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Genetics

remtoe 控制系统在内源基因表达调控中的应用

Published: March 29, 2019 doi: 10.3791/59235

Summary

该协议概述了生成模型系统所需的步骤, 在该模型系统中, 相关内源基因的转录可以在活体动物或细胞中使用增强的 lac 抑制和/或 tet激活剂系统有条件地控制。

Abstract

在这里, 我们描述了一个协议, 实现 remote 控制系统 (re理解 m anipulation of t 输药在endogenous loci), 它允许可逆和可调谐的表达式控制生命模型系统中感兴趣的内源基因。remte 控制系统采用强化的乳酸抑制和泰特激活系统, 以实现在单一生物系统中对目标基因的向下或上行。通过抑制转录伸长率, 可以通过灵活地位于转录起始位点下游的抑制位点来实现严格的抑制。通过靶向同源启动子的转录激活剂, 增强内源基因的转录, 可以获得鲁棒的增强。这种可逆和可调谐的表达控制可以应用和反复撤回的生物体。该系统的有效性和多功能性, 如这里为内源性 Dnmt1所示, 将允许更精确的体内功能分析, 通过允许在不同的表达水平上的基因功能的调查, 并通过测试的可逆性表。

Introduction

遗传敲除或转基因方法已成为研究动物模型基因功能的有效手段。然而, 这些方法的表达调控是二分法的, 非时间性的, 因此不能揭示基因的完整功能谱。条件 Cre /oxp技术允许时空失活或激活基因功能 , 但其二分法性质继续构成局限性 , 如细胞杀伤力和不可逆性1,2,3. 为了填补这一空白, 使用 tet 调控的 Shrna 或mirna4开发了有条件的敲除方法。然而, 非目标效应仍然是 RNAi5关注的问题, 在体内控制一直具有挑战性.最近, crisprc 介导的转录控制技术引入了一种更加通用的方法来实现内源基因表达的上升和下降调控, 并展示了它们的效用6,7.然而, crisprc 介导的转录控制的有效性在体内尚不清楚, 基于 krab 的抑制的可逆性还有待观察, 因为 KRAB 的强力抑制及其相互作用的蛋白质 KAP1 已被证明会诱发永久基因沉默8,9

为了解决这些局限性, 我们开发了一种新的转录调控系统, 能够利用工程原核二元转录以可逆和可调谐的方式有条件地控制小鼠内源性基因表达监管制度10。原核二元转录调节系统与调节配体, 如lactet, 已经启用了这样的可逆和可调谐的表达控制11,12,13, 14. 然而, 目前的二元系统抑制能力不足, 妨碍了它们被广泛采用, 以控制哺乳动物的内源性基因表达。我们开发了一种增强的 lac 抑制系统, 该系统足以抑制内源基因, 并采用了一种新的策略, 将转录激活剂直接靶向到源基因的同源启动子, 以实现鲁棒放大 (图 1)10。利用这项技术, 我们在可调谐、诱导和可逆的方式10中实现了内源性 dnmt1基因近两个数量级的表达控制。在这里, 我们提供了一步一步的指导, 它在体内应用于其他基因和生物使用小鼠作为模型物种。

Figure 1
图 1: 远程控制系统概述.内源性靶基因的转录可以通过工程lac抑制和tet激活剂系统进行调控。目标基因启动子或内含子被设计为包含紧密结合的 LacIGY 抑制剂和/或 rtta-m2 激活剂的运算符。R 表示 Repron (Repron (rep-回归 intr on), 其中包含12个对称 lac 运算符 (s) 加上部分兔子β-球蛋白内含物。T 表示tet运算符。抑制剂和催化剂是由组织特异性启动子表达的。然后, 通过给药 IPTG (作为 lacigny 抑制剂的拮抗剂) 或多西环素 (dox) 的 IPTG (异丙基β-d-1-硫代角糖苷) 或多西环素 (Dox), 可以将目标基因的表达可逆地调整到所需的表达水平。这个数字已经从 Lee 等人的修改.点击这里查看这个数字的更大版本.

在开始此协议之前, 请查看表 1 , 以确定所需的基因表达控制的相关步骤。例如, 要设计一个鼠标, 使 "基因 X" 的可逆下调, 完成以下协议的第1、3和4节。表 1还总结了 remote 控制系统所需的组件。

所需的表达式更改 仅限镇压 仅激活 抑制和激活
《议定书》的相关章节 1, 3-4 2-4 1-4
目标基因中所需的运动控制序列 Repron ("抑制内含子"; 12个对称 lac 运算符加上部分兔子β-球蛋白内含子) 泰特运算符 Repron 和 Tet 运算符
控制序列位置 内含 子 促进 Intron & 启动子
所需的控制所需的激活不压机 LacIGY 抑制器 Rtta-m2 激活剂 LacIGY 抑制剂和 Rtta-m2 激活剂
监管配体 IPTG 多西环素 IPTG 和/或多西环素

表 1:控制组件概述.

Protocol

所有动物程序都是经南加州大学和范安德尔研究所动物护理和使用机构委员会批准并按照《实验室动物护理和使用指南》进行的来自美国国立卫生研究院15号

1. 通过 remote 控制修改感兴趣的基因进行抑制

  1. 使用下面的指南, 识别转录惰性惰性内含体接近兴趣基因的 5 ' 端插入 Repron 序列 ("返回输入"; 12个对称的 lac 运算符加上部分兔子β-球蛋白内含物)。注意感兴趣基因的替代启动子, 并根据要控制的转录项选择一个内带 (即所有转录的内带共享或所需的转录单字的一个特定的)。
    注: 对于没有内含子或与 3 ' 端的基因, 将 Repron 序列插入启动子 (有关详细过程, 请参见 Lee 等)。
    1. 获取感兴趣基因的基因组序列。
      1. 导航到 ucsc 基因组 16,17, 并选择鼠标基因组的最新草案 (鼠标 grcm38/m10 在出版时), 目前在基因组选项卡下。
      2. 在搜索栏中输入感兴趣的基因的名称或符号, 以查看该基因的成绩单。点击转到
      3. 为感兴趣的基因选择所需的转录变体。
      4. 点击感兴趣的成绩单变体旁边的基因符号 (先前选择的成绩单的符号将在一个黑暗的盒子里)。
      5. 在 "到工具和数据库的序列和链接" 横幅下, 单击 "基因组序列"链接。
      6. 对于序列检索区域选项,仅选择 "exons" (5 ' UTR、cds 和 3 ' utr)、"内行" 和每个基因的默认 "一个 fasta" 记录。对于"序列格式选项", 选择大写的 exons, 小写中的所有其他内容和 "掩码重复到 n" (以隐藏重复序列)。然后单击 "提交".
      7. 保存此序列, 在可以批注的文档或程序中保留大小写格式。
    2. 避免 CpG 岛屿的中断, 这可能表明具有基因调控功能的地区。
      注: 虽然 5 ' 内含子更适合插入 Repron 序列, 但第一个内含子可能包含转录调节元素, 如 CpG 孤岛 (在此步骤中检查) 或增强剂元素 (在步骤1.1.4 中检查), 这对于 Repron 是要避免的插入。
      1. 在 UCSC 基因组浏览器的"表达式和规则" 横幅下 , 选择"cpg 群岛轨道显示", 然后单击 "刷新"。
      2. 放大 5 ' 内含子, 单击每个 CpG 岛 (如果存在, 则在发布时显示为绿色), 然后为此功能选择 "查看 DNA"
      3. 选择"蒙版重复到 n"后, 选择获取 dna以获取 cpg 岛序列。
      4. 用原始序列文件覆盖这些序列, 并将这些序列注释为内来子区域, 以避免由于可能的基因调控功能而产生。
    3. 避免非编码 Rna 的中断, 以防它们具有监管功能。
      1. 在 UCSC 基因组浏览器的"基因和基因预测" 横幅下, 选择 "相关代码 ( ensembl")轨道的 "显示", 然后单击 "刷新"。
      2. 放大 5 ' 内含子, 点击每个非编码 RNA (如果有绿色, 则在发布时显示), 并通过单击其染色体坐标获得每个 RNA 序列。
      3. 在 "查看" 下拉菜单中, 选择"dna", 然后单击 "蒙版重复到 n"。然后单击 "获取 DNA"。
      4. 用原始序列文件覆盖这些序列, 并将这些序列注释为内来子区域, 以避免由于可能的基因调控功能而产生。
    4. 避免在感兴趣的组织中具有增强剂特征的内连区域, 如 h3k4me1、h3k27ac 和 dnase i 超敏反应18192021以及 ctcf 结合站点, 调控增强剂循环22,23
      1. 导航到 encode 数据库2425, 然后选择 "实验" 图标。
      2. 对于检测类型, 选择Chip-seqdnase-seq,并根据要设计的细胞填充其他类别 (生物生物物质类型等)。
      3. 在要素选择之后, 将鼠标悬停在蓝色的象形图上, 并选择显示"查看结果为列表" 的象形图 (发布时最左侧的象形图)。
      4. 为 H3K4me1、H3K27ac、DNase i 和 CTCF 的目标选择与要设计的单元格最匹配的数据集。
      5. 在每个相关数据集中, 滚动到 "文件"部分, 验证是否选择了 mm10 (或最新的基因组版本) 和 UCSC, 然后单击 "可视化" 按钮。
      6. 现在, 在 UCSC 基因组浏览器和放大 5 ' 内含子的兴趣基因, 点击每个 H3K4me1, H3K27ac, DNase i 和 CTCF 在各自的注释峰值轨道。
      7. 通过单击每个峰值区域的染色体坐标来获取其 DNA 序列。
      8. 在 "查看" 下拉菜单中, 选择"dna", 然后单击 "蒙版重复到 n"。然后单击 "获取 DNA"。
      9. 用原始序列文件覆盖这些序列, 并将这些序列注释为内来子区域, 以避免由于可能的基因调控功能而产生。
    5. 避免中断协商一致的拼接序列, 以免干扰外部的适当拼接。
      注: 虽然拼接所需的序列主要限于在内带26的 5 ' 端约有6个碱基, 在 3 ' 结尾的六个碱基3 ' 端 27, 但最好选择一个大的内带, 允许从这些区域获得更宽的利润。以最大限度地减少影响拼接的可能性。建议使用内联分析工具 (如 SVM-BPfinder28), 以便对潜在的拼接序列进行更彻底的分析。
  2. 在确定符合上述标准的内情地区 (如补充数据中的 Dnmt1示例) 后, 使用在线 sgrna 设计工具筛选序列, 以识别该区域中具有高特异性和预测性的 sgRNA效率得分。
    1. 导航到一个在线 sgRNA 设计工具的选择, 如 CRISPOR29
    2. 输入感兴趣的内音区的序列, 指定相关的参考基因组, 并选择所需的协议相邻主题 (PAM)。单击 "提交"
    3. 根据特异性评分对预测的 Sgrna 进行排序, 并选择一个或多个也具有较高预测效率评分29的 sgrna。
      1. 可选: 为了最大限度地提高使用有效 sgRNA 的可能性, 首先在体外检测30中测试几个得分最高的 sgrna 的裂解效率, 并在体内进行最有效的 sgRNA。
  3. 设计一个 DNA 模板, 其中包含一个基于 PREGORT-TRATENAGE卡塔) 着陆场序列, 如补充图1A,B 所示, 两侧有60个基质臂, 对应于 sgRNA 切割位点31.
    注: 着陆场包含两个异型Loxp站点 (Jt15 和 lox2272), 可通过两步方法有针对性地插入大序列;确保此插入的连接点不会创建神秘的拼接站点。或者, 基于胚胎干细胞 (ESC) 的敲入策略可以直接插入 Repron 序列。
  4. 根据已建立的协议 32, 33, 准备用于着陆场的 sgrna、cas9 蛋白和单链 dna (ssdna) 模板, 并向受精卵 (B6C3F1/J 小鼠或其他所需菌株) 微注射。
  5. 屏幕上的老鼠与着陆板敲入。
    1. 设计 PCR 引物, 补充基因组位点, 但在同源臂所针对的区域之外, 如补充图 1C的 dnmt1所示。在设计引物时, 避免重复的基因组序列。
    2. 根据已建立的协议34从小鼠的尾夹中提取 dna。
    3. 使用 PCR 和凝胶电泳来识别有着陆垫插入的小鼠。
    4. 通过对 PCR 产品进行测序, 确认敲入成功。
      注: crispr/cas935 可以引入不必要的大删除和重新排列, 因此建议在进行353637之前仔细筛选目标外编辑。
  6. 使用着陆场小鼠的受精卵, 微注射 icre mrna38和一个转基因质粒, 其中含有 repron 序列, 由 jtz17 和 Lox2272 重组位点 31,39, 40,41根据既定的方法38,42,43
  7. 使用 "重新插入" 的鼠标屏幕。
    1. 设计 PCR 引物, 补充基因组位点, 外的 Repron 插入。在设计引物时, 避免重复的基因组序列。
    2. 根据已建立的协议34从小鼠的尾夹中提取 dna。
    3. 使用 PCR 和凝胶电泳来识别有 Repron 插入的小鼠。
    4. 通过对 PCR 产品进行测序, 确认敲入成功。

2. 利用 remte 控制修改感兴趣的基因

  1. 使用下面的指南, 确定感兴趣的基因启动子中的一个区域, 该区域在插入tet运算符序列时不太可能干扰启动子功能。注意感兴趣基因的替代启动子, 并根据要控制的转录项 (即所有成绩单共享的启动子或所需转录的一个推广点) 选择启动子。
    1. 获取感兴趣的启动子的基因组序列。
      1. 导航到 ucsc 基因组 16,17, 并选择鼠标基因组的最新草案 (鼠标 grcm38/m10 在出版时), 目前在基因组选项卡下。
      2. 在搜索栏中输入感兴趣的基因的名称或符号, 以查看该基因的成绩单。点击转到
      3. 为感兴趣的基因选择所需的转录变体。
      4. 点击感兴趣的转录变体旁边的基因符号 (先前选择的转录符号将在一个黑暗的盒子里)。
      5. 在 "到工具和数据库的序列和链接" 横幅下, 单击 "基因组序列"链接。
      6. 对于序列检索区域选项,选择1000个基的 Proter\ 上流。对于"序列格式选项", 选择 "蒙版重复到 n" (以隐藏重复序列)。然后单击 "提交".
      7. 将此启动子序列保存在可以注释的文档或程序中。
    2. 选择不含假定转录因子结合位点的区域, 因为中断这些序列可能会改变内源性基因表达。
      1. 导航到 UCSC 基因组浏览器, 并打开最新版本的鼠标基因组。
      2. 在 "映射和排序"横幅上方, 选择"跟踪中心"
      3. 单击Jaspar 2018 TFBS (或最新的 jaspar 版本) 的中心名称旁边的mm10
      4. 在搜索栏中输入感兴趣的基因的名称或符号, 以查看该基因的成绩单。点击转到
      5. 为感兴趣的基因选择所需的转录变体。
      6. 向下滚动到jaspar 2018 TFBS横幅, 然后单击下拉箭头, 为轨道选择所需的查看选项, 如挤压。单击 "刷新"。
      7. 放大感兴趣基因的启动子区域, 并根据 JASPPAR 轨道确定转录因子结合位点的自由 (或相对自由) 区域。记录这些区域的染色体坐标。
      8. 通过将这些染色体坐标分入搜索栏并单击"转到",获取这些染色体坐标的基因组序列。在 "查看" 下拉菜单中, 选择"dna", 然后单击 "蒙版重复到 n"。然后单击 "获取 DNA"。
      9. 用原始序列文件覆盖这些序列, 并将其注释为理想的启动子区域, 以实现目标, 因为缺乏转录因子绑定。
    3. 在这些序列中, 选择一个可摄动的启动子区域, 该启动子区域是上游的, 但接近感兴趣基因的转录起始位点。
      注: 插入距离转录起始点太近可能会增加损害启动子活动的机会, 但距离太远的插入可能会降低提升的水平。在转录起始点上游插入tet运算符序列约200基部, 对测试的两个启动子进行了鲁棒的提高 (见讨论)10
  2. 使用在线 sgRNA 设计工具筛选选定的启动子区域, 以识别该区域具有高特异性和预测效率得分的 sgRNA。
    1. 导航到一个在线 sgRNA 设计工具的选择, 如 CRISPOR29
    2. 输入感兴趣区域的序列, 指定相关的参考基因组, 并选择所需的协议相邻主题 (PAM)。单击 "提交"
    3. 根据特异性评分对预测的 Sgrna 进行排序, 并选择一个或多个也具有较高预测效率评分29的 sgrna。
      1. 可选: 为了最大限度地提高使用有效 sgRNA 的可能性, 首先在体外检测30中测试几个 Sgrna 的裂解效率, 并在体内进行最有效的 sgRNA。
  3. 设计一个 dna 模板 , 其中包含在两侧的60基同源臂, 对应于 sgrna 切割位点31,33
    注: tet运算符的数量是可自定义的;在一起插入两到四个tet运算符序列之前已被证明是有效的, 但原则上更多的运算符是理想的驱动更高的表达式。或者, 可以使用基于 esc 的敲入策略来插入tet运算符。
    1. 可选: 对于拟议的修改很可能不会破坏感兴趣基因的内源性转录活性的实验证据, 将工程启动子序列克隆为萤火虫荧光素酶载体 (如 Pgl3-basic), 以及用荧光素酶法将其疗效与原启动子进行比较。
  4. 根据已建立的协议 32, 33, 准备包含tet运算符序列的 sgrna、cas9蛋白和 ssdna 模板, 并向受精卵 (B6C3F1/J 小鼠或其他所需菌株) 微注射。
    注: 由于合成重复序列的复杂性, 建议采用体外转录/逆转录酶逆转录酶法, 从双链 DNA (dsDNA) 质粒44合成 ssDNA 模板.或者, dsDNA 模板可用于微注射, 但敲击效率可能会降低45
  5. 屏幕上的老鼠与敲作为的 tet操作人员。
    1. 设计 PCR 引物, 补充同源武器所针对的区域之外的基因组位点。在设计引物时, 避免重复的基因组序列。
    2. 根据已建立的协议34从小鼠的尾夹中提取 dna。
    3. 使用 PCR 和凝胶电泳来识别小鼠插入的 tet操作人员。
    4. 通过对 PCR 产品进行测序, 确认敲入成功。
      注: crispr/cas935 可以引入不必要的大删除和重新排列, 因此建议在进行353637之前仔细筛选目标外编辑。

3. 培养表达激活剂和/或压剂的小鼠

  1. 识别感兴趣的组织或细胞类型的有力表达启动子。
    注: 文献搜索和特定于组织的启动子数据库46可能有助于确定这种促进者。
  2. 将提供的增强型 lac抑制剂或tet激活剂序列放置在所需启动子的下游, 以生成转基因结构。
  3. 使用标准的转基因程序424347生产转基因鼠标线。或者, 可以使用特定地点的移位方法来避免位置效应, 并允许单拷贝转基因插入31,48
  4. 传播创始人, 确定转基因在每个创始人后代中的表达模式和水平。在预期的组织类型中选择具有鲁棒表达的线, 以便进一步繁殖。
    1. 将创始人培育成野生老鼠。
    2. 设计 PCR 引物, 可检测激活剂和/或抑制剂的插入。
    3. 根据已建立的协议34从后代的尾夹中提取 dna。
    4. 使用 PCR 和凝胶电泳来识别插入的小鼠。
    5. 通过对 PCR 产品进行测序, 确认转基因插入。
    6. 促进转基因线。
    7. 从每条线上牺牲一些幼崽, 收集 qRT-PCR、免疫组织化学和/或西方印迹感兴趣的组织, 以分析目标组织类型中感兴趣的基因蛋白的表达。
    8. 选择在感兴趣的组织中表达最强的线条, 以便在第4节中使用。

4. 体内操纵基因表达

  1. 根据既定的育种做法49, 用第3节的转基因小鼠用修饰的感兴趣基因 (第1和第2节) 对小鼠进行繁殖。为了最大限度地控制表达, 繁殖小鼠的纯合性修改等位基因。
  2. 对于目标基因的逆转或抑制调整, 在饮用水中使用 IPTG。
    1. 为了实验确定使用 iptg 的剂量, 用一个剂量范围 (推荐的起始范围: 0–400 mm iptg) 进行至少一周的 50,51, 治疗适当的基因型小鼠和控制。包括每个治疗组至少3只小鼠, 并选择与计划的未来实验最相关的小鼠年龄和性别。注: 小鼠的繁殖对可以用 IPTG 水进行治疗, 以便在需要的情况下将 IPTG 发育暴露给后代, 或者小鼠可以在出生后的任何时候开始治疗。
      1. 在给药日, 在无菌蒸馏水中溶解所需的 IPTG 质量, 用搅拌棒搅拌5分钟或直到完全溶解。
      2. 用铝箔包裹瓶子, 然后在一个防光的瓶子里管理 IPTG 水。每周更换两次。为接收 0 mM IPTG 的小鼠提供相同的水源。
      3. 至少一周后, 牺牲小鼠, 并使用 qRT-PCR、免疫组织化学和西部印迹分析目标组织中感兴趣的基因的表达。
      4. 确定将感兴趣的基因表达恢复到野生型对照的剂量, 并在未来的实验中使用此剂量来实现该基因的正常表达。
  3. 对于基因可读的诱导, 在饮食中使用多西环素 (Dox)。
    1. 实验确定要给出的 Dox 浓度, 用一系列 Dox 浓度之一对适当基因型的小鼠进行控制 (推荐的起始范围: 0–5000 mg/kg Doxycycline hylate), 为期至少一周, 52次,53, 包括每个治疗组至少3只小鼠。从商业供应商处购买含有 doxd 的老鼠食品。
      注: 繁殖对小鼠可以用 dox 食物进行治疗, 以便在需要的情况下, 将 dox 与后代发育接触, 或者小鼠在出生后的任何时候都可以开始治疗。
    2. 每周更换一次饮食。为接受无多克食物的小鼠提供相同的基本饮食。
    3. 至少一周后, 牺牲小鼠, 并使用 qRT-PCR、免疫组织化学和西部印迹分析目标组织中感兴趣的基因的表达。
    4. 确定将感兴趣的基因表达提升到所需水平的剂量, 并使用此剂量在未来的实验中实现该基因的过度表达。

Representative Results

到目前为止, remote 控制系统的抑制能力已通过两种不同的方法得到证明。在第一种方法中, 在dnmt1基因的内源启动子中插入了乳酸抑制位点。在本协议建议的第二种方法中, 将抑制绑定位点插入到下游内含子中, 以避免通过插入影响启动子功能的潜在风险, 从而简化 remote 控制的应用系统。这两种方法都导致了成功的压制 (2 a、b图 3a-c)10。使用基于启动器的方法, Dnmt1表达式被抑制到不受管制级别的 15% (图 2a)。这种严格的抑制被逆转, 通过治疗不同数量的 IPTG 小鼠 (图 2a), 以剂量依赖性的方式逆转。通过免疫染色在蛋白质水平上证实了观察到的Dnmt1抑制 (图 2b)。我们没有观察到dnmt1+/+ 和 dnmt1loo 小鼠在dnmt1表达上有任何明显差异, 证实我们的lac运算符插入没有干扰正常启动子函数10。基于内的方法通过减少转录伸长率 (图 3a,b) 10, 实现了在转录起始位下的几种千酶的操作人员90% 以上的抑制.这种基于内的方法在另外七个鲁棒启动子上得到了进一步验证 (图 3c)。所有被测试的促进者都得到了完全严格的压制。没有观察到残余表达水平与促进者的优势之间的相关性, 这表明我们基于内部的抑制系统的抑制能力超过了我们测试的所有强大促进者的转录效力 (图 3c)。

dnmt1基因上还演示了 remte 控制系统的体内控制能力。我们将tet算子的两个副本引入dnmt1启动子, 以及lac算子序列, 以便根据存在的效应蛋白进行放大或下调。在含有改性内源 Dmt1 等位基因 (dnmt1lgt) 的 Esc 中, Dnmt1 表达式的鲁棒控制和下调, 接近两个数量级 (10%至 650%) (图 4a) 10.这两种规定都是完全可逆的, 分别通过 IPTG 和 Dox 处理诱导 (图 4a)。接下来, 我们在小鼠胚系中引入了 dnmt1lgt修饰, 以测试 remte 控制系统的体内放大能力。从肝脏、脾脏和肾脏观察到 Dnmt1的强凝血, 而在心脏中没有发现可检测到的可发生的凝血 (图 4b)7dnmt1的细胞周期依赖性表达模式和心脏增殖细胞的稀缺可能是这一观察 10,56的基础。这种限制是否可以通过增加激活器的表达级别或其绑定站点的数量来克服, 还有待观察。

Figure 2
图 2: 在体内由 LacIGY 抑制者对 dnmt1的镇压.(a) 将 lac 运算符 (Lo) 插入dnmt1启动子的小鼠, 无论是否有lacigy的表达, 均采用不同剂量的 iptg 进行治疗。对Dnmt1表达的 qRT-PCR 分析显示, IPTG 治疗在体内抑制 Dnmt1的剂量依赖性逆转。每个条形图表示来自不同鼠标的数据。数据表示平均值±SEM (n = 3)。(b) Dnmt1 蛋白在提供有或不使用 160 MM iptg 的小鼠结肠墓穴中的免疫染色, 为期3周。这个数字已经从 Lee 等人的修改.点击这里查看这个数字的更大版本.

Figure 3
图 3: 在体内和各种启动子的体外抑制的 remote 控制系统.(a) 在vilin-mkate2转基因小鼠 (vilmkate2) 中, 将 Repron 序列 (r *) 的早期版本插入维林启动子的一个内含子下游。对有或没有 Lacigy抑制剂的小鼠小肠中Mkate2的表达进行了 qrt-pcr 分析。每个条形图表示来自不同鼠标的数据。(b) 有和没有lacigy表达的小肠共聚焦 mkate2 图像。(c) 在不同的启动子和一个荧光素酶记者之间插入了六个对称 lac 算子 (s)。以 1: 1 摩尔比的方式将记者 (96 孔板中的 50 ng\ 井) 和抑制质粒临时引入 nih t3 细胞。转染后24小时评估荧光素酶值。这些体外数据代表了lacigy表达细胞中荧光素酶表达的百分比, 相对于那些表达非功能性拉西(nflaci) 的细胞。t 检验被用来确定统计意义。数据表示平均值±SEM (n = 3)。*p ≤0.05, * * p ≤0.01。这个数字已经从 Lee 等人的修改.点击这里查看这个数字的更大版本.

Figure 4
图 4: dnmt1在体外和体内表达的向下和向下的提高。(A)采用基因靶向和电穿孔的方法, 在培养的 Esc 中设计了完整的 remote 控制系统。Dnmt1表达的最大抑制是在没有治疗的情况下实现的, 而最大的激活是通过 Iptg 和 dox 治疗实现的。数据表示平均值±SEM (n = 3)。*p≤0.05 , * * P≤0.01 (韦尔奇的 t-试验)。(b) remote 控制系统在体内激活 Dnmt1, remote 控制小鼠在各种组织中对dnmt1蛋白进行免疫染色就证明了这一点。Lgt等位基因代表dnmt1的启动子修改, 以包含lac算子和tet激活剂结合位点。小鼠接受了一个月的正常或含多克饮食 (5000 mg/kg Doxycycline Hyclate) 治疗。这个数字已经从 Lee 等人的修改.点击这里查看这个数字的更大版本.

Supplementary Figure 1
补充图 1: 着陆台插入小鼠 Dnmt1内压子1的示例.(a) 着陆场插入 dna 模板示意图, 改编自 quadros 等人 (2015年)31。异型Loxp 位点, Jt15 和 Lox2272, 由一个短的间隔序列 (sp) 分离, 并由与目标基因组区域同源的 60 bp dna 两侧。(b) 使用以下 SGRNA 将着陆板插入Dnmt1内含子的样品 DNA 模板: ctagtaccctgtacg (针对反向链)。步骤1.1 对选定的中而已区进行了生物信息通报, 并使用 CRISPOR29对 sgRNA 进行了鉴定。(c) pcr 引物设计示例, 用于评估着陆场的插入情况。PCR 引物是在模板同源臂之外设计的, 以确认与内源性 Dnmt1的集成。野生型 PCR 放大器为 213 bp;插入后, 它将成为 291 bp. 请点击这里查看此图的较大版本.

Discussion

remote 控制系统的一个关键步骤和潜在限制是在不影响目标基因表达的情况下插入抑制剂和/或激活剂结合位点所带来的挑战。我们最初的抑制方法, 适用于dnmt1基因, 包括在转录关键区域内插入乳酸抑制结合位点的启动子。为了降低影响启动子功能的风险, 从而提高 remote 控制系统的普遍适用性, 我们开发了一种基于内部的抑制方法。我们增强的 lac系统的效力使我们能够严格地抑制所有强启动子的转录, 我们在转录起始位下游数百到几千基酶的运算符中测试过这些启动子 (3a-c)10. 重要的是, 抑制的程度与促进者的转录强度无关 (图 3a–c)10。这表明, 我们基于内部的压制系统的压制能力超过了被测试的促进者的转录强度。在这种基于内的方法中, 抑制很可能是通过转录伸长机制和 lac 抑制剂57这两个成分之间的物理干扰来介导。这种简单的抑制机制和基于内的方法所证明的稳健性可能会使这种方法普遍适用于不同的基因、组织和生物体。

remote 控制系统的控制要求转位剂结合序列接近目标基因启动子, 这就带来了影响启动子功能的风险。然而, 我们发现绑定序列的位置可以在转录临界区域之外。从位于转录起始点上游的几百个碱基中,对 Dnmt1ef1 α启动子进行了有力的放大.这种松弛约束极大地降低了在没有转化剂的情况下影响目标基因启动子功能的机会。增加结合序列的数量和/或使用更强的转化剂可以帮助进一步降低风险, 使更远的地点更远离转录起始位点的位置上进行增强。

我们的 remote 控制系统提供了对内源基因表达的水平、时间和位置的优雅控制, 允许测试表型的可逆性和不同表达水平的后果, 而这是不容易实现的目前体内基因表达控制技术。需要注意的是, 在包括我们在内的大多数基因表达分析中, 表达值代表了细胞群体的平均值, 其中可以发现相当大的差异。这种异质性可能会影响细胞决策过程, 如分化或凋亡58。尽管额外的基因工程 59可能会进一步提高基因表达控制的精度, 但我们目前系统的观测到的效力将使我们能够在许多生物环境中对基因功能进行有益的研究。此外, 由于操作序列的复杂性以及哺乳动物与监管成分的原始物种之间的进化距离大, 预计目标特异性会很高。此外, 转基因小鼠系的抑制剂和激活剂可以开发和应用于任何内源基因。例如, 现有的 tet转位动物模型可以被调整为在所需的小鼠组织中完成目标基因的增加。我们最近开发了一条转基因线, 通过将lacgy基因引入 Hipp11 位点 48, 可以在多个组织类型中驱动增强 lac 抑制剂的增强型组织特异性表达 在 Loxs-stop-lox 元素的控制下 (未发布)。这条线路将大大便利 remte 控制系统的组织特异性应用。

与目前诱导的转基因方法相比, remte 控制系统的基因控制提供了几个优点。它不需要生成多个转基因线来测试插入的位置效果, 因为它利用内源性位点。此外, 这种方法非常适合具有强基线表达的基因的提升, 因为它增强了已经强大的启动子的表达, 而传统的转基因模型依赖于最小的病毒启动子。最后, 我们的方法可以保留目标基因的组织特异性、细胞周期控制和剪接变体, 因为它保留了自然调节的元素, 如先天的 cis-调控元素。crispr· cicpr 介导的基因靶向技术的出现将极大地促进这一技术在各种模型系统中的应用。

Disclosures

PWL 是安卓dx 和后代公司的科学咨询委员会成员。

Acknowledgments

我们感谢已故的海蒂·斯库夫医生慷慨赠送了哺乳动物 lacI 基因结构 (明尼苏达州罗切斯特梅奥诊所), 丹尼尔·卢沃德医生 (法国巴黎居里研究所) 提供了维林推广人员, 劳里·杰克逊-格鲁斯比医生 (儿童医院,波士顿, 马萨诸塞州) 为她的贡献, 这项技术开发的早期阶段。我们感谢吴南茜博士和罗伯特·马克森博士在产生转基因和淘汰赛小鼠方面提供的帮助。我们感谢莱尔德实验室成员的有益讨论和支持。这项工作得到了国家卫生研究院 [R01 CA75090、R01 DA030325、R01 CA157918 和 R01 CA212374 至 p. w. l. 和1F31CA21397-01A1 至 n. a. v. s] 的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
B6C3F1/J The Jackson Laboratory 100010 https://www.jax.org/strain/100010
Cas9 Protein PNA Bio CP04 http://www.pnabio.com/products/CRISPR_Cas9.htm?gclid=EAIaIQobChMIsoG8pLL33QIVBr7ACh0naQ4dEAAYAiAAEgKyHvD_BwE
CRISPOR Haeussler et al. 2016 http://crispor.tefor.net/
Doxycycline-Containing Mouse Diet Envigo Varies by concentration https://www.envigo.com/products-services/teklad/laboratory-animal-diets/custom-research/doxycycline-diets/
ENCODE Database Stanford University https://www.encodeproject.org/
iCre mRNA synthesis plasmid (pBBI) Addgene 65795 https://www.addgene.org/65795/
IPTG GoldBio I2481C https://www.goldbio.com/search?isSearch=Y&q=iptg
pGL3-Basic Promega E1751 https://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-vectors-and-cell-lines/pgl3-luciferase-reporter-vectors/?catNum=E1751
SVM-BPfinder Regulatory Genomics, Pompeu Fabra University http://regulatorygenomics.upf.edu/Software/SVM_BP/
TiProD: Tissue specific promoter Database Department of Bioinformatics, UMG, University of Göttingen  http://tiprod.bioinf.med.uni-goettingen.de
UCSC Genome Browser University of California Santa Cruz https://genome.ucsc.edu/

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遗传学 第145期 转录 表达 可逆 乳酸抑制 tet 激活剂 Dnmt1 抑制 基因调控 诱导
remtoe 控制系统在内源基因表达调控中的应用
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Vander Schaaf, N. A., Oghamian, S.,More

Vander Schaaf, N. A., Oghamian, S., Park, J. A., Kang, L., Laird, P. W., Lee, K. H. In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression. J. Vis. Exp. (145), e59235, doi:10.3791/59235 (2019).

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