Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

In vivo tillämpning av systemet med fjärrkontroll för Manipulation av endogena genuttrycket

Published: March 29, 2019 doi: 10.3791/59235
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, 1
1Center for Epigenetics, Van Andel Research Institute, 2Amgen

Summary

Detta protokoll beskriver de steg som behövs för att generera modellsystem där transkriptionen av en endogen gen av intresse kan styras villkorligt i levande djur eller celler använder förbättrad lac repressor eller tet aktivare system.

Abstract

Här beskriver vi ett protokoll för genomförandet av systemet med fjärrkontroll (Reversible Manipulation of Transcription på Endogenous loci), vilket möjliggör reversibla och avstämbara uttryck kontroll av en endogena gen av intresse på levande modell system. Fjärrkontroll systemet använder system för förbättrad lac -förtryck och tet aktivering att uppnå ned- eller uppreglering av en målgenen inom ett enda biologiska system. Tight förtryck kan uppnås från repressor bindningsställen flexibelt ligger långt nedströms en transkription startwebbplats genom att hämma transkription töjning. Robust uppreglering kan uppnås genom att förbättra transkriptionen av en endogen gen genom att rikta tet transkriptionell aktivatorer till cognate arrangören. Reversibel och avstämbara uttryck kontrollen kan tillämpas och dragit tillbaka upprepade gånger i organismer. Styrkan och mångsidighet av systemet, som visats för endogena Dnmt1 här, kommer att möjliggöra mer exakt Invivo funktionella analyser genom att aktivera utredning av geners funktion på olika nivåer och genom att testa reversibiliteten av en fenotyp.

Introduction

Genetiska knockout eller transgena metoder har varit effektiva medel för att studera geners funktion i djurmodeller. Dock uttryck förordning av dessa synsätt är dikotoma (på/av), icke-temporal, och således är inte kapabel att avslöja kompletta funktionella spectrumen av en gen. Villkorliga Cre/LoxP technologies har tillåtit plats och tid inaktivering eller aktivering av geners funktion, men deras dikotomiska naturen fortsätter att utgöra begränsningar, till exempel cell dödlighet och oåterkallelig1,2 , 3. för att fylla detta tomrum, villkorlig knockdown metoder har utvecklats med hjälp av tet-reglerade shRNA eller miRNA4. Men off-target effekter förbli en angelägenhet för RNAi5 och har varit en utmaning för att styra i vivo. Mer nyligen, CRISPR/Cas-medierad transkriptionell-control teknik har infört en mer mångsidig strategi för att uppnå både upp- och nedreglering av endogena genuttryck och visat deras verktyg6,7 . Dock effektiviteten i CRISPR/Cas-medierad transkriptionell kontroll är ännu oklart i vivo, och reversibiliteten av KRAB-baserade repression återstår att ses, så starkt förtryck av KRAB och dess interagerande protein KAP1 har visats inducera permanent nedtystning8,9.

För att hantera dessa begränsningar, har vi utvecklat en roman transkriptionell regelsystemet kan villkorligt styra endogena genuttryck i en reversibel och avstämbara sätt i möss med konstruerad prokaryota binära transkriptionell regelsystem10. Prokaryota binära transkriptionell regelsystem med föreskrivande ligander, såsom lac och tet, har aktiverat sådana vändbar och avstämbara uttryck styra11,12,13, 14. dock otillräcklig förtryck styrkan hos de nuvarande binära systemen har hindrat deras bred antagande för styrning av endogena genuttryck hos däggdjur. Vi utvecklat en förbättrad lac förtryck system tillräckligt potenta för undertryckandet av endogena gener och anställd en roman strategi av inriktning tet transkriptionell aktivatorer direkt till cognate arrangören av en endogen gen att uppnå robust uppreglering (figur 1)10. Med denna teknik, har vi uppnått nästan två tiopotenser uttryck kontroll av endogena Dnmt1 genen i en avstämbara, inducerbara och reversibel sätt10. Här tillhandahåller vi stegvisa instruktioner för dess Invivo tillämpning på andra gener och organismer med möss som modell art.

Figure 1
Figur 1 : Översikt över systemets fjärrkontroll. Transkriptionen av en endogen målgenen kan regleras med hjälp av bakåtkompilerade lac repressor och tet aktivare system. Den mål genen arrangören eller intron är konstruerad för att innehålla operatörer för den snäva-bindande LacIGY repressor eller rtTA-M2 aktivator. R visar Repron (Repression intrpå), som innehåller 12 symmetriska lac operatorer (S) plus en partiell kanin beta-globin intron. T anger tet operatör. Den repressor eller aktivator/uttrycks från en vävnad-specifika Promotorn. Uttrycket av målgenen kan sedan reversibelt stämmas till önskat uttryck nivå genom administrering av IPTG (isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, en antagonist till den LacIGY repressor) eller doxycyklin (Dox). Denna siffra har ändrats från Lee et al.10vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Innan du börjar detta protokoll, se tabell 1 för att identifiera de relevanta stegen för önskad kontroll av genuttryck. Exempelvis för att iscensätta en mus som gör reversibel nedreglering av ”Gen X”, fylla i avsnitten 1, 3 och 4 i den nedan protokoll. Tabell 1 sammanfattar också de nödvändiga komponenterna i systemets fjärrkontroll.

Önskat uttryck förändring Förtrycket bara Enbart aktivering Både förtryck och aktivering
Relevanta delar av protokollet 1, 3-4 2-4 1-4
Fjärrkontroll sekvens behövs i målgenen Repron (”förtryck intron”; 12 symmetriska lac operatörer plus en partiell kanin beta-globin intron) Tet aktörerna Repron och Tet aktörerna
Fjärrkontroll sekvens läge Intron Arrangören Intron & arrangören
Aktivator/Repressor behövs för önskad kontroll LacIGY Repressor rtTA-M2 aktivator LacIGY Repressor och rtTA-M2 aktivator
Reglerande ligander IPTG Doxycyklin IPTG och/eller doxycyklin

Tabell 1: Översikt över fjärrkontrollen komponenter.

Protocol

Alla djur förfaranden genomfördes med godkännande av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) vid University of Southern California och Van Andel Research Institute och i enlighet med guiden för skötsel och användning av försöksdjur från de nationella instituten av hälsa15.

1. ändra gen av intresse för förtryck av fjärrkontroll

  1. Använd riktlinjerna nedan, för att identifiera en transcriptionally inert intron mot 5' slutet av genen av intresse för insättning av sekvensen Repron (”Repression intrpå”; 12 symmetriska lac operatörer plus en partiell kanin beta-globin intron). Vara medveten om alternativa initiativtagare för gen av intresse och välja en intron enligt den avskrift som skall kontrolleras (dvs en intron som delas av alla avskrifter eller en specifik till en önskad avskrift).
    Obs: För gener utan en intron eller med dem mot slutet 3', infoga Repron sekvensen i arrangören (se Lee, et al.10 detaljerade anvisningar).
    1. Få den genomiska sekvensen för gen av intresse.
      1. Navigera till UCSC genomet webbläsare16,17, och välj det senaste utkastet av mus genomet (mus GRCm38/mm10 vid tidpunkten för offentliggörandet), som för närvarande är under fliken genomen .
      2. Ange namn eller symbol för genen sevärdheter i sökfältet för att Visa avskrifter för genen. Klicka på gå.
      3. Välj önskad avskrift varianten för gen av intresse.
      4. Klicka på symbolen gen bredvid den avskrift varianten av intresse (symbolen för den tidigare valda avskriften kommer att vara i en mörk låda).
      5. Klicka på länken Genomiska sekvensen under sekvens och länkar till verktyg och databaser banner.
      6. För Sekvens hämtning regionen alternativ, välj bara exonerna (5' UTR, CD-skivor, och 3' UTR), introner och standard en FASTA post per genen. För Sekvens formatering alternativ, Välj exonerna i versaler, allt annat i gemener och Mask upprepar till N (för att dölja repetitiva sekvenser). Klicka sedan på Skicka.
      7. Spara denna sekvens, bevara den övre - och gemener formateringen i ett dokument eller program som kan vara kommenterad.
    2. Undvika avbrott av CpG öar, vilket kan tyda på regioner med gen reglerande funktion.
      Obs: Även en 5' intron är att föredra för införande av Repron sekvensen, den första intron kan innehålla transkriptionell reglerande element såsom CpG öar (undersökt i det här steget) eller enhancer element (undersökt i steg 1.1.4), vilket bör undvikas för Repron insättningspunkten.
      1. Markera Visa för CpG öarna spåret under UCSC genomet webbläsaren uttryck och förordning fana, och klicka på Uppdatera.
      2. Zooma in på intronerna 5', klicka på varje CpG ö (visas i grönt vid tidpunkten för offentliggörandet om de finns) och välj Visa DNA för denna funktion.
      3. Efter väljande Mask upprepas n, Välj få DNA att erhålla CpG ön sekvensen.
      4. Överlagra dessa sekvenser med originalfilen sekvens, och kommentera dessa som intronic regioner att undvika på grund av möjliga gen tillsynsuppdrag.
    3. Undvika avbrott av icke-kodande RNAs, om de har en reglerande funktion.
      1. Markera Visa för GENCODE (häckning) spåret under UCSC genomet webbläsaren gener och Gene förutsägelser fana, och klicka på Uppdatera.
      2. Zooma in på intronerna 5', klicka på varje icke-kodande RNA (visas i grönt vid tidpunkten för offentliggörande om närvarande) och få DNA-sekvensen för var och en genom att klicka på dess kromosomala koordinater.
      3. I menyn Visa , väljer DNAoch på Mask upprepar till N. Klicka sedan på få DNA.
      4. Överlagra dessa sekvenser med originalfilen sekvens, och kommentera dessa som intronic regioner att undvika på grund av möjliga gen tillsynsuppdrag.
    4. Undvika intronic regioner med förstärkare signaturer i tissue(s) av intresse, såsom H3K4me1, H3K27ac och DNAS jag överkänslighet18,19,20,21, samt SAP bindande platser, som reglerar enhancer looping22,23.
      1. Navigera till koda databasen24,25, och välj ikonen experiment .
      2. Välj ChIP-seq eller DNAS-seqför typ av analys, och fylla i de andra kategorierna (organismen, Biosample typ, etc.) enligt cellerna som ska vara konstruerad.
      3. Håll muspekaren över symbolerna i blått efter funktionsurval, och välja den som verkar Visa resultat som lista (vänster piktogram vid tidpunkten för offentliggörandet).
      4. Välj datamängderna för målen i H3K4me1, H3K27ac, DNase jag och SAP som närmast matchar cellerna att vara konstruerad.
      5. Inom varje relevanta dataset, rulla ned till avsnittet filer , kontrollera att mm10 (eller den senaste genom-versionen) och UCSC är markerade och klicka på knappen visualisera .
      6. Nu i UCSC genomet webbläsaren och inzoomning på 5' intronerna för gen av intresse, klicka på varje H3K4me1, H3K27ac, DNase jag och SAP toppen i sina respektive kommenterad peak spår.
      7. Få den DNA-sekvensen för varje topp region genom att klicka på dess kromosomala koordinater.
      8. I menyn Visa , väljer DNAoch på Mask upprepar till N. Klicka sedan på få DNA.
      9. Överlagra dessa sekvenser med originalfilen sekvens, och kommentera dessa som intronic regioner att undvika på grund av möjliga gen tillsynsuppdrag.
    5. Undvika störningar av samförstånd skarvning sekvenser, så att inte störa lämpliga skarvning av exonerna.
      Obs: Även om sekvenser som krävs för skarvning är i stort sett begränsade till ca sex baser i slutet 5' av en intron26 och ca 60 baser på 3na ' slut27, är det lämpligt att välja en stor intron, möjliggör betydligt bredare marginaler från dessa samförstånd regioner för att minimera sannolikheten för påverkar skarvning. Intron analys verktyg, såsom SVM-BPfinder28, rekommenderas för en mer grundlig analys av potentiella splice sekvenser.
  2. Efter att identifiera en intronic region det uppfyller ovanstående kriterier (som exemplifieras för Dnmt1 i kompletterande data), skärm sekvensen med hjälp av en online sgRNA utforma verktyg för att identifiera en sgRNA i regionen med hög specificitet och förutspådde effektivitet noter.
    1. Navigera till en online sgRNA design redskap val, såsom CRISPOR29.
    2. Ange sekvensen i regionen intronic i intresse, ange relevanta referensen genomet och välj önskad Protospacer angränsande motiv (PAM). Klicka på Submit.
    3. Sortera de förutspådda sgRNAs specificitet poäng och välj en eller flera sgRNAs som också har en hög förväntad effektivitet poäng29.
      1. Valfritt: För att maximera sannolikheten för att använda en effektiv sgRNA, först testa flera topp-scoring sgRNAs klyvning effektivitet i en in vitro-test30, och fortsätt med de effektivaste sgRNA i vivo.
  3. Designa en DNA mall som innehåller en PITT (pronukleär injektion-baserade riktad genmodifiering) landning pad sekvens, som exemplifieras i kompletterande figur 1A, B, flankerad på båda sidor av 60-base homologi armar som motsvarar den sgRNA som skär webbplats31 .
    Obs: Landning pad innehåller två heterotypic loxP webbplatser (JT15 och Lox2272) och möjliggör riktade införande av stora sekvenser genom en tvåstegsstrategi; vara säker på att korsningar av detta införande inte skapar kryptiska splice platser. Alternativt kan en embryonala stamceller (ESC) - baserade knock - strategi användas för att infoga sekvensen Repron direkt.
  4. Förbered sgRNA, Cas9 protein och enkelsträngat DNA (ssDNA) mallen för landning pad och microinject i befruktade ägg (från B6C3F1/J möss eller annan önskad stam) enligt fastställda protokoll32,33.
  5. Skärmen för möss med knock-modulen landning pad.
    1. Utforma PCR primers kompletterande till det genomiska locus men utanför de regioner som riktade av homologi armar, som visats för Dnmt1 i kompletterande figur 1 c. Undvik repetitiva genomsekvenser när du utformar primers.
    2. Extrahera DNA från svans klipp av möss enligt fastställda protokoll34.
    3. Använda PCR och gel elektrofores för att identifiera möss med en landning pad isättning.
    4. Bekräfta att inpressning lyckades genom sekvensering av PCR-produkter.
      Obs: Oönskade stora borttagningar och rearrangements kan införas av CRISPR/Cas935, så noggrann screening för off-target redigering rekommenderas innan du fortsätter35,36,37.
  6. Med befruktade ägg från landning pad möss, microinject iCre mRNA38 och en transgen plasmid som innehåller sekvensen Repron flankerad av JTZ17 och Lox2272 rekombination platser31,39,40, 41 enligt etablerade metoder38,42,43.
  7. Skärmen för möss med Repron insättningspunkten.
    1. Design PCR primers kompletterar det genomiska locus, utanför Repron skäret. Undvik repetitiva genomsekvenser när du utformar primers.
    2. Extrahera DNA från svans klipp av möss enligt fastställda protokoll34.
    3. Använda PCR och gel elektrofores för att identifiera möss med en Repron isättning.
    4. Bekräfta inpressning lyckades genom sekvensering av PCR-produkter.

2. ändra genen av intresse för uppreglering av fjärrkontroll

  1. Använd riktlinjerna nedan för att identifiera en region i arrangören av genen som är osannolikt att stör arrangören funktion vid införande av tet operatören sekvenser. Vara medveten om alternativa initiativtagare för gen av intresse och välja en promotor enligt avskrift som skall kontrolleras (dvs en promotor som delas av alla avskrifter eller en specifik till en önskad avskrift).
    1. Skaffa den genomiska sekvensen för arrangören av intresse.
      1. Navigera till UCSC genomet webbläsare16,17, och välj det senaste utkastet av mus genomet (mus GRCm38/mm10 vid tidpunkten för offentliggörandet), som för närvarande är under fliken genomen .
      2. Ange namn eller symbol för genen sevärdheter i sökfältet för att Visa avskrifter för genen. Klicka på gå.
      3. Välj önskad avskrift varianten för gen av intresse.
      4. Klicka på symbolen gen bredvid den avskrift varianten av intresse (gen symbolen för den tidigare valda avskriften kommer att vara i en mörk låda).
      5. Klicka på länken Genomiska sekvensen under sekvens och länkar till verktyg och databaser banner.
      6. För Sekvens hämtning regionen alternativ, väljer du bara arrangören/Upstream av 1000 baser. För Sekvens formatering alternativ, Välj Mask upprepar till N (för att dölja repetitiva sekvenser). Klicka sedan på Skicka.
      7. Spara denna arrangören sekvens i ett dokument eller program som kan vara kommenterad.
    2. Vissa regioner som är fria från förmodade transkription faktorn bindande platser, som att avbryta dessa sekvenser kan förändra endogena genuttryck.
      1. Navigera till UCSC genomet webbläsaren och öppna den senaste versionen av mus genomet.
      2. Ovanför den kartläggning och sekvensering bannern, väljer du spår hubbar.
      3. Klicka på mm10 bredvid namnet hub JASPAR 2018 TFBS (eller den senaste JASPAR versionen).
      4. Ange namn eller symbol för genen sevärdheter i sökfältet för att Visa avskrifter för genen. Klicka på gå.
      5. Välj önskad avskrift varianten för gen av intresse.
      6. Rulla ned till JASPAR 2018 TFBS banner och klicka på den nedrullningsbara pilen markerar du alternativet önskad visning för spåret, såsom squish. Klicka på Uppdatera.
      7. Zooma in i promotor regionen av genen av intresse och identifiera regioner som är gratis (eller relativt gratis) av transkription faktorn bindande platser enligt JASPAR spåret. Spela in kromosomala koordinaterna för dessa regioner.
      8. Få den genomiska sekvensen av dessa kromosomala koordinater genom att skriva dem i sökfältet och klicka på gå. I menyn Visa , väljer DNAoch på Mask upprepar till N. Klicka sedan på få DNA.
      9. Överlagra dessa sekvenser med originalfilen sekvens, och kommentera dessa som idealisk arrangören regioner att rikta på grund av bristande transkription faktorn bindande.
    3. Inom dessa sekvenser, Välj en perturbable Promotorn region som är uppströms men nära webbplatsen start transkription av genen av intresse.
      Obs: En insättning som är för nära transkription start webbplatsen kan öka chansen att försämra arrangören aktivitet, men ett införande som är för långt kan sänka nivån för uppreglering. Infoga tet operatören sekvenser ca 200 basepairs uppströms av transkription start webbplatsen har resulterat i robust uppreglering av två initiativtagarna testade (se diskussion)10.
  2. Skärmen regionen valda arrangören använder en online sgRNA designverktyg för att identifiera en sgRNA i regionen med hög specificitet och förutsedd effektivitet betyg.
    1. Navigera till en online sgRNA design redskap val, såsom CRISPOR29.
    2. Ange sekvensen av regionen av intresse, ange relevanta referensen genomet och välj önskad Protospacer angränsande motiv (PAM). Klicka på Submit.
    3. Sortera de förutspådda sgRNAs specificitet poäng och välj en eller flera sgRNAs som också har en hög förväntad effektivitet poäng29.
      1. Valfritt: För att maximera sannolikheten för att använda en effektiv sgRNA, först testa klyvning effektiviteten i flera sgRNAs i en in vitro-test30, och fortsätt med de effektivaste sgRNA i vivo.
  3. Designa en DNA mall som innehåller tet operatörer flankerad på båda sidor av 60-base homologi armar som motsvarar den sgRNA som skär webbplats31,33.
    Anmärkning: Antalet tet operatörer är anpassningsbar; införandet av två till fyra tet operatören sekvenser i tandem har tidigare visat sig vara effektiva, men i princip fler operatörer är önskvärda för att köra högre uttryck. Alternativt kan en ESC-baserade inpressning strategi användas för att infoga tet operatörerna.
    1. Tillval: För experimentella bevis att de föreslagna ändringarna sannolikt inte kommer att störa den endogena transkriptionell aktiviteten av genen av intresse, klona bakåtkompilerade arrangören sekvensen i en firefly luciferas vektor (till exempel pGL3-Basic), och jämföra dess effekt till ursprungliga arrangören med en luciferas-analys.
  4. Förbereda sgRNA, Cas9 protein och ssDNA mallen som innehåller de tet operatör sekvenserna, och microinject i befruktade ägg (från B6C3F1/J möss eller annan önskad stam) enligt fastställda protokoll32,33.
    Obs: På grund av komplexiteten i syntetisera en repetitiv sekvens, en in vitro-transkription/omvänd transkription-baserade strategi rekommenderas att syntetisera en ssDNA mall från ett dubbelsträngat DNA (dsDNA) plasmid44. Alternativt en dsDNA mall kan användas för Mikroskop, men inpressning effektivitet kan vara minskad45.
  5. Skärmen för möss med inpressning av tet operatörerna.
    1. Design PCR primers kompletterar det genomiska locus, utanför de regioner som riktade av homologi armarna. Undvik repetitiva genomsekvenser när du utformar primers.
    2. Extrahera DNA från svans klipp av möss enligt fastställda protokoll34.
    3. Använda PCR och gel elektrofores för att identifiera möss med införandet av tet operatörerna.
    4. Bekräfta att inpressning lyckades genom sekvensering av PCR-produkter.
      Obs: Oönskade stora borttagningar och rearrangements kan införas av CRISPR/Cas935, så noggrann screening för off-target redigering rekommenderas innan du fortsätter35,36,37.

3. utveckla aktivator- eller repressor-uttryckande möss

  1. Identifiera ett kraftfullt uttrycker Promotorn för tissue(s) eller cell typ(er) av intresse.
    Obs: En litteratursökning och den vävnad-specifika Promotorn databasen46 kan vara användbara för att identifiera sådana en promotor.
  2. Placera medföljande förbättrade lac repressor eller tet aktivator sekvens nedströms av önskad arrangören att generera en transgena konstruktion.
  3. Producera transgena möss rad(er) med hjälp av transgena standardförfaranden42,43,47. Alternativt kan en sitespecifik genmodifiering strategi användas att undvika position effekter och låta singel-kopia transgenens införande31,48.
  4. Propagera grundarna, och fastställa uttrycksmönstret och nivån på transgenens hos avkomman till varje grundare. Markera rader med robust uttryck i avsedda vävnad typ(er) för vidare avel.
    1. Rasen grundarna till vildtyp möss.
    2. Design PCR primers som kommer att upptäcka insättningspunkten aktivator eller repressor.
    3. Extrahera DNA från svans klipp av avkomman enligt fastställda protokoll34.
    4. Använda PCR och gel elektrofores för att identifiera möss med insättningspunkten.
    5. Bekräfta transgenens insättningspunkten genom sekvensering av PCR-produkter.
    6. Propogate de transgena linjerna.
    7. Offra några valpar ur varje rad, och samla vävnaderna av intresse för qRT-PCR, immunohistokemi eller western blotting för att analysera uttrycket av genen/protein av intresse i målet vävnad typ(er).
    8. Välj raderna som har det starkaste uttrycket i vävnader i intresse för användning i avsnitt 4.

4. manipulera genuttryck i vivo

  1. Föder upp möss med den modifierade genen av intresse (avsnitt 1 eller 2) med de transgena möss från avsnitt 3 enligt etablerade avel praxis49. Föder upp möss till homozygosity för den modifierade allelen för kontroll av maximal uttryck.
  2. För återgång eller justering av förtryck av målgenen, administrera IPTG i dricksvattnet.
    1. För att experimentellt bestämma dosen av IPTG att använda, behandla möss av lämpliga genotyp och kontroller med en av en rad doser (rekommenderas start intervall: 0 – 400 mM IPTG) för minst en vecka50,51. Omfatta minst tre möss per behandlingsgrupp och välj ålder och kön av möss som är mest relevanta för de planerade framtida experiment. Obs: Häckande par av möss kan behandlas med IPTG vatten ge utvecklande exponering av IPTG till avkomman om så önskas13eller möss kan börja behandlingen när som helst efter födseln.
      1. Lös upp önskad massa IPTG i sterilt destillerat vatten på dagen för administration, och rör om med en uppståndelse bar i 5 minuter eller tills helt upplöst.
      2. Wrap flaskan med folie, och administrera IPTG vattnet i en ljus-skyddad flaska. Byt ut två gånger i veckan. Ge samma källa av vatten till möss som fick 0 mM IPTG.
      3. Efter minst en vecka, offra möss och analysera uttrycket av genen av intresse i det målet tissue(s) använder qRT-PCR, immunohistokemi eller western blotting.
      4. Identifiera den dosen som återställer uttrycket av genen av intresse som vildtyp kontroller, och denna dos för att uppnå normalt uttryck av genen i framtida experiment.
  3. För induktion av genen uppreglering, administrera doxycyklin (Dox) i kosten.
    1. För att experimentellt bestämma koncentrationen av Dox att administrera, behandla möss av lämpliga genotyp och kontroller med en av en rad av Dox koncentrationerna (rekommenderas start intervall: 0-5000 mg/kg Doxycyklinhyklat) för minst en vecka52 ,53, inklusive minst tre möss per behandlingsgrupp. Köp Dox-innehållande mus mat från en kommersiell leverantör.
      Obs: Häckande par av möss kan behandlas med Dox mat ge utvecklande exponering av Dox till avkomman om så önskas54,55, eller möss kan börja behandlingen när som helst efter födseln.
    2. Ersätta kosten en gång per vecka. Ge samma bas kost till möss som fick Dox-fri mat.
    3. Efter minst en vecka, offra möss och analysera uttrycket av genen av intresse i det målet tissue(s) använder qRT-PCR, immunohistokemi eller western blotting.
    4. Identifiera den dosen som höjer uttrycket av genen av intresse till önskad nivå, och denna dos för att uppnå överuttryck av genen i framtida experiment.

Representative Results

Systemets fjärrkontroll förtryck förmåga har påvisats i två olika metoder hittills. I den första metoden infogades lac repressor bindningsställen på endogena arrangören av Dnmt1 genen. I den andra metoden, som rekommenderas av detta protokoll, infördes de repressor bindningsställen en nedströms intron att undvika risken för påverkar arrangören funktion genom införande och därmed förenkla tillämpningen av fjärrkontrollen- systemet. Båda dessa tillvägagångssätt resulterat i framgångsrika förtryck (figur 2A, B och figur 3A-C)10. Dnmt1 uttryck förtrycktes till 15% av de oreglerade nivåer med hjälp av metoden arrangören-baserade (figur 2A). Denna snäva förtryck bröts på ett dosberoende sätt genom att behandla möss med varierande mängder av IPTG (figur 2A). Observerade Dnmt1 förtrycket har validerats på proteinnivå genom immunfärgning (figur 2B). Vi inte Observera någon märkbar skillnad i Dnmt1 uttryck mellan Dnmt1+/ + och Dnmt1LO/LO möss, bekräftar att våra lac operatören införande inte hade störs normala arrangören funktion10. Den intron-baserat tillvägagångssätt uppnått mer än 90% förtryck från operatörerna ligger flera kilobases nedströms av transkription start platsen av förmildrande transkription töjning (figur 3A, B)10. Detta intron-baserat tillvägagångssätt validerades ytterligare på sju extra robust initiativtagare (figur 3C). Undantagslöst snäva förtryck uppnåddes från alla initiativtagarna testade. Ingen korrelation mellan kvarvarande uttryck och styrkan hos initiativtagarna observerades, vilket tyder på att förtryck kapaciteten hos våra intron-baserade förtryck systemet överskrider transkriptionell styrkan hos alla robust initiativtagarna vi testat () Figur 3 ( C).

Invivo uppreglering förmåga fjärrkontroll systemet visades också på genen Dnmt1 . Vi införde två kopior av operatorn tet i Dnmt1 arrangören, tillsammans med lac operatören sekvenser, som möjliggör antingen uppreglering eller nedreglering beroende på vilken effektor protein är närvarande. Robust uppreglering och nedreglering av Dnmt1 uttryck, nära två tiopotenser (10% till 650%), uppnåddes i ESCs som innehåller den modifierade endogena Dnmt1 allelen (Dnmt1LGT), (figur 4A)10 . Båda förordningarna var fullt reversibel inducerbara av IPTG och Dox behandlingar, respektive (figur 4A). Vi introducerade nästa Dnmt1LGT ändringen i mus könsceller att testa funktionen i vivo uppreglering av systemets fjärrkontroll. Stark uppreglering av Dnmt1 observerades från lever, mjälte och njure, medan inga påvisbara uppreglering i hjärtat observerades (figur 4B)7. Cellcykeln-beroende uttrycksmönstret av Dnmt1 och bristen på proliferativ celler i hjärtat kan ligga bakom denna observation10,56. Det återstår för att se huruvida denna begränsning kan övervinnas genom att öka uttrycket av aktivator eller numrera av dess bindningsställen.

Figure 2
Figur 2 : In vivo förtryck av Dnmt1 av den LacIGY repressor. (A) möss med lac operatörer (LO) infogas i Dnmt1 arrangören, med eller utan uttryck för LacIGY, behandlades med olika doser av IPTG. qRT-PCR-analys av Dnmt1 uttryck visar dosberoende återföring av Dnmt1 förtryck i vivo genom IPTG behandling. Varje stapel representerar data från en annan mus. Uppgifterna representerar medelvärde ± SEM (n = 3). (B) immunfärgning av Dnmt1 protein i kolon kryptor av möss som dricksvatten med eller utan 160 mM IPTG för 3 veckor. Denna siffra har ändrats från Lee et al.10vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : In vivo och in vitro-förtryck av olika främjare av fjärrkontroll systemet. (A), en tidig version av sekvensen Repron (R *) infogades i en intron nedströms Villin arrangörens i en transgen mus som Villin-mKate2 (VilmKate2). qRT-PCR-analys av mKate2 uttryck i tunntarmen av möss med eller utan den LacIGY repressor visas. Varje stapel representerar data från en annan mus. (B) Confocal mKate2 bilder av tunntarmen med och utan LacIGY uttryck. (C) sex symmetriska lac operatörer (S) sattes in mellan olika initiativtagare och luciferas reporter. Reportrar (50 ng/hål i plattan med 96 brunnar) och repressor plasmider infördes normalnivå i NIH/3T3-celler i förhållandet 1:1 molar. Luciferas värden var bedömda 24 h efter transfection. Dessa in vitro-data representerar procentandelen luciferas uttryck i LacIGY-uttrycker celler i förhållande till de som uttrycker icke-funktionella Lindeberg (NFlacI). T-test användes för att bestämma statistisk signifikans. Uppgifterna representerar medelvärde ± SEM (n = 3). P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01. Denna siffra har ändrats från Lee et al.10vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Ned- eller uppreglering av Dnmt1 uttryck in vitro- och in vivo. (A) komplett fjärrkontroll systemet var konstruerad i odlade ESCs av genen inriktning och elektroporation metoder. Maximal förtryck av Dnmt1 uttryck uppnåddes med ingen behandling medan maximal aktivering uppnåddes genom både IPTG och Dox behandling. Uppgifterna representerar medelvärde ± SEM (n = 3). P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01 (Welch's t-test). (B) In vivo aktivering av Dnmt1 av fjärrkontroll systemet, vilket framgår av immunfärgning av Dnmt1 protein i olika vävnader från fjärrkontroll möss. Den LGT allelen representerar arrangören modifiering av Dnmt1 innehålla lac operatör och tet aktivator bindningsställen. Möss behandlades med en normal eller Dox-innehållande kost (5000 mg/kg Doxycyklinhyklat) för en månad. Denna siffra har ändrats från Lee et al.10vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Supplementary Figure 1
Kompletterande bild 1 : Exempel på landning pad införande i murina Dnmt1 intron 1. (A) Schematisk bild av DNA mall för landning pad införande, anpassad från Quadros et al. (2015)31. Heterotypic loxP platser, JT15 och Lox2272, separeras genom en kort distans-sekvens (sp) och flankerad på varje sida av 60-bp DNA som är homolog till målet genomisk regionen. (B), Sample DNA mall för landning pad införande i den Dnmt1 intron med hjälp av följande sgRNA: CTAGTACCACTCCTGTACCG (som riktar den omvänd strand). Den valda intronic regionen var bioinformatically informeras av steg 1,1, och sgRNA identifierades med CRISPOR29. (C) exempel på PCR primer design för bedömning av införande av landning pad. PCR primers utformades utanför homologi armarna på mallen för att bekräfta integreras endogena Dnmt1. Den vildtyp PCR-Amplikonen är 213 bp; efter införande, blir det 291 bp. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Discussion

Ett kritiskt steg och potentiell begränsning av fjärrkontroll systemet är den utmaning som är associerad med insättningspunkten repressor eller aktivator bindande platser utan att påverka mål genuttryck. Vår ursprungliga förtryck strategi, involverade som tillämpas för genen Dnmt1 , införande av lac repressor bindande platser inom transcriptionally kritiska regioner i en promotor. För att minska risken som påverkar arrangören funktion och därigenom förbättra den allmänna tillämpligheten av fjärrkontroll systemet, vi utvecklat betraktelsesätt intron-baserade förtryck. Styrkan av vår förbättrade lac systemet tillät oss att tätt förtränga transkriptionen av alla starka tillskyndarna vi testat på operatörer som ligger hundratals till flera kilobases nedströms av transkriptionen starta platser (figur 3A – C) 10. allt förtryck var oberoende av transkriptionell styrkorna av de projektansvariga (figur 3A – C)10. Detta tyder på att förtryck kapaciteten hos våra intron-baserade förtryck systemet överskrider testade initiativtagarna transkriptionell styrka. I detta intron-baserat tillvägagångssätt är det sannolikt att förtrycket medieras genom fysiska störningar mellan två komponenter, transkription töjning maskinen och den lac kvinnoförtryckarna57. Denna enkla förtryck mekanism och påvisade robustheten av intron-baserade metoden kan göra detta tillvägagångssätt allmänt tillämpliga på olika gener, vävnader och organismer.

Uppreglering av fjärrkontroll systemet kräver transactivator bindande sekvenser att vara i närheten av promotorn mål genen, som medför risk för påverkar arrangören funktion. Vi fann dock att placeringen av bindande sekvenser kan vara utanför regionen transcriptionally kritiska. Både Dnmt1 och EF1α initiativtagare var kraftigt uppreglerad från tet aktörer ligger ett par hundra baser uppströms av transkription start platser10. Här avslappnad villkoret minskar chansen påverka arrangören funktion av en målgenen i avsaknad av transactivator. Öka antalet bindande sekvenser och/eller användningen av starkare transactivators kunde hjälpa till att ytterligare minska risken genom att aktivera uppreglering från platser längre bort från webbplatsen transkription start.

Vår fjärrkontroll systemet ger eleganta kontroll av nivå, tidpunkten och platsen för endogena genuttryck, möjliggör testning reversibiliteten av en fenotyp och följderna av olika uttryck nivåer, som inte lätt kan uppnås genom aktuella i vivo gen uttryck-control teknik. Det är viktigt att notera att i de flesta gen uttryck analyser, inklusive vår, uttryckets värden representerar i genomsnitt en population av celler bland vilka betydande variation kan hittas. Denna heterogenitet kan påverka cellulära beslutsprocesser, såsom differentiering eller apoptos58. Även om precisionen i gen uttryck kontroll kunde sannolikt ytterligare förbättras genom ytterligare genetiska krets engineering59, gör observerade styrkan av vårt nuvarande system att användbar undersökning av geners funktion i många biologiska sammanhang. Dessutom förväntas en hög grad av målet specificitet på grund av komplexiteten av operatören sekvenser samt stora evolutionära avståndet mellan däggdjur och de ursprungliga arterna av reglerande komponenter60. Transgena möss rader kvinnoförtryckarna och aktivatorer kan dessutom utvecklas och anställd för någon endogena gen. Till exempel kan befintliga tet transactivator musmodeller anpassas för att åstadkomma uppreglering av en målgenen i önskad mus vävnader. Vi har nyligen utvecklat en transgena linje som kan köra robust vävnad-specifika uttryck för vår förbättrade lac repressor i flera vävnadstyper när de kombineras med befintliga Cre linjer genom att införa den lacIGY genen i det Hipp11 locus48 under kontroll av ett Lox-STOP-Lox element (opublicerade). Denna linje skulle väsentligt underlätta vävnadsspecifika tillämpningen av systemets fjärrkontroll.

Gen uppreglering av fjärrkontroll systemet ger flera fördelar jämfört med nuvarande inducerbara transgena metoder. Det kräver inte generation av flera transgena linjerna att testa för position effekter av införande, eftersom det använder det endogena locus. Dessutom, är detta tillvägagångssätt väl lämpad för uppreglering av gener med stark baslinjen uttryck eftersom det förbättrar uttryck från en redan robusta Promotorn, medan konventionella transgena modeller förlitar sig på minimal viral initiativtagare. Slutligen, vävnaden specificitet, cellcykeln kontroll och skarvning varianter av en målgenen får behållas vid uppreglering av vår strategi, eftersom det bevarar element av naturliga förordning såsom medfödda cis-reglerande element. Tillkomsten av CRISPR/Cas-medierad gen-inriktning teknik kommer kraftigt att underlätta tillämpningen av denna teknik i olika modellsystem.

Disclosures

PWL serverar på den vetenskapliga rådgivande brädor av AnchorDx och Progenity, Inc.

Acknowledgments

Vi tackar den sena Dr Heidi Scrable för hennes generösa gåva på den däggdjur lacI gen konstruktion (Mayo Clinic, Rochester, MN), Dr Daniel Louvard (Institut Curie, Paris, Frankrike) för att tillhandahålla Promotorn Villin och Dr Laurie Jackson-Grusby (Children's Hospital, Boston, MA) för hennes bidrag till de tidiga stadierna av denna teknikutveckling. Vi är tacksamma för Dr Nancy Wu och Dr Robert Maxson för deras hjälp generera de transgena och knockout-möss. Vi tacka medlemmarna i Laird laboratoriet för bra diskussioner och stöd. Detta arbete stöds av National Institutes of Health [R01 CA75090, R01 DA030325, R01 CA157918 och R01 CA212374 till P.W.L. och 1F31CA213897-01A1 till N.A.V.S].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
B6C3F1/J The Jackson Laboratory 100010 https://www.jax.org/strain/100010
Cas9 Protein PNA Bio CP04 http://www.pnabio.com/products/CRISPR_Cas9.htm?gclid=EAIaIQobChMIsoG8pLL33QIVBr7ACh0naQ4dEAAYAiAAEgKyHvD_BwE
CRISPOR Haeussler et al. 2016 http://crispor.tefor.net/
Doxycycline-Containing Mouse Diet Envigo Varies by concentration https://www.envigo.com/products-services/teklad/laboratory-animal-diets/custom-research/doxycycline-diets/
ENCODE Database Stanford University https://www.encodeproject.org/
iCre mRNA synthesis plasmid (pBBI) Addgene 65795 https://www.addgene.org/65795/
IPTG GoldBio I2481C https://www.goldbio.com/search?isSearch=Y&q=iptg
pGL3-Basic Promega E1751 https://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-vectors-and-cell-lines/pgl3-luciferase-reporter-vectors/?catNum=E1751
SVM-BPfinder Regulatory Genomics, Pompeu Fabra University http://regulatorygenomics.upf.edu/Software/SVM_BP/
TiProD: Tissue specific promoter Database Department of Bioinformatics, UMG, University of Göttingen  http://tiprod.bioinf.med.uni-goettingen.de
UCSC Genome Browser University of California Santa Cruz https://genome.ucsc.edu/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jackson-Grusby, L., et al. Loss of genomic methylation causes p53-dependent apoptosis and epigenetic deregulation. Nature Genetics. 27 (1), 31-39 (2001).
  2. David, G., Turner, G. M., Yao, Y., Protopopov, A., DePinho, R. A. mSin3-associated protein, mSds3, is essential for pericentric heterochromatin formation and chromosome segregation in mammalian cells. Genes & Development. 17 (19), 2396-2405 (2003).
  3. Sumi-Ichinose, C., Ichinose, H., Metzger, D., Chambon, P. SNF2beta-BRG1 is essential for the viability of F9 murine embryonal carcinoma cells. Molecular and Cellular Biology. 17 (10), 5976-5986 (1997).
  4. Premsrirut, P. K., et al. A rapid and scalable system for studying gene function in mice using conditional RNA interference. Cell. 145 (1), 145-158 (2011).
  5. Qiu, S., Adema, C. M., Lane, T. A computational study of off-target effects of RNA interference. Nucleic Acids Research. 33 (6), 1834-1847 (2005).
  6. Gilbert, L. A., et al. Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation. Cell. 159 (3), 647-661 (2014).
  7. Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).
  8. Peng, H., Ivanov, A. V., Oh, H. J., Lau, Y. F., Rauscher, F. J. Epigenetic gene silencing by the SRY protein is mediated by a KRAB-O protein that recruits the KAP1 co-repressor machinery. The Journal of Biological Chemistry. 284 (51), 35670-35680 (2009).
  9. Groner, A. C., et al. KRAB-zinc finger proteins and KAP1 can mediate long-range transcriptional repression through heterochromatin spreading. PLOS Genetics. 6 (3), 1000869 (2010).
  10. Lee, K. H., Oghamian, S., Park, J. A., Kang, L., Laird, P. W. The REMOTE-control system: a system for reversible and tunable control of endogenous gene expression in mice. Nucleic Acids Research. 45 (21), 12256-12269 (2017).
  11. Gossen, M., Bonin, A. L., Bujard, H. Control of gene activity in higher eukaryotic cells by prokaryotic regulatory elements. Trends in Biochemical Sciences. 18 (12), 471-475 (1993).
  12. Hu, M. C., Davidson, N. The inducible lac operator-repressor system is functional in mammalian cells. Cell. 48 (4), 555-566 (1987).
  13. Cronin, C. A., Gluba, W., Scrable, H. The lac operator-repressor system is functional in the mouse. Genes & Development. 15 (12), 1506-1517 (2001).
  14. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  15. Council, N. R. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals: Eighth Edition. , The National Academies Press. (2011).
  16. Casper, J., et al. The UCSC Genome Browser database: 2018 update. Nucleic Acids Research. 46 (1), 762-769 (2018).
  17. Church, D. M., et al. Lineage-specific biology revealed by a finished genome assembly of the mouse. PLOS Biology. 7 (5), 1000112 (2009).
  18. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  19. Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
  20. Heintzman, N. D., et al. Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome. Nature Genetics. 39 (3), 311-318 (2007).
  21. Rada-Iglesias, A., et al. A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature. 470 (7333), 279-283 (2011).
  22. Handoko, L., et al. CTCF-mediated functional chromatin interactome in pluripotent cells. Nature Genetics. 43 (7), 630-638 (2011).
  23. Splinter, E., et al. CTCF mediates long-range chromatin looping and local histone modification in the beta-globin locus. Genes & Development. 20 (17), 2349-2354 (2006).
  24. The ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  25. Rosenbloom, K. R., et al. ENCODE data in the UCSC Genome Browser: year 5 update. Nucleic Acids Research. 41, Database issue 56-63 (2013).
  26. Murray, J. I., Voelker, R. B., Henscheid, K. L., Warf, M. B., Berglund, J. A. Identification of motifs that function in the splicing of non-canonical introns. Genome Biology. 9 (6), 97 (2008).
  27. Taggart, A. J., et al. Large-scale analysis of branchpoint usage across species and cell lines. Genome Research. 27 (4), 639-649 (2017).
  28. Corvelo, A., Hallegger, M., Smith, C. W., Eyras, E. Genome-wide association between branch point properties and alternative splicing. PLOS Computational Biology. 6 (11), 1001016 (2010).
  29. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
  30. Grainger, S., et al. CRISPR Guide RNA Validation In Vitro. Zebrafish. 14 (4), 383-386 (2017).
  31. Quadros, R. M., Harms, D. W., Ohtsuka, M., Gurumurthy, C. B. Insertion of sequences at the original provirus integration site of mouse ROSA26 locus using the CRISPR/Cas9 system. FEBS Open Bio. 5, 191-197 (2015).
  32. Harms, D. W., et al. Mouse Genome Editing Using the CRISPR/Cas System. Current Protocols in Human Genetics. 83, (2014).
  33. Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors. Nature Protocols. 13 (1), 195-215 (2018).
  34. Laird, P. W., et al. Simplified mammalian DNA isolation procedure. Nucleic Acids Research. 19 (15), 4293 (1991).
  35. Kosicki, M., Tomberg, K., Bradley, A. Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements. Nature Biotechnology. 36 (8), 765-771 (2018).
  36. Akcakaya, P., et al. In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations. Nature. 561 (7723), 416-419 (2018).
  37. Lazzarotto, C. R., et al. Defining CRISPR-Cas9 genome-wide nuclease activities with CIRCLE-seq. Nature Protocols. 13 (11), 2615-2642 (2018).
  38. Ohtsuka, M., et al. Improvement of pronuclear injection-based targeted transgenesis (PITT) by iCre mRNA-mediated site-specific recombination. Transgenic Research. 22 (4), 873-875 (2013).
  39. Ohtsuka, M., et al. Pronuclear injection-based mouse targeted transgenesis for reproducible and highly efficient transgene expression. Nucleic Acids Research. 38 (22), 198 (2010).
  40. Lee, G., Saito, I. Role of nucleotide sequences of loxP spacer region in Cre-mediated recombination. Gene. 216 (1), 55-65 (1998).
  41. Thomson, J. G., Rucker, E. B., Piedrahita, J. A. Mutational analysis of loxP sites for efficient Cre-mediated insertion into genomic DNA. Genesis. 36 (3), 162-167 (2003).
  42. Cho, A., Haruyama, N., Kulkarni, A. B. Generation of Transgenic Mice. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter Unit-19.11 (2009).
  43. Pu, X. A., Young, A. P., Kubisch, H. M. Production of Transgenic Mice by Pronuclear Microinjection. Methods in Molecular Biology. 1874, 17-41 (2019).
  44. Murgha, Y., et al. Combined in vitro transcription and reverse transcription to amplify and label complex synthetic oligonucleotide probe libraries. Biotechniques. 58 (6), 301-307 (2015).
  45. Quadros, R. M., et al. Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins. Genome Biology. 18 (1), 92 (2017).
  46. Chen, X., Wu, J. M., Hornischer, K., Kel, A., Wingender, E. TiProD: the Tissue-specific Promoter Database. Nucleic Acids Research. 34, Database issue 104-107 (2006).
  47. Haruyama, N., Cho, A., Kulkarni, A. B. Overview: Engineering transgenic constructs and mice. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter Unit-19.10 (2009).
  48. Tasic, B., et al. Site-specific integrase-mediated transgenesis in mice via pronuclear injection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7902-7907 (2011).
  49. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Fundamentals of Breeding and Weaning. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
  50. Wyborski, D. L., DuCoeur, L. C., Short, J. M. Parameters affecting the use of the lac repressor system in eukaryotic cells and transgenic animals. Environmental and Molecular Mutagenesis. 28 (4), 447-458 (1996).
  51. Wyborski, D. L., Short, J. M. Analysis of inducers of the E.coli lac repressor system in mammalian cells and whole animals. Nucleic Acids Research. 19 (17), 4647-4653 (1991).
  52. Traykova-Brauch, M., et al. An efficient and versatile system for acute and chronic modulation of renal tubular function in transgenic mice. Nature Medicine. 14 (9), 979-984 (2008).
  53. Michel, G., Mosser, J., Fauran, F. Serum kinetics of doxycycline polyphosphate in dogs. European Journal of Drug Metabolism and Pharmacokinetics. 4 (1), 43-48 (1979).
  54. Bertocchi, I., et al. Regulatory functions of limbic Y1 receptors in body weight and anxiety uncovered by conditional knockout and maternal care. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (48), 19395-19400 (2011).
  55. Plageman, T. F., Lang, R. A. Generation of an Rx-tTA: TetOp-Cre knock-in mouse line for doxycycline regulated Cre activity in the Rx expression domain. PLOS One. 7 (11), 50426 (2012).
  56. Mollova, M., et al. Cardiomyocyte proliferation contributes to heart growth in young humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1446-1451 (2013).
  57. Ptashne, M. Principles of a switch. Nature Chemical Biology. 7 (8), 484-487 (2011).
  58. Balazsi, G., van Oudenaarden, A., Collins, J. J. Cellular decision making and biological noise: from microbes to mammals. Cell. 144 (6), 910-925 (2011).
  59. Nevozhay, D., Zal, T., Balazsi, G. Transferring a synthetic gene circuit from yeast to mammalian cells. Nature Communications. 4, 1451 (2013).
  60. Labow, M. A., Baim, S. B., Shenk, T., Levine, A. J. Conversion of the lac repressor into an allosterically regulated transcriptional activator for mammalian cells. Molecular and Cellular Biology. 10 (7), 3343-3356 (1990).

Tags

Genetik fråga 145 transkription uttryck vändbar lac repressor tet aktivator Dnmt1 förtryck genreglering inducerbara
In vivo tillämpning av systemet med fjärrkontroll för Manipulation av endogena genuttrycket
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vander Schaaf, N. A., Oghamian, S.,… More

Vander Schaaf, N. A., Oghamian, S., Park, J. A., Kang, L., Laird, P. W., Lee, K. H. In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression. J. Vis. Exp. (145), e59235, doi:10.3791/59235 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter