Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

In vivo anvendelsen av fjernkontroll systemet for manipulering av endogene genuttrykk

Published: March 29, 2019 doi: 10.3791/59235
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, 1
1Center for Epigenetics, Van Andel Research Institute, 2Amgen

Summary

Denne protokollen beskriver trinnene for å generere et modellsystem som transkripsjon av en endogen genet av interesse kan være betinget kontrollert i levende dyr og celler ved hjelp av forbedret lac repressor og/eller tet aktivator systemer.

Abstract

Her beskriver vi en protokoll for å implementere fjernkontroll systemet (Reversible Manipulation of Transcription på Endogenous loci), som tillater reversibel og tunable kontroll over en endogene genet av interesse i levende modell systemer. Fjernkontroll systemet benytter forbedret lac undertrykkelse og tet aktivisering systemer å oppnå ned- eller oppregulering med et mål i en enkelt biologiske system. Tett undertrykkelse kan oppnås fra repressor bindende fleksibelt ligger langt nedstrøms en transkripsjon startwebstedet begrenser transkripsjon forlengelse. Solid upregulation kan oppnås ved å styrke transkripsjon av en endogen genet av målretting tet transcriptional aktivator beslektet selskapet. Denne reversibel og tunable kontrollen kan anvendt og trukket tilbake flere ganger i organismer. Styrken og allsidighet av systemet, som demonstrert for endogene Dnmt1 her, vil tillate mer presis i vivo funksjonelle analyser ved at etterforskningen av gen funksjon på ulike uttrykk nivåer og testet Reversibilitet av en fenotypen.

Introduction

Genetisk knockout eller transgene tilnærminger har vært effektivt middel for å studere gen funksjon i dyremodeller. Men uttrykket regulering av disse er dikotom (på/av), ikke-temporal, og dermed er ikke i stand til å avsløre hele funksjonelle spekteret av et gen. Betinget grobunn/LoxP teknologi har tillatt spatio-temporale inaktivering eller aktivering av gen funksjon, men deres dikotom natur fortsetter å posere begrensningene for eksempel celle dødelighet og irreversibilitet1,2 , 3. for å fylle dette tomrommet, betinget knockdown tilnærminger har blitt utviklet ved hjelp av tet-regulert shRNA eller miRNA4. Men off-målet effekter fortsatt en bekymring for RNAi5 og har vært vanskelig for å kontrollere i vivo. Nylig har CRISPR/Cas-mediert transcriptional-kontroll teknologi innført en mer allsidig tilnærming for å oppnå både opp- og downregulation av endogene genuttrykk og demonstrerte sine verktøy6,7 . Imidlertid effektiviteten av CRISPR/Cas-mediert transcriptional kontroll er ennå uklart i vivo, og Reversibilitet KRAB-baserte undertrykkelse gjenstår for å bli sett, så sterk undertrykkelse av KRAB og dens samspill protein KAP1 har vist seg å indusere permanent genet stanse8,9.

For å håndtere disse begrensningene, har vi utviklet en roman transcriptional regulatoriske system kan betinget styre endogene byggkorn under en reversibel og tunable måte i mus med konstruert prokaryote binære transcriptional regelverk10. Prokaryote binære transcriptional regulatoriske systemer med regulatoriske ligander, som lac og tet, har aktivert slik reversibel og tunable uttrykk kontrollere11,12,13, 14. men utilstrekkelig undertrykkelse styrken av gjeldende binære systemer har hindret deres omfattende bruk for å kontrollere endogene genuttrykk i pattedyr. Vi utviklet en forbedret lac undertrykkelse system tilstrekkelig muligheter for undertrykkelse av endogene gener og ansatt en ny strategi for målretting tet transcriptional aktivator direkte til beslektet arrangøren av en endogen genet å oppnå solid upregulation (figur 1)10. Med denne teknologien, har vi oppnådd nesten to størrelsesordener uttrykk kontroll av endogene Dnmt1 genet i en tunable induserbart og reversibel måte10. Her gir vi trinnvise instruksjoner for anvendelsen i vivo til andre gener og organismer bruker mus som modell art.

Figure 1
Figur 1 : Oversikt over fjernkontrollen systemet. Transkripsjon av en endogen målet genet kan reguleres utviklet lac repressor og tet aktivator systemer. Med målet genet arrangør eller intron er konstruert for å inneholde operatorer for stramt-bindende LacIGY repressor og/eller rtTA-M2 aktivator. R angir Repron (Repinntrykk Innlpå), som inneholder 12 symmetrisk lac operatører (S) pluss en delvis kanin beta-globin intron. T angir tet operatør. Repressor og/eller aktivator/uttrykkes fra en vev-spesifikke promoter. Uttrykk for målet genet kan deretter reversibel stilles til ønsket uttrykk nivå av administrasjonen av IPTG (isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, en antagonist av LacIGY-repressor) eller Doxycycline (Dox). Dette tallet er endret fra Lee et al.10Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Før du starter denne protokollen, se tabell 1 for å identifisere de relevante trinnene for ønsket kontroll av genuttrykk. For eksempel for å ingeniør en mus som lar reversibel downregulation av "Gene X", fullføre delene 1, 3 og 4 av de nedenfor protokollen. Tabell 1 oppsummerer også de nødvendige komponentene av fjernkontroll.

Ønsket uttrykk endring Undertrykkelse bare Aktivisering bare Både undertrykkelse og aktivisering
Relevante delene av protokollen 1, 3-4 2-4 1-4
Fjernkontroll sekvens trengs i målet genet Repron ("Undertrykkelse intron", 12 symmetrisk lac operatører pluss en delvis kanin beta-globin intron) Tet operator(s) Repron og Tet operator(s)
Fjernkontroll sekvens plassering Intron Arrangøren Intron & arrangøren
Aktivator/Repressor nødvendig for ønsket kontroll LacIGY Repressor rtTA-M2 aktivator LacIGY Repressor og rtTA-M2 aktivator
Regulatoriske ligander IPTG Doxycycline IPTG og/eller Doxycycline

Tabell 1: Oversikt over fjernkontrollen komponenter.

Protocol

Alle dyr prosedyrer ble gjennomført med godkjenning av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved University of Southern California og Van Andel Research Institute og i henhold til guiden og bruk av forsøksdyr fra National Institutes of Health15.

1. endre genet av interesse for undertrykkelse av fjernkontroll

  1. Ved hjelp av retningslinjene nedenfor, identifisere en transcriptionally inert intron mot 5' slutten av genet av interesse for innsetting av Repron sekvensen ("Repinntrykk Innlpå"; 12 symmetrisk lac operatører pluss en delvis kanin beta-globin intron). Være klar over alternative arrangører for genet av interesse, og velg en intron ifølge transcript(s) skal kontrolleres (dvs. en intron deles av alle utskrifter eller en spesifikk for ønsket avskrift).
    Merk: For gener uten en intron eller med de mot slutten 3, inn i den Repron sekvensen arrangøren (se Lee, et al.10 for en detaljert prosedyre).
    1. Få genomisk rekkefølgen for genet av interesse.
      1. Naviger til UCSC genomet nettleser16,17, og velg det siste utkastet til musen genomet (mus GRCm38/mm10 for tid av forlagsartikkel), som er under kategorien genomer .
      2. Angi navn eller symbol på genet av interesse inn i søkefeltet vise transkripsjoner for genet. Klikk gå.
      3. Velg ønsket transkripsjon varianten for genet av interesse.
      4. Klikk på gene-symbolet ved siden av transkripsjon varianten av interesse (symbolet på tidligere valgte transkripsjon vil være i en mørk).
      5. Under rekkefølge og koblinger til verktøy og databaser banneret, klikker du koblingen Genomic sekvens .
      6. Sekvensen henting regionen alternativer, velger du bare Exons (5' UTR, CDer, og 3' UTR), Introns og standard en FASTA post per genet. For Sekvensen formatering alternativer, velg Exons med store bokstaver, alt annet i små bokstaver og Maske gjentas til N (å skjule gjentatte sekvenser). Klikk Send.
      7. Lagre denne sekvensen, bevare den øvre - og små formatering, i et dokument eller program som kan kommenteres.
    2. Unngå avbrudd av CpG øyer, som kan indikere regioner med Gen regulatoriske funksjon.
      Merk: Selv om en 5' intron anbefales for innsetting av Repron sekvensen, den første intron kan inneholde transcriptional regulatoriske elementer som CpG øyene (undersøkt i dette trinnet) eller enhancer elementer (undersøkt i trinn 1.1.4), som må unngås for Repron innsetting.
      1. Velg Vis for CpG øyene sporet under uttrykk og regulering banneret av UCSC genomet nettleseren, og klikk Oppdater.
      2. Zoomer inn på 5' introns, klikk på hver CpG øy (vises i grønt på utgivelsestidspunktet hvis den finnes), og velg Vis DNA for denne funksjonen.
      3. Når du velger maske gjentas til N, merker du få DNA å få CpG øya sekvensen.
      4. Overlegg disse sekvensene med filen sekvens, og kommentere dette som intronic områder å unngå på grunn av mulig genet regulatoriske funksjoner.
    3. Unngå at ikke-koding RNAs, dersom de har en regulerende funksjon.
      1. Velg Vis for GENCODE (Ensembl) sporet under gener og Gene spådommer banneret av UCSC genomet nettleseren, og klikk Oppdater.
      2. Zoomer inn på 5' introns, klikk på hver ikke-koding RNA (vises i grønt på utgivelsestidspunktet hvis den finnes), og få DNA sekvensen for hver ved å klikke på chromosomal koordinatene.
      3. Velg DNAi Vis dropdown-menyen, og klikk maske gjentas til N. Klikk få DNA.
      4. Overlegg disse sekvensene med filen sekvens, og kommentere dette som intronic områder å unngå på grunn av mulig genet regulatoriske funksjoner.
    4. Unngå intronic regioner med enhancer signaturer i tissue(s) steder som H3K4me1, H3K27ac og DNase jeg overfølsomhet18,19,20,21, samt CTCF binding nettsteder, som regulerer enhancer looping22,23.
      1. Gå til kode databasen24,25, og Velg ikonet eksperimenter .
      2. Velg ChIP-seq eller DNase-seqhvilken analysen, og fylle ut de andre kategoriene (organisme, Biosample type, etc.) ifølge cellene å bli konstruert.
      3. Etter funksjonen valgt, hold over piktogrammer i blått, og velge den som Vise resultater som vises (venstre piktogram for tid av forlagsartikkel).
      4. Velg datasett for målene for H3K4me1, H3K27ac, DNase jeg og CTCF som noenlunde tilsvarer cellene å bli konstruert.
      5. Innenfor hver relevante datasett, blar du til delen , kontroller at mm10 (eller siste genomet versjon) og UCSC er valgt, og klikk på effekter -knappen.
      6. Nå i UCSC genomet leseren og zoome inn på de 5' introns for genet av interesse, klikk på hver H3K4me1, H3K27ac, DNase jeg og CTCF toppen i sine respektive kommenterte peak spor.
      7. Få DNA sekvensen for hver peak regionen ved å klikke på chromosomal koordinatene.
      8. Velg DNAi Vis dropdown-menyen, og klikk maske gjentas til N. Klikk få DNA.
      9. Overlegg disse sekvensene med filen sekvens, og kommentere dette som intronic områder å unngå på grunn av mulig genet regulatoriske funksjoner.
    5. Unngå avbrudd av konsensus skjøting sekvenser, for ikke å forstyrre riktig skjøting av exons.
      Merk: Selv om sekvenser kreves for skjøting er stort sett begrenset til rundt seks baser på 5' slutten av en intron26 og 60 baser på 3' end27, er det tilrådelig å velge en stor intron, muliggjør vesentlig bredere marger fra disse konsensus regioner for å minimere sannsynligheten for påvirker skjøting. Bruk av intron analyseverktøy som SVM-BPfinder28, anbefales for en mer grundig analyse av potensielle skjøte sekvenser.
  2. Etter å identifisere en intronic region som oppfyller de ovennevnte kriteriene (som eksemplifisert for Dnmt1 i supplerende data), skjermen sekvensen bruker en online sgRNA design verktøy for å identifisere en sgRNA i regionen med høy spesifisitet og spådd effektivitet score.
    1. Naviger til en online sgRNA design verktøyet valgfrihet, som CRISPOR29.
    2. Angi rekkefølgen i intronic regionen rundt, angi relevante referanse genomet, og velg den ønskede Protospacer tilstøtende motiv (PAM). Klikk Send.
    3. Sortere den anslåtte sgRNAs ved spesifisitet resultat, og velg ett eller flere sgRNAs som også har en anslått høyeffektiv score29.
      1. Valgfritt: for å maksimere sannsynligheten for bruker en effektiv sgRNA, først teste cleavage effektiviteten av flere topp-scoring sgRNAs i en i vitro analysen30, og fortsette med de mest effektive sgRNA i vivo.
  3. Utforme en DNA mal som inneholder en PITT (Pronuclear injeksjon-baserte målrettet Transgenesis) landing pad sekvens, som eksemplifisert i supplerende figur 1A, B, omgitt på begge sider av 60-base homologi armer som tilsvarer sgRNA kuttet nettstedet31 .
    Merk: Landing puten inneholder to heterotypic loxP stedene (JT15 og Lox2272) og muliggjør målrettet innsetting av stor sekvenser gjennom en to-trinns tilnærming; Sørg for at knutepunktene i denne innsetting ikke Opprett kryptiske skjøte nettsteder. Alternativt kan en embryonale stamcelleforskningen (ESC) - basert knock - i strategi brukes til å sette inn Repron sekvensen direkte.
  4. Forberede sgRNA, Cas9 proteiner og malen enkelt-strandet DNA (ssDNA) for landing pad, og microinject i befruktede egg (fra B6C3F1/J mus eller andre ønskede belastning) i henhold til etablerte protokoller32,33.
  5. Skjermen for mus med landing pad knock-modulen.
    1. Utforme PCR primere komplementære genomisk locus men utenfor regionene målrettet av homologi armene, som demonstrert for Dnmt1 i supplerende figur 1 c. Unngå repeterende genomisk sekvenser designerne primerne.
    2. Ekstra DNA fra halen klipp av mus etter etablerte protokoller34.
    3. Bruker PCR og gel geleelektroforese for å identifisere mus med en landing pad innsetting.
    4. Bekrefte at knock-i ble vellykket ved sekvensering PCR produktene.
      Merk: Uønsket store slettinger og rearrangements kan bli introdusert av CRISPR/Cas935, så forsiktig screening for off-målet redigering er anbefalt før du fortsetter35,36,37.
  6. Bruker befruktede egg fra landing pute musene, microinject iCre mRNA38 og en transgene plasmider som inneholder den Repron sekvensen flankert av JTZ17 og Lox2272 rekombinasjon nettsteder31,39,40, 41 i henhold til etablerte metoder38,42,43.
  7. Skjermen for mus med Repron innsetting.
    1. Utforme PCR primere utfyllende til genomisk locus, utenfor Repron innsatsen. Unngå repeterende genomisk sekvenser designerne primerne.
    2. Ekstra DNA fra halen klipp av mus etter etablerte protokoller34.
    3. Bruker PCR og gel geleelektroforese for å identifisere mus med en Repron innsetting.
    4. Bekreft knock-i ble vellykket ved sekvensering PCR produktene.

2. endre genet av interesse for oppregulering av fjernkontroll

  1. Bruke retningslinjene nedenfor, Identifiser et område i arrangøren av genet av interesse som er usannsynlig å forurolige promoter funksjon ved innsetting av tet operatør sekvenser. Være klar over alternative arrangører for genet av interesse, og velg en pådriver i henhold til transcript(s) skal kontrolleres (dvs. en promoter deles av alle utskrifter eller en spesifikk for en ønsket transkripsjon).
    1. Få genomisk sekvensen for arrangøren av interesse.
      1. Naviger til UCSC genomet nettleser16,17, og velg det siste utkastet til musen genomet (mus GRCm38/mm10 for tid av forlagsartikkel), som er under kategorien genomer .
      2. Angi navn eller symbol på genet av interesse inn i søkefeltet vise transkripsjoner for genet. Klikk gå.
      3. Velg ønsket transkripsjon varianten for genet av interesse.
      4. Klikk på gene-symbolet ved siden av transkripsjon varianten av interesse (gene symbolet på tidligere valgte transkripsjon vil være i en mørk).
      5. Under rekkefølge og koblinger til verktøy og databaser banneret, klikker du koblingen Genomic sekvens .
      6. For Sekvensen henting regionen alternativer, velger du bare Promoter/Upstream med 1000 baser. Sekvensen formatering alternativer, velg Maske gjentas til N (å skjule gjentatte sekvenser). Klikk Send.
      7. Lagre denne promoter sekvensen i et dokument eller program som kan kommenteres.
    2. Enkelte områder som er fri for antatte transkripsjon faktor bindende områder, som avbryter disse sekvensene kan endre endogene genuttrykk.
      1. Naviger til UCSC genomet nettleseren og åpne den nyeste versjonen av musen genomet.
      2. Over kartlegging og sekvensering banneret, velge spore huber.
      3. Klikk mm10 ved siden av JASPAR 2018 TFBS (eller siste JASPAR versjon) hub.
      4. Angi navn eller symbol på genet av interesse inn i søkefeltet vise transkripsjoner for genet. Klikk gå.
      5. Velg ønsket transkripsjon varianten for genet av interesse.
      6. Bla ned JASPAR 2018 TFBS banner, og klikk pilen i rullegardinlisten for å velge den ønskede visningsalternativ for banen, for eksempel squish. Klikk Oppdater.
      7. Zoome inn regionen arrangøren av genet av interesse, og identifisere områder som er gratis (eller relativt fri) av transkripsjon faktor bindende områder etter JASPAR sporet. Registrere chromosomal koordinatene i disse regionene.
      8. Få genomisk sekvensen av koordinatene chromosomal ved å skrive dem inn i søke stang og gå. Velg DNAi Vis dropdown-menyen, og klikk maske gjentas til N. Klikk få DNA.
      9. Overlegg disse sekvensene med filen sekvens, og kommentere disse som ideelt promoter områder å målrette på grunn av transkripsjon faktor bindende.
    3. Innenfor disse sekvenser, velger du perturbable promoter region som oppstrøms, men nær transkripsjon start genet av interesse.
      Merk: En innsetting som er for nær startwebstedet transkripsjon kan øke sjansen for å svekke promoter aktivitet, men en innsetting som er langt kan redusere nivået av oppregulering. Sette inn tet operatør sekvenser ca 200 basepairs oppstrøms av transkripsjon startwebstedet resultert i solid upregulation av de to arrangørene testet (se diskusjon)10.
  2. Skjermen regionen valgte selskapet bruker en online sgRNA design verktøyet identifiserer en sgRNA i regionen med høy spesifisitet og anslått effektivitet score.
    1. Naviger til en online sgRNA design verktøyet valgfrihet, som CRISPOR29.
    2. Angi sekvensen av regionen rundt, angi relevante referanse genomet, og velg den ønskede Protospacer tilstøtende motiv (PAM). Klikk Send.
    3. Sortere den anslåtte sgRNAs ved spesifisitet resultat, og velg ett eller flere sgRNAs som også har en anslått høyeffektiv score29.
      1. Valgfritt: for å maksimere sannsynligheten for bruker en effektiv sgRNA, først teste cleavage effektiviteten av flere sgRNAs i en i vitro analysen30, og fortsette med de mest effektive sgRNA i vivo.
  3. Utforme en DNA mal som inneholder tet operatører flankert på begge sider av 60-base homologi armer som tilsvarer sgRNA kuttet nettstedet31,33.
    Merk: Antall tet operatører er tilpassbare; innsetting av to til fire tet operatør sekvenser i tandem har tidligere vist seg å være effektive, men i prinsippet flere operatører er ønskelig for kjøring høyere uttrykk. Alternativt kan en ESC-basert Bank i strategi brukes sette tet operatørene.
    1. Valgfritt: For eksperimentelle bevis at foreslåtte endringene ikke vil sannsynligvis forstyrre endogene transcriptional aktiviteten til genet av interesse, klone utviklet selskapet sekvensen i en firefly luciferase vektor (for eksempel pGL3-grunnleggende), og sammenligne effekt opprinnelige selskapet bruker en luciferase analysen.
  4. Forberede sgRNA og Cas9 protein ssDNA malen som inneholder tet operatør sekvenser, og microinject i befruktede egg (fra B6C3F1/J mus eller andre ønskede belastning) i henhold til etablerte protokoller32,33.
    Merk: Komplekse syntetisere en repeterende sekvens, i vitro transkripsjon/revers transkripsjon-basert tilnærming er anbefalt å syntetisere en ssDNA mal fra en double-strandet DNA (dsDNA) plasmider44. Eventuelt dsDNA mal kan brukes til microinjection, men banke i effektiviteten kan være redusert45.
  5. Skjermen for mus med banke på tet operatørene.
    1. Utforme PCR primere utfyllende til genomisk locus, utenfor regionene målrettet av homologi armene. Unngå repeterende genomisk sekvenser designerne primerne.
    2. Ekstra DNA fra halen klipp av mus etter etablerte protokoller34.
    3. Bruker PCR og gel geleelektroforese for å identifisere mus med innsetting av tet operatørene.
    4. Bekrefte at knock-i ble vellykket ved sekvensering PCR produktene.
      Merk: Uønsket store slettinger og rearrangements kan bli introdusert av CRISPR/Cas935, så forsiktig screening for off-målet redigering er anbefalt før du fortsetter35,36,37.

3. utvikle Aktivator - og/eller repressor-uttrykke mus

  1. Identifisere en robust uttrykke arrangøren for tissue(s) eller celle hvilke av interesse.
    Merk: En litteratursøk og vev-spesifikke Promoter Database46 kan være nyttig for å identifisere slike en promoter.
  2. Plass forsynt forbedret lac repressor eller tet aktivator sekvens nedstrøms til ønsket promoter generere en transgene konstruksjon.
  3. Produsere transgene musen linjen(e) bruker standard transgene prosedyrer42,43,47. Alternativt, en områdespesifikk transgenesis tilnærming kan brukes å unngå posisjon virkninger og å tillate enkelt-kopi transgene innsetting31,48.
  4. Overføre grunnleggerne og bestemme uttrykksmønster og nivå av transgene i avkom av hver grunnlegger. Velg linjene med robust uttrykk i tiltenkte vev hvilke for videre avl.
    1. Rase grunnleggerne til wildtype mus.
    2. Design PCR primere som vil oppdage innsetting av Aktivator eller repressor.
    3. Pakk ut DNA fra halen klipp av avkom etter etablerte protokoller34.
    4. Bruker PCR og gel geleelektroforese for å identifisere mus med innsettingspunktet.
    5. Bekreft transgene innsettingspunktet ved sekvensering av PCR produktene.
    6. Forplante transgene linjene.
    7. Ofre noen pups fra hver linje, og samle vev av interesse for qRT PCR, immunohistochemistry eller vestlige blotting å analysere uttrykk for genet/protein interesse målet vev hvilke.
    8. Velg linjene med sterkeste uttrykket i vev av interesse for bruk i Seksjon 4.

4. endre genuttrykk i vivo

  1. Rase mus med endrede genet av interesse (del 1 og/eller 2) med transgene musene fra avsnitt 3 i henhold til etablerte oppdrett praksis49. For maksimal uttrykk kontroll, rase mus til homozygosity for det endrede allelet.
  2. Hjemfall eller justering av undertrykkelse av målet genet, administrere IPTG i drikkevannet.
    1. Å eksperimentelt avgjøre dosen av IPTG bruke, behandle mus riktig genotype og kontroller med en av en rekke doser (anbefalt starter rekkevidde: 0-400 mM IPTG) for minst en uke50,51. Inkluderer minst tre mus per behandlingsgruppe, og velg alder og kjønn mus som er mest relevante for de planlagte senere eksperimentene. Merk: Avl par mus kan behandles med IPTG vann å gi utviklingsmessige eksponering av IPTG til avkom hvis ønskelig13eller mus kan begynne behandlingen helst etter fødselen.
      1. Oppløse ønsket masse IPTG i sterilt destillert vann på dagen av administrasjon og rør med en røre bar i 5 minutter eller til fullt ut oppløst.
      2. Bryte flasken med folie og administrere IPTG vannet i en lys-beskyttet flaske. Erstatte to ganger i uken. Gi den samme kilden til vann til mus mottar 0 mM IPTG.
      3. Minst en uke, ofre mus og analysere uttrykk for genet av interesse i målet tissue(s) bruker qRT PCR, immunohistochemistry eller vestlige blotting.
      4. Identifisere dosen som gjenoppretter uttrykket av genet av interesse for wildtype kontroller, og bruke denne dose for å oppnå vanlig uttrykk av genet i senere eksperimenter.
  3. For induksjon av genet oppregulering, administrere Doxycycline (Dox) i kostholdet.
    1. For å bestemme konsentrasjonen av Dox administrere eksperimentelt, behandle mus riktig genotype og kontroller med en for et utvalg av Dox (anbefalt starter rekkevidde: 0-5000 mg/kg Doxycycline Hyclate) for minst en uke52 ,53, inkludert minst tre mus per behandlingsgruppe. Kjøpe Dox inneholder musen mat fra en kommersiell leverandør.
      Merk: Hekkende par mus kan behandles med Dox mat å gi utviklingsmessige eksponering av Dox avkom hvis ønskelig54,55, eller mus kan begynne behandlingen helst etter fødselen.
    2. Erstatte diett en gang per uke. Gi samme base diett mus mottar Dox-fri mat.
    3. Minst en uke, ofre mus og analysere uttrykk for genet av interesse i målet tissue(s) bruker qRT PCR, immunohistochemistry eller vestlige blotting.
    4. Identifisere dosen som løfter uttrykket av genet av interesse til ønsket nivå, og bruke denne dose for å oppnå overuttrykte genet i senere eksperimenter.

Representative Results

Undertrykkelse evnen til fjernkontrollen systemet har blitt demonstrert i to ulike tilnærminger hittil. I den første tilnærmingen, lac repressor bindende områder ble satt inn på endogene arrangøren av Dnmt1 genet. I den andre tilnærmingen, som er anbefalt av denne protokollen, repressor bindende områder ble satt inn i en nedstrøms intron å unngå potensielle påvirke promoter funksjonen ved innsetting og dermed forenkle bruk av fjernkontrollen- system. Begge tilnærminger resulterte i vellykket undertrykkelse (figur 2A, B og figur 3A-C)10. Dnmt1 uttrykk ble repressed 15% av uregulert nivåene med den formidler tilnærmingen (figur 2A). Denne stramt undertrykkelse ble reversert i en doseavhengig måte ved å behandle mus med varierende mengder IPTG (figur 2A). Observerte Dnmt1 undertrykkelse ble godkjent på protein nivå av immunostaining (figur 2B). Vi ikke observerer en merkbar forskjell i Dnmt1 uttrykk mellom Dnmt1+/ + og Dnmt1LO/LO mus, bekrefter at våre lac operatør innsetting ikke hadde forstyrret normal arrangøren funksjonen10. Intron tilnærming oppnådd mer enn 90% undertrykkelse fra operatører ligger flere kilobases nedstrøms av startwebstedet transkripsjon av demping transkripsjon forlengelse (Figur 3A, B)10. Denne intron tilnærming ble ytterligere validert på 7 ekstra robust arrangører (Figur 3C). Alltid stramt undertrykkelse ble oppnådd fra alle arrangører testet. Ingen sammenheng mellom de gjenværende uttrykk nivåene og styrkene til arrangørene ble observert, tyder på at undertrykkelse kapasitet intron-baserte undertrykkelse systemet overskrider transcriptional styrken av alle de robuste arrangørene vi testet () Figur 3 C).

I vivo oppregulering evnen til fjernkontroll systemet ble også demonstrert på Dnmt1 genet. Vi introdusert to kopier av operatoren tet i Dnmt1 selskapet, sammen med lac operatør sekvenser, å tillate oppregulering eller downregulation avhengig av hvilken effektor protein er tilstede. Solid upregulation og downregulation av Dnmt1 uttrykk, nær to størrelsesordener (10% til 650%), ble oppnådd i ESCs som inneholder det endrede endogene Dnmt1 allelet (Dnmt1LGT) (Figur 4A)10 . Begge regelverket var fullt reversibel og induserbart av IPTG og Dox behandlinger, henholdsvis (Figur 4A). Vi introdusert neste Dnmt1LGT endring i musen germline å teste i vivo oppregulering evnen av fjernkontroll. Sterk oppregulering av Dnmt1 ble observert fra leveren, milt og nyre, mens ingen synlig oppregulering i hjertet ble observert (Figur 4B)7. Cellen syklus-avhengige uttrykksmønster av Dnmt1 og knapphet på proliferativ celler i hjertet kan ligger denne observasjon10,56. Det gjenstår for å se om denne begrensningen kan overvinnes ved å øke hvilket uttrykk Aktivator eller antall sin bindende områder.

Figure 2
Figur 2 : I vivo undertrykkelse av Dnmt1 av LacIGY-repressor. (A) mus med lac operatører (LO) settes inn i Dnmt1 selskapet, med eller uten uttrykk for LacIGY, ble behandlet med ulike doser av IPTG. qRT PCR analyse av Dnmt1 uttrykk viser doseavhengig reversering av Dnmt1 undertrykkelse i vivo av IPTG behandling. Hver stolpe representerer data fra en annen mus. Dataene representerer gjennomsnittlig ± SEM (n = 3). (B) Immunostaining Dnmt1 protein i colonic crypts mus gitt drikkevann med eller uten 160 mM IPTG for 3 uker. Dette tallet er endret fra Lee et al.10Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : I vivo og i vitro undertrykkelse av ulike arrangører av fjernkontroll systemet. (A) en tidlig versjon av Repron sekvensen (R *) ble satt inn i en intron nedstrøms til Villin promoter i en Villin-mKate2 transgene mus (VilmKate2). qRT PCR analyse av mKate2 uttrykk i tynntarmen mus med eller uten LacIGY repressor vises. Hver stolpe representerer data fra en annen mus. (B) AC Confocal mKate2 bilder av tynntarmen med og uten LacIGY uttrykk. (C) seks symmetrisk lac operatører (S) ble satt inn mellom ulike arrangører og luciferase reporter. Journalister (50 ng/vel i 96-brønnen plate) og repressor plasmider ble transiently innført i NIH/3T3 celler i en 1:1 molar ratio. Luciferase verdier ble vurdert 24 timer etter hva. Disse i vitro dataene representerer prosent av luciferase uttrykk i LacIGY-uttrykke celler i forhold til de uttrykker fungerer ikke LacI (NFlacI). T-tester ble brukt til å finne statistiske betydning. Dataene representerer gjennomsnittlig ± SEM (n = 3). P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01. Dette tallet er endret fra Lee et al.10Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Ned - og/eller oppregulering av Dnmt1 uttrykk i vitro og in vivo. (A) komplett fjernkontroll systemet ble utviklet i kulturperler ESCs av genet målrette og electroporation tilnærminger. Maksimal undertrykkelse av Dnmt1 uttrykk ble oppnådd med ingen behandling mens maksimal aktivisering ble oppnådd av både IPTG og Dox behandling. Dataene representerer gjennomsnittlig ± SEM (n = 3). P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01 (Welch's t-tester). (B) In vivo aktivering av Dnmt1 av fjernkontroll systemet, som demonstrert av immunostaining Dnmt1 protein i ulike vev fra fjernkontroll mus. LGT allelet representerer selskapet modifikasjon av Dnmt1 inneholder lac operatør og tet aktivator bindende områder. Mus ble behandlet med en normal eller Dox inneholder diett (5000 mg/kg Doxycycline Hyclate) i en måned. Dette tallet er endret fra Lee et al.10Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplementary Figure 1
Supplerende figur 1 : Eksempel på destinasjonssiden pad innsetting i murine Dnmt1 intron 1. (A) skjematisk av DNA mal for landing pad innsetting, tilpasset fra Quadros et al. (2015)31. Heterotypic loxP områder, JT15 og Lox2272, er atskilt med en kort avstand sekvens (sp) og flanked på hver side av 60-bp av DNA som homologe genomisk målregion. (B) prøve DNA mal for landing pad innsetting i Dnmt1 intron med følgende sgRNA: CTAGTACCACTCCTGTACCG (som mål den omvendte stranden). Den valgte intronic regionen var bioinformatically informert steg 1.1, og sgRNA ble identifisert med CRISPOR29. (C) eksempel på PCR primer design for å vurdere innsetting av landing puten. PCR primere ble utformet utenfor homologi armene av malen for å bekrefte integrering i endogene Dnmt1. Wildtype PCR amplicon er 213 bp; ved innsetting, blir 291 bp. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

En kritisk trinn og potensielle ANSVARSBEGRENSNING fjernkontroll systemet er utfordringen forbundet med innsetting av repressor eller aktivator bindende områder uten å påvirke mål genuttrykk. Vår opprinnelige undertrykkelse tilnærming, involvert som brukes til Dnmt1 genet, innsetting av lac repressor bindende områder innen transcriptionally kritiske områder av en promoter. For å redusere risikoen for påvirker promoter funksjon og dermed å forbedre den generelle anvendelighet av fjernkontroll systemet, vi utviklet intron-baserte undertrykkelse tilnærming. Styrken på forbedret lac systemet tillot oss å undertrykke tett transkripsjon av alle de sterke arrangørene vi testet mot ligger hundrevis til flere kilobases nedstrøms av transkripsjon starte områder (Figur 3-Vekselstrøm) 10. viktigst, nivåer av undertrykkelse er uavhengige av transcriptional styrkene til arrangører (Figur 3-Vekselstrøm)10. Dette tyder på at undertrykkelse kapasitet intron-baserte undertrykkelse systemet overskrider transcriptional styrke de testede arrangørene. I denne intron tilnærming er det sannsynlig at undertrykkelse er formidlet gjennom fysisk interferens mellom to komponenter, transkripsjon forlengelse maskiner og lac repressors57. Denne enkle undertrykkelsen mekanisme og vist robust metoden intron-baserte kan gjøre denne generelt gjelder for ulike gener, vev og organismer.

Oppregulering av fjernkontroll systemet krever transactivator binding sekvenser i nærhet til målet genet selskapet, som innebærer en risiko for påvirker promoter funksjon. Vi fant imidlertid at plasseringen av bindende sekvenser kan være utenfor regionen transcriptionally kritisk. Både Dnmt1 og EF1α arrangører var robust upregulated fra tet operatører ligger et par hundre baser oppstrøms av transkripsjon start nettsteder10. Denne avslappende betingelsen reduserer sjansen for påvirker promoter funksjon med et mål i fravær av transactivator. Øke antall bindende sekvenser og/eller bruk av sterkere transactivators kunne hjelpe ytterligere redusere risikoen ved å aktivere oppregulering fra områder lenger bort fra startwebstedet transkripsjon.

Fjernkontroll systemet gir elegante kontroll av nivå, timing og plasseringen av endogene genuttrykk, slik at Reversibilitet av en fenotypen og konsekvensene av ulike uttrykk nivåer, som ikke er lett oppnåelig ved gjeldende i vivo gene expression-kontroll teknologi. Det er viktig å merke seg at i de fleste gene expression analyser, inkludert vår, uttrykk verdiene representerer gjennomsnittet for en populasjon av celler som store variasjoner kan bli funnet. Denne heterogene kan påvirke mobilnettet beslutningsprosesser, som differensiering eller apoptose58. Men presisjonen for gene expression kontroll kan trolig ytterligere forbedret av flere genetiske krets engineering59, kan observerte styrken på vårt nåværende system nyttig undersøkelse av gen funksjon i mange biologiske sammenhenger. I tillegg forventes en høy grad av målet spesifisitet fordi operatøren sekvensene samt stor evolusjonære avstanden mellom pattedyr og opprinnelige arter i de regulatoriske komponenter60. Videre kan transgene musen linjer med repressors og aktivator utvikles og ansatt for noen endogene genet. For eksempel kan eksisterende tet transactivator musen modeller tilpasses for å oppnå oppregulering med et mål i ønsket musen vev. Vi har nylig utviklet en transgene linje som kan kjøre robuste vev-spesifikke uttrykk for vår forbedrede lac repressor i flere vev typer kombinert med eksisterende grobunn linjer ved å innføre lacIGY genet til Hipp11 locus48 under kontroll av et Lox-stopp-Lox element (upublisert). Denne linjen vil vesentlig lette vev-spesifikke anvendelsen av fjernkontrollen systemet.

Gene oppregulering av fjernkontroll systemet gir flere fordeler i forhold til gjeldende induserbart transgene tilnærminger. Det krever ikke generasjon av flere transgene linjer til å teste posisjon virkningene av innsetting, som det utnytter endogene locus. I tillegg denne tilnærmingen er velegnet for oppregulering av gener med sterk planlagte uttrykket fordi det forbedrer uttrykk fra en allerede robust promoter, mens konvensjonelle transgene modeller stole på minimal viral arrangører. Til slutt, vevet spesifisitet, celle-syklus kontroll og skjøting varianter med et mål kan beholdes på oppregulering av vår tilnærming, som det bevarer elementer av naturlige forskrift som medfødt cis-regulatoriske elementer. Bruk av CRISPR/Cas-mediert genet målretting teknologi vil forenkle anvendelse av denne teknologien i ulike modellsystemer.

Disclosures

PWL serverer på vitenskapelige Advisory Boards av AnchorDx og Progenity, Inc.

Acknowledgments

Vi takker den avdøde Dr Heidi Scrable for hennes sjenerøse gaven av pattedyr lacI gene Konstruer (Mayo Clinic, Rochester, MN) Dr. Daniel Louvard (Institut Curie, Paris, Frankrike) for å gi Villin selskapet og Dr. Laurie Jackson-Grusby (barnesykehus, Boston, MA) for hennes bidrag til de tidlige stadiene av denne teknologiutvikling. Vi er takknemlige for Dr. Nancy Wu og Dr Robert Maxson for deres hjelp i å generere transgene og knockout musene. Vi takker medlemmene av Laird laboratorium for nyttig diskusjoner og støtte. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health [R01 CA75090, R01 DA030325, R01 CA157918 og R01 CA212374 til P.W.L. og 1F31CA213897-01A1 å N.A.V.S].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
B6C3F1/J The Jackson Laboratory 100010 https://www.jax.org/strain/100010
Cas9 Protein PNA Bio CP04 http://www.pnabio.com/products/CRISPR_Cas9.htm?gclid=EAIaIQobChMIsoG8pLL33QIVBr7ACh0naQ4dEAAYAiAAEgKyHvD_BwE
CRISPOR Haeussler et al. 2016 http://crispor.tefor.net/
Doxycycline-Containing Mouse Diet Envigo Varies by concentration https://www.envigo.com/products-services/teklad/laboratory-animal-diets/custom-research/doxycycline-diets/
ENCODE Database Stanford University https://www.encodeproject.org/
iCre mRNA synthesis plasmid (pBBI) Addgene 65795 https://www.addgene.org/65795/
IPTG GoldBio I2481C https://www.goldbio.com/search?isSearch=Y&q=iptg
pGL3-Basic Promega E1751 https://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-vectors-and-cell-lines/pgl3-luciferase-reporter-vectors/?catNum=E1751
SVM-BPfinder Regulatory Genomics, Pompeu Fabra University http://regulatorygenomics.upf.edu/Software/SVM_BP/
TiProD: Tissue specific promoter Database Department of Bioinformatics, UMG, University of Göttingen  http://tiprod.bioinf.med.uni-goettingen.de
UCSC Genome Browser University of California Santa Cruz https://genome.ucsc.edu/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jackson-Grusby, L., et al. Loss of genomic methylation causes p53-dependent apoptosis and epigenetic deregulation. Nature Genetics. 27 (1), 31-39 (2001).
  2. David, G., Turner, G. M., Yao, Y., Protopopov, A., DePinho, R. A. mSin3-associated protein, mSds3, is essential for pericentric heterochromatin formation and chromosome segregation in mammalian cells. Genes & Development. 17 (19), 2396-2405 (2003).
  3. Sumi-Ichinose, C., Ichinose, H., Metzger, D., Chambon, P. SNF2beta-BRG1 is essential for the viability of F9 murine embryonal carcinoma cells. Molecular and Cellular Biology. 17 (10), 5976-5986 (1997).
  4. Premsrirut, P. K., et al. A rapid and scalable system for studying gene function in mice using conditional RNA interference. Cell. 145 (1), 145-158 (2011).
  5. Qiu, S., Adema, C. M., Lane, T. A computational study of off-target effects of RNA interference. Nucleic Acids Research. 33 (6), 1834-1847 (2005).
  6. Gilbert, L. A., et al. Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation. Cell. 159 (3), 647-661 (2014).
  7. Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).
  8. Peng, H., Ivanov, A. V., Oh, H. J., Lau, Y. F., Rauscher, F. J. Epigenetic gene silencing by the SRY protein is mediated by a KRAB-O protein that recruits the KAP1 co-repressor machinery. The Journal of Biological Chemistry. 284 (51), 35670-35680 (2009).
  9. Groner, A. C., et al. KRAB-zinc finger proteins and KAP1 can mediate long-range transcriptional repression through heterochromatin spreading. PLOS Genetics. 6 (3), 1000869 (2010).
  10. Lee, K. H., Oghamian, S., Park, J. A., Kang, L., Laird, P. W. The REMOTE-control system: a system for reversible and tunable control of endogenous gene expression in mice. Nucleic Acids Research. 45 (21), 12256-12269 (2017).
  11. Gossen, M., Bonin, A. L., Bujard, H. Control of gene activity in higher eukaryotic cells by prokaryotic regulatory elements. Trends in Biochemical Sciences. 18 (12), 471-475 (1993).
  12. Hu, M. C., Davidson, N. The inducible lac operator-repressor system is functional in mammalian cells. Cell. 48 (4), 555-566 (1987).
  13. Cronin, C. A., Gluba, W., Scrable, H. The lac operator-repressor system is functional in the mouse. Genes & Development. 15 (12), 1506-1517 (2001).
  14. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  15. Council, N. R. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals: Eighth Edition. , The National Academies Press. (2011).
  16. Casper, J., et al. The UCSC Genome Browser database: 2018 update. Nucleic Acids Research. 46 (1), 762-769 (2018).
  17. Church, D. M., et al. Lineage-specific biology revealed by a finished genome assembly of the mouse. PLOS Biology. 7 (5), 1000112 (2009).
  18. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  19. Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
  20. Heintzman, N. D., et al. Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome. Nature Genetics. 39 (3), 311-318 (2007).
  21. Rada-Iglesias, A., et al. A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature. 470 (7333), 279-283 (2011).
  22. Handoko, L., et al. CTCF-mediated functional chromatin interactome in pluripotent cells. Nature Genetics. 43 (7), 630-638 (2011).
  23. Splinter, E., et al. CTCF mediates long-range chromatin looping and local histone modification in the beta-globin locus. Genes & Development. 20 (17), 2349-2354 (2006).
  24. The ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  25. Rosenbloom, K. R., et al. ENCODE data in the UCSC Genome Browser: year 5 update. Nucleic Acids Research. 41, Database issue 56-63 (2013).
  26. Murray, J. I., Voelker, R. B., Henscheid, K. L., Warf, M. B., Berglund, J. A. Identification of motifs that function in the splicing of non-canonical introns. Genome Biology. 9 (6), 97 (2008).
  27. Taggart, A. J., et al. Large-scale analysis of branchpoint usage across species and cell lines. Genome Research. 27 (4), 639-649 (2017).
  28. Corvelo, A., Hallegger, M., Smith, C. W., Eyras, E. Genome-wide association between branch point properties and alternative splicing. PLOS Computational Biology. 6 (11), 1001016 (2010).
  29. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
  30. Grainger, S., et al. CRISPR Guide RNA Validation In Vitro. Zebrafish. 14 (4), 383-386 (2017).
  31. Quadros, R. M., Harms, D. W., Ohtsuka, M., Gurumurthy, C. B. Insertion of sequences at the original provirus integration site of mouse ROSA26 locus using the CRISPR/Cas9 system. FEBS Open Bio. 5, 191-197 (2015).
  32. Harms, D. W., et al. Mouse Genome Editing Using the CRISPR/Cas System. Current Protocols in Human Genetics. 83, (2014).
  33. Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors. Nature Protocols. 13 (1), 195-215 (2018).
  34. Laird, P. W., et al. Simplified mammalian DNA isolation procedure. Nucleic Acids Research. 19 (15), 4293 (1991).
  35. Kosicki, M., Tomberg, K., Bradley, A. Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements. Nature Biotechnology. 36 (8), 765-771 (2018).
  36. Akcakaya, P., et al. In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations. Nature. 561 (7723), 416-419 (2018).
  37. Lazzarotto, C. R., et al. Defining CRISPR-Cas9 genome-wide nuclease activities with CIRCLE-seq. Nature Protocols. 13 (11), 2615-2642 (2018).
  38. Ohtsuka, M., et al. Improvement of pronuclear injection-based targeted transgenesis (PITT) by iCre mRNA-mediated site-specific recombination. Transgenic Research. 22 (4), 873-875 (2013).
  39. Ohtsuka, M., et al. Pronuclear injection-based mouse targeted transgenesis for reproducible and highly efficient transgene expression. Nucleic Acids Research. 38 (22), 198 (2010).
  40. Lee, G., Saito, I. Role of nucleotide sequences of loxP spacer region in Cre-mediated recombination. Gene. 216 (1), 55-65 (1998).
  41. Thomson, J. G., Rucker, E. B., Piedrahita, J. A. Mutational analysis of loxP sites for efficient Cre-mediated insertion into genomic DNA. Genesis. 36 (3), 162-167 (2003).
  42. Cho, A., Haruyama, N., Kulkarni, A. B. Generation of Transgenic Mice. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter Unit-19.11 (2009).
  43. Pu, X. A., Young, A. P., Kubisch, H. M. Production of Transgenic Mice by Pronuclear Microinjection. Methods in Molecular Biology. 1874, 17-41 (2019).
  44. Murgha, Y., et al. Combined in vitro transcription and reverse transcription to amplify and label complex synthetic oligonucleotide probe libraries. Biotechniques. 58 (6), 301-307 (2015).
  45. Quadros, R. M., et al. Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins. Genome Biology. 18 (1), 92 (2017).
  46. Chen, X., Wu, J. M., Hornischer, K., Kel, A., Wingender, E. TiProD: the Tissue-specific Promoter Database. Nucleic Acids Research. 34, Database issue 104-107 (2006).
  47. Haruyama, N., Cho, A., Kulkarni, A. B. Overview: Engineering transgenic constructs and mice. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter Unit-19.10 (2009).
  48. Tasic, B., et al. Site-specific integrase-mediated transgenesis in mice via pronuclear injection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7902-7907 (2011).
  49. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Fundamentals of Breeding and Weaning. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
  50. Wyborski, D. L., DuCoeur, L. C., Short, J. M. Parameters affecting the use of the lac repressor system in eukaryotic cells and transgenic animals. Environmental and Molecular Mutagenesis. 28 (4), 447-458 (1996).
  51. Wyborski, D. L., Short, J. M. Analysis of inducers of the E.coli lac repressor system in mammalian cells and whole animals. Nucleic Acids Research. 19 (17), 4647-4653 (1991).
  52. Traykova-Brauch, M., et al. An efficient and versatile system for acute and chronic modulation of renal tubular function in transgenic mice. Nature Medicine. 14 (9), 979-984 (2008).
  53. Michel, G., Mosser, J., Fauran, F. Serum kinetics of doxycycline polyphosphate in dogs. European Journal of Drug Metabolism and Pharmacokinetics. 4 (1), 43-48 (1979).
  54. Bertocchi, I., et al. Regulatory functions of limbic Y1 receptors in body weight and anxiety uncovered by conditional knockout and maternal care. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (48), 19395-19400 (2011).
  55. Plageman, T. F., Lang, R. A. Generation of an Rx-tTA: TetOp-Cre knock-in mouse line for doxycycline regulated Cre activity in the Rx expression domain. PLOS One. 7 (11), 50426 (2012).
  56. Mollova, M., et al. Cardiomyocyte proliferation contributes to heart growth in young humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1446-1451 (2013).
  57. Ptashne, M. Principles of a switch. Nature Chemical Biology. 7 (8), 484-487 (2011).
  58. Balazsi, G., van Oudenaarden, A., Collins, J. J. Cellular decision making and biological noise: from microbes to mammals. Cell. 144 (6), 910-925 (2011).
  59. Nevozhay, D., Zal, T., Balazsi, G. Transferring a synthetic gene circuit from yeast to mammalian cells. Nature Communications. 4, 1451 (2013).
  60. Labow, M. A., Baim, S. B., Shenk, T., Levine, A. J. Conversion of the lac repressor into an allosterically regulated transcriptional activator for mammalian cells. Molecular and Cellular Biology. 10 (7), 3343-3356 (1990).

Tags

Genetikk problemet 145 transkripsjon uttrykk reversibel lac repressor tet aktivator Dnmt1 undertrykkelse gene regulering induserbart
In vivo anvendelsen av fjernkontroll systemet for manipulering av endogene genuttrykk
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vander Schaaf, N. A., Oghamian, S.,… More

Vander Schaaf, N. A., Oghamian, S., Park, J. A., Kang, L., Laird, P. W., Lee, K. H. In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression. J. Vis. Exp. (145), e59235, doi:10.3791/59235 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter