gen transkripsiyonu başlangıç yakınlarında bir perturbable organizatörü bölge seçeneğini belirleyin.
      Not: transkripsiyon başlangıç sitesi organizatörü etkinlik bozulması olasılığını artırabilir yakın olduğunu bir ekleme, ama çok uzak bir ekleme upregulation düzeyini azaltabilir. Tet operatör dizileri transkripsiyon başlangıç sitenin yaklaşık 200 basepairs akıntıya karşı iki rehberleri sağlam upregulation içinde sonuçlandı ekleme (bkz: tartışma)10test.
  2. Ekran yüksek özgüllük ve öngörülen verim puanları ile bir sgRNA bölge tanımlamak için bir online sgRNA tasarım aracını kullanarak seçili organizatörü bölge.
    1. Seçim, CRISPOR29gibi bir online sgRNA tasarım aracı gidin.
    2. İlgi bölgenin sırasını girin, ilgili başvuru genom belirtin ve istenen Protospacer bitişik motifi (PAM) seçin. Gönder' i tıklatın.
    3. Tahmin edilen sgRNAs özgüllük skora göre sıralamak ve aynı zamanda yüksek bir tahmin edilen verim29Puan edinildi var bir veya daha fazla sgRNAs seçin.
      1. İsteğe bağlı: etkili bir sgRNA kullanma olasılığını en üst düzeye çıkarmak için önce bir tüp bebek tahlil30' u çeşitli sgRNAs bölünme etkinliğini test ve içinde vivo en verimli sgRNA ile devam edin.
  3. Site31,33kesmek sgRNA karşılık 60-base homoloji silah her iki tarafta çevrili tet işleç içeren bir DNA şablonu tasarlayın.
    Not: Tet işleçler numarasını özelleştirilebilir; 2-4 tet operatör dizileri tandem ekleme daha önce etkili olduğu gösterilmiştir, ancak ilke olarak daha çok işleç daha yüksek ifade sürüş için arzu edilir. Alternatif olarak, çakma bir ESC tabanlı strateji tet operatörleri eklemek için kullanılabilir.
    1. İsteğe bağlı: önerilen değişiklikler büyük olasılıkla endojen transkripsiyon etkinliği ilgi gen bölebilir değil deneysel kanıt için tasarlanmış organizatörü sıra (pGL3-Basic) gibi bir ateş böceği luciferase vektör içine clone ve onun etkinlik luciferase tahlil kullanarak özgün organizatörü için karşılaştırın.
  4. SgRNA, Cas9 protein ve tet operatör dizileri içeren ssDNA şablon hazırlamak ve döllenmiş yumurta (B6C3F1/J fareler veya istenen diğer zorlanma) göre kurulan iletişim kuralları32,33içine microinject.
    Not: tekrarlayan bir dizi sentezleme karmaşıklığı nedeniyle, çift iplikçikli DNA (dsDNA) plazmid44ssDNA şablondan sentezlemek için tüp bebek transkripsiyon/ters transkripsiyon dayalı bir yaklaşım tavsiye edilir. Alternatif olarak, bir dsDNA şablonu mikroenjeksiyon için kullanılmış olabilir ama çakma verimliliği düşük45olabilir.
  5. Knock-in tet operatörleri ile fareler için ekran.
    1. Tasarım PCR astar homoloji kollarından hedef bölgeleri dışında genomik odağı için tamamlayıcı. Tekrarlayan genom dizileri astar tasarlarken kaçının.
    2. DNA kurulan iletişim kuralları34göre farelerin kuyruk klipleri ayıklamak.
    3. PCR kullanın ve Jel Elektroforez fareler tet İşletmenleri ekleme ile tanımlamak için.
    4. Knock-in PCR ürünleri sıralama tarafından başarıyla yüklendiğini doğrulayın.
      Not: İstenmeyen büyük silme ve düzenlemeler CRISPR/Cas935, hedef kapalı düzenlemek için tarama devam etmeden35,36,37önce tavsiye edilir çok dikkatli tarafından tanıttı olabilir.

3. harekete geçirmek - ve/veya önleyici ifade fareler geliştirin

  1. Sağlam ifade organizatörü için faiz tissue(s) veya hücre türlerini tanımlayın.
    Not: Bir edebiyat arama ve doku özgü organizatörü veritabanı46 böyle bir organizatörü belirlemek için yararlı olabilir.
  2. Sağlanan gelişmiş lac önleyici veya transgenik bir yapı oluşturmak için istediğiniz düzenleyicinin tet harekete geçirmek sıra aşağı yerleştirin.
  3. Standart transgenik prosedürler42,43,47kullanarak transgenic fare hatlarınızı üretmek. Alternatif olarak, bir siteye özgü transgenesis yaklaşım tek kopya transgene ekleme31,48izin veren ve pozisyon etkileri önlemek için kullanılabilir.
  4. Kurucuları yayar ve ifade deseni ve her kurucu dölü transgene düzeyini belirler. Sağlam ifade içeren satırları daha fazla üreme için amaçlanan doku türlerini seçin.
    1. Kurucuları wildtype fareler için doğurmak.
    2. Harekete geçirmek ve/veya önleyici ekleme algılar tasarım PCR astar.
    3. DNA göre kurulan iletişim kuralları34yavru kuyruk klipleri ayıklamak.
    4. Fare ile ekleme tanımlamak için Elektroforez jel ve PCR kullanın.
    5. Transgene ekleme tarafından PCR ürünlerinin sıralama onaylayın.
    6. Yüklemelerin transgenik satırları.
    7. Her satırdan bir kaç yavru feda ve doku qRT-PCR, immünhistokimya, ve/veya gen/protein hedef doku türlerini ilgi ifade analiz etmek için Batı kurutma için ilgi toplamak.
    8. Bölüm 4 kullanım için ilgi dokularda en güçlü ifade içeren satırları seçin.

4. gen ifadesinin içinde vivo işlemek

  1. Faiz (Bölüm 1 ve/veya 2) değiştirilmiş gen ile fareler kurulmuş ıslah uygulamaları49göre 3 bölümünden transgenik fareler ile doğurmak. Maksimal ifade denetimi için fareler için homozygosity modifiye gen için doğurmak.
  2. Reversion veya hedef gen bir baskı düzeltilmesi için IPTG içme suyuna yönetme.
    1. Deneysel olarak kullanmak için IPTG doz belirlemek için uygun genotip ve denetimlerin fareler bir doz aralığı ile tedavi (aralığı başlangıç tavsiye: 0-400 mM IPTG) için en az bir hafta50,51. Tedavi grubu başına en az üç farelerin bulunur ve yaş ve cinsiyet planlı gelecekteki deneyler için en uygun olan farelerin seçin. Not: Üreme çiftlerini fare gelişimsel IPTG13istenirse yavru sağlarlar için IPTG su ile tedavi edilebilir veya fareler tedavi her zaman doğumdan sonra başlayabilirsiniz.
      1. IPTG steril distile su içinde istenen kitle yönetim gününde dağıtılması ve bir heyecan bar ile 5 dakika veya tamamen eriyene kadar karıştırın.
      2. Şişeyi folyo ile sarın ve ışık korumalı bir şişe IPTG suda yönetmek. Haftada iki kez değiştirin. Aynı kaynak su 0 mM IPTG alma fareler için sağlar.
      3. En az bir hafta sonra farelerin kurban ve gen qRT-PCR, immünhistokimya, ve/veya western Blot kullanarak hedef tissue(s) ilgi ifade analiz.
      4. Faiz gen ifadesi bu wildtype denetimler için geri yükler dozu belirlemek ve bu doz gelecekteki deneyler gen normal ifade elde etmek için kullanın.
  3. Gen upregulation indüksiyon için Doksisiklin (Dox) diyet yönetmek.
    1. Deneysel olarak yönetmek için Dox konsantrasyonu belirlemek için fare uygun genotip ve denetimlerin bir aralığı Dox konsantrasyonları ile tedavi (aralığı başlangıç tavsiye: 0-5000 mg/kg Doksisiklin Hyclate) için en az bir hafta52 ,53tedavi grubu başına en az üç fare dahil olmak üzere,. Dox içeren fare gıda ticari bir satıcıdan satın.
      Not: fareler çift damızlık gelişimsel Dox54,55, istenirse yavru sağlarlar Dox gıda ile tedavi edilebilir veya fareler tedavi her zaman doğumdan sonra başlayabilirsiniz.
    2. Haftada bir kez diyet değiştirin. Aynı temel diyet Dox free gıda alma fareler için sağlar.
    3. En az bir hafta sonra farelerin kurban ve gen qRT-PCR, immünhistokimya, ve/veya western Blot kullanarak hedef tissue(s) ilgi ifade analiz.
    4. İstenen seviyeye faiz gen ifadesinin yükseltir dozu belirlemek ve bu doz overexpression gelecekteki deneyler gen elde etmek için kullanın.

Representative Results

Baskı yeteneği uzaktan kumanda sisteminin şu ana kadar iki farklı yaklaşımlar gösterilmiştir. İlk yaklaşımda lac önleyici bağlayıcı siteleri Dnmt1 gen düzenleyici endojen yerleştirildi. Bu iletişim kuralı tarafından tavsiye edilir, ikinci yaklaşımda önleyici bağlayıcı siteleri bir aşağı akım intron organizatörü işlev ekleme tarafından etkileyen potansiyel riskini önlemek için ve böylece uygulama uzaktan kumandanın basitleştirmek için eklenmiş sistem. Her iki yaklaşımın başarılı baskı (Şekil 2A, B ve şekil 3A-C)10' sonuçlandı. Dnmt1 ifade organizatörü dayalı yaklaşım (Şekil 2A) kullanarak düzensiz düzeyleri % 15'i için baskı. Bu sıkı baskı IPTG (Resim 2A) değişen miktarlarda ile fareler davranarak bir doz bağımlı şekilde ters. Gözlenen Dnmt1 baskı protein düzeyinde immunostaining (Resim 2B) tarafından doğrulandı. Biz Dnmt1 ifade Dnmt1arasında herhangi bir fark fark gözlemlemek değil+/ + ve Dnmt1LO/LO fareler, bizim lac operatör ekleme normal organizatörü kesintiye değil teyit işlev10. İntron dayalı bir yaklaşım elde daha fazla % 90 baskı operatörleri transkripsiyon uzama (şekil 3A, B)10inceltiyorum tarafından transkripsiyon başlangıç sitesinin birkaç kilobases nehrin aşağısında yer. Bu intron dayalı yaklaşım daha fazla yedi ek sağlam rehberleri (şekil 3C) üzerinde doğrulandı. Her zaman sıkı baskı test rehberleri tümünden sağlanır. Kalan ifade düzeyleri ve güçlü bir rehberleri arasında hiçbir bağlantı gözlendi, baskı kapasitesi bizim intron tabanlı baskı sisteminin tüm sağlam rehberleri transkripsiyon potens aştığını öne test ettik () Şekil 3 C).

Uzaktan kumanda sistemi içinde vivo upregulation yeteneği de Dnmt1 gen üzerinde gösterilmiştir. Ya upregulation ya da hangi efektör bağlı olarak protein mevcut downregülasyon için izin vermek için Dnmt1 düzenleyici, lac operatör dizileri, birlikte tet işleç iki kopyasını girmiştir. Sağlam upregulation ve iki büyüklük (10 650-%), yakın Dnmt1 ifade downregülasyon değiştirilmiş endojen Dnmt1 gen (Dnmt1LGT) (şekil 4A) içeren ESCs elde edildi10 . Her iki yönetmelik tam tersine çevrilebilir ve tedaviler, IPTG ve Dox tarafından indüklenebilir idi (şekil 4A). Biz sonraki uzaktan kumanda sistemi içinde vivo upregulation yeteneğini test etmek için fare germline içine Dnmt1LGT değişiklik tanıttı. Hiçbir tespit upregulation ' kalbinde (şekil 4B)7gözlendi, ancak güçlü upregulation Dnmt1 , karaciğer, dalak ve böbrek, gözlendi. Dnmt1 hücre döngüsü bağımlı ifade desenini ve proliferatif kalp hücrelerinde kıtlığı bu gözlem10,56altında yatan. Belgili tanımlık harekete geçirmek veya onun bağlama sitelerin sayısı ifade düzeyini artırarak bu sınırlamayı aşmak olup olmadığını görülecek.

Figure 2
Resim 2 : Vivo Dnmt1 baskı LacIGY önleyici tarafından. Dnmt1 organizatörü, veya LacIGY, ifade olmadan eklenen(a)fareler lac operatörleri (LO) ile IPTG çeşitli dozları ile tedavi. Dnmt1 ifade analizini qRT-PCR Dnmt1 baskı doz bağımlı iptali ile IPTG tedavi içinde vivo gösterir. Her çubuk farklı bir fareden veri temsil eder. Verileri temsil eden ortalama ± SEM (n = 3). (B) Immunostaining farelerin kolon kriptalarının Dnmt1 proteinin içme suyu ile veya olmadan 160 mM IPTG 2 hafta için sağlanan. Bu rakam Lee ve ark.10değiştirildiBu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : Vivo ve Uzaktan kumanda sistemi tarafından çeşitli rehberleri tüp bebek bastırma. (A) Repron sıra (R *) önceki bir sürümü bir intron aşağı bir Villin-mKate2 transgenik Mouse (VilmKate2) Villin düzenleyicinin içine eklenen. ince bağırsak mKate2 ifadede fare ile veya olmadan LacIGY önleyici analizini qRT-PCR gösterilir. Her çubuk farklı bir fareden veri temsil eder. İnce bağırsak ile ve LacIGY ifade olmadan (B) Confocal mKate2 görüntüleri. (C) altı simetrik lac operatörleri (S) çeşitli rehberleri ve luciferase muhabir arasında yerleştirildi. Gazetecilere (50 ng/96-şey plaka iyi) ve önleyici plazmid geçici bir 1:1 molar oranı NIH/3T3 hücreye kullanılmaya başlanmıştır. Luciferase değer biçilen 24 saat sonra transfection vardı. Bunlar tüp bebek veri temsil LacIGYluciferase ifade yüzde-hücreleri göre bu işlevsel olmayan LacI (NFlacI) ifade ifade. T-testleri istatistiksel anlamlılık belirlemek için kullanılmıştır. Verileri temsil eden ortalama ± SEM (n = 3). P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01. Bu rakam Lee ve ark.10değiştirildiBu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 : Aşağı - ve/veya tüp bebek ve içinde vivo Dnmt1 ifade upregulation. (A) tam uzaktan kumanda sistemi kültürlü ESCs gen hedefleme ve elektroporasyon yaklaşımlar tarafından geliştirilmiş. Maksimal harekete geçirmek IPTG ve Dox elde ederken Dnmt1 ifade maksimal baskı ile hiçbir tedavi sağlanır. Verileri temsil eden ortalama ± SEM (n = 3). P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01 (Welch t-testleri). (B) In vivo aktivasyonu Dnmt1 gibi uzaktan kumandalı fareler immunostaining Dnmt1 protein çeşitli dokularda tarafından uzaktan kumanda sistemi tarafından. LGT alleli lac operatör ve tet harekete geçirmek bağlayıcı siteleri içeren Dnmt1 organizatörü değişiklik gösterir. Fare ile normal veya Dox içeren diyet (5000 mg/kg Doksisiklin Hyclate) bir ay boyunca tedavi edildi. Bu rakam Lee ve ark.10değiştirildiBu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Supplementary Figure 1
Ek resim 1 : Örnek pad ekleme fare Dnmt1 intron 1 iniş. (A)şeması DNA şablonunun pad ekleme, Brezilya'lı ve ark. (2015)31adapte açılış için. Heterotypic loxP siteleri, JT15 ve Lox2272, (sp) kısa spacer sırası tarafından ayrılmış ve 60-bp hedef genomik bölgesine homolog DNA'ın her tarafında çevrili. Pad ekleme aşağıdaki sgRNA kullanarak Dnmt1 intron iniş için (B) örnek DNA şablon: (ki ters strand hedefleyen) CTAGTACCACTCCTGTACCG. Seçili intronic bölge bioinformatically adım 1.1 tarafından haberdar oldu ve sgRNA CRISPOR29kullanarak tespit edildi. (C) örnek ekleme iniş pisti değerlendirmek için PCR astar tasarım. PCR astar şablonu homoloji silah dışında endojen Dnmt1entegrasyon onaylamak için tasarlanmıştır. 213 wildtype PCR amplicon olan kan basıncı; ekleme, 291 olur bp. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

Uzaktan kumanda sistemi potansiyel sınırlama ve kritik adım hedef gen ekspresyonu etkilemeden önleyici ve/veya harekete geçirmek bağlayıcı siteleri ekleme ile ilgili sorun var. Özgün Baskı yaklaşımımız, Dnmt1 gen için uygulanan olarak lac önleyici bağlayıcı siteleri bir organizatörü transcriptionally kritik bölgeleri içinde ekleme dahil. Organizatörü işlevi etkileyen ve bu nedenle riskini azaltmak amacıyla uzaktan kumandalı sistem genel uygulanabilirliği geliştirmek, biz bir intron tabanlı baskı yaklaşım geliştirmiştir. Gelişmiş lac sistemimiz potens bizi sıkı bir şekilde yer alan işleçler test ettik güçlü rehberleri transkripsiyon bastırmak izin birkaç kilobases aşağı transkripsiyonu yüzlerce siteleri (şekil 3A-C) başlatmak 10. baskı düzeyleri önemlisi, Organizatör (şekil 3A-C)10transkripsiyon güçlerinden bağımsız olduğunu. Bu baskı kapasitesi bizim intron tabanlı baskı sisteminin test rehberleri transkripsiyon gücünü aştığını göstermektedir. İntron tabanlı bu yaklaşım, baskı yoluyla iki bileşeni, transkripsiyon uzama makine ve lac repressors57arasında fiziksel girişime aracılık ettiği olasıdır. Bu basit baskı mekanizması ve intron tabanlı yöntemi gösterdiği sağlamlık bu yaklaşım genellikle farklı genler, doku ve organizmalar için geçerli hale gelebilir.

Upregulation uzaktan kumanda sistemi tarafından organizatörü işlevi etkileyen riski üzerine kuruludur hedef gen düzenleyici bir mesafede olmak transactivator Bağlayıcı sıraları gerektirir. Ancak, dizileri bağlama pozisyon dışında transcriptionally kritik bölgesi olabilir bulundu. Hem Dnmt1 hem de EF1α rehberleri sağlam upregulated tet operatörleri transkripsiyon başlangıç siteleri10yüz üsleri akıntıya karşı birkaç yer vardı. Bu rahat sınırlama organizatörü işlevi bir hedef gen transactivator yokluğunda etkileyen şansını büyük ölçüde azaltır. Bağlama artırıldığında dizileri ve/veya daha güçlü transactivators kullanımı daha da azaltmak belgili tanımlık tehlike yanında olanaklı kılmak uzak uzak transkripsiyon başlangıç sitesinden sitelerden upregulation yardımcı olabilir.

Bizim uzaktan kumandalı sistem düzeyinde, zamanlama ve endojen gen ifadesinin bir fenotip reversibility ve tarafından kolayca ulaşılabilir değildir farklı ifade düzeyleri sonuçlarını test etmek için izin vererek, konumunu zarif kontrol sağlar vivo gen ifade-kontrol teknolojilerinde geçerli. Bizimki de dahil olmak üzere çoğu gen ifade analizleri içinde bir nüfus arasında önemli farklılıklar bulunan hücrelerin ortalamasını ifade değerleri temsil unutmamak gerekir. Bu heterojenlik farklılaşma veya apoptosis58gibi hücresel karar alma süreçlerine etkileyebilir. Gen ifadesi denetim duyarlığını ek genetik devre mühendislik59tarafından büyük olasılıkla daha fazla geliştirilebilir rağmen mevcut sistem gözlenen potens birçok biyolojik bağlamlarda yararlı gen fonksiyon incelenmesi izin verir. Buna ek olarak, hedef özgüllüğü yüksek derecede operatör dizileri yanı sıra büyük bir evrimsel mesafe memeliler ve düzenleyici bileşenleri60kaynak türleri arasında karmaşıklığı nedeniyle bekleniyor. Ayrıca, repressors ve harekete geçirmek transgenik fare satırları geliştirilen ve endojen herhangi bir gen için istihdam. Örneğin, varolan tet transactivator fare modelleri upregulation hedef gen istenen fare dokularda gerçekleştirmek için adapte edilebilir. Biz son zamanlarda bizim gelişmiş lac önleyici sağlam doku özgü ifade lacIGY gen48 Hipp11 odağı getirerek mevcut Cre satırları ile birlikte birden fazla doku türlerinde sürebilirim transgenik bir çizgi geliştirilen (yayınlanmamış) bir somon balığı-STOP-Lox öğesinin kontrol altında. Bu satırı önemli ölçüde uzaktan kumandalı sistem doku özgü uygulanmasının kolaylaştırılması.

Gene upregulation uzaktan kumanda sistemi tarafından geçerli indüklenebilir transgenik yaklaşımlar ile karşılaştırıldığında birçok avantaj sağlar. Endojen locus kullanır gibi ekleme konumu etkili için sınama için birden çok satıra transgenik nesil gerektirmez. O zaten güçlü bir organizatörü ifadeden artırır çünkü geleneksel transgenik modelleri üzerinde en az viral rehberleri itimat ise buna ek olarak, bu yaklaşım gen güçlü temel ifade ile upregulation için çok uygundur. Son olarak, doku özgüllük, hücre döngüsü kontrol ve bir hedef gen türevleri Uçbirleştirme muhafaza upregulation yaklaşımımız tarafından doğuştan gelen BDTgibi doğal düzenleme unsurları korur gibi-düzenleyici elemanlarının. CRISPR/CA-aracılı gen hedefleme teknolojisi gelişine bu teknoloji farklı modeli sistemlerinde büyük ölçüde kolaylaştıracaktır.

Disclosures

AnchorDx bilimsel Danışma kurulları ve Progenity, Inc PWL hizmet vermektedir

Acknowledgments

Biz geç Dr Heidi Scrable memeli lacI gen yapısı (Mayo Clinic, Rochester, MN), onun cömert bir hediye için teşekkür Dr Daniel Villin organizatörü sağlamak için Louvard (Institut Curie, Paris, Fransa) ve Dr Laurie Jackson-Grusby (Çocuk Hastanesi, Boston, MA) bu teknoloji gelişme erken aşamalarında onun katkıları için. Dr Nancy Wu ve Dr Robert Maxson transgenik ve nakavt fareler üreten onların yardım için sana şükrediyoruz. Biz yararlı tartışmalar için Laird laboratuvar üye teşekkür ve destek. Bu eser Ulusal Sağlık Enstitüleri [R01 CA75090, R01 DA030325, R01 CA157918 ve R01 CA212374 için P.W.L. ve 1F31CA213897-01A1 N.A.V.S için] tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
B6C3F1/J The Jackson Laboratory 100010 https://www.jax.org/strain/100010
Cas9 Protein PNA Bio CP04 http://www.pnabio.com/products/CRISPR_Cas9.htm?gclid=EAIaIQobChMIsoG8pLL33QIVBr7ACh0naQ4dEAAYAiAAEgKyHvD_BwE
CRISPOR Haeussler et al. 2016 http://crispor.tefor.net/
Doxycycline-Containing Mouse Diet Envigo Varies by concentration https://www.envigo.com/products-services/teklad/laboratory-animal-diets/custom-research/doxycycline-diets/
ENCODE Database Stanford University https://www.encodeproject.org/
iCre mRNA synthesis plasmid (pBBI) Addgene 65795 https://www.addgene.org/65795/
IPTG GoldBio I2481C https://www.goldbio.com/search?isSearch=Y&q=iptg
pGL3-Basic Promega E1751 https://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-vectors-and-cell-lines/pgl3-luciferase-reporter-vectors/?catNum=E1751
SVM-BPfinder Regulatory Genomics, Pompeu Fabra University http://regulatorygenomics.upf.edu/Software/SVM_BP/
TiProD: Tissue specific promoter Database Department of Bioinformatics, UMG, University of Göttingen  http://tiprod.bioinf.med.uni-goettingen.de
UCSC Genome Browser University of California Santa Cruz https://genome.ucsc.edu/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jackson-Grusby, L., et al. Loss of genomic methylation causes p53-dependent apoptosis and epigenetic deregulation. Nature Genetics. 27 (1), 31-39 (2001).
  2. David, G., Turner, G. M., Yao, Y., Protopopov, A., DePinho, R. A. mSin3-associated protein, mSds3, is essential for pericentric heterochromatin formation and chromosome segregation in mammalian cells. Genes & Development. 17 (19), 2396-2405 (2003).
  3. Sumi-Ichinose, C., Ichinose, H., Metzger, D., Chambon, P. SNF2beta-BRG1 is essential for the viability of F9 murine embryonal carcinoma cells. Molecular and Cellular Biology. 17 (10), 5976-5986 (1997).
  4. Premsrirut, P. K., et al. A rapid and scalable system for studying gene function in mice using conditional RNA interference. Cell. 145 (1), 145-158 (2011).
  5. Qiu, S., Adema, C. M., Lane, T. A computational study of off-target effects of RNA interference. Nucleic Acids Research. 33 (6), 1834-1847 (2005).
  6. Gilbert, L. A., et al. Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation. Cell. 159 (3), 647-661 (2014).
  7. Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).
  8. Peng, H., Ivanov, A. V., Oh, H. J., Lau, Y. F., Rauscher, F. J. Epigenetic gene silencing by the SRY protein is mediated by a KRAB-O protein that recruits the KAP1 co-repressor machinery. The Journal of Biological Chemistry. 284 (51), 35670-35680 (2009).
  9. Groner, A. C., et al. KRAB-zinc finger proteins and KAP1 can mediate long-range transcriptional repression through heterochromatin spreading. PLOS Genetics. 6 (3), 1000869 (2010).
  10. Lee, K. H., Oghamian, S., Park, J. A., Kang, L., Laird, P. W. The REMOTE-control system: a system for reversible and tunable control of endogenous gene expression in mice. Nucleic Acids Research. 45 (21), 12256-12269 (2017).
  11. Gossen, M., Bonin, A. L., Bujard, H. Control of gene activity in higher eukaryotic cells by prokaryotic regulatory elements. Trends in Biochemical Sciences. 18 (12), 471-475 (1993).
  12. Hu, M. C., Davidson, N. The inducible lac operator-repressor system is functional in mammalian cells. Cell. 48 (4), 555-566 (1987).
  13. Cronin, C. A., Gluba, W., Scrable, H. The lac operator-repressor system is functional in the mouse. Genes & Development. 15 (12), 1506-1517 (2001).
  14. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  15. Council, N. R. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals: Eighth Edition. , The National Academies Press. (2011).
  16. Casper, J., et al. The UCSC Genome Browser database: 2018 update. Nucleic Acids Research. 46 (1), 762-769 (2018).
  17. Church, D. M., et al. Lineage-specific biology revealed by a finished genome assembly of the mouse. PLOS Biology. 7 (5), 1000112 (2009).
  18. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  19. Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
  20. Heintzman, N. D., et al. Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome. Nature Genetics. 39 (3), 311-318 (2007).
  21. Rada-Iglesias, A., et al. A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature. 470 (7333), 279-283 (2011).
  22. Handoko, L., et al. CTCF-mediated functional chromatin interactome in pluripotent cells. Nature Genetics. 43 (7), 630-638 (2011).
  23. Splinter, E., et al. CTCF mediates long-range chromatin looping and local histone modification in the beta-globin locus. Genes & Development. 20 (17), 2349-2354 (2006).
  24. The ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  25. Rosenbloom, K. R., et al. ENCODE data in the UCSC Genome Browser: year 5 update. Nucleic Acids Research. 41, Database issue 56-63 (2013).
  26. Murray, J. I., Voelker, R. B., Henscheid, K. L., Warf, M. B., Berglund, J. A. Identification of motifs that function in the splicing of non-canonical introns. Genome Biology. 9 (6), 97 (2008).
  27. Taggart, A. J., et al. Large-scale analysis of branchpoint usage across species and cell lines. Genome Research. 27 (4), 639-649 (2017).
  28. Corvelo, A., Hallegger, M., Smith, C. W., Eyras, E. Genome-wide association between branch point properties and alternative splicing. PLOS Computational Biology. 6 (11), 1001016 (2010).
  29. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
  30. Grainger, S., et al. CRISPR Guide RNA Validation In Vitro. Zebrafish. 14 (4), 383-386 (2017).
  31. Quadros, R. M., Harms, D. W., Ohtsuka, M., Gurumurthy, C. B. Insertion of sequences at the original provirus integration site of mouse ROSA26 locus using the CRISPR/Cas9 system. FEBS Open Bio. 5, 191-197 (2015).
  32. Harms, D. W., et al. Mouse Genome Editing Using the CRISPR/Cas System. Current Protocols in Human Genetics. 83, (2014).
  33. Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors. Nature Protocols. 13 (1), 195-215 (2018).
  34. Laird, P. W., et al. Simplified mammalian DNA isolation procedure. Nucleic Acids Research. 19 (15), 4293 (1991).
  35. Kosicki, M., Tomberg, K., Bradley, A. Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements. Nature Biotechnology. 36 (8), 765-771 (2018).
  36. Akcakaya, P., et al. In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations. Nature. 561 (7723), 416-419 (2018).
  37. Lazzarotto, C. R., et al. Defining CRISPR-Cas9 genome-wide nuclease activities with CIRCLE-seq. Nature Protocols. 13 (11), 2615-2642 (2018).
  38. Ohtsuka, M., et al. Improvement of pronuclear injection-based targeted transgenesis (PITT) by iCre mRNA-mediated site-specific recombination. Transgenic Research. 22 (4), 873-875 (2013).
  39. Ohtsuka, M., et al. Pronuclear injection-based mouse targeted transgenesis for reproducible and highly efficient transgene expression. Nucleic Acids Research. 38 (22), 198 (2010).
  40. Lee, G., Saito, I. Role of nucleotide sequences of loxP spacer region in Cre-mediated recombination. Gene. 216 (1), 55-65 (1998).
  41. Thomson, J. G., Rucker, E. B., Piedrahita, J. A. Mutational analysis of loxP sites for efficient Cre-mediated insertion into genomic DNA. Genesis. 36 (3), 162-167 (2003).
  42. Cho, A., Haruyama, N., Kulkarni, A. B. Generation of Transgenic Mice. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter Unit-19.11 (2009).
  43. Pu, X. A., Young, A. P., Kubisch, H. M. Production of Transgenic Mice by Pronuclear Microinjection. Methods in Molecular Biology. 1874, 17-41 (2019).
  44. Murgha, Y., et al. Combined in vitro transcription and reverse transcription to amplify and label complex synthetic oligonucleotide probe libraries. Biotechniques. 58 (6), 301-307 (2015).
  45. Quadros, R. M., et al. Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins. Genome Biology. 18 (1), 92 (2017).
  46. Chen, X., Wu, J. M., Hornischer, K., Kel, A., Wingender, E. TiProD: the Tissue-specific Promoter Database. Nucleic Acids Research. 34, Database issue 104-107 (2006).
  47. Haruyama, N., Cho, A., Kulkarni, A. B. Overview: Engineering transgenic constructs and mice. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter Unit-19.10 (2009).
  48. Tasic, B., et al. Site-specific integrase-mediated transgenesis in mice via pronuclear injection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7902-7907 (2011).
  49. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Fundamentals of Breeding and Weaning. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
  50. Wyborski, D. L., DuCoeur, L. C., Short, J. M. Parameters affecting the use of the lac repressor system in eukaryotic cells and transgenic animals. Environmental and Molecular Mutagenesis. 28 (4), 447-458 (1996).
  51. Wyborski, D. L., Short, J. M. Analysis of inducers of the E.coli lac repressor system in mammalian cells and whole animals. Nucleic Acids Research. 19 (17), 4647-4653 (1991).
  52. Traykova-Brauch, M., et al. An efficient and versatile system for acute and chronic modulation of renal tubular function in transgenic mice. Nature Medicine. 14 (9), 979-984 (2008).
  53. Michel, G., Mosser, J., Fauran, F. Serum kinetics of doxycycline polyphosphate in dogs. European Journal of Drug Metabolism and Pharmacokinetics. 4 (1), 43-48 (1979).
  54. Bertocchi, I., et al. Regulatory functions of limbic Y1 receptors in body weight and anxiety uncovered by conditional knockout and maternal care. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (48), 19395-19400 (2011).
  55. Plageman, T. F., Lang, R. A. Generation of an Rx-tTA: TetOp-Cre knock-in mouse line for doxycycline regulated Cre activity in the Rx expression domain. PLOS One. 7 (11), 50426 (2012).
  56. Mollova, M., et al. Cardiomyocyte proliferation contributes to heart growth in young humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1446-1451 (2013).
  57. Ptashne, M. Principles of a switch. Nature Chemical Biology. 7 (8), 484-487 (2011).
  58. Balazsi, G., van Oudenaarden, A., Collins, J. J. Cellular decision making and biological noise: from microbes to mammals. Cell. 144 (6), 910-925 (2011).
  59. Nevozhay, D., Zal, T., Balazsi, G. Transferring a synthetic gene circuit from yeast to mammalian cells. Nature Communications. 4, 1451 (2013).
  60. Labow, M. A., Baim, S. B., Shenk, T., Levine, A. J. Conversion of the lac repressor into an allosterically regulated transcriptional activator for mammalian cells. Molecular and Cellular Biology. 10 (7), 3343-3356 (1990).

Tags

Genetik sayı: 145 transkripsiyon ifade geri dönüşümlü lac önleyici tet harekete geçirmek Dnmt1 baskı gen düzenlemesi indüklenebilir
Uzaktan kumandalı sistem in vivo uygulama için işleme endojen gen ekspresyonu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vander Schaaf, N. A., Oghamian, S.,More

Vander Schaaf, N. A., Oghamian, S., Park, J. A., Kang, L., Laird, P. W., Lee, K. H. In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression. J. Vis. Exp. (145), e59235, doi:10.3791/59235 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter