Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

In vivo anvendelse af sen-kontrol-System for Manipulation af endogene genekspression

Published: March 29, 2019 doi: 10.3791/59235
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, 1
1Center for Epigenetics, Van Andel Research Institute, 2Amgen

Summary

Denne protokol beskriver de nødvendige skridt for at generere en modelsystem hvor transkription af en endogen gen af interesse betinget kan styres i levende dyr eller celler ved hjælp af forbedrede lac repressor og/eller tet aktivator systemer.

Abstract

Her beskriver vi en protokol for at gennemføre ordningen fjernbetjening (Reversible Manipulation of Transcription på Endogenous loci), som giver mulighed for reversible og afstemmelige udtryk kontrol af en endogene gen af interesse i levende model systemer. Fjernbetjening system beskæftiger udvidede lac undertrykkelse og tet aktivering systemer at opnå ned- eller Opregulering af et target gen inden for en enkelt biologisk system. Stram undertrykkelse kan opnås fra repressor bindende websteder fleksibelt beliggende langt neden for en transskription startsted ved at hæmme transskription brudforlængelse. Robust Opregulering kan nås ved at forbedre transskription af en endogen gen ved at målrette tet transcriptional aktivatorer til beslægtet initiativtageren. Denne reversible og afstemmelige udtryk kontrol kan anvendes og trukket tilbage gentagne gange i organismer. Styrken og alsidigheden i systemet, som demonstrerede for endogene Dnmt1 her, vil give mere præcise in vivo funktionelle analyser ved at aktivere undersøgelse af genfunktioner på forskellige udtryk og ved at teste reversibilitet af en fænotype.

Introduction

Genetiske knockout eller transgene tilgange har været effektive midler til at studere genfunktion i dyremodeller. Dog udtryk regulering af disse tilgange er dikotome (tænd/sluk), ikke-temporale, og er således ikke i stand til at afsløre den komplette funktionelle spektrum af et gen. Betinget Cre/LoxP teknologier har tilladt spatio-temporale inaktivering eller aktivering af genfunktioner, men deres dikotome natur fortsat at udgøre begrænsninger, såsom celle dødelighed og uigenkaldelighed1,2 , 3. for at udfylde dette tomrum, betinget knockdown metoder er blevet udviklet ved hjælp af tet-reguleret shRNA eller miRNA4. Men ud-target effekter fortsat en bekymring for RNAi5 og har udfordrende for at styre in vivo. For nylig, CRISPR/Cas-medieret transcriptional-kontrol teknologier har indførte en mere alsidig tilgang til at opnå både op- og downregulation af endogene genekspression og demonstreret deres utilities6,7 . Dog, effektiviteten af CRISPR/Cas-medieret transcriptional kontrol er endnu uklart i vivo, og reversibiliteten af KRAB-baserede undertrykkelse mangler for at blive set, så stærk undertrykkelse af KRAB og dens interagerende protein KAP1 har vist sig at fremkalde permanent genhæmning8,9.

For at imødegå disse begrænsninger, har vi udviklet en roman transcriptional regulerende system kan betinget kontrollere endogene genekspression i en reversibel og afstemmelige måde i mus bruger manipuleret prokaryote binære transcriptional reguleringssystemer10. Prokaryote binære transcriptional reguleringssystemer med regulerende ligander såsom lac og tet, har aktiveret sådan reversible og afstemmelige udtryk styre11,12,13, 14. imidlertid den utilstrækkelige undertrykkelse styrken af de aktuelle binære systemer har hæmmet deres brede vedtagelse for at kontrollere endogene genekspression hos pattedyr. Vi udviklet en forbedret lac undertrykkelse system tilstrækkeligt potent til undertrykkelse af endogene gener og ansat en roman strategi rettet mod tet transcriptional aktivatorer direkte til den beslægtet fortaler for en endogen gen at opnå robust Opregulering (figur 1)10. Med denne teknologi, har vi opnået næsten to størrelsesordener udtryk kontrol af den endogene Dnmt1 gen i en afstemmelige, inducerbar og reversibel måde10. Her giver vi trinvise instruktioner til stævningen in vivo til andre gener og organismer ved hjælp af mus som en model art.

Figure 1
Figur 1 : Oversigt over fjernbetjening systemet. Transskription af en endogen target gen kan reguleres ved hjælp af konstruerede lac repressor og tet aktivator systemer. Target gen promotor eller intron er udviklet til at indeholde operatorer for tight bindende LacIGY repressor og/eller rtTA-M2 aktivator. R angiver Repron (Repression intrpå), som indeholder 12 symmetrisk lac operatører (S) plus en delvis kanin beta-globin intron. T angiver tet operatør. Repressor og aktivator/udtrykkes fra en væv-specifikke promotor. Udtryk af target-genet kan derefter reversibelt tunet til det ønskede udtryk niveau af administration af IPTG (isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, en antagonist af LacIGY repressor) eller doxycyclin (Dox). Dette tal er blevet ændret fra Lee et al.10venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Før du begynder denne protokol, anmeld tabel 1 for at identificere de relevante trin for den ønskede kontrol af genekspression. For eksempel for at ingeniør en mus, der muliggør reversibel downregulation af "Gen X", udfylde rubrik 1, 3 og 4 i den nedenfor protokol. Tabel 1 også opsummerer de nødvendige komponenter til fjernbetjening systemet.

Ønskede udtryk ændring Undertrykkelse kun Aktivering kun Både undertrykkelse og aktivering
Relevante dele af protokollen 1, 3-4 2-4 1-4
Fjernbetjening sekvens i Target gen Repron ("Undertrykkelse intron"; 12 symmetrisk lac operatører plus en delvis kanin beta-globin intron) Tet operatører Repron og Tet operatører
Fjernbetjening sekvens placering Intron Promotor Intron & promotor
Aktivator/Repressor behov for ønskede kontrol LacIGY Repressor rtTA-M2 aktivator LacIGY Repressor og rtTA-M2 aktivator
Regulerende ligander IPTG Doxycyclin IPTG og/eller doxycyklin

Tabel 1: Oversigt over fjernbetjening komponenter.

Protocol

Alle dyr procedurer blev gennemført med godkendelse af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) på University of Southern California og Van Andel Research Institute og i overensstemmelse med vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr fra de nationale kontorer i sundhed15.

1. ændre gen af interesse for undertrykkelse af fjernbetjening

  1. Ved hjælp af retningslinjerne nedenfor, identificere en transcriptionally inert intron mod 5' slutningen af gen af interesse for indsættelse af Repron sekvens ("Repression intrpå"; 12 symmetrisk lac operatører plus en delvis kanin beta-globin intron). Være opmærksom på alternative initiativtagere til gen af interesse, og vælg en intron ifølge transcript(s) skal kontrolleres (dvs. en intron deles af alle udskrifter eller en bestemt til en ønskede udskrift).
    Bemærk: For gener uden en intron eller med dem mod 3'-enden, Indsæt Repron sekvens i selskabet (Se Lee, et al.10 for en detaljeret procedure).
    1. Få genomisk sekvensen for gen af interesse.
      1. Naviger til UCSC genom Browser16,17, og vælg det seneste udkast til musen genomet (mus GRCm38/mm10 på tidspunktet for offentliggørelse), der er i øjeblikket under fanen genomer .
      2. Skriv det navn eller symbol på gen af interesse i den ransage advokatstanden at se udskrifter for genet. Klik på gå.
      3. Vælg den ønskede udskrift variant til gen af interesse.
      4. Klik på gen-symbolet ud for udskrift variant af interesse (symbolet på den tidligere valgte udskrift vil være i en mørk kasse).
      5. Klik på linket Genomisk sekvens under banneret sekvens og Links til værktøjer og databaser .
      6. Sekvens hentning Region indstillinger, Vælg kun Exons (5' UTR, cd'er, og 3' UTR), introner og standard én FASTA post pr. gen. Sekvens formatering indstillinger, Vælg Exons med store bogstaver, alt andet i små bogstaver og Maske gentager til N (at skjule gentagne sekvenser). Klik derefter på Send.
      7. Gemme denne rækkefølge, bevare øvre - og små formatering i et dokument eller program, der kan blive kommenteret.
    2. Undgå afbrydelse af CpG øer, hvilket kan indikere regioner med gen regulerende funktion.
      Bemærk: Selv om en 5' intron er at foretrække frem for indsættelse af Repron sekvens, den første intron kan indeholde transcriptional regulerende elementer såsom CpG øer (undersøgt i dette trin) eller forstærker elementer (undersøgt i trin 1.1.4), som skal undgås for Repron indsættelse.
      1. Vælg Vis for CpG øer spor under banneret udtryk og regulering af UCSC genom-Browser, og klik på Opdater.
      2. Zoome ind på 5' introns, klik på hver CpG ø (vist med grønt på tidspunktet for offentliggørelsen hvis tilstede), og vælg Vis DNA for denne funktion.
      3. Når du har valgt maske gentager til N, skal du vælge få DNA til at få CpG ø sekvens.
      4. Overlay disse sekvenser med filen oprindelige rækkefølge, og anmærke disse som intronic regioner at undgå på grund af mulige gen regulerende funktioner.
    3. Undgå afbrydelse af ikke-kodende RNA'er, hvis de har en regulerende funktion.
      1. Vælg Vis GENCODE (Ensembl) spor under banneret gener og gen forudsigelser af UCSC genom-Browser, og klikke på Opdater.
      2. Du zoomer ind på 5' introns, klik på hver ikke-kodende RNA (vist med grønt på tidspunktet for offentliggørelsen hvis tilstede), og få DNA-sekvens for hver ved at klikke på dets kromosomale koordinater.
      3. I dropdown menuen, Vælg DNA, og klik på maske gentager til N. Klik derefter på få DNA.
      4. Overlay disse sekvenser med filen oprindelige rækkefølge, og anmærke disse som intronic regioner at undgå på grund af mulige gen regulerende funktioner.
    4. Undgå intronic regioner med forstærker signaturer i tissue(s) af interesse, såsom H3K4me1, H3K27ac og DNase jeg overfølsomhed18,19,20,21, samt CTCF bindende websteder, der regulerer enhancer looping22,23.
      1. Navigere hen til INDKODE database24,25, og Vælg ikonet eksperimenter .
      2. Vælg ChIP-seq eller DNase-seqtypen assay, og udfylde de andre kategorier (organisme, Biosample type, osv.) efter cellerne til at blive manipuleret.
      3. Efter valg af funktion, svæve over piktogrammer i blå, og vælg den ene som Vis resultater som liste vises (længst til venstre piktogram på tidspunktet for offentliggørelsen).
      4. Vælg datasæt for mål af H3K4me1, H3K27ac, DNase jeg, og CTCF, der bedst matcher cellerne til at blive manipuleret.
      5. Inden for hver relevant datasæt, rulle ned til afsnittet filer , kontrollere, at mm10 (eller den nyeste genom version) og UCSC er markeret, og klik på knappen Visualiser .
      6. Nu i UCSC genom Browser og zoomer ind på 5' introner for gen af interesse, klik på hver H3K4me1, H3K27ac, DNase jeg, og CTCF peak i deres respektive kommenteret peak spor.
      7. Få DNA-sekvens for hver peak region ved at klikke på dets kromosomale koordinater.
      8. I dropdown menuen, Vælg DNA, og klik på maske gentager til N. Klik derefter på få DNA.
      9. Overlay disse sekvenser med filen oprindelige rækkefølge, og anmærke disse som intronic regioner at undgå på grund af mulige gen regulerende funktioner.
    5. Undgå forstyrrelser af konsensus splejsning sekvenser, så ikke at blande sig med passende splejsning af exons.
      Bemærk: Selvom sekvenser kræves til splejsning er stort set begrænset til omkring seks baser i 5' slutningen af en intron26 og ca. 60 baser på 3' ende27, er det tilrådeligt at vælge en stor intron, giver mulighed for væsentligt bredere marginer fra disse konsensus regioner til at minimere sandsynligheden for påvirker splicing. Brug af intron analyseværktøjer, som SVM-BPfinder28, anbefales en mere grundig analyse af potentielle splice sekvenser.
  2. Efter at identificere et intronic område, opfylder de ovenstående kriterier (som eksemplificeret for Dnmt1 i de supplerende data), skærm sekvensen ved hjælp af en online sgRNA design værktøj til at identificere en sgRNA i regionen med høj specificitet og forudsagt effektivitet score.
    1. Navigere til en online sgRNA designværktøj af valg, som CRISPOR29.
    2. Angiv rækkefølgen af den intronic region af interesse, angive det relevante reference genom, og vælg ønskede Protospacer tilstødende motiv (PAM). Klik på Send.
    3. Sortere de forudsagte sgRNAs af specificitet score, og vælg en eller flere sgRNAs, der også har en høj forventede effektivitet score29.
      1. Valgfrit: For at maksimere sandsynligheden for ved hjælp af en effektiv sgRNA, først teste kavalergang effektiviteten af flere top-scoring sgRNAs i en in vitro assay30, og Fortsæt med den mest effektive sgRNA in vivo.
  3. Designe en DNA-skabelon indeholder en PITT (Pronuclear injektion-baserede målrettede transgenese) landing pad sekvens, som eksemplificeret i supplerende figur 1A, B, flankeret på begge sider af 60-base homologi arme, der svarer til den sgRNA klippe site31 .
    Bemærk: Landing pad indeholder to Heterotypiske loxP websteder (JT15 og Lox2272) og giver mulighed for målrettede indsættelse af store sekvenser gennem en totrinsstrategi; Sørg for at knudepunkter for denne indsættelse ikke skaber kryptiske splice websteder. Alternativt, en embryonale stamceller (ESC) - baseret knock - strategi kan bruges til at indsætte Repron sekvens direkte.
  4. Forberede sgRNA, Cas9 protein og enkeltstrenget DNA (ssDNA) skabelon for landing pad, og microinject i befrugtede æg (fra B6C3F1/J mus eller andre ønskede stamme) Ifølge etablerede protokoller32,33.
  5. Skærm for mus med pad-knock-i landing.
    1. Designe PCR primere supplerende genomisk locus, men uden for de regioner, der er målrettet af homologi arme, som demonstrerede for Dnmt1 i tillægs figur 1 c. Undgå gentagne genomiske sekvenser, når du udformer primere.
    2. Uddrag DNA fra hale klip af mus efter fastlagte protokoller34.
    3. Bruge PCR og gel elektroforese for at identificere mus med en landing pad indsættelse.
    4. Bekræft, at knock-i var vellykket ved sekventering af PCR-produkter.
      Bemærk: Uønskede store sletninger og rearrangementer kan indføres ved CRISPR/Cas935, så omhyggelig, screening for off-target redigering anbefales før proceduren35,36,37.
  6. Ved hjælp af befrugtede æg fra landing pad mus, microinject iCre mRNA38 og en transgene plasmid som indeholder Repron sekvens flankeret af JTZ17 og Lox2272 rekombination websteder31,39,40, 41 i henhold til etablerede metoder38,42,43.
  7. Skærm for mus med Repron indsættelse.
    1. Design PCR primere supplerer den genomisk locus, uden for Repron indsætte. Undgå gentagne genomiske sekvenser, når du udformer primere.
    2. Uddrag DNA fra hale klip af mus efter fastlagte protokoller34.
    3. Bruge PCR og gel elektroforese for at identificere mus med en Repron indsættelse.
    4. Bekræfte knock-i var vellykket ved sekventering af PCR-produkter.

2. ændre gen af interesse for opregulering af fjernbetjening

  1. Ved hjælp af retningslinjer nedenfor, identificere en region i promotor af gen af interesse, det er usandsynligt at forurolige promotor funktion ved indsættelse af tet operatør sekvenser. Være opmærksom på alternative initiativtagere til gen af interesse, og vælg en promotor ifølge transcript(s) skal kontrolleres (dvs. en promotor, deles af alle udskrifter eller en bestemt til en ønskede udskrift).
    1. Få genomisk sekvensen for promotor af interesse.
      1. Naviger til UCSC genom Browser16,17, og vælg det seneste udkast til musen genomet (mus GRCm38/mm10 på tidspunktet for offentliggørelse), der er i øjeblikket under fanen genomer .
      2. Skriv det navn eller symbol på gen af interesse i den ransage advokatstanden at se udskrifter for genet. Klik på gå.
      3. Vælg den ønskede udskrift variant til gen af interesse.
      4. Klik på gen-symbolet ud for udskrift variant af interesse (gen symbol på den tidligere valgte udskrift vil være i en mørk kasse).
      5. Klik på linket Genomisk sekvens under banneret sekvens og Links til værktøjer og databaser .
      6. Sekvens hentning Region indstillinger, Vælg kun promotor/Upstream af 1000 baser. Sekvens formatering indstillinger, Vælg Maske gentager til N (at skjule gentagne sekvenser). Klik derefter på Send.
      7. Gem denne promotor sekvens i et dokument eller program, der kan blive kommenteret.
    2. Udvalgte områder, som er fri for formodede transskription faktor bindingssteder, som afbryder disse sekvenser kan ændre endogene genekspression.
      1. Naviger til UCSC genom-Browser, og Åbn den seneste version af musen genom.
      2. Ovenstående kortlægning og sekventering banneret, Vælg spore hubs.
      3. Klik på mm10 ud for navnet hub JASPAR 2018 TFBS (eller den nyeste JASPAR version).
      4. Skriv det navn eller symbol på gen af interesse i den ransage advokatstanden at se udskrifter for genet. Klik på gå.
      5. Vælg den ønskede udskrift variant til gen af interesse.
      6. Rul ned til JASPAR 2018 TFBS banner, og klik på rullepilen for at vælge den ønskede visning mulighed for spor, såsom klemme. Klik på Opdater.
      7. Zoom ind på regionen promotor af gen af interesse, og identificere regioner, som er gratis (eller relativt fri) af transskription faktor bindingssteder ifølge JASPAR spor. Optage de kromosomale koordinaterne for disse regioner.
      8. Få genomisk rækkefølgen af disse kromosomale koordinater ved at skrive dem i den ransage advokatstanden og klikke på go. I dropdown menuen, Vælg DNA, og klik på maske gentager til N. Klik derefter på få DNA.
      9. Overlay disse sekvenser med filen oprindelige rækkefølge, og anmærke disse som ideelle promotor regioner at målrette på grund af manglende transskription faktor bindende.
    3. Vælg en perturbable promoter-region, som er opstrøms men nær transskription startstedet for gen af interesse inden for disse sekvenser.
      Bemærk: En indføring, der er for tæt på startstedet transskription kan øge chancen for forringer promotor aktivitet, men en indsættelse, der er for langt kan nedsætte niveauet af Opregulering. Indsætte tet operatør sekvenser omkring 200 basepairs opstrøms af webstedet transskription start har resulteret i robust opregulering af de to initiativtagere testet (Se diskussion)10.
  2. Skærmen valgte promotor-regionen ved hjælp af en online sgRNA designværktøj til at identificere en sgRNA i regionen med høj specificitet og forventede effektivitet score.
    1. Navigere til en online sgRNA designværktøj af valg, som CRISPOR29.
    2. Angiv rækkefølgen af det pågældende område, angive det relevante reference genom, og vælg ønskede Protospacer tilstødende motiv (PAM). Klik på Send.
    3. Sortere de forudsagte sgRNAs af specificitet score, og vælg en eller flere sgRNAs, der også har en høj forventede effektivitet score29.
      1. Valgfrit: For at maksimere sandsynligheden for ved hjælp af en effektiv sgRNA, først teste kavalergang effektiviteten af flere sgRNAs i en in vitro assay30, og Fortsæt med den mest effektive sgRNA in vivo.
  3. Designe en DNA-skabelon, der indeholder tet operatører flankeret på begge sider af 60-base homologi arme, der svarer til den sgRNA klippe site31,33.
    Bemærk: Antallet af tet operatører kan tilpasses; indsættelse af to til fire tet operatør sekvenser i tandem har tidligere vist sig at være effektiv, men i princippet flere operatører er ønskeligt, at køre højere udtryk. Alternativt, en ESC-baserede knock-i strategien kan bruges til at indsætte tet operatorer.
    1. Valgfrit: For eksperimentelle beviser at de foreslåede ændringer sandsynligvis ikke vil forstyrre den endogene transcriptional aktivitet af gen af interesse, klon manipuleret promotor sekvens i en firefly luciferase vektor (som pGL3-Basic), og sammenligne sin effektivitet til den oprindelige initiativtager ved hjælp af en luciferase assay.
  4. Forberede sgRNA, Cas9 protein, og skabelonen ssDNA indeholdende tet operatør sekvenser, og microinject i befrugtede æg (fra B6C3F1/J mus eller andre ønskede stamme) Ifølge etablerede protokoller32,33.
    Bemærk: På grund af kompleksiteten af syntetisere en gentagen sekvens, anbefales en in vitro-transskription/reverse transkription-baseret tilgang til at syntetisere en ssDNA skabelon fra en dobbelt-strenget DNA (dsDNA) plasmid44. Alternativt, en dsDNA skabelon kan bruges til mikroinjektion, men knock-i effektivitet kan blive reduceret45.
  5. Skærm for mus med knock-i tet operatører.
    1. Design PCR primere supplerer den genomisk locus, uden for de regioner ramt af homologi arme. Undgå gentagne genomiske sekvenser, når du udformer primere.
    2. Uddrag DNA fra hale klip af mus efter fastlagte protokoller34.
    3. Bruge PCR og gel elektroforese for at identificere mus med indsættelse af tet operatører.
    4. Bekræft, at knock-i var vellykket ved sekventering af PCR-produkter.
      Bemærk: Uønskede store sletninger og rearrangementer kan indføres ved CRISPR/Cas935, så omhyggelig, screening for off-target redigering anbefales før proceduren35,36,37.

3. udvikle activator - og/eller at udtrykke repressor mus

  1. Identificere en håndfast udtrykker promotor for tissue(s) eller cellen type(r) af interesse.
    Bemærk: En litteratursøgning og væv-specifikke promotor Database46 kan være nyttig til at identificere sådan en promotor.
  2. Placer forudsat forbedret lac repressor eller tet aktivator sekvens nedstrøms for den ønskede initiativtageren til at generere en transgene konstruktion.
  3. Producere de Transgene mus eller ved hjælp af transgene standardprocedurer42,43,47. Alternativt, en lokationsspecifik transgenese tilgang kan bruges til at undgå holdning effekter og tillade enkelt-kopi transgen indsættelse31,48.
  4. Udbrede grundlæggerne, og fastlægger de udtryk mønster og niveau af transgenet i afkom af hver grundlægger. Vælg linjer med robust udtryk i den eller de påtænkte væv typer til videre avl.
    1. Opdrætte stiftere til vildtype mus.
    2. Design PCR-primere, som vil afsløre indsættelse af aktivator og/eller repressor.
    3. Uddrag DNA fra hale klip af afkom efter fastlagte protokoller34.
    4. Bruge PCR og gel elektroforese for at identificere mus med indsættelsen.
    5. Bekræfte transgen indsættelse af sekventering af PCR-produkter.
    6. Propogate transgene linjerne.
    7. Ofre et par unger fra hver linje, og indsamle væv af interesse for qRT-PCR, immunhistokemi og western blotting for at analysere udtryk for gen/protein af interesse i target væv type(r).
    8. Marker linjerne med de stærkeste udtryk i væv af interesse til brug i afsnit 4.

4. manipulere genekspression in vivo

  1. Avle mus med det ændrede gen af interesse (afsnit 1 og/eller 2) med de Transgene mus fra afsnit 3 Ifølge etablerede avls praksis49. For maksimal udtryk kontrol, avle mus til homozygocitet for den modificerede allel.
  2. For tilbagefald eller justering af undertrykkelse af target-genet, administrere IPTG i drikkevandet.
    1. Bestem eksperimentelt dosis af IPTG til brug ved behandling af musene passende genotype og kontrollen med en af en række doser (anbefalet start interval: 0-400 mM IPTG) for mindst én uge50,51. Omfatter mindst tre mus pr. behandling gruppe, og vælg den alder og køn af mus der er mest relevante for de planlagte fremtidige eksperimenter. Bemærk: Ynglende par af mus kan behandles med IPTG vand til at give afkommet, hvis det ønskes13udviklingsmæssige eksponering af IPTG eller mus kan begynde behandling nogen tid efter fødslen.
      1. Opløse den ønskede massen af IPTG i sterilt destilleret vand på dag i administration, og omrøres med en røre bar i 5 minutter eller indtil helt opløst.
      2. Wrap flaske med folie, og administrere IPTG vand i en lys-beskyttet flaske. Erstatte to gange om ugen. Yde den samme kilde af vand til mus modtage 0 mM IPTG.
      3. Efter mindst en uge, ofrer mus og analysere udtryk for gen af interesse i mål tissue(s) ved hjælp af qRT-PCR, immunhistokemi og western blotting.
      4. Identificere den dosis, der genskaber gen af interesse udtryk som vildtype kontrol, og bruge denne dosis til at opnå normal udtryk af genet i fremtidige eksperimenter.
  3. Til induktion af genet Opregulering, administrere doxycyclin (Dox) i kosten.
    1. For at eksperimentelt bestemmes koncentrationen af Dox at administrere, behandle mus af passende genotype og kontrollen med en af en række af Dox koncentrationer (anbefalet start interval: 0 – 5000 mg/kg doxycyclin hyclat) for mindst én uge52 ,53, herunder mindst tre mus pr. behandling gruppe. Købe Dox-holdige mus mad fra en kommerciel leverandør.
      Bemærk: Ynglende par af mus kan behandles med Dox mad give afkom hvis det ønskes54,55, udviklingsmæssige eksponering af Dox eller mus kan begynde behandling nogen tid efter fødslen.
    2. Erstatte kost en gang om ugen. Yde den samme base kost til mus modtage Dox-fri fødevarer.
    3. Efter mindst en uge, ofrer mus og analysere udtryk for gen af interesse i mål tissue(s) ved hjælp af qRT-PCR, immunhistokemi og western blotting.
    4. Identificere den dosis, der hæver gen af interesse udtryk til det ønskede niveau, og bruge denne dosis til at opnå overekspression af genet i fremtidige eksperimenter.

Representative Results

Den undertrykkelse evne til fjernbetjening system er blevet påvist i to forskellige tilgange hidtil. I den første fremgangsmåde, blev lac repressor bindingssteder indsat på den endogene promotor af Dnmt1 -genet. I den anden tilgang, som anbefales af denne protokol, blev repressor bindingssteder indsat i en downstream intron at undgå den potentielle risiko for at påvirke promotor funktion ved indsættelse og dermed at forenkle anvendelsen af fjernbetjeningen system. Begge strategier resulterede i vellykkede undertrykkelse (figur 2A, B og figur 3A-C)10. Dnmt1 udtryk var undertrykt til 15% af de uregulerede niveauer ved hjælp af metoden promotor-baseret (fig. 2A). Denne stramme undertrykkelse var vendt i en dosisafhængig måde af behandle musene med varierende mængder af IPTG (fig. 2A). Den observerede Dnmt1 undertrykkelse blev valideret på protein-niveau ved immunfarvning (figur 2B). Vi ikke observere nogen mærkbar forskel i Dnmt1 udtryk mellem Dnmt1+/ + og Dnmt1LO/LO mus, bekræfter, at vores lac operatør indsættelse ikke havde forstyrret normale promotor funktionen10. Intron-baserede tilgang opnåede mere end 90% undertrykkelse fra operatører ligger flere kilobases nedstrøms i transskription start site af formildende omskrivning brudforlængelse (fig. 3A, B)10. Denne intron-baserede tilgang var yderligere valideret på syv ekstra robust initiativtagere (figur 3C). Altid stramme undertrykkelse blev opnået fra alle initiativtagerne testet. Ingen korrelation mellem resterende udtryk og de stærke sider af projektansvarlige blev observeret, hvilket tyder på at undertrykkelse af vores intron-baserede undertrykkelse ordning overstiger transcriptional styrken af alle de robuste initiativtagere vi testet () Figur 3 C).

In vivo Opregulering mulighed for fjernbetjening system blev også demonstreret på Dnmt1 genet. Vi indført to kopier af operatoren tet i Dnmt1 promotor, sammen med lac operatør sekvenser, at give mulighed for enten Opregulering eller downregulation afhængigt af hvilke effektor protein er til stede. Robust Opregulering og downregulation af Dnmt1 udtryk, tæt på to størrelsesordener (10% til 650%), der blev opnået i sektorrådene indeholdende den modificerede endogene Dnmt1 allel (Dnmt1LGT) (figur 4A)10 . Begge forordninger var fuldt reversibel og inducerbar ved IPTG og Dox behandlinger, henholdsvis (figur 4A). Vi indført næste Dnmt1LGT ændring i mus kønscelleoverførsel til test in vivo Opregulering mulighed for fjernbetjening system. Stærk opregulering af Dnmt1 blev observeret fra lever, milt og nyrer, hvorimod ingen påviselige Opregulering i hjertet blev observeret (fig. 4B)7. Cellecyklus-afhængige udtryk mønster af Dnmt1 og knaphed på proliferativ celler i hjertet kan ligge til grund for denne observation10,56. Det er stadig uvist, om denne begrænsning kan overvindes ved at øge niveauet udtryk af aktivator eller antallet af dets bindingssteder.

Figure 2
Figur 2 : In vivo undertrykkelse af Dnmt1 af LacIGY repressor. (A) mus med lac operatører (LO) indsat i Dnmt1 promotor, med eller uden udtryk for LacIGY, blev behandlet med forskellige doser af IPTG. qRT-PCR analyse af Dnmt1 udtryk viser dosisafhængig tilbageførsel af Dnmt1 undertrykkelse in vivo af IPTG behandling. Hver søjle repræsenterer data fra en anden mus. Data repræsenterer gennemsnit ± SEM (n = 3). (B) immunfarvning af Dnmt1 protein i Colon Krypter af mus leveret drikkevand med eller uden 160 mM IPTG i 3 uger. Dette tal er blevet ændret fra Lee et al.10venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : In vivo og in vitro-undertrykkelse af forskellige projektledere fjernbetjening systemet. (A) en tidlig version af Repron sekvens (R *) blev indsat i en intron neden for Villin i en Villin-mKate2 Transgene mus (VilmKate2). qRT-PCR analyse af mKate2 udtryk i tyndtarmen i mus med eller uden LacIGY repressor er vist. Hver søjle repræsenterer data fra en anden mus. (B) Konfokal mKate2 billeder af tyndtarmen med og uden LacIGY udtryk. (C) seks symmetrisk lac operatører (S) blev indsat mellem forskellige projektledere og en luciferase reporter. Journalister (50 ng/godt i 96-brønd plade) og repressor plasmider indført forbigående NIH/3T3 celler i forholdet 1:1 molar. Luciferase værdier blev vurderet 24 h efter Transfektion. Disse in vitro data repræsenterer procentdelen af luciferase udtryk i LacIGY-at udtrykke celler i forhold til dem, der giver udtryk for ikke-funktionelle Lund (NFlacI). T-test blev anvendt til at bestemme Statistisk signifikans. Data repræsenterer gennemsnit ± SEM (n = 3). P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01. Dette tal er blevet ændret fra Lee et al.10venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Ned - og/eller Opregulering af Dnmt1 udtryk in vitro- og in vivo. (A) komplet fjernbetjening systemet blev udviklet i kulturperler sektorrådene af genet målretning og elektroporation tilgange. Maksimal undertrykkelse af Dnmt1 udtryk blev opnået med ingen behandling, mens maksimal aktivering blev opnået ved både IPTG og Dox behandling. Data repræsenterer gennemsnit ± SEM (n = 3). P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01 (Welch's t-test). (B) In vivo aktivering af Dnmt1 af fjernbetjening systemet, som det fremgår af immunfarvning af Dnmt1 protein i forskellige væv fra fjernbetjening mus. LGT allel repræsenterer promotor ændring af Dnmt1 til at indeholde lac operatør og tet aktivator bindingssteder. Mus blev behandlet med en normal eller Dox-holdige kost (5000 mg/kg doxycyclin hyclat) for en måned. Dette tal er blevet ændret fra Lee et al.10venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplementary Figure 1
Supplerende figur 1 : Eksempel på landing pad indsættelse i murine Dnmt1 intron 1. (A) skematisk af DNA skabelon for landing pad indsættelse, tilpasset fra Quadros et al. (2015)31. Heterotypiske loxP sider, JT15 og Lox2272, er adskilt af et kort afstandsstykke sekvens (sp) og flankeret på hver side af 60-bp af DNA, der er homologe til genomisk målområde. (B) prøve DNA skabelon for landing pad indsættelse i Dnmt1 intron ved hjælp af de følgende sgRNA: CTAGTACCACTCCTGTACCG, (som er rettet mod den omvendte strand). Det valgte intronic område var bioinformatically oplyst af trin 1.1, og sgRNA blev identificeret ved hjælp af CRISPOR29. (C) eksempel på PCR primer design for vurdering af indsættelse af landing pad. PCR-primere var designet uden for homologi armene af skabelonen til at bekræfte integration i endogene Dnmt1. Vildtype PCR-amplikon er 213 bp; ved indsættelse, bliver det 291 bp. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Et kritisk trin og potentielle begrænsning af fjernbetjening systemet er udfordringen forbundet med indsættelse af repressor og/eller aktivator bindingssteder uden at påvirke målet genekspression. Vores oprindelige undertrykkelse tilgang, involveret som anvendes til Dnmt1 -gen indsættelse af lac repressor bindingssteder i transcriptionally kritiske regioner af en promotor. For at mindske risikoen for påvirker promotor funktion og dermed til at forbedre den almene gyldighed af fjernbetjening system, vi udviklede en intron-baserede undertrykkelse tilgang. Styrken af vores forbedrede lac systemet tillod os at stramt undertrykke transkription af alle stærke initiativtagerne vi testet på operatører ligger flere hundrede til flere kilobases nedstrøms i transkription starte websteder (fig. 3A-C) 10. vigtigere, undertrykkelse var uafhængig af de transkriptionel styrker af initiativtagere (fig. 3A-C)10. Dette tyder på at undertrykkelse af vores intron-baserede undertrykkelse ordning overstiger transcriptional styrken af de testede initiativtagere. I denne intron-baseret tilgang er det sandsynligt, at undertrykkelsen er medieret gennem fysiske interferens mellem to komponenter, transskription brudforlængelse maskiner og lac repressors57. Denne enkle undertrykkelse mekanisme og demonstreret robustheden af metoden intron-baserede kan gøre denne tilgang generelt gælder for forskellige gener, væv og organismer.

Opregulering af fjernbetjening systemet kræver transaktivatoren bindende sekvenser til at være i nærheden af target gen promotor, hvilket indebærer en risiko for at påvirke promotor funktion. Dog fandt vi, at placeringen af bindende sekvenser kan være uden for regionen transcriptionally kritisk. Både Dnmt1 og EF1α initiativtagerne var håndfast upregulated fra tet operatører ligger et par hundrede baser opstrøms transskription start sites10. Denne afslappet begrænsning reducerer chancen for at påvirke promotor funktion af et target gen i mangel af transaktivatoren. Øge antallet af bindende sekvenser og/eller brug af stærkere transactivators kunne hjælpe yderligere reducere risikoen ved at aktivere Opregulering fra steder længere væk fra startstedet transskription.

Vores fjernbetjening system giver elegante kontrol af niveau, timing og placering af endogene genekspression, giver mulighed for prøvning reversibilitet af en fænotype og konsekvenserne af forskellige udtryk niveauer, der ikke er let opnåeligt ved nuværende in vivo gen expression-adgangskontrol teknologier. Det er vigtigt at bemærke, at i de fleste gen expression analyser, herunder vores, udtryk værdier repræsenterer gennemsnittet af en population af celler blandt hvilke betydelig variation kan findes. Denne forskelligartethed kan påvirke cellulære beslutningsprocesser, såsom differentiering eller apoptose58. Selvom præcision af gen expression kontrol kunne sandsynligvis forbedres yderligere ved yderligere genetiske kredsløb engineering59, vil den observerede styrken af vores nuværende system give nyttige undersøgelse af genfunktioner i mange biologiske sammenhænge. Derudover forventes en høj grad af target specificitet på grund af operatør sekvenser samt store evolutionære afstanden mellem pattedyr og arternes oprindelse på den reguleringsmæssige komponenter60kompleksitet. Derudover kan Transgene mus linjer af repressors og aktivatorer udviklet og ansat for enhver endogene genet. For eksempel, kan eksisterende tet transaktivatoren musemodeller tilpasses for at udføre opregulering af et target gen i de ønskede mus væv. Vi har for nylig udviklet en transgene linje, der kan drive robust væv-specifikke udtryk for vores forbedrede lac repressor i flere vævstyper når de kombineres med eksisterende Cre linjer ved at indføre lacIGY -gen i Hipp11 locus48 under kontrol af en Lox-STOP-Lox element (upubliceret). Denne linje ville væsentligt lette væv-specifikke anvendelse af sen-kontrol-system.

Gen opregulering af fjernbetjening system giver adskillige fordele i forhold til nuværende inducerbar transgene tilgange. Det kræver ikke generation af flere transgene linjer til at teste for position virkningerne af indsættelsen, som det udnytter den endogene locus. Desuden, er denne fremgangsmåde velegnet til opregulering af gener med stærk baseline udtryk, fordi det øger udtryk fra en allerede robuste promotor, mens konventionelle transgene modeller er afhængige af minimal viral initiativtagere. Endelig væv specificitet, celle-cyklus kontrol og splejsning varianter af et target gen kan bevares ved opregulering af vores tilgang, da det bevarer elementer af naturlige regulering som medfødte cis-regulerende elementer. Fremkomsten af CRISPR/Cas-medieret gen-targeting teknologi vil i høj grad lette anvendelsen af denne teknologi i forskellige modelsystemer.

Disclosures

PWL serverer på videnskabelige rådgivende bestyrelser af AnchorDx og Progenity, Inc.

Acknowledgments

Vi takker den sene Dr. Heidi Scrable for hendes generøse gave af pattedyr lacI gen konstruktionen (Mayo Clinic, Rochester, MN), Dr. Daniel Louvard (Institut Curie, Paris, Frankrig) for at give Villin-promotor og Dr. Laurie Jackson-Grusby (children's Hospital, Boston, MA) for hendes bidrag til de tidlige stadier af denne teknologiudvikling. Vi er taknemmelige for Dr Nancy Wu og Dr. Robert Maxson for deres bistand til at generere de transgene og knockout mus. Vi vil gerne takke medlemmerne af Laird laboratorium for nyttige diskussioner og støtte. Dette arbejde blev støttet af den National Institutes of Health [R01 CA75090 R01 DA030325, R01 CA157918 og R01 CA212374 til P.W.L. og 1F31CA213897-01A1 til N.A.V.S].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
B6C3F1/J The Jackson Laboratory 100010 https://www.jax.org/strain/100010
Cas9 Protein PNA Bio CP04 http://www.pnabio.com/products/CRISPR_Cas9.htm?gclid=EAIaIQobChMIsoG8pLL33QIVBr7ACh0naQ4dEAAYAiAAEgKyHvD_BwE
CRISPOR Haeussler et al. 2016 http://crispor.tefor.net/
Doxycycline-Containing Mouse Diet Envigo Varies by concentration https://www.envigo.com/products-services/teklad/laboratory-animal-diets/custom-research/doxycycline-diets/
ENCODE Database Stanford University https://www.encodeproject.org/
iCre mRNA synthesis plasmid (pBBI) Addgene 65795 https://www.addgene.org/65795/
IPTG GoldBio I2481C https://www.goldbio.com/search?isSearch=Y&q=iptg
pGL3-Basic Promega E1751 https://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-vectors-and-cell-lines/pgl3-luciferase-reporter-vectors/?catNum=E1751
SVM-BPfinder Regulatory Genomics, Pompeu Fabra University http://regulatorygenomics.upf.edu/Software/SVM_BP/
TiProD: Tissue specific promoter Database Department of Bioinformatics, UMG, University of Göttingen  http://tiprod.bioinf.med.uni-goettingen.de
UCSC Genome Browser University of California Santa Cruz https://genome.ucsc.edu/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jackson-Grusby, L., et al. Loss of genomic methylation causes p53-dependent apoptosis and epigenetic deregulation. Nature Genetics. 27 (1), 31-39 (2001).
  2. David, G., Turner, G. M., Yao, Y., Protopopov, A., DePinho, R. A. mSin3-associated protein, mSds3, is essential for pericentric heterochromatin formation and chromosome segregation in mammalian cells. Genes & Development. 17 (19), 2396-2405 (2003).
  3. Sumi-Ichinose, C., Ichinose, H., Metzger, D., Chambon, P. SNF2beta-BRG1 is essential for the viability of F9 murine embryonal carcinoma cells. Molecular and Cellular Biology. 17 (10), 5976-5986 (1997).
  4. Premsrirut, P. K., et al. A rapid and scalable system for studying gene function in mice using conditional RNA interference. Cell. 145 (1), 145-158 (2011).
  5. Qiu, S., Adema, C. M., Lane, T. A computational study of off-target effects of RNA interference. Nucleic Acids Research. 33 (6), 1834-1847 (2005).
  6. Gilbert, L. A., et al. Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation. Cell. 159 (3), 647-661 (2014).
  7. Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).
  8. Peng, H., Ivanov, A. V., Oh, H. J., Lau, Y. F., Rauscher, F. J. Epigenetic gene silencing by the SRY protein is mediated by a KRAB-O protein that recruits the KAP1 co-repressor machinery. The Journal of Biological Chemistry. 284 (51), 35670-35680 (2009).
  9. Groner, A. C., et al. KRAB-zinc finger proteins and KAP1 can mediate long-range transcriptional repression through heterochromatin spreading. PLOS Genetics. 6 (3), 1000869 (2010).
  10. Lee, K. H., Oghamian, S., Park, J. A., Kang, L., Laird, P. W. The REMOTE-control system: a system for reversible and tunable control of endogenous gene expression in mice. Nucleic Acids Research. 45 (21), 12256-12269 (2017).
  11. Gossen, M., Bonin, A. L., Bujard, H. Control of gene activity in higher eukaryotic cells by prokaryotic regulatory elements. Trends in Biochemical Sciences. 18 (12), 471-475 (1993).
  12. Hu, M. C., Davidson, N. The inducible lac operator-repressor system is functional in mammalian cells. Cell. 48 (4), 555-566 (1987).
  13. Cronin, C. A., Gluba, W., Scrable, H. The lac operator-repressor system is functional in the mouse. Genes & Development. 15 (12), 1506-1517 (2001).
  14. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  15. Council, N. R. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals: Eighth Edition. , The National Academies Press. (2011).
  16. Casper, J., et al. The UCSC Genome Browser database: 2018 update. Nucleic Acids Research. 46 (1), 762-769 (2018).
  17. Church, D. M., et al. Lineage-specific biology revealed by a finished genome assembly of the mouse. PLOS Biology. 7 (5), 1000112 (2009).
  18. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  19. Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
  20. Heintzman, N. D., et al. Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome. Nature Genetics. 39 (3), 311-318 (2007).
  21. Rada-Iglesias, A., et al. A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature. 470 (7333), 279-283 (2011).
  22. Handoko, L., et al. CTCF-mediated functional chromatin interactome in pluripotent cells. Nature Genetics. 43 (7), 630-638 (2011).
  23. Splinter, E., et al. CTCF mediates long-range chromatin looping and local histone modification in the beta-globin locus. Genes & Development. 20 (17), 2349-2354 (2006).
  24. The ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  25. Rosenbloom, K. R., et al. ENCODE data in the UCSC Genome Browser: year 5 update. Nucleic Acids Research. 41, Database issue 56-63 (2013).
  26. Murray, J. I., Voelker, R. B., Henscheid, K. L., Warf, M. B., Berglund, J. A. Identification of motifs that function in the splicing of non-canonical introns. Genome Biology. 9 (6), 97 (2008).
  27. Taggart, A. J., et al. Large-scale analysis of branchpoint usage across species and cell lines. Genome Research. 27 (4), 639-649 (2017).
  28. Corvelo, A., Hallegger, M., Smith, C. W., Eyras, E. Genome-wide association between branch point properties and alternative splicing. PLOS Computational Biology. 6 (11), 1001016 (2010).
  29. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
  30. Grainger, S., et al. CRISPR Guide RNA Validation In Vitro. Zebrafish. 14 (4), 383-386 (2017).
  31. Quadros, R. M., Harms, D. W., Ohtsuka, M., Gurumurthy, C. B. Insertion of sequences at the original provirus integration site of mouse ROSA26 locus using the CRISPR/Cas9 system. FEBS Open Bio. 5, 191-197 (2015).
  32. Harms, D. W., et al. Mouse Genome Editing Using the CRISPR/Cas System. Current Protocols in Human Genetics. 83, (2014).
  33. Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors. Nature Protocols. 13 (1), 195-215 (2018).
  34. Laird, P. W., et al. Simplified mammalian DNA isolation procedure. Nucleic Acids Research. 19 (15), 4293 (1991).
  35. Kosicki, M., Tomberg, K., Bradley, A. Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements. Nature Biotechnology. 36 (8), 765-771 (2018).
  36. Akcakaya, P., et al. In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations. Nature. 561 (7723), 416-419 (2018).
  37. Lazzarotto, C. R., et al. Defining CRISPR-Cas9 genome-wide nuclease activities with CIRCLE-seq. Nature Protocols. 13 (11), 2615-2642 (2018).
  38. Ohtsuka, M., et al. Improvement of pronuclear injection-based targeted transgenesis (PITT) by iCre mRNA-mediated site-specific recombination. Transgenic Research. 22 (4), 873-875 (2013).
  39. Ohtsuka, M., et al. Pronuclear injection-based mouse targeted transgenesis for reproducible and highly efficient transgene expression. Nucleic Acids Research. 38 (22), 198 (2010).
  40. Lee, G., Saito, I. Role of nucleotide sequences of loxP spacer region in Cre-mediated recombination. Gene. 216 (1), 55-65 (1998).
  41. Thomson, J. G., Rucker, E. B., Piedrahita, J. A. Mutational analysis of loxP sites for efficient Cre-mediated insertion into genomic DNA. Genesis. 36 (3), 162-167 (2003).
  42. Cho, A., Haruyama, N., Kulkarni, A. B. Generation of Transgenic Mice. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter Unit-19.11 (2009).
  43. Pu, X. A., Young, A. P., Kubisch, H. M. Production of Transgenic Mice by Pronuclear Microinjection. Methods in Molecular Biology. 1874, 17-41 (2019).
  44. Murgha, Y., et al. Combined in vitro transcription and reverse transcription to amplify and label complex synthetic oligonucleotide probe libraries. Biotechniques. 58 (6), 301-307 (2015).
  45. Quadros, R. M., et al. Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins. Genome Biology. 18 (1), 92 (2017).
  46. Chen, X., Wu, J. M., Hornischer, K., Kel, A., Wingender, E. TiProD: the Tissue-specific Promoter Database. Nucleic Acids Research. 34, Database issue 104-107 (2006).
  47. Haruyama, N., Cho, A., Kulkarni, A. B. Overview: Engineering transgenic constructs and mice. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter Unit-19.10 (2009).
  48. Tasic, B., et al. Site-specific integrase-mediated transgenesis in mice via pronuclear injection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7902-7907 (2011).
  49. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Fundamentals of Breeding and Weaning. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
  50. Wyborski, D. L., DuCoeur, L. C., Short, J. M. Parameters affecting the use of the lac repressor system in eukaryotic cells and transgenic animals. Environmental and Molecular Mutagenesis. 28 (4), 447-458 (1996).
  51. Wyborski, D. L., Short, J. M. Analysis of inducers of the E.coli lac repressor system in mammalian cells and whole animals. Nucleic Acids Research. 19 (17), 4647-4653 (1991).
  52. Traykova-Brauch, M., et al. An efficient and versatile system for acute and chronic modulation of renal tubular function in transgenic mice. Nature Medicine. 14 (9), 979-984 (2008).
  53. Michel, G., Mosser, J., Fauran, F. Serum kinetics of doxycycline polyphosphate in dogs. European Journal of Drug Metabolism and Pharmacokinetics. 4 (1), 43-48 (1979).
  54. Bertocchi, I., et al. Regulatory functions of limbic Y1 receptors in body weight and anxiety uncovered by conditional knockout and maternal care. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (48), 19395-19400 (2011).
  55. Plageman, T. F., Lang, R. A. Generation of an Rx-tTA: TetOp-Cre knock-in mouse line for doxycycline regulated Cre activity in the Rx expression domain. PLOS One. 7 (11), 50426 (2012).
  56. Mollova, M., et al. Cardiomyocyte proliferation contributes to heart growth in young humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1446-1451 (2013).
  57. Ptashne, M. Principles of a switch. Nature Chemical Biology. 7 (8), 484-487 (2011).
  58. Balazsi, G., van Oudenaarden, A., Collins, J. J. Cellular decision making and biological noise: from microbes to mammals. Cell. 144 (6), 910-925 (2011).
  59. Nevozhay, D., Zal, T., Balazsi, G. Transferring a synthetic gene circuit from yeast to mammalian cells. Nature Communications. 4, 1451 (2013).
  60. Labow, M. A., Baim, S. B., Shenk, T., Levine, A. J. Conversion of the lac repressor into an allosterically regulated transcriptional activator for mammalian cells. Molecular and Cellular Biology. 10 (7), 3343-3356 (1990).

Tags

Genetik sag 145 transskription udtryk vendbar lac repressor tet aktivator Dnmt1 undertrykkelse genregulering inducerbar
In vivo anvendelse af sen-kontrol-System for Manipulation af endogene genekspression
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vander Schaaf, N. A., Oghamian, S.,… More

Vander Schaaf, N. A., Oghamian, S., Park, J. A., Kang, L., Laird, P. W., Lee, K. H. In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression. J. Vis. Exp. (145), e59235, doi:10.3791/59235 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter