Summary
该协议的目的是描述一种分析成人神经干细胞/祖细胞行为的方法,以响应特定局部神经回路的化学遗传学操作。
Abstract
成人神经发生是一个动态过程,新激活的神经干细胞 (NSC) 在分粒区 (SGZ) 的登牙陀螺(DG) 生成新的神经元,这些神经元集成到现有的神经回路中,并有助于特定的海马功能.重要的是,成人神经发生是高度容易受到环境刺激,这允许各种认知功能的活动依赖调节。来自各个大脑区域的大量神经回路协调这些复杂的认知功能。因此,了解特定神经回路如何调节成人神经发生非常重要。在这里,我们描述了一个协议,以操纵神经回路活动使用设计师受体完全激活由设计师药物(DREADDs)技术,调节NSC和新生后代在啮齿动物。此综合方案包括病毒颗粒的立体注入、特定神经回路的化学遗传学刺激、胸腺素模拟给治、组织处理、免疫荧光标记、共聚焦成像和成像神经前体细胞各个阶段的分析。该协议提供有关用于可视化 NSC 及其后代的抗原检索技术的详细说明,并描述了使用氯扎平 N 氧化物 (CNO) 或含 CNO 的饮用水调节脑回路的一种简单而有效的方法,表达病毒的病毒。该协议的优势在于其适应性,以研究影响从NSC衍生的成人神经发生的各种神经回路。
Introduction
成人神经发生是一个生物过程,新的神经元诞生在成人中,并集成到现有的神经网络1。在人类中,这个过程发生在海马的登当陀螺(DG),每天大约有1,400个新细胞诞生2。这些细胞驻留在DG的内部部分,它蕴藏着一个神经性利基,称为亚粒度区域(SGZ)。在这里,海马成人神经干细胞(NSCs)经历一个复杂的发育过程,成为功能齐全的神经元,有助于调节特定的大脑功能,包括学习和记忆,情绪调节和应激反应3 ,4,5,6.为了影响行为,成人 NSC 通过响应一系列局部和远端化学线索,以活动相关方式受到各种外部刺激的高度监管。这些化学线索包括神经递质和神经调节器,并且以来自各种大脑区域的特定电路方式作用。重要的是,这些化学线索在NSC上的电路广泛收敛,可以独特而精确地调节干细胞的活化、分化和命运决定。
将免疫荧光分析与电路宽操作配对,是询问体内成人NSC电路调节的最有效方法之一。成人NSC的免疫荧光分析是一种常用的技术,其中针对特定分子标记的抗体用于指示成人NSC的发育阶段。这些标记包括:内窝作为径向胶质细胞和早期神经祖传标记,Tbr2作为中间祖传标记,dcx作为神经细胞和未成熟的神经元标记7。此外,通过管理胸腺素类比,如BrdU,CidU,Idu和Edu,经历S相的细胞群可以单独标记和可视化8,9,10。通过结合这两种方法,可以研究广泛的问题,从在特定发育阶段如何调节增殖,到各种线索如何影响NSC分化和神经发生。
有几个选项可以有效地操纵神经回路,包括电刺激、光遗传学和化学遗传学,每个选项都有各自的优缺点。电刺激涉及一个广泛的手术,电极被植入一个特定的大脑区域,后来用于传输电信号来调节目标的大脑区域。然而,这种方法缺乏细胞和电路特异性。光遗传学涉及病毒粒子的传递,这种粒子编码光激活受体,由激光通过植入的光纤激发,但需要大量的操作、巨大的成本和复杂的手术11。化学遗传学涉及病毒粒子的传递,这些粒子编码由设计师药物或DREADD专门激活的设计师受体,随后由称为氯扎平N-氧化物(CNO)的特定和生物惰性配体激活.利用DREADD来操纵控制成人NSC的局部神经回路的好处在于CNO管理的简便性和各种途径。这允许减少动物处理,从而简化耗时的方法,这很容易适应长期研究,以调节神经回路。
该协议中描述的方法是综合收集成功询问成年海马神经发生电路调节所需的各种协议,该控制结合了免疫荧光技术和电路操作使用化学遗传学。以下协议中描述的方法适用于在体内同时刺激或抑制一个或多个回路,以确定其对成人神经发生中的调节功能。如果问题不需要高度的时间解析,则最好使用此方法。需要精确时间控制在一定频率的刺激/抑制的问题,可以更好地使用光遗传学13,14。这里描述的方法很容易适应长期研究,动物处理最少,特别是在压力是主要问题的地方。
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Protocol
所有程序,包括动物科目,都已获得北卡罗来纳大学教堂山分校机构动物护理和使用委员会(IACUC)的批准。
1. 病毒颗粒的立体注射
- 确定有问题的神经回路。这将确定用于以下过程的病毒和鼠标线。
注:对于这个例子,反向青苔细胞投影被刺激,以分析其对成人神经发生的影响。编码AAV5-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry的病毒颗粒被传送到5ht2A-Cre小鼠的DG15。 - 在手术前至少30分钟施用梅洛西卡姆(5毫克/千克,皮下),为8周大的雄性杂音5ht2A-Cre小鼠提供先发制人的麻醉。
- 使用4%的离氧混合物麻醉小鼠,直到其呼吸减慢,小鼠使用离室失去知觉。脚趾捏住鼠标,以确保它不响应。
- 将鼠标放在小型动物加热垫上的立体税中,以便进行热调节,并在每只眼睛上涂抹眼部润滑剂。一旦动物进入立体税体内,将异苯可不及。
注:在此阶段,耳杆放置非常重要。确保耳杆放置后头部水平。更详细的说明可以在盖革等人16。 - 将脱毛产品放在头部,使其最多放置 1 分钟。用乙醇抹布擦头,去除头发。如果头发没有完全去除,重复此过程,直到头部顶部无毛。
- 用波维酮碘溶液对无毛区域消毒至少3次。
- 将局部利多卡因溶液放在头部的无毛皮肤上,等待1分钟。从头部取出局部利多卡因,并用手术刀在头部进行一个小切口,从眼睛开始到耳朵开始约2毫米。
注:脚趾捏住鼠标,以确保在进行任何切口之前,它完全镇静。 - 缩回头皮,使用消毒棉签清洁头部顶部的结缔组织,直到棉签易于识别。
- 找到布雷格玛并调整头部,通过将钻头放在两个坐标上并确保它们对齐,使布雷格玛和 lambda 都位于同一平面上。此外,通过将钻头放在布雷格玛和 lambda 之间的区域的左侧/右侧,对齐左半球和右半球。
注:这一步非常重要;头部放置不协调会破坏立体坐标。 - 使用 0.5 mm 钻头从 bregma 处钻取以下坐标:前后轴 (AP) -2.00 mm,中侧轴 (ML) ±1.50 mm。制作一个直径为 0.5 mm 至 1 mm 的钻孔。
注:使用特定于相关电路的坐标修改此步骤。本示例针对含有青苔细胞的单边脱牙环状体,并确定其对侧边成人神经干细胞的影响。 - 将钻头切换到 5 μL 注射器和 26-33 G 针头。在 bregma 处为零,然后通过在前 2.00 mm、中侧轴 -1.50 mm、背心轴 -2.3 mm 处将针放在钻孔中,在以下坐标处注入。
- 使用输注泵(材料表)以50~100 nL/min从病毒核心或商业来源向适当的半球注入500 nL的腺相关病毒(AAV)。注射后至少等待5分钟,然后慢慢从大脑中取出针头。
注:这些坐标可能需要根据鼠标的年龄和大小进行调整。某些病毒血清型有不同的扩散模式,最好在进行试验实验,以测试病毒传播之前完成实验。 - 使用盐水清洁头皮和皮肤切口,然后用组织粘合剂(材料表)密封切口,同时用钳子将皮肤粘在一起。执行所有术后程序,如在加热垫上进行恢复期间的监测,直到小鼠激活,在伤口上施加镇痛,以及施用止痛药两天。
注:许多实验需要2-4周的等待时间后,病毒注入正确的病毒表达。
2. 克洛扎平N氧化物管理
- 通过在100μL二甲基硫酸盐(DMSO)和涡旋中溶解10毫克的CNO,制备库存CNO溶液。
注:如果溶液不能完全溶解,增加DMSO的体积,但过多的DMSO可能会使水苦涩。在 CNO 水溶液中不要超过 0.1% DMSO,或 200 mL 溶液的 DMSO 超过 200 μL。CNO 库存溶液可在 -20°C 下存储长达两周。 - 将10~50 μL的10mg/100 μL CNO库存溶液加入每200mL水中,最终浓度为1~5mg/200 mL。每天准备新鲜的CNO水混合物。
注:一些小组已经补充了高达1%的糖精在水中,以掩盖苦味,如果老鼠不喝酒。所调查的电路根据激活程度显示不同的响应。一般来说,1毫克CNO/200 mL足以刺激大多数电路17。 - 在从步骤1.13中恢复两周后,将CNO溶液放入铝箔覆盖或防光容器中,为期4天。
注:CNO 是光敏的;在整个过程中减少暴露在光线下。 - 在准备新鲜的 CNO 溶液时,每天测量和记录消耗的 CNO 水溶液。平均而言,一只成年小鼠会消耗约4 mL的CNO水混合物。此外,每天记录鼠标重量,以确保他们喝酒。
- 确保每个实验都使用适当的控件。包括 CNO 和 DREADD 控件。实验设置的示例包括:(1)车辆 + 自主两栖车辆 (AAV)与病毒报告器没有 DREADD,(2) CNO + AAV 与病毒报告器没有 DREADD,和 (3) CNO + AAV DREADD。
注:所有组都包括在解决方案中。DMSO控制不包括,因为动物接受的DMSO低于0.1%,这还没有被证明对小鼠的成年神经干细胞有不利影响。如果对饮用水中的 DMSO 使用存在疑虑,则添加额外的无 DMSO 和盐水控制。
3. 泰米丁模拟标签
-
在组织收集日,施用CNO后4天,通过执行一系列胸腺素模拟,5-ethynyl-2'-脱氧尿氨酸(Edu)腹膜内注射,标记增殖细胞。
注:此协议使用 Edu。然而,有几个胸腺素类比,可以有效地标记增殖细胞群,包括布尔杜,伊杜,和Cidu 8。- 通过涡旋和放在转子上15分钟,在4mg/mL的兽医级0.9%氯化钠注射液中称重Edu并溶解。
注:Thymidine 类比物具有毒性和光敏性。使用铝箔处理和覆盖溶液时,请遵循材料安全数据表 (MSDS)。 - 以40mg/kg或0.1 mL/10 g体重为4mg/mL Edu溶液,每2小时4次施用Edu内腹。
注:超过50毫克/千克的剂量达到接近饱和水平,不会显著增加标记增殖细胞的量18。至关重要的是,所有小鼠接受相同数量的Edu注射,因为不正确的标签可能会扭曲结果。
- 通过涡旋和放在转子上15分钟,在4mg/mL的兽医级0.9%氯化钠注射液中称重Edu并溶解。
4. 组织制备和加工
- 上次 Edu 注射两小时后,使用离室麻醉小鼠,直到呼吸明显减少和脚趾挤压,以确保其完全镇静。
- 使用针头将鼠标固定在表面,并做一个小切口,露出心脏。将 25 G 针头插入左侧主干,并切下右心室,以磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 溶液进行转心室灌注,流速为 1⁄4 mL/min,直到肝脏组织被清除。
- 将灌注溶液切换到4%的甲醛(PFA),并灌注约15~20 mL以修复脑组织。
注:关于灌注过程的更详细的说明可以在Gage等人19中找到。动物震颤将观察到,如果做正确。 - 用一把大剪刀取下头部,然后进行一系列仔细的切口,将大脑从头骨中解放出来。将脑组织储存在4°C的4%PFA过夜,以继续固定。
- 从4%PFA溶液中取出脑组织,并放入PBS中的10%蔗糖溶液中,在4°C下冷冻保护组织24小时。然后将组织转移到30%蔗糖PBS溶液中,在4°C下再输送24小时,然后再进行切片。
注:脑组织在准备进行微缩切片时会沉入蔗糖中。脑组织可以长期储存在30%蔗糖中。 - 使用微托姆在40μm部分的截面脑组织。收集部分从发落陀螺开始开始,约 -1.20 毫米从布雷格玛,结束后板完成与第一部分是最前和最后一部分是最后。查阅小鼠大脑图集,准确识别DG和起始组织收集坐标。
- 将每个部分连续存储在充满防冻液的48孔板中的6行(表1)。
| 防冻液 | 乙二醇 150 mL = 蔗糖 150 g + 填充至 500 mL 0.1 M PB,用于 500 mL 溶液 |
| 坐酸盐缓冲器 | 柠檬酸库存为 9 mL = 41 mL 的三钠柠檬酸缓冲液 = 450 mL ddH2O |
| 柠檬酸库存 | [0.1 M]柠檬酸 21 g/1 L ddH2O |
| 三钠柠子酸盐库存 | [0.1 M]三钠柠酸二钠 29.4 g/1 L ddH2O |
| 特里斯缓冲盐水 - 特里顿 (TBS - 特里顿) | 0.05% 100-x TbS 中的 Triton |
| 渗透缓冲器 | 0.5% 100-x Triton 在 TBS 中 |
| 阻塞缓冲区 | 0.33 mL 驴血清,10 mL TBS-Triton |
| Edu 反应解决方案 | 在 [0.1 M] Tris pH 8.5 的 4 mL 溶液中加入 1 毫克 CuSO4+5H2O 溶液,制作 CuSO4[5H2O]溶液。然后在涂至组织之前,将100μM Alexa488-azide溶液和10mg/mL-na+抗坏血液加入CuSO 4+5H2O溶液中。 |
表1:用于免疫性植物学的溶液。
5. 免疫性化学
- 基本浮动协议
注:如果染色,请跳过第 5.1 节,然后转到第 5.2 节。基本浮动协议仅适用于Tbr2或双皮质素(DCX),没有胸腺素模拟Edu染色。- 在 48 孔板中按串行顺序将部分从防冻液转移到 Tris 缓冲盐水 (TBS)。
- 在 TBS-triton 中清洗两次部分(0.05% TBS-triton,表 1),每次在摇动或以低速摇动摇臂时将溶液吸气 5 分钟。
- 使用渗透缓冲液(0.5% TBS-triton,表1)在低速晃动时,渗透部分 20-30 分钟。
- 将0.33 μL的驴血清加入10 mL的TBS-triton,使阻塞缓冲液。在3天内新鲜使用。
- 吸气渗透缓冲液和孵育部分在室温 (RT) 下阻塞缓冲液 30 分钟到 1 小时。
- 使主要抗体溶液在阻断缓冲液中加入每个井。500 μL/井足以使所有组织部分完全浸没。在 RT 上在摇臂或摇臂上孵育过夜。
- 在 TBS-triton 3x 中,吸气溶液和冲洗部分各 10 分钟,以去除原抗体的痕迹。
- 在荧光酸结合二级抗体中孵育,对在摇滚乐队上RT处制备的阻滞缓冲液中制备的初级抗体孵育2小时。
- 在 TBS-triton 中分别清洗 3x 节 5 分钟,然后在 PBS 中稀释 4°,6-二酰胺-2-苯胺醇 (DAPI) 溶液 (300 μM 溶液,1:100)中孵育部分 15 分钟。
- 在 PBS 中清洗第 3x 节,在带正电的幻灯片上保持从前到后的顺序。让组织在RT干燥,直到水分明显消失,通常约2~5分钟,然后用安装介质盖住。
- 抗原检索
注:此部分仅对嵌套是必需的。如果染色内窝,在胸腺素模拟染色之前执行此部分(第 5.3 节)。跳过 Tbr2 或 DCX 染色与 Edu。- 将组织部分置于 PBS 中,并将 5⁄8 节安装在带正电的幻灯片上,保持从前到后的顺序。让组织部分在RT干燥,完全粘附于幻灯片上,大约需要2~5分钟。
- 在容器中制备丁酸盐缓冲液 (表 1), 通常是 1,000 μL 移液器尖端盒.
- 在微波炉(1,000 W)中加热青酸盐缓冲液5分钟,直到溶液沸腾。当溶液加热时,将安装的截面放在 20 滑动玻璃滑架中。5 分钟后,小心地将带有部分的滑块放入移液器盒中。
- 将微波炉的功率设置为 50%,煮7分钟。启动计时器 7 分钟,观看微波炉。在这 7 分钟内,当溶液开始沸腾时停止微波炉,并在沸腾停止后继续微波。
注:这一步的目标是将水温保持在沸腾温度以下7分钟。 计时器用完后停止,即使微波炉上的烹饪时间还没有结束。更详细的说明可以在胡赛尼等人20。 - 拿出装有水酸盐缓冲液和纸巾的暖盒,放在冰桶中冷却。盖住以防止冰块或其他材料进入溶液。等待约30分钟或直到溶液冷却触摸。
- 如果使用胸腺素模拟,则继续执行胸腺素模拟染色步骤 5.3.2。
- 泰米丁模拟染色
注:如果染色 Edu 和 Tbr2 或 Edu 和 DCX,则从这里开始。- 将组织部分置于 PBS 中,并将 5⁄8 节安装在带正电的幻灯片上,保持从前到后和相同方向的序列顺序。让组织部分干燥,完全粘附在幻灯片上,然后用疏水笔或PAP笔绘制边框。
- 使用渗透缓冲液(0.5% TBS-triton)渗透部分,20-30 分钟。然后用TBS-triton洗2次,每次5分钟。
注:渗透有助于细胞内抗体渗透。渗透时间可根据组织厚度和抗体效率进行调整。或者,可以增加洗涤剂浓度,以增加渗透效力。然而,由于组织脆弱性随着渗透时间的延长而增加,因此应注意不要渗透太久。 - 根据表1准备Edu反应溶液。Alexa488-azide的最终浓度为15 μM,在1mL的Edu反应溶液中。
- 在 Edu 反应溶液中孵育部分 30 分钟至 1 小时,然后在 TBS-triton 中分别洗涤 3 倍,每次 5 分钟。此步骤后,将滑片盖在铝箔中,以防光线照射。在此阶段,使用荧光显微镜检查 Edu 反应是否有效。Edu 标记的细胞将在荧光显微镜下荧光。
- 安装组织切片协议
- 使用与二次抗体(如驴血清)相同的动物(如驴血清)在相同动物中培养的阻塞缓冲液,将组织部分从步骤 5.3.4 安装在幻灯片上,每次 30 分钟至 1 小时,然后在 TBS-triton 中洗 2次,每次 5 分钟。
- 在阻断步骤期间制备原抗体(即鸡抗nestin)溶液,在1:200将原抗体混合在阻断缓冲液中。每张幻灯片250μL足以确保组织完全浸没在溶液中。
- 在阻断后,在RT过夜在原发抗体溶液中孵育组织部分。根据所使用的主要抗体修改此步骤。
注:如果抗体具有高背景或非特异性结合,在4°C代替RT孵育可以改善结果。如果需要,组织渗透不良的抗体可以留育2天。 - 在TBS-triton中孵育组织部分3倍5分钟,以去除多余的原抗体。然后在荧光酸偶联二级抗体(即Alexa 647抗鸡在1:200)中孵育组织部分,在RT处在阻断缓冲液中制备2小时。
- 在 TBS-triton 中孵育组织部分 3x 5 分钟,以去除多余的二次抗体,并在 PBS 的 1:100 在 RT 上应用 300 μM DAPI 溶液 15 分钟。
- 在 PBS 中孵育组织部分 3x 5 分钟,以去除多余的 DAPI,并使用棉签或精细的任务擦拭从周围组织中取出纸笔圈。让部分干燥,然后应用安装介质和盖滑。在成像幻灯片之前,让安装介质干燥。
6. 图像集合
- 通过覆盖幻灯片标签,并使用共聚焦显微镜(材料表)使用 40 倍油放大光学透镜(1 μm 步长大小)或 20x 2 倍变焦在 1 μm 时覆盖幻灯片标签和图像 DG 的同一侧,从而蒙蔽对照组。
注:40 倍机油放大倍率的分辨率会提高,但比 20 倍 2 倍变焦的分辨率要长。 - 将目标镜头设置为 40 倍,然后单击共聚焦软件(材料表)中左上角的定位选项卡,并在视场中间设置所需的 DG 部分。
- 找到 DG,切换到左上角的采集选项卡,并选中以下框:Z堆栈、切片扫描和位置。
- 在 600-750 增益、1%-15% 激光强度和 1+10 偏移之间设置通道设置。对于任何通道,激光强度不得超过 20%。在设置增益和强度时,确保像素没有过度饱和。
注:这些范围将因所使用的设备的效率和染色效率而异。 - 在磁贴扫描窗口中将切片设置为 7 水平 3 垂直,并使用与当前使用的设置相同的设置按扫描概览图像。例如,使用 7 水平 x 3 垂直和 20 倍目标与 2 倍缩放。
- 在概览扫描后,确保 DG 完全在预期图像范围内。如果没有,请调整 DG 的视图,直到它完全位于概览图像中,因为这是将获取的代表性图像。
- 使用精细对焦旋钮滚动浏览不同的 Z 堆栈,设置成像深度。确保整个 DG 在起点和终点内。假设步长大小为 1 μm,则每个图像应约为 40 步。
- 通过双向扫描将扫描速度设置为 9,在采集模式窗口中不求平均值。然后在位置窗口中添加位置。
注:重复步骤 6.3_6.8,一次对多个 DG 进行映像。提高扫描速度会降低图像质量,但会缩短整体成像时间。如果图像质量过低,请降低扫描速度或增加平均值。 - 准备就绪后,单击"开始实验"按钮。沿前轴到后轴扫描每只鼠标的 5 个部分 DG。例如,如果为第 1 节对左侧 DG 进行成像,则在第二节的后左 DG 图像。
- 使用共聚焦软件中过程选项卡下的缝合功能,将单独的图像缝合在一起,形成变性陀螺的完整图像。或者,使用 FIJI(ImageJ)将图像拼接在一起,形成完整的假陀螺。
- 保存拼接的图像进行量化。
7. 图像分析
- 使用 FIJI 作为最大投影和复合图像,将通道以不同颜色合并,轻松可视化共定位。打开每个树突部分的每个图像。
- 使用多边形选择工具(左侧的第三个框)测量最大投影图像的每个部分的 DG 面积,并记录每个鼠标的每个部分。这将是用于计算密度的 DG 区域。
- 通过使用插件下的 FIJI 插件单元计数器,记录具有共同本地化原抗体(即内窝)和胸腺素模拟 Edu 的复合图像中的 DG 中的细胞数 |分析 [ 细胞计数器 ] 细胞计数器.此外,记录具有径向过程的 Edu 阳性和内嵌阳性细胞的总数。
注:在内窝的情况下,注意形态学是非常重要的。如果量化神经干细胞,请确保只有具有径向过程的细胞被量化。在量化树落陀螺部分时,将相同的标准应用于所有部分,尤其是在对焦平面外的单元格进行可视化时。如果单元格不在焦点平面内,请不要计算它们。有关立体定量的更详细说明,请参阅 West 等人21。 - 在电子表格软件中输入单元格计数,以编译所有数据段以供以后分析。
- 通过将共位化细胞的总数除以每个动物中每个部分的总体积来计算每个截面的共位化细胞的密度。例如,通过将一种动物中的 nestin_/edu® 细胞之和除以一种动物中的 DG 体积之和,获得干细胞密度。假设每个部分为 1 μm,则通过将面积与 Z 步长增量相乘来计算每个部分的体积。
注:在此协议中,总步数应接近40,因为组织在40μm处被分割。 - 为要解决的问题执行其他必要的计算。在此示例中,计算刺激反向青苔细胞后增殖细胞的总数、干细胞总数量和增殖干细胞百分比。
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Representative Results
按照上述实验程序(图1A,B),我们能够确定刺激逆侧苔细胞投影对海马内神经性利基的影响。通过使用与标有5-HT2A Cre-line的苔丝细胞配对的Cre依赖性Gq耦合刺激DREADD病毒,我们能够选择性地将来自青苔细胞的兴奋性投影激活到相反的DG上,并确定强苔细胞刺激促进干细胞静默(图1C)。在分析组织之前,我们验证了准确的病毒传递(图2A,B)。此外,我们通过c-fos免疫组织化学实验验证了青苔细胞的活化(未显示数据)。在病毒注射不当的情况下,将动物排除在进一步分析之外。不正确的注射是一种未能瞄准所需的坐标,大部分表达超出所需区域,或几乎没有病毒传递。在这个实验中,DG的血性细胞是预定的目标,如果注射在hilus之外,则排除它们。通过使用胸腺素模拟、Edu 和抗原检索,用于第 5.2 节和 5.3 节中概述的内窝染色,我们能够成功地标记增殖神经干细胞(图 3A)。此外,通过省略抗原检索步骤,第5.2节,我们能够标记Tbr2阳性神经祖细胞和神经细胞,以及DCX阳性神经细胞和未成熟的神经元(图3A)。我们演示了一个量化和用于计算密度的区域示例,并提供幻灯片上安装组织的示例(图 3B和图 4A)。此外,成功实验和低于标准的实验都作为实验方法的参考(图4B)。最后,从成功的实验(图5A-D)15中可以得到几种不同的定量。定量包括增殖神经干细胞的密度(Nestin+/Edu+/体积)、增殖神经干细胞的百分比(Nestin®/Edu+/总内窝)、总增殖细胞(Edu+/体积)和总干细胞库(Nestin®/体积)).在逆边刺激青苔细胞时,神经干细胞增殖减少。使用适当的抗体,可以获得神经祖和不成熟神经元的类似定量。
图1:成人神经干细胞测定回路调节的实验方法。(A) 表示协议中概述的不同步骤的架构。(B) 用于刺激啮齿动物中青苔细胞的实验方法的时间线.(C) 注射示意图,以针对反向青苔细胞进行刺激。(D) 在子粒区 (SGZ)、颗粒细胞层 (GCL) 和分子层 (ML) 中成人神经干细胞的发育系图,在不同发育阶段使用相应的抗体。不同的发育阶段包括静止或活化径向神经干细胞(NSC)、神经祖细胞(NP)、神经细胞(NB)、未成熟的颗粒细胞(GC)和成熟的GC。请点击此处查看此图的较大版本。
图2:有效病毒传播的演示。(A) 准确传播病毒的免疫荧光图像.病毒颗粒表示 mCherry 荧光标签,该标签以希鲁斯(白色盒装区域)中的青苔细胞为目标。DAPI 标记细胞核。准确病毒传递的图像侧显示从反向注射侧清晰的苔丝纤维投影。(B) 离目标病毒注射的免疫荧光图像。请注意,在这种情况下,图像侧不存在反向青苔纤维。比例尺 = 50 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图3:增殖神经干细胞和后代分析。(A) 胸腺素模拟 Edu 与特定细胞阶段标记(神经干细胞和祖细胞)、Tbr2(神经干细胞、神经祖细胞)和 DCX(神经细胞、未成熟神经元)共同的免疫组织化学图像白色箭头。刻度条 = 10 μm . (B) 用于计算密度的树形陀螺仪内区域的代表性测量。比例尺 = 50 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图4:免疫荧光制剂的示范。(A) 显示从前轴到后轴的安装组织部分的立体分离的原理图。红色框表示图像的侧面。(B) 神经元系系标记的成功和低于标准免疫荧光实验的演示。比例尺 = 50 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图5:青苔细胞的反向活化减少神经干细胞增殖。(A) 内斯丁®/Edu®细胞在脱毛陀螺中的免疫组织化学定量表明,在刺激逆侧苔细胞后增殖减少。(B) 使用活性逆向苔细胞的组中增殖神经干细胞的百分比降低。(C) 两组的神经干细胞密度均无显著变化.(D) 登当陀螺仪中增殖细胞的总体水平没有变化.值表示表示 = 测量标准误差。p < 0.05 (n = 3 用于控制,n = 5 表示 hM3D 组)。这个数字是从Yeh等人15号改编的。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
该协议的目的是评估操纵特定神经回路如何利用一系列免疫组化学技术调节体内的成年海马神经发生。由特定神经回路介导的成人神经发生过程分析活性依赖调节是一项有价值的技术,具有很大的修改潜力,可用于研究各种神经回路。这些类型的实验的成功取决于多种因素,包括准确的病毒传递,正确的病毒选择所需的操作,正确交付胸腺素模拟,动物年龄,免疫染色效率,成功跨心灌注,无偏量定量图像。例如,不准确的病毒传递可能会导致偏离目标的影响,导致与相关电路无关的表型。此外,低质量的免疫荧光技术可能隐藏当前细胞的真实数量,从而产生与生物学无关的表型。另一个非常重要的因素来控制是年龄时,执行实验,考虑到成人神经发生是年龄依赖22。最后,重要的是,每个部分都得到公正评分。为了减少偏见,采取有条不紊的方法,并确保评分的人熟练地使用形态信息识别成人 NSC 发展阶段。此外,盲人控制组和治疗组,并在图像量化后揭示其身份。作为减少偏差的附加措施,两个单独的个体可以量化相同的数据集以验证观察到的结果。
研究成人NSC和新生儿后代的回路活动依赖调节有若干限制。第一个限制是,此方法不提供有关电路中特定单元类型的信息,从而调解对 NSC 操纵相关电路的总体影响。这意味着,虽然对成人 NSC 可能有型板型效应,但该效应可能通过一种或几种中间细胞类型发挥作用。解决这一问题的有效方法是将这些研究与电生理学配对,以固定中间体。该协议的另一个限制是需要具有特定的Cre鼠标(5-HTR2A)线或病毒结构(AAV5-camKII-hM3d-mcherry),可以瞄准所需的电路。如果有效的细胞特异性Cre鼠标线不能随时用于感兴趣的问题,研究此电路的能力就变得越来越困难。然而,大脑中的许多细胞类型都有Cre特定的小鼠线。该协议的较小限制与CNO作为有效的惰性配体有关。最近,研究表明,CNO,用于激活DREADD的惰性化学物质,代谢为氯扎平,这可能导致行为表型23。但是,解决的有效方法是在每个实验中包括适当的控件。正确控制的一个示例包括 CNO 和 DREADD 控制,其中 CNO 与控制报告器病毒 (AAV5-DIO-mCherry) 结合使用,并且仅对未对报告病毒组施用 CNO 的盐水控制。通过包括这些控件,可以隔离仅 CNO 的影响。或者,一种称为C21的二次惰性配体,最近已被证明具有类似的疗效和效力,没有证明的行为效果24。最后,该协议的最终限制是控制每只动物在实验期间消耗的CNO量。不同的动物在不同程度上饮用含CNO的水,因此可能对成人神经发生产生一系列影响。一般来说,一只老鼠在24小时内会喝大约4 mL的CNO水。这意味着,在浓度为1mg/200 mL时,动物每天总共接受0.02毫克的CNO,这与注射腹内的单次CNO剂量的量相当。如果及时耦合给CNO是一个问题,切换到腹内注射可能是一个更好的选择。
使用该协议的优点是在调节成人神经发生时达到的特异性程度。过去的神经发生研究已经利用系统管理的药理激动剂或拮抗剂来调节电路成分。这些非特异性操作可能产生型板状差异,但很少对成人神经干细胞调控所涉及的机制提供深入的了解。此外,该协议可以很容易地修改,以研究各种电路宽的影响成人神经发生。例如,通过切换到抑制性DREADD,或同时瞄准一个或多个大脑区域,可以提出一系列问题,以了解成人神经发生回路的特定调控。与以前的方法相比,使用该协议的另一个优点是,使用内窝抗体可以消除荧光编码神经干细胞报告机的转基因动物繁殖,如nestin:GFP,从而提高效率,减少每一个实验8.此外,该技术限制了啮齿动物在施用CNO时的处理,从而在实验中减少啮齿动物的压力。在研究对压力敏感的过程时,减轻压力是很重要的。最后,这种方法很容易修改,包括行为测定,例如,如果人们有兴趣询问调节NSC的反向苔状细胞电路是否也在空间学习或抗压能力中发挥作用。
使用这种方法的主要技术难点是准确的病毒传播。成为一个熟练的啮齿动物外科医生需要实践,可以采取重大的故障排除。因此,建议进行一系列试验性实验,以测试病毒性标注、标签效率和病毒传播。我们发现,某些血清型有不同的传播模式,AAV2 血清型传播小于 AAV5 或 AAV8。此外,最好为每个实验提供值得信赖的病毒包装提供商。通过进行试点手术,许多这些问题都可以得到解决,并可以节省时间。还建议测试不同的CNO浓度,以刺激或抑制所需的电路。一般来说,1 mg/kg 将充分激活测试电路,但某些电池类型可能需要或多或少的 CNO。值得注意的是,CNO给药的剂量可以差别地影响某些电路,特别是当看的东西,如苔细胞15。
该协议的替代应用包括同时行为测试、替代电路的调制以及神经发生特征的附加分析。要执行行为测试,可以遵循所述协议,在管理 CNO 后,执行特定的行为任务,如新颖的位置测定或空间导航任务。这种方法的好处是,单个实验将产生行为和电路特定信息,可能导致电路特定的行为表型。要调节替代电路,可以使用不同克雷线和病毒载体的组合。例如,如果有兴趣了解如何抑制从腹腔内腺区域 (VTA) 或 VTA 调节成人神经发生多巴胺能神经元,可以使用酪氨酸羟基酶 Cre 小鼠线并注射 Cre 依赖性 hM4D(抑制)DREADD病毒在VTA中确定成人神经发生多巴胺能特异性调节。使用这种方法定位其他大脑区域的可能性很大,可以战略性地用于询问引人注目的神经回路。最后,这种方法允许研究成人神经发生的其他阶段。例如,如果想要了解刺激的苔细胞如何影响未成熟神经元的树形或树突长度,那么人们将遵循类似的协议,但执行替代分析,如sholl分析。
总之,该协议提供了一个详细的分步过程,通过DREADD技术对成人NSC和神经发生进行循环活动依赖调节。该协议的优势在于它能够轻松修改,以解决有关电路特定的成人神经干细胞调控的各种问题。随着集群定期间隔短回溯重复 (CRISPR) 技术的进步,现在更容易生成细胞特定的 Cre 小鼠线,以与复杂的病毒结构配对,以解决日益复杂的问题扩大该协议的适用性。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
L.J.Q. 得到国立卫生研究院国家精神卫生研究所在多样性补充R01MH111773以及T32培训补助金T32NS007431-20的支持下。该项目得到了NIH(MH1111773、AG058160和NS104530)授予J.S.的赠款的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| 48 Well Plate | Denville Scientific | T1049 | |
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (Edu) | Carbosynth | NE08701 | |
| Alcohol 70% Isopropyl | Thermo Fisher Scientific | 64-17-5 | |
| Alcohol Prep Pads | Thermo Fisher Scientific | 13-680-63 | |
| Alexa-488 Azide | Thermo Fisher Scientific | A10266 | |
| Anti-Chicken Nestin | Aves | NES; RRID: AB_2314882 | |
| Anti-Goat DCX | Santa Cruz | Cat# SC_8066; RRID: AB_2088494 | |
| Anti-Mouse Tbr2 | Thermo Fisher Scientific | 14-4875-82; RRID: AB_11042577 | |
| Betadine Solution (povidone-iodine) | Amazon | ||
| Citiric Acid Stock [.1M] Citric Acid (21g/L citric acid) | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| Clozapine N- Oxide | Sigma-Aldrich | C08352-5MG | |
| Confocal Software (Zen Black) | Zeiss Microscopy | Zen 2.3 SP1 FP1 (black) | |
| Copper (II) Sulfate Pentahydrate | Thermo Fisher Scientific | AC197722500 | |
| Cotton Swabs | Amazon | ||
| Coverslip | Denville Scientific | M1100-02 | |
| Delicate Task Wipe Kimwipes | Kimtech Science | 7557 | |
| Drill Bit 0.5 mm | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Ethylene Glycol | Thermo Fisher Scientific | E178-1 | |
| Hamilton Needle 2 inch | Hmailton Company | 7803-05 | |
| Hamilton Syringe 5 μL Model 75 RN | Hmailton Company | Ref: 87931 | |
| High Speed Drill | Foredom | 1474 | |
| Infusion Pump | Harvard Apparatus | 70-4511 | |
| Injectable Saline Solution | Mountainside Health Care | NDC 0409-4888-20 | |
| Insulin Syringe | BD Ultra-Fine Insulin Syringes | ||
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| Stereotax For Small Animal | KOPF Instruments | Model 942 | |
| Leica M80 | Leica | ||
| Leica Microtome | Leica | SM2010 R | |
| LSM 780 | Zeiss Microscopy | ||
| Nair (Hair Removal Product) | Nair | ||
| Paraformaldahyde 4% | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Plus Charged Slide | Denville Scientific | M1021 | |
| Phosphate Buffered Solution (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | |
| Puralube Vet Ointment | Puralube | ||
| Slide Rack 20 slide unit | Electron Microscopy Science | 70312-24 | |
| Slide Rack holder | Electron Microscopy Science | 70312-25 | |
| Small Animal Heating Pad | K&H | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Super PAP Pen 4 mm tip | PolySciences | 24230 | |
| Surgical Scalpel | MedPride | 47121 | |
| Tris Buffered Solution (TBS) | Sigma-Aldrich | T5912 | |
| Tri-sodium citrate Stock [0.1 M] Tri-sodium Citrate (29.4g/L tri-sodium citrate) | Sigma-Aldrich | C8532 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Tweezers | Amazon | ||
| Vet Bond Tissue Adhesive | 3M | 1469SB |
References
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