Summary
המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר גישה לניתוח התנהגות של מבוגרים בתאי גזע/מחולל קדמון בתגובה לטיפול כימוגנטי של מעגל מקומי ספציפי עצביים.
Abstract
נוירוגנזה למבוגרים הוא תהליך דינמי שבו הופעל לאחרונה תאי גזע עצביים (NSCs) באזור תת-החוליות (sgz) של פיתול כישור מבית (DG) ליצור נוירונים חדשים, אשר משתלבים לתוך המעגל העצבי הקיים ולתרום פונקציות היפוקאמאל ספציפיים . חשוב מכך, נוירוגנזה מבוגרת היא רגישה מאוד לגירויים סביבתיים, המאפשרת רגולציה תלוית הפעילות של פונקציות קוגניטיביות שונות. מגוון רחב של מעגלים עצביים מאזורי מוח שונים מתזמרים פונקציות קוגניטיביות מורכבות אלה. לכן חשוב להבין כיצד מעגלים עצביים ספציפיים לווסת נוירוגנזה למבוגרים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לתמרן פעילות המעגל העצבי באמצעות קולטן מעצב מופעל באופן בלעדי על ידי תרופות מעצב (ראסטות) טכנולוגיה המסדיר NSCs ו צאצאי היילוד במכרסמים. פרוטוקול מקיף זה כולל הזרקת סטריאוטקאית של חלקיקים ויראליים, גירוי גנטי כימוע של מעגלים עצביים ספציפיים, מינהל אנלוגי של תימידין, עיבוד רקמות, מimmunofluorescence תיוג, הדמיה מיקוד, והדמיה ניתוח של בשלבים שונים של תאים מקודמי העצבי. פרוטוקול זה מספק הוראות מפורטות על טכניקות אחזור אנטיגן המשמש להמחיש NSCs וצאצהם ומתאר פשוט, דרך יעילה עדיין לווסת את מעגלי המוח באמצעות קלוזאפין N-תחמוצת (cno) או cno-המכיל מי שתייה ו וירוסים בהבעת הדרדים. החוזק של פרוטוקול זה טמון ביכולת הסתגלות שלה ללמוד מגוון רחב של מעגלים עצביים המשפיעים על נוירוגנזה מבוגרת נגזר מ NSCs.
Introduction
נוירוגנזה למבוגרים הוא תהליך ביולוגי שדרכו הנוירונים החדשים נולדים במבוגר ומשולבים לתוך הרשתות העצביות הקיימות1. בבני אדם, תהליך זה מתרחש בפיתול הדנאט (DG) של ההיפוקמפוס, שם כ-1,400 תאים חדשים נולדים כל יום2. תאים אלה נמצאים בחלק הפנימי של ה-DG, אשר הנמלים נישה נוירוגניים, כינה את האזור התת בגרגרים (SGZ). כאן, תאי גזע עצביים מבוגרים (NSCs) עוברים תהליך התפתחותי מורכב כדי להפוך נוירונים תפקודית לחלוטין כי לתרום לוויסות של פונקציות המוח ספציפיים, כולל למידה וזיכרון, רגולציה מצב הרוח, ואת תגובת הלחץ3 ,4,5,6. כדי להשפיע על התנהגויות, מבוגר NSCs מוסדר ביותר על ידי גירויים חיצוניים שונים באופן התלוי בפעילות על ידי תגובה למערך של רמזים מקומיים וכימיים. הסימנים הכימיים הללו כוללים נוירוטרנסמיטורים ונוירומודולטורים ופועלים באופן מעגלי מאזורי מוח שונים. חשוב מכך, התכנסות מעגל רחב של רמזים כימיים אלה על NSCs מאפשר רגולציה ייחודית ומדויקת של הפעלת תא גזע, בידול, והחלטות הגורל.
אחת הדרכים האפקטיביות ביותר לחקור את הרגולציה בוויסות של NSCs למבוגרים בvivo היא על ידי שיוך ניתוח מערכתית של מניפולציות במעגל רחב. Immunofluorescence ניתוח של למבוגרים NSCs היא טכניקה מנוצל בדרך כלל, שבו נוגדנים נגד סמנים מולקולריים ספציפיים משמשים כדי לציין את השלב ההתפתחותי של למבוגרים NSCs. סמנים אלה כוללים: nestin כמו תא הרדיאלי של גליה וסמן קדמון מוקדם של העצב, Tbr2 כסמן מחולל קדמון ביניים, ו dcx כמו הסמן הישן והלא בוגר תא מטרה7. בנוסף, על-ידי ניהול האנלוגיות של תימידין כגון brdu, cidu, idu, ו-Edu, אוכלוסיות תאים שעברו שלב S יכול להיות מתויג בנפרד ודמיינו8,9,10. על-ידי שילוב שתי הגישות הללו, ניתן לחקור מגוון רחב של שאלות החל מאופן ההפצה המוסדר בשלבים התפתחותיים ספציפיים, לגבי האופן שבו סימנים שונים משפיעים על בידול המועצה לבטחון לאומי ועל נוירוגנזה.
מספר אפשרויות קיימות כדי לטפל ביעילות במעגלים עצביים כולל גירוי חשמלי, אלקטרואופטיקה, וכימוסגנטיקה, כל אחד עם יתרונות וחסרונות משלהם. גירוי חשמלי כרוך בניתוח נרחב שבו אלקטרודות מושתלים לאזור המוח מסוים אשר משמשים מאוחר יותר כדי לשדר אותות חשמליים לווסת את אזור המוח המיועד. עם זאת, גישה זו חסרה גם הסלולר וגם המעגלים. אלקטרואופטיקה כרוכה במסירת חלקיקים ויראליים לקודד קולטן המופעל אור כי הוא מגורה על ידי לייזר הנפלט באמצעות סיבים אופטיים מושתל, אבל דורש מניפולציות נרחבות, עלות גדולה, ניתוחים מורכבים11. כימוקוטיקה כרוכה במסירת חלקיקים ויראליים המקודדים קולטן מעצב המופעל באופן בלעדי על ידי תרופות מעצבים או ראסטות, אשר מופעלים לאחר מכן על ידי מסוים ומבחינה ביולוגית המכונה קלוזאפין N-תחמוצת (cno)12 . היתרון של ניצול ראסטות לתמרן מעגלים עצביים מקומיים המסדירים למבוגרים NSCs שקרים בקלות ומסלולים שונים של הממשל CNO. זה מאפשר גישה פחות זמן רב עם טיפול בעלי חיים מופחתת, אשר ניתנת להתאמה בקלות למחקרים ארוכי טווח לווסת את המעגלים העצביים.
הגישה המתוארת בפרוטוקול זה היא אוסף מקיף של פרוטוקולים שונים הנדרשים לחקור בהצלחה את הרגולציה של היפוקמאל נוירוגנזה למבוגרים המשלבת הן שיטות immunofluorescence ומניפולציות מעגלים באמצעות כימוטיקה. השיטה המתוארת בפרוטוקול הבא מתאימה לעירור או לעיכוב של מעגלים אחד או מספר בו בvivo כדי לקבוע את התפקוד הרגולטורי שלהם על נוירוגנזה מבוגרת. גישה זו משמשת במידה הטובה ביותר אם השאלה אינה זקוקה לרזולוציה גבוהה של הזמן. שאלות הדורשות שליטה טמפורלית מדויקת של גירוי/עיכוב בתדר מסוים, יכולה להיות ממוענת טוב יותר באמצעות אלקטרואופטיקה13,14. הגישה המתוארת כאן מותאמת בקלות למחקרים ארוכי טווח עם טיפול בבעלי חיים מינימלי במיוחד כאשר המתח הוא דאגה עיקרית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים כולל נושאי בעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) באוניברסיטת צפון קרוליינה היל.
1. הזרקת סטריאוטקאית של חלקיקים ויראליים
- . קבע את המעגלים העצביים האלה זה יקבע את הווירוס ואת קו העכבר מנוצל עבור ההליך הבא.
הערה: בדוגמה זו, התחזיות תא מוסי צלעות מושלכות לנתח את השפעותיו על נוירוגנזה למבוגרים. ויראלי חלקיקים קידוד AAV5-hSyn-דיו-hM3Dq-mCherry מועברים DG של 5ht2A-יצור עכברים15. - מנהל מלוקסיאם (5 מ"ג/ק"ג, תת-עורי) לפחות 30 דקות מראש כדי לספק משככי כאבים מראש לזכר בן 8 שבועות heterozygous בעכבר 5ht2A.
- הניחו את העכבר בתערובת חמצן באורך 4% עד שנשימתו מאיטה והעכבר חסר הכרה באמצעות תא isofלוריאן. הבוהן לצבוט את העכבר כדי להבטיח שזה לא מגיב.
- הניחו את העכבר בסטריאוממס על משטח חימום בעלי חיים קטנים לוויסות תרמי והחילו חומר סיכה על כל עין. להקטין את ה1.5% לאחר שהחיה נמצאת בתוך הסטריאומס.
הערה: מיקום בר האוזן במהלך שלב זה חשוב. ודא כי הראש הוא ברמה לאחר מיקום בר האוזן. הוראות מפורטות יותר ניתן למצוא גייגר et al.16. - מניחים הסרת שיער המוצר על הראש ולתת לו לשבת עד 1 דקות מקסימום. להסיר את השיער על ידי ניגוב הראש עם מגבונים האתנול. אם השיער אינו מוסר לחלוטין, חזור על תהליך זה עד העליון של הראש הוא שיער.
- לחטא את האזור שיער עם הפתרון povidone-יוד לפחות 3 פעמים.
- המקום פתרון לידוקאין אקטואלי על העור שיער של הראש ולחכות 1 דקות. הסר לידוקאין אקטואלי מהראש ולעשות חתך קטן על הראש מתחילת העיניים לתחילת האוזניים על 2 מ"מ באמצעות אזמל כירורגי.
הערה: הבוהן לצבוט את העכבר כדי להבטיח כי הוא מסומם לחלוטין לפני ביצוע כל חתכים. - למשוך את הקרקפת ולנקות את רקמת החיבור על החלק העליון של הראש על ידי שימוש מטליות כותנה מעוקר עד הברגמה ניתן לזיהוי בקלות.
- אתר את הברגמה והתאם את הראש כך שהמגמה והלאמבדה יהיו באותו מישור על-ידי הצבת התרגיל בשני הקואורדינטות והבטחת היישור. בנוסף, ליישר את האונה השמאלית והימנית על ידי הצבת התרגיל שמאלה/ימינה של אזור בין ברז למדא.
הערה: שלב זה חשוב מאוד; מיקום ראש לא תקין. יגרום לשבש את קואורדינטות הסטריאוטקאיות - מקדחה בנקודות הציון הבאות מברגמה באמצעות מקדחה 0.5 מ"מ: הציר האחורי הקדמי (AP)-2.00 מ"מ, ציר לרוחב המדיאלי (ML) + 1.50 mm. בצע a 0.5 מ"מ 1 מ"מ בקוטר חור מקדחה.
הערה: שנה שלב זה עם קואורדינטות הספציפיות למעגל המדובר. דוגמה זו מהווה מטרה לפיתול חד צדדי המכיל תאים טחבי וקובעת את השפעתם על תאי גזע עצביים מבוגרים בצד השני של הצלעות. - מעבר מקדחה ל-5 מזרק μL ו-26 מחטים של G-33. אפס בברגמה ולאחר מכן להזריק בנקודות הציון הבאות על ידי הצבת המחט בחור המקדחה על הציר האחורי הקדמי-2.00 מ"מ, ציר לרוחב המדילי-1.50 מ"מ, הציר הגחוני-2.3 מ"מ.
- להחדיר 500 nL של וירוס הקשורים adeno (AAV) מליבה ויראלי או מקור מסחרי לחצי הכדור המתאים, ב 50-100 nL/min באמצעות משאבת אינפוזיה (טבלת חומרים). לחכות לפחות 5 דקות הזרקה לפני הסרת לאט להסיר את המחט מהמוח.
הערה: קואורדינטות אלה עשויות לחייב התאמה על בסיס הגיל והגודל של העכבר. סוגים מסוימים של סרוטיפים ויראליות יש דפוסי דיפוזיה שונים, עדיף לבצע ניסויים פיילוט כדי לבדוק התפשטות נגיפית לפני ניסוי מלא. - ניקוי הקרקפת והעור סביב החתך באמצעות תמיסת מלח, לאחר מכן לאטום את החתך באמצעות דבק רקמה (טבלה של חומרים) תוך החזקת העור יחד עם מספריים. בצע את כל ההליכים שלאחר הניתוח כגון ניטור במהלך ההתאוששות על משטח חימום עד העכבר פעיל, החלת כאבים על הפצע, וניהול משככי כאבים במשך יומיים.
הערה: ניסויים רבים דורשים 2-4 שבוע המתנה זמן לאחר אינפוזיה ויראלית לביטוי ויראלי הנכון.
2. clozapine N-מינהל תחמוצת
- הכנת פתרון CNO מלאי על ידי המסת 10 מ"ג של CNO ב 100 μL של diמתיל סולפוקסיד (DMSO) ו-vortexing.
הערה: אם הפתרון אינו מתמוסס לחלוטין, להגדיל את נפח של DMSO, אבל יותר מדי DMSO עלול להפוך את המים מריר. אין לחרוג מ-0.1% DMSO ב-CNO בפתרון מים או יותר מאשר 200 μL של DMSO עבור פתרון של 200 mL. ניתן לאחסן פתרון מניות CNO ב-20 ° צ' עד שבועיים. - הוסף 10 כ 50 μL של 10 מ"ג/100 μL CNO מלאי פתרון לכל 200 mL של מים לריכוז הסופי של 1-5 מ"ג/200 mL. הכינו את תערובת המים הטרייה בכל יום.
הערה: קבוצות מסוימות יש בתוספת של עד 1% סכב במים כדי להסוות את המרירות אם העכברים הם הימנעות משתייה. חקירת המעגל הראתה תגובה שונה בהתבסס על מידת ההפעלה. באופן כללי, 1 מ"ג CNO/200 mL מספיקה כדי לעורר את רוב מעגלי17. - מניחים את הפתרון CNO בנייר מכוסה רדיד אלומיניום או מוגן באור בעת מתן לעכברים שבועיים לאחר התאוששות הזרקת סטריאוטקאית משלב 1.13 על פני תקופה של 4 ימים.
הערה: CNO הוא רגיש באור; להפחית את החשיפה לאור במהלך התהליך כולו. - למדוד ולהקליט הצורכים CNO מים פתרון כל יום בעת הכנת פתרון CNO טריים. בממוצע, עכבר למבוגרים יצרוך כ 4 מ ל של תערובת מים CNO. בנוסף, הקלט משקל העכבר היומי כדי להבטיח שהם שותים.
- ודא שפקדים נאותים מנוצלים עבור כל ניסוי. כלול הן בקרת CNO ו-ראסטות. דוגמה של התקנה ניסיונית יכלול: (1) רכב + הרכב אמפיבי אוטונומית (AAV) עם כתבת נגיפי אין ראסטות, (2) CNO + AAV עם כתבת ויראלי אין ראסטות, ו (3) CNO + AAV דרברה.
הערה: כל הקבוצות כוללות DMSO בפתרון. שולטת DMSO אינם כלולים כי בעלי חיים מקבלים פחות מ 0.1% DMSO, אשר לא הוכחו השפעות שליליות על תאי גזע עצביים למבוגרים בעכברים. אם יש חששות בנוגע DMSO להשתמש במים לשתייה, להוסיף עוד לא DMSO ושליטה מלוחים.
3. תימילין תיוג אנלוגי
-
ביום איסוף רקמות, 4 ימים לאחר מתן cno, תווית מתרבים תאים על ידי ביצוע סדרה של האנלוגי תימידין, 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (Edu) זריקות הצפק.
הערה: פרוטוקול זה מנצל את Edu. עם זאת, ישנם מספר מקבילים תימידין שיכולים ביעילות לתייג אוכלוסיות תאים מתרבים כולל brdu, idu, ו cidu8.- שוקלים Edu ולפזר וטרינרית כיתה 0.9% נתרן כלוריד פתרון הזרקת ב 4 מ"ג/mL על ידי vortexing והצבת על רוטור עבור 15 דקות.
הערה: הפונקציה האנלוגית הינה רעילה ורגישים באור. עקוב אחר גליונות נתונים של בטיחות חומרים (MSDS) בעת טיפול וכיסוי פתרון מחשיפה באור באמצעות רדיד אלומיניום. - מנהל intraperitoneally ב 40 מ"ג/ק"ג או 0.1 mL/10 גרם של משקל הגוף של 4 מ"ג/mL Edu פתרון 4 פעמים כל 2 h.
הערה: מינונים מעל 50 מ"ג/ק"ג להגיע לרמות הרוויה ולא יגדיל את כמות התאים מתרבים באופן משמעותי18. זה חשוב כי כל העכברים מקבלים את אותה כמות של הזריקות Edu מאז תיוג לא נאות יכול להטות את התוצאות.
- שוקלים Edu ולפזר וטרינרית כיתה 0.9% נתרן כלוריד פתרון הזרקת ב 4 מ"ג/mL על ידי vortexing והצבת על רוטור עבור 15 דקות.
4. הכנת רקמה ועיבוד
- שעתיים לאחר הזרקת Edu האחרון, להפחית את העכבר באמצעות החדר isof, עד הנשימה מופחת באופן משמעותי הבוהן צביטה כדי להבטיח שהוא הרגעה לחלוטין.
- לאבטח את העכבר על פני השטח באמצעות מחטים ולעשות חתך קטן חשיפת הלב. הוסף מחט של 25 גרם לבית העורקים השמאלי ולחתוך את חדר התאים הימני עבור הפרזיה עם תמיסת מלח מלוחים באגירה (PBS) בקצב הזרימה של 1-4 mL/min עד רקמת הכבד מנוקה.
- החלף את התמיסה הפרפיוז ל -4% פאראפורמלדהיד (בכיוון הלוח) ומשכן סביב 15 ל-20 מ ל כדי לתקן את רקמת המוח.
הערה: הוראות מפורטות יותר על תהליך זלוף ניתן למצוא Gage et al.19. רעידות בעלי חיים יובחנו כאשר יבוצע כראוי. - הסר את הראש באמצעות זוג מספריים גדולים ולאחר מכן לבצע סדרה של חתכים זהירים כדי לשחרר את המוח מהגולגולת. החנות רקמת מוח ב 4 ° c בתוך 4% בכיוון השביל להמשיך לתקן.
- הסירו את רקמת המוח מ 4% בחצי החצי החצי החצי החצי בחצי הערוץ והציבו בתמיסה בגובה 10% ב-PBS כדי להוריד את רקמת הרקמה ב -4 ° c. לאחר מכן העבר את הרקמה ל-30% מפתרון ה-PBS לעוד 24 שעות ב -4 ° c לפני המעבר.
הערה: רקמת המוח תשקע בסוכרוז. כשהיא מוכנה לסקר מיקרוטום רקמת מוח יכול להיות מאוחסן לטווח ארוך 30% סוכרוז. - מקטע רקמת המוח באזור בתוך 40 יקרומטר סעיפים באמצעות מיקרוטומה. לאסוף סעיפים החל בתחילת הפיתול הדנטלי, כ-1.20 מ"מ מברגמה, ומסתיים אחרי הצלחת להשלים עם הסעיף הראשון להיות הקדמי ביותר ואת החלק האחרון להיות האחורי ביותר. להתייעץ עם המוח אטלס העכבר כדי לזהות במדויק את ה-DG ואת התחלת איסוף הרקמה הרקמות.
- סרילית מאחסנת כל קטע בשורות של 6 ב 48 צלחת באר מלא בתמיסה נגד קיפאון (שולחן 1).
| תמיסה נגד קיפאון | אתילן-גליקול 150 mL + סוכרוז 150 g + מילוי ל 500 mL 0.1 M PB לפתרון 500 mL |
| מאגר ציטראט | 9 מ ל של מלאי חומצת לימון + 41 mL של tri-נתרן ציטראט מאגר + 450 mL של ddH2O |
| ממלאי חומצת לימון | [0.1 מ'] חומצת לימון 21 גרם/1 L ddH2O |
| ממלאי משולש נתרן ציטראט | [0.1 מ'] Tri-נתרן ציטראט 29.4 g/1 L ddH2O |
| מלוחים באגירה טריס-טריטון (TBS-טריטון) | 0.05% 100-x טריטון ב-TBS |
| מאגר החדירות | 0.5% 100-x טריטון ב-TBS |
| חסימת מאגר | סרום חמור ל0.33 מ"ל בשנת 10 mL-טריטון |
| Edu פתרון התגובה | הפוך CuSO4· 5h2o פתרון על ידי הוספת 1 מ"ג של cuso4· 5H2o ב 4 ML פתרון של [0.1 M] טריס pH 8.5. לאחר מכן להוסיף 1:40 של 600 μM Alexa488-azide פתרון ו 10 מ"ג/mL של L-Na+ Ascorbate כדי cuso4· 5h2פתרון לפני החלת רקמות. |
שולחן 1: פתרונות הנמצאים בשימוש עבור אימונוהיסטוכימיה.
5. אימונוהיסטוכימיה
- פרוטוקול צף בסיסי
הערה: אם הצביעת nestin, לדלג על סעיף 5.1 ולהמשיך לסעיף 5.2. הפרוטוקול הצף הבסיסי הוא עבור Tbr2 או doublecortin (dcx) רק מבלי להכתים את הצביעה האנלוגית של הפונקציה תימידין.- העבר מקטעים מהפתרון נוגד קיפאון כדי טריס באגירה מלוחים (TBS) בסדר סדרתי 48 צלחת היטב.
- לשטוף סעיפים פעמיים ב-TBS-טריטון (0.05% TBS-טריטון, שולחן 1) עבור 5 דקות על ידי שטפי את הפתרון בכל פעם תוך כדי טלטול או על נדנדה במהירויות איטיות.
- מקטעים הניתנים לחדירות באמצעות מאגר חדירות (0.5% TBS-טריטון, שולחן 1) במשך 20-30 דקות תוך כדי טלטול במהירויות איטיות.
- הפוך את מאגר חסימת ידי הוספת 0.33 μL של סרום חמור ל 10 מ ל של TBS-טריטון. להפוך טרי ולהשתמש בתוך 3 ימים.
- שאיפה מאגר חדירות ומקטעים דגירה במאגר חסימת עבור 30 דקות עד 1 h בטמפרטורת החדר (RT).
- הפוך את פתרון הנוגדן העיקרי לחסימת מאגר והוסף לכל באר. 500 μL/טוב מספיק עבור כל מקטעי הרקמה להיות שקוע לחלוטין. דגירה הלילה ב RT על נדנדה או שייקר.
- מפרקים את הפתרון ולשטוף סעיפים ב-TBS-טריטון 3x עבור 10 דקות כל אחד כדי להסיר עקבות של נוגדן ראשוני.
- מודטה ב fluorophore מצותת נוגדן משנית נגד נוגדנים העיקרי מוכן חסימת פתרון מאגר עבור 2 h ב RT על הנדנדה.
- לשטוף סעיפים 3x עבור 5 דקות כל אחד TBS-טריטון ולאחר מכן מקטעים דגירה ב 4 ′, 6-diamidino-2-פניינידול (DAPI) פתרון (300 μM פתרון ב 1:100) מדולל ב-PBS עבור 15 דקות.
- שטוף את הסעיפים 3 x ב-PBS ומקטעי הר שמירה על סדר סדרתי מקדמי לאחורי על שקופית טעונה באופן חיובי. תן רקמות יבש ב-RT עד הלחות נעלם בעליל, בדרך כלל כ 2-5 דקות, לפני coverslipping עם מדיה הרכבה.
- שליפת אנטיגן
הערה: סעיף זה נדרש עבור nestin בלבד. אם הצביעת nestin, לבצע את הסעיף הזה לפני מכתים אנלוגי תימידין (סעיף 5.3). דלג לTbr2 או לצביעת DCX עם Edu.- הצב מקטעי רקמות ב-PBS ו-mount 5-8 סעיפים על שקופית טעונה חיובי וממירה על הסדר הסידורי מאחורי לאחוריים. בואו לחלק רקמות יבש ב-RT כדי לדבוק לחלוטין שקופיות, אשר לוקח בערך 2-5 דקות. הרקמה צריכה להיות בלתי נראית בעליל לחות.
- הכן מאגר ציטראט (טבלה 1) בגורם מכיל, בדרך כלל בתיבת קצה של 1,000 μl.
- חום מאגר ציטראט במיקרוגל (1,000 W) במשך 5 דקות עד שהפתרון רותח. בעוד הפתרון הוא חימום, למקם מקטעים רכוב על מחזיק שקופיות של 20 שקופיות זכוכית. לאחר 5 דקות, הציבו בזהירות את מחזיק השקופיות עם מקטעים לתוך תיבת הפיפטה.
- הגדר את החשמל בתנור מיקרוגל כדי 50% ולבשל זמן עבור 7 דקות. להתחיל טיימר עבור 7 דקות ולצפות במיקרוגל. במהלך 7 דקות אלה, לעצור את המיקרוגל כאשר הפתרון מתחיל לרתוח ולהמשיך את המיקרוגל לאחר עצירות הרתיחה.
הערה: המטרה של שלב זה היא לשמור על טמפרטורת המים ממש מתחת לטמפרטורה הרתיחה עבור 7 דקות. להפסיק אחרי טיימר נגמר גם אם זמן הבישול על המיקרוגל לא סיים. הוראות מפורטות יותר ניתן למצוא בחוסייני ובאל20. - להוציא את הקופסה החם עם מאגר ציטראט ושקופיות רקמות ולמקם אותו דלי קרח להתקרר. לכסות כדי למנוע קרח או חומרים אחרים מלהיכנס לפתרון. המתן כ -30 דקות או עד שהפתרון יהיה מגניב למגע.
- להמשיך תימידין 5.3.2 שלב הצביעת האנלוגי אם באמצעות האנלוגי תימידין.
- תימילין כתמים אנלוגיים
הערה: התחל כאן אם צביעת Edu ו-Tbr2 או Edu ו-DCX.- הצב מקטעי רקמות ב-PBS ו-mount 5-8 סעיפים על שקופית טעונה באופן חיובי שמירה על הסדר הסידורי מאחורי לאחוריים וכיוון זהה. תן מקטעים רקמות יבש כדי לדבוק לחלוטין שקופיות ולאחר מכן לצייר גבול באמצעות עט הידרופובי או עט פאפ.
- מקטעים פרסותית עם מאגר חדירות (0.5% TBS-טריטון) עבור 20-30 דקות. ואז לשטוף סעיפים 2x באמצעות TBS-טריטון עבור 5 דקות כל אחד.
הערה: החדירות מסייעת לחדירת נוגדנים תאיים. זמן החדירות ניתן לכוונן בהתאם לעובי הרקמה וליעילות הנוגדן. לחילופין, ניתן להגביר את ריכוז חומרי הניקוי כדי להגביר את עוצמת החדירות. עם זאת, הטיפול צריך להילקח לא לחלחל במשך זמן רב מדי מאז שברינות הרקמה עולה עם זמן חדירות ממושך. - הכינו פתרון תגובה לפי שולחן 1. הריכוז הסופי של Alexa488-azide הוא 15 μM ב 1 mL של פתרון התגובה.
- מקטעי דגירה בפתרון התגובה Edu עבור 30 דקות עד 1 h ולאחר מכן לשטוף 3x ב TBS-טריטון עבור 5 דקות כל אחד. כסו שקופיות ברדיד אלומיניום כדי להגן מפני האור לאחר שלב זה. בשלב זה בדוק אם התגובה של Edu פועלת באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט. עידו התאים המסומנים בתווית יהיה זוהר תחת מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטית.
- פרוטוקול מקטע טישו נטען
- מקטעי רקמות לחסום רכוב על שקופית משלב 5.3.4 באמצעות מאגר חסימת מוגבה באותם בעלי חיים כמו הנוגדן המשני, למשל, סרום חמור, עבור 30 דקות עד 1 h ולאחר מכן לשטוף 2x ב-TBS-טריטון עבור 5 דקות כל אחד.
- הכינו נוגדן ראשי (כלומר, עוף אנטי-nestin) פתרון במהלך החסימה על ידי ערבוב נוגדנים העיקרי חסימת פתרון המאגר ב 1:200. 250 μL לכל שקופית מספיקה כדי להבטיח שהרקמה תהיה שקוע לחלוטין בתמיסה.
- מחלקים רקמות הרקמה בפתרון נוגדן ראשוני בלילה ב-RT לאחר חסימת שוטף. שנה שלב זה בהתאם לנוגדן הראשי המשמש.
הערה: אם לנוגדנים יש רקע גבוה או כריכה לא ספציפית, הדגירה ב-4 ° c במקום RT עשויה לשפר את התוצאות. נוגדנים עם חדירה לרקמות עניים ניתן להשאיר את הדגירה עבור 2 ימים אם יש צורך. - הרקמה של מפרק 3x ב TBS-טריטון עבור 5 דקות כדי להסיר את הנוגדן העיקרי עודף. לאחר מכן דגירה מקטעים רקמות fluorophore מצותת נוגדנים משניים (כלומר, אלקסה 647 נגד עוף ב 1:200) הוכן חסימת פתרון מאגר עבור 2 h ב RT.
- הרקמה המדמדית סעיפים 3x ב TBS-טריטון עבור 5 דקות כדי להסיר את הנוגדן המשני העודף ולהחיל 300 μM DAPI פתרון ב 1:100 ב PBS עבור 15 דקות ב RT.
- הרקמה הריבית מקטעים 3x ב-PBS עבור 5 דקות כדי להסיר את העודף DAPI ולהסיר את מעגל הפאפ מסביב לרקמות באמצעות ספוגית כותנה או לנגב משימה עדינה. אפשר למקטעים להתייבש ולאחר מכן להחיל מדיה הרכבה ושובר כיסוי. הנח למדיה להיות יבשה לפני שקופיות הדמיה.
6. אוסף תמונות
- קבוצות נסיוניות עיוורות מקבוצות שליטה על-ידי כיסוי תוויות שקופיות ותמונה באותו צד של DG באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלית וקד (טבלה של חומרים) עם עדשת ההגדלה 40x הגדלת שמן בגודל של 1 יקרומטר או זום 20x 2 x 1 יקרומטר.
הערה: הגדלת השמן 40x ייתן רזולוציה מוגברת אבל לוקח יותר זמן מאשר זום 20x 2x. - הגדר עדשה אובייקטיבית כדי 40x ולאחר מכן לחץ על הכרטיסייה לאתר בפינה השמאלית העליונה של התוכנה הקונמוקד (טבלה של חומרים) ולהגדיר את החלק הרצוי DG באמצע שדה הראייה.
- אתר את DG, עבור ללשונית הרכישה בפינה השמאלית העליונה ובדוק את התיבות הבאות: מחסנית Z, סריקת אריחומיקום.
- הגדר את הגדרות הערוץ בין 600-750 לרווח, 1%-15% לייזר, והיסט 1-10. לא יעלה על 20% עוצמת לייזר עבור כל הערוצים. ודא שאין פיקסלים בעלי רוויה יתר בעת הגדרת רווח ועוצמה.
הערה: טווחים אלה ישתנו בהתאם ליעילות של הציוד מנוצל ומכתים יעילות. - הגדר את האריחים כדי 7 אופקי על ידי 3 אנכי בחלון סריקת אריח ולחץ על התמונה סקירה הסריקה באמצעות אותן הגדרות כמו אלה כיום בשימוש. לדוגמה, להשתמש 7 אופקי על ידי 3 אנכית ואת המטרה 20x עם זום 2x.
- ודא ש-DG היא לגמרי בתוך התמונה הצפויה לאחר סריקת סקירה. אם לא, כוונן את התצוגה של ה-DG עד שהוא לגמרי בתמונת הסקירה מאחר שזוהי תמונה מייצגת שניתן יהיה להשיג.
- הגדר עומק הדמיה על-ידי גלילה באמצעות שונים Z-ערימות באמצעות כפתור המיקוד העדין. ודא כי ה-DG כולה נמצאת בתוך נקודות ההתחלה והסיום. בהנחה גודל צעד של 1 μm, כל תמונה צריכה להיות כ 40 שלבים.
- הגדר את מהירות הסריקה ל -9 עם סריקה דו-כיוונית ולא בממוצע בחלון מצב הרכישה. לאחר מכן הוסף מיקום בחלון המיקום.
הערה: חזור על שלבים 6.3-10.9 כדי לדמות מספר DGs בבת אחת. הגדלת מהירות הסריקה מפחיתה את איכות התמונה, אך מפחיתה את זמן הדימות הכולל. אם איכות התמונה נמוכה מדי, הפחת את מהירות הסריקה או הגדל את הממוצע. - לחץ על התחל כפתור ניסוי כאשר הוא מוכן. סריקה 5 מקטעים של DG לכל עכבר לאורך הקדמי לציר האחורי. לדוגמה, אם ה-DG השמאלית מקיימת התמונה עבור מקטע 1, יש לצלם את ה-DG השמאלי ביותר הבא עבור סעיף שני.
- תפר להפריד תמונות יחד כדי ליצור תמונה מלאה של פיתול כישור הדנטט באמצעות התכונה תפר תחת הכרטיסיה תהליך בתוכנה קונפוקלית וקד. לחילופין, השתמש בפיג (ImageJ) כדי לתפור תמונות יחד כדי ליצור gyrus מלאה.
- שמור תמונות תפור עבור כימות.
7. ניתוח תמונה
- פתח כל תמונה של כל מקטע פיתול כישור באמצעות פיג'י הן הקרנה מקסימלית וגם תמונה מורכבת עם הערוצים ממוזג בצבעים שונים כדי להמחיש בקלות לוקליזציה.
- למדוד את האזור של DG עבור כל קטע של תמונת ההקרנה המקסימלית באמצעות כלי בחירת מצולע (התיבה השלישית משמאל) ורשומה עבור כל מקטע של כל עכבר. זה יהיה האזור של די. ג'י. ששימש לחישוב הצפיפות
- הקלט את מספר התאים ב-DG מהתמונה ללא הפרדות צבע, המכילים נוגדן ראשוני (כלומר, nestin) ו-מזהה האנלוגי של תימידין, באמצעות מונה תא התוסף של פיג'י שנמצאו תחת תוספים | לנתח | מונה תאים | מונה תאים | בנוסף, הקלט את המספר הכולל של תאים חיוביים ומלא חיוביים של Edu עם תהליך רדיאלי.
הערה: במקרה של nestin, חשוב מאוד לשים לב מורפולוגיה. אם מכמת תאי גזע עצביים, ודא שרק תאים בעלי תהליך רדיאלי מתכמת. בעת הכמת של מקטעי פיתול כישור, להחיל את אותם קריטריונים על כל, במיוחד כאשר מדמיין תאים מחוץ למישור מוקד. אם התאים אינם בתוך מישור המוקד, אל תספרו אותם. נא לראות את מערב ואח '21 לקבלת הוראות מפורטות יותר על כימות סטריאוולוגית. - הזן ספירות תאים בתוכנת גיליון אלקטרוני כדי לקמפל את כל פיסות הנתונים לצורך ניתוח מאוחר יותר.
- חישוב הצפיפות של תאים מותאמים לשפות אחרות עבור כל מקטע על-ידי חלוקת המספר הכולל של תאים מותאמים לשפות אחרות לפי הנפח הכולל של כל מקטע בכל חיה. לדוגמה, השג צפיפות תא גזע על-ידי חלוקת הסכום של nestin +/edu + תאים בחיה אחת על-ידי סכום אמצעי האחסון של DG בבעל חיים אחד. חשב את עוצמת הקול של כל מקטע על-ידי הכפלת האזור בהפרשים קבועים של Z-step בהנחה שכל שלב הוא 1 μm.
הערה: בפרוטוקול זה, השלבים הכולל צריך להיות קרוב ל 40, מאז הרקמה הוא מנות ב 40 μm. להבטיח כי כל חיה היא נקודת נתונים מאז המטרה של גישה זו היא להעריך את הסכום הכולל של תאים מקומיים באונה אחת של ההיפוקמפוס. - בצע חישובים הכרחיים נוספים עבור השאלה שהיא מנסה לטפל בה. בדוגמה זו, לחשב את המספר הכולל של תאים מתרבים, כולל האוכלוסייה בתאי גזע, ואחוז של תאי גזע מתרבים לאחר עירור תאים מוסי הצלעות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בעקבות ההליכים הניסיוניים שתוארו לעיל (איור 1A,B), הצלחנו לקבוע את ההשפעות של עירור התחזיות תא מוסי הצלעות על הנישה הנוירוגניים בתוך ההיפוקמפוס. על-ידי ניצול של היצורים התלויים ביצור-מצמידים וירוס המגרה בשילוב עם מכשיר הקשר של תא מוסי 5-HT2A-קו, היינו מסוגלים באופן סלקטיבי הפעלה של התחזיות הגירוי מתאי מוסי על ה-DG הצלעות וקבע כי תא מוסי חזק גירוי תא גזע הקודם השקט (איור 1C). אנו מאומתים משלוח נגיפי מדויק לפני ניתוח רקמות (איור 2A, B). בנוסף, אנו מאומתים הפעלה של תאים מוסי באמצעות ניסויים אימונוהיסטוכימיה c-fos (נתונים לא מוצגים). במקרה של הזרקה ויראלית לא הולמת, להוציא את החיה מניתוח נוסף. זריקה לא ראויה היא אחד שאינו מכוון את הקואורדינטות הרצויות, יש את רוב הביטוי מחוץ לאזור הרצוי, או לא מעט משלוח נגיפי. עבור ניסוי זה, תאים טחבי בפילוס של ה-DG היו המטרה המיועדת, ואם הזריקות היו מחוץ לפילוס, הם לא נכללו. באמצעות האנלוגי תימידין, Edu, ואחזור אנטיגן עבור הצביעת nestin המתואר סעיפים 5.2 ו 5.3, היינו מסוגלים תווית בהצלחה מתרבים תאי גזע עצביים (איור 3a). בנוסף, על ידי השמטת שלב האחזור אנטיגן, סעיף 5.2, היינו מסוגלים לתייג Tbr2 מחולל מעשה עצבי חיובי ונוירובלסטומה, ו-DCX חיובי neuroblast ולא בוגר נוירונים (איור 3A). אנו מדגימים דוגמה של האזור כימות ומשמש לחישוב צפיפות ולספק דוגמה של רקמה רכוב על שקופית (איור 3B ואיור 4a). כמו-כן, ניסויים מוצלחים ומשניים מסופקים כהפניות לגישות נסיוניות (איור 4B). לבסוף, קיימות מספר כימות שונות שניתן לקבלו מניסוי מוצלח (איור 5A-D)15. כימות הכמויות כוללות את צפיפות תאי גזע עצביים מתרבים (Nestin +/edu +/נפח), את האחוזים של תאי גזע עצביים מתרבים (Nestin +/edu +/total nestin), כולל תאים מתרבים (Edu +/volume) ובריכת תא גזע כולל (Nestin +/אמצעי אחסון ). עם גירוי מוחי צלעות של תאים טחבי, ירידה התפשטות תא גזע עצבי נצפתה. כימות דומות ניתן להשיג עבור מחולל קדמון ונוירונים בוגרים באמצעות הנוגדן המתאים.
איור 1: גישה ניסויית להסדרת מעגל הוויסות של תאי גזע עצביים בוגרים. (א) סכימטי המייצג את השלבים השונים המתוארים בפרוטוקול. (ב) ציר זמן של גישה ניסויית המשמש לעירור תאי הטחבי במכרסמים. (ג) סכימטי הזרקה המכוון תאים מוסי צלעות עבור גירוי. (ד) סכמטי של השושלת ההתפתחותית של תאי גזע עצביים בוגרים באזור תת-החוליות (sgz), שכבת התאים הגרתית (gcl), ושכבה מולקולרית (ML) עם נוגדנים מקבילים המשמשים בשלבים התפתחותיים שונים. השלבים התפתחותיים שונים כוללים השקט או מופעל תאי גזע עצביים הרדיאלי (המועצה לבטחון לאומי), ושלתי עצביים (NP), neuroblast (NB), תאים בלתי בוגרים (GC), ו-GC בוגרת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הפגנה של משלוח נגיפי אפקטיבי. (א) החיסונית של משלוח ויראלי מדויק. חלקיקים ויראליים לבטא תווית פלורסנט mCherry אשר היעד תאים טחבי ב פילוס (באזור הקופסה הלבנה). תוויות DAPI מדבקות לגרעיני תאים. הצד של התמונה של משלוח נגיפי מדויק ממחיש התחזיות סיבים מוסי ברור מהצד ההזרקה שבצלעות. (ב) אימונוoforסנס תמונות של היעד זריקות ויראליות. שימו לב כי במקרה זה סיבי מוסי הצלעות הם נעדרים בצד התמונה. סרגל קנה מידה = 50 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ניתוח מפיצים של תאי גזע עצביים וצאצאים. (א) אימונוהיסטוכימיה תמונות של תימידין אנלוגי Edu לוקליזציה עם סמנים מסוימים בשלב התאים nestin (תאי גזע עצביים ו ושלתי), Tbr2 (תאי גזע עצביים, ושלתי עצביים), ו dcx (neuroblast, בוגר נוירונים) המצוין על ידי ראשי חץ לבנים. סרגל בקנה מידה = 10 μm. (ב) מדידה ייצוגית של האזור בתוך הפיתול הדנטאלי המשמש לחישוב צפיפות. סרגל קנה מידה = 50 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הפגנה של הכנה לאימונולובורנציה. (א) סכמטי מפגין הפרדה סטריאוולוגית של מקטעי רקמה מורכבים הקדמי ועד לציר האחורי. התיבה האדומה מציינת את התמונה הצדדית. (ב) הדגמה של ניסויים אימונולואוגנטים מוצלחים ומוופרים לסמני השושלת העצביים. סרגל קנה מידה = 50 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: הפעלת צלעות הזרע של תאים טחבי מקטין את התפשטות התא גזע עצביים. (א) אימונוהיסטוכימיה כימיה של nestin +/Edu + תאים בפיתול הדנאט מדגימים ירידה בהתפשטות לאחר גירוי של תאים מוסי צלעות. (ב) להקטין את אחוז מתרבים תאי גזע עצביים בקבוצה עם מופעל בתאי מוסי מופעלים צלעות. (ג) לא היה שינוי משמעותי בצפיפות תאי הגזע העצבית באחת הקבוצות. (ד) לא היה שינוי ברמות הכלליות של תאים מתרבים ב-דנטאט gyrus. ערכים מייצגים פירושו ± שגיאה סטנדרטית של מדידה. p < 0.05 (n = 3 עבור בקרה, n = 5 עבור הקבוצה hM3D). הדמות הזאת הותאמה לה ואח '15. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המטרה של פרוטוקול זה היא להעריך כיצד מניפולציה מעגלים עצביים ספציפיים מסדיר נוירוגנזה היפוקאמאל למבוגרים בvivo באמצעות סדרה של טכניקות אימונוהיסטוכימיה. שיטה התלויה בוויסות הפעילות של בוגרים נוירוגנזה באמצעות מעגלים עצביים ספציפיים היא טכניקה רבת ערך עם פוטנציאל רב לשינויים לחקר מגוון רחב של מעגלים עצביים. ההצלחה של סוגים אלה של ניסויים תלוי בגורמים מרובים כולל משלוח נגיפי מדויק, הבחירה הנגיפית הנכונה עבור המניפולציה הרצויה, המסירה הנכונה של אנמיטין אנלוגי, בעלי חיים גיל, היעילות חיסוני, מוצלח וכימות בלתי משוחדת של תמונות. לדוגמה, משלוח נגיפי לא מדויק עלול לגרום לתופעות היעד הנובעות פנוטיפ שאינו קשור למעגל המדובר. בנוסף, שיטות immunofluorescence באיכות נמוכה עשוי להסתיר את המספר האמיתי של התאים הנוכחיים ולכן לייצר פנוטיפ כי הוא לא רלוונטי ביולוגית. גורם מאוד חשוב מאוד לשלוט הוא הגיל של העכברים בעת ביצוע ניסויים, בהתחשב בעובדה נוירוגנזה מבוגר הוא התלוי בגיל22. לבסוף, חשוב כי כל סעיף הוא הבקיע באופן בלתי הולם. כדי להפחית את ההטיה, יש לנקוט בגישה שיטתית ולהבטיח שהאדם הבקיע מיומן בזיהוי שלבי הפיתוח של המועצה לבטחון לאומי למבוגרים באמצעות מידע מורפולוגי. בנוסף, העיוורים הן שליטה והן קבוצות הטיפול ולחשוף את זהותם לאחר כימות התמונה. כאמצעי נוסף כדי להקטין את ההטיה, שני אנשים נפרדים יכולים לכמת את אותו ערכת נתונים כדי לאמת תוצאות שנצפו.
ישנן מספר מגבלות הקשורות גישה זו כדי לחקור את הפעילות המעגל התלוי הרגולציה של NSCs למבוגרים וצאצאים יילוד. המגבלה הראשונה היא שגישה זו אינה מספקת מידע על סוגי התאים הספציפיים בתוך מעגל השולט בהשפעה הכוללת על NSCs מלתפעל את המעגל המדובר. משמעות הדבר היא כי למרות שייתכן שיש השפעה פנוטימית על NSCs למבוגרים, ההשפעה עשויה לפעול דרך סוגי תא ביניים אחד או כמה. דרך יעילה לטפל בעניין זה היא לזווג את המחקרים האלה באמצעות אלקטרופיזיולוגיה כדי להצמיד את המתווכים. מגבלה נוספת של פרוטוקול זה היא הצורך להיות בעל עכבר מסוים (5-HTR2A) קו או מבנה נגיפי (AAV5-camKII-hM3d-mcherry) שיכול למקד את המעגל הרצוי. אם קו מסוים של העכבר הספציפי של היצור הוא לא זמין עבור שאלה של עניין, היכולת ללמוד את המעגל הזה הופך קשה יותר ויותר. עם זאת, סוגי תאים רבים במוח יש שורות העכבר ספציפיים. הגבלה פחותה של פרוטוקול זה קשורה ל-CNO כיעיל למדי. לאחרונה, מחקרים הראו כי CNO, הכימיקל אינרטי המשמש להפעלת ראסטות, חילוף חומרים כדי clozapine, אשר עלול לגרום פנוטיפים התנהגותיים23. עם זאת, דרך יעילה לטיפול היא לכלול בקרות מתאימות בכל ניסוי. דוגמה של פקדים נאותים כוללת הן בקרת CNO ו-ראסטות, כאשר CNO מנוהל בשילוב עם וירוס עיתונאי בקרה (AAV5-DIO-mCherry), ו מלוחים רק לשלוט איפה CNO מנוהל קבוצת וירוס עיתונאי. על-ידי כלילת פקדים אלה, ניתן לבודד את ההשפעות של CNO בלבד. לחילופין, אינרטי משני המכונה C21, כבר הפגינו לאחרונה יש יעילות דומה והעוצמה עם לא הפגינו השפעות התנהגותיות24. לבסוף, הגבלה סופית של פרוטוקול זה היא שליטה על כמות CNO שכל בעל חיים צורכת במהלך הניסוי. בעלי חיים שונים משקה CNO-המכיל מים במעלות שונות ולכן עשוי להיות מגוון של אפקטים על נוירוגנזה למבוגרים. באופן כללי, עכבר נוטה לשתות כ 4 מ ל של מים CNO בתקופה של 24 שעות. משמעות הדבר היא כי בריכוז של 1 מ"ג/200 מ"ל חיות לקבל סך של 0.02 מ"ג של CNO ליום אשר דומה לסכום של מינון יחיד CNO מוזרק intraperitoneally. אם בזמן הניהול מצמידים של CNO הוא חשש, מעבר לזריקות הצפק יכול להיות חלופה טובה יותר.
היתרון של שימוש בפרוטוקול זה הוא המידה של הספציפיות שהושגו כאשר מאופגות נוירוגנזה מבוגרת. בעבר מחקרים נוירוגנזה השתמשו במערכת מערכתית פרמקולוגית או היריב לווסת את רכיבי המעגל. אלה מניפולציות שאינן ספציפיות עשוי לייצר הבדלים פנוהקטנים, אך לספק תובנה קטנה על מנגנונים המעורבים בוויסות למבוגרים תא גזע הרגולציה. בנוסף, פרוטוקול זה ניתן לשנות בקלות כדי לחקור אפקטים שונים רחב המעגלים על נוירוגנזה למבוגרים. לדוגמה, על-ידי מעבר ל-ראסטות מעכבות, או על-ידי התמקדות באזורי מוח אחד או מספר בו, ניתן לבקש מגוון שאלות כדי להבין את הרגולציה הספציפית של נוירוגנזה מבוגרת. יתרון נוסף של שימוש בפרוטוקול זה על פני גישות קודמות היא כי, השימוש בנוגדן nestin מבטלת הרבייה בעלי חיים טרנסגניים של כתבים בעלי מקודד העצבים העצבי פלואורוסקופים כגון nestin: GFP, הגדלת יעילות והפחתת זמן לכל . ניסוי8 יתר על כן, טכניקה זו מגבילה טיפול מכרסם בעת מתן CNO, אשר מפחית את הלחץ מכרסם במהלך ניסויים. חשוב להמתיק את המתח בעת לימוד תהליכים רגישים ללחץ. לבסוף, גישה זו היא בקלות amendable לכלול שיטה התנהגותית, למשל, אם אחד היה מעוניין לשאול אם מעגל התאים הצלעות מוחלק מוסי מודולים NSCs גם ממלא תפקיד בלמידה מרחבית או עמידות בלחץ.
הקושי הטכני העיקרי בעת שימוש בגישה זו הוא משלוח נגיפי מדויק. להיות מנתח מכרסם מיומן לוקח להתאמן ויכול לקחת פתרון בעיות משמעותי. לכן מומלץ לבצע סדרה של ניסויים פיילוט כדי לבדוק titer ויראלי, היעילות תיוג, ו ויראלי התפשטות. מצאנו כי מסרוטיפים מסוימים יש דפוסי התפשטות שונים ושהסוג AAV2 מתפשט פחות מ-AAV5 או AAV8. בנוסף, מומלץ לקבל ספק אריזה ויראלי אמין עבור כל אחד מאותם ניסויים. על ידי ביצוע ניתוחי הטייס, רבים מדאגות אלה יכולים להיות ממוען ואחד יכול לחסוך זמן. מומלץ גם כי מבחן אחד ריכוזי CNO שונים כדי לעורר או לעכב את המעגלים הרצויים. באופן כללי, 1 מ"ג/ק"ג יהיה מספיק להפעיל מעגלים נבדק, אך סוגי תאים מסוימים עשויים לדרוש יותר או פחות CNO. חשוב לציין כי המינון של הממשל CNO יכול להשפיע על מעגלים מסוימים במיוחד כאשר מסתכלים על משהו כגון תאים מוסי15.
יישומים חלופיים של פרוטוקול זה כוללים בדיקות התנהגותיות סימולטני, אפנון של מעגלים חלופיים, ניתוח נוסף של תכונות נוירוגנזה. כדי לבצע בדיקות התנהגותיות, ניתן לבצע את הפרוטוקול המתואר ולאחר מתן CNO, לבצע משימה התנהגותית ספציפית, כגון שיטת המיקום הרומן, או משימת ניווט מרחבית. היתרון של גישה זו הוא כי ניסוי בודד יהיה להניב מידע התנהגותי ומעגל ספציפי שיכול להוביל מעגל התנהגותי ספציפי התנהגות. כדי לווסת מעגלים חלופיים, ניתן להשתמש בשילוב של קווי יצור שונים ווקטורים ויראליות. לדוגמה, אם אחד היה מעוניין להבין כיצד מעכבים נוירונים דואמנרגיים מתוך האזור tegmental הגחוני (VTA) או VTA מודולים למבוגרים נוירוגנזה, אחד יכול להשתמש בחוט העכבר של הידרוסון הידקסילאז ולהזריק hM4D התלויים ביצור (מעכבות) וירוס ראסטות ב VTA כדי לקבוע את הרגולציה הספציפית הדואמנרגית של נוירוגנזה מבוגרת. האפשרויות למקד אזורי מוח חלופיים באמצעות גישה זו הם עצומים והוא יכול לשמש אסטרטגית לחקור מעגלים עצביים משכנעת. לבסוף, גישה זו מאפשרת אחד לחקור שלבים נוספים של נוירוגנזה למבוגרים. אם למשל אחד רצה להבין כיצד מגרה בתאי טחבי משפיע על arborization או אורך הדנדריטים של נוירונים בלתי בוגרים, אחד היה לעקוב אחר פרוטוקול דומה אך לבצע ניתוח אלטרנטיבי כגון ניתוח שולבה.
לסיכום, פרוטוקול זה מספק תהליך מפורט צעד אחר צעד כדי לספק את הרגולציה התלויה של פעילות מעגל של NSCs למבוגרים ונוירוגנזה באמצעות טכנולוגיית הדרברה. החוזק של פרוטוקול זה טמון ביכולתה להיות שונה בקלות כדי להתמודד עם מגוון רחב של שאלות לגבי המעגלים ספציפי למבוגרים מסוימים הרגולציה העצבית תא גזע. עם התקדמות האשכולות מקובצים באופן קבוע משני התאים הקצרים והמרווחים של הטכנולוגיה (CRISPR), קל יותר ליצור שורות מסוימות של העכבר הספציפי התא לזוג עם מבנים ויראליות מתוחכמים כדי לטפל שאלות מורכבות יותר ויותר הרחבת הישימות של פרוטוקול זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
L.J.Q. היה נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות הנפש של המוסדות הלאומיים לבריאות תחת התוספת גיוון R01MH111773, כמו גם מענק הכשרה T32 T32NS007431-20. פרויקט זה נתמך ממענקים הוענק ל-י. ס. י. מ-NIH (MH111773, AG058160, ו NS104530).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| 48 Well Plate | Denville Scientific | T1049 | |
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (Edu) | Carbosynth | NE08701 | |
| Alcohol 70% Isopropyl | Thermo Fisher Scientific | 64-17-5 | |
| Alcohol Prep Pads | Thermo Fisher Scientific | 13-680-63 | |
| Alexa-488 Azide | Thermo Fisher Scientific | A10266 | |
| Anti-Chicken Nestin | Aves | NES; RRID: AB_2314882 | |
| Anti-Goat DCX | Santa Cruz | Cat# SC_8066; RRID: AB_2088494 | |
| Anti-Mouse Tbr2 | Thermo Fisher Scientific | 14-4875-82; RRID: AB_11042577 | |
| Betadine Solution (povidone-iodine) | Amazon | ||
| Citiric Acid Stock [.1M] Citric Acid (21g/L citric acid) | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| Clozapine N- Oxide | Sigma-Aldrich | C08352-5MG | |
| Confocal Software (Zen Black) | Zeiss Microscopy | Zen 2.3 SP1 FP1 (black) | |
| Copper (II) Sulfate Pentahydrate | Thermo Fisher Scientific | AC197722500 | |
| Cotton Swabs | Amazon | ||
| Coverslip | Denville Scientific | M1100-02 | |
| Delicate Task Wipe Kimwipes | Kimtech Science | 7557 | |
| Drill Bit 0.5 mm | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Ethylene Glycol | Thermo Fisher Scientific | E178-1 | |
| Hamilton Needle 2 inch | Hmailton Company | 7803-05 | |
| Hamilton Syringe 5 μL Model 75 RN | Hmailton Company | Ref: 87931 | |
| High Speed Drill | Foredom | 1474 | |
| Infusion Pump | Harvard Apparatus | 70-4511 | |
| Injectable Saline Solution | Mountainside Health Care | NDC 0409-4888-20 | |
| Insulin Syringe | BD Ultra-Fine Insulin Syringes | ||
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| Stereotax For Small Animal | KOPF Instruments | Model 942 | |
| Leica M80 | Leica | ||
| Leica Microtome | Leica | SM2010 R | |
| LSM 780 | Zeiss Microscopy | ||
| Nair (Hair Removal Product) | Nair | ||
| Paraformaldahyde 4% | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Plus Charged Slide | Denville Scientific | M1021 | |
| Phosphate Buffered Solution (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | |
| Puralube Vet Ointment | Puralube | ||
| Slide Rack 20 slide unit | Electron Microscopy Science | 70312-24 | |
| Slide Rack holder | Electron Microscopy Science | 70312-25 | |
| Small Animal Heating Pad | K&H | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Super PAP Pen 4 mm tip | PolySciences | 24230 | |
| Surgical Scalpel | MedPride | 47121 | |
| Tris Buffered Solution (TBS) | Sigma-Aldrich | T5912 | |
| Tri-sodium citrate Stock [0.1 M] Tri-sodium Citrate (29.4g/L tri-sodium citrate) | Sigma-Aldrich | C8532 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Tweezers | Amazon | ||
| Vet Bond Tissue Adhesive | 3M | 1469SB |
References
- Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. Mechanisms and Functional Implications of Adult Neurogenesis. Cell. 132 (4), 645-660 (2008).
- Spalding, K. L., et al. Dynamics of hippocampal neurogenesis in adult humans. Cell. 153 (6), 1219-1227 (2013).
- Hill, A. S., Sahay, A., Hen, R. Increasing Adult Hippocampal Neurogenesis is Sufficient to Reduce Anxiety and Depression-Like Behaviors. Neuropsychopharmacology. 40 (10), 2368-2378 (2015).
- Clelland, C. D., et al. A functional role for adult hippocampal neurogenesis in spatial pattern separation. Science. 325, (2009).
- Sahay, A., et al. Increasing adult hippocampal neurogenesis is sufficient to improve pattern separation. Nature. 472 (7344), 466-470 (2011).
- Anacker, C., et al. Hippocampal neurogenesis confers stress resilience by inhibiting the ventral dentate gyrus. Nature. , 1 (2018).
- Kuhn, H. G., Eisch, A. J., Spalding, K., Peterson, D. A. Detection and Phenotypic Characterization of Adult Neurogenesis. Cold Spring Harb Perspect Biol. , (2016).
- Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis. Journal of Visualized Experiments. (98), 1-13 (2015).
- Podgorny, O., Peunova, N., Park, J. H., Enikolopov, G. Triple S-Phase Labeling of Dividing Stem Cells. Stem Cell Reports. 10 (2), 615-626 (2018).
- Taupin, P. BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: Paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Research Reviews. 53 (1), 198-214 (2007).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (12), 5163-5168 (2007).
- Sidor, M. M., Davidson, T. J., Tye, K. M., Warden, M. R., Diesseroth, K., Mcclung, C. A. In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System. J Vis Exp. , (2015).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Primer Optogenetics in Neural Systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
- Yeh, C., Asrican, B., Moss, J., Lu, W., Toni, N., Song, J. Mossy Cells Control Adult Neural Stem Cell Quiescence and Maintenance through a Dynamic Balance between Direct and Indirect Pathways. Neuron. , 1-18 (2018).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable Stereotaxic Surgery in Rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), 20-22 (2008).
- Roth, B. L. Primer DREADDs for Neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
- Zeng, C., et al. Evaluation of 5-ethynyl-2 ′ -deoxyuridine staining as a sensitive and reliable method for studying cell proliferation in the adult nervous system. Brain Research. 1319, 21-32 (2010).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), 1-9 (2012).
- Hussaini, S. M. Q., Jun, H., Cho, C. H., Kim, H. J., Kim, W. R., Jang, M. Heat-induced antigen retrieval: an effective method to detect and identify progenitor cell types during adult hippocampal neurogenesis. J Vis Exp. , (2013).
- West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. G. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. The Anatomical Record. 231 (4), 482-497 (1991).
- Kuhn, H., Dickinson-Anson, H., Gage, F. Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat: age-related decrease of neuronal progenitor proliferation. The Journal of Neuroscience. 16 (6), 2027-2033 (1996).
- Gomez, J. L., et al. Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine. Science. 357 (6350), 503-507 (2017).
- Thompson, K. J., et al. Dreadd Agonist 21 (C21) Is an Effective Agonist for Muscarnic-Based Dreadds in Vitro and in Vivo. ACS Pharmacology & Translational Science. 72 (3), (2018).
