Summary
Målet med denne protokollen er å beskrive en tilnærming for å analysere atferden til voksen neural Stem/stamceller som svar på chemogenetic manipulering av en bestemt lokal nevrale krets.
Abstract
Voksen neurogenesis er en dynamisk prosess som nylig aktiverte nevrale stamceller (NSCs) i subgranular sonen (SGZ) av dentate gyrus (DG) generere nye neurons, som integreres i en eksisterende nevrale krets og bidra til bestemte hippocampus funksjoner . Betydelig, voksen neurogenesis er høylig mottagelig å miljømessig stimulere, hvilke innrømmer for aktivitet-avhengig reguleringen av forskjellige Cognitive funksjonene. Et stort utvalg av nevrale kretser fra ulike hjerneområder appartefakter disse komplekse kognitive funksjoner. Det er derfor viktig å forstå hvordan spesifikke nevrale kretser regulere voksen neurogenesis. Her beskriver vi en protokoll for å manipulere nevrale krets aktivitet ved hjelp av designer reseptor eksklusivt aktiveres av designer narkotika (DREADDs) teknologi som regulerer NSCs og nyfødte avkom i gnagere. Denne omfattende protokollen inkluderer stereotaxic injeksjon av viral partikler, chemogenetic stimulering av spesifikke nevrale kretser, tymidin analog administrasjon, vevs behandling, immunofluorescence merking, konfokalmikroskopi Imaging, og Imaging analyse av ulike stadier av nevrale forløper celler. Denne protokollen gir detaljerte instruksjoner om Antigen gjenfinning teknikker som brukes til å visualisere NSCs og deres avkom og beskriver en enkel, men likevel effektiv måte å modulere hjernen kretser ved hjelp av Clozapine N-oksid (CNO) eller CNO-inneholdende drikkevann og DREADDs-uttrykker virus. Styrken i denne protokollen ligger i tilpasningsdyktighet sin for å studere et mangfoldig utvalg av nevrale kretser som påvirker voksen neurogenesis avledet fra NSCs.
Introduction
Voksen neurogenesis er en biologisk prosess der nye neurons er født i en voksen og integrert i eksisterende nevrale nettverk1. Hos mennesker skjer denne prosessen i dentate gyrus (DG) av hippocampus, der om 1 400 nye celler blir født hver dag2. Disse cellene bor i den indre delen av DG, som havner en neurogenic nisje, kalt subgranular sonen (SGZ). Her, hippocampus voksen nevrale stamceller (NSCs) gjennomgår en kompleks utviklingsprosess å bli fullt funksjonell neurons som bidrar til regulering av spesifikke hjernens funksjoner, inkludert læring og hukommelse, humør regulering, og stress respons3 ,4,5,6. For å påvirke atferd, voksen NSCs er sterkt regulert av ulike eksterne stimuli i en aktivitet avhengig måte ved å svare på en rekke lokale og eksterne kjemiske signaler. Disse kjemiske stikkordene inkluderer nevrotransmittere og neuromodulatorer og opptrer i en krets spesifikk måte fra ulike hjerneområder. Viktigere, krets bredt konvergens av disse kjemiske signaler på NSCs gjør det mulig for unike og presise regulering av stilk cellen aktivisering, differensiering, og skjebnen beslutninger.
En av de mest effektive måtene å forhøre krets regulering av voksen NSCs in vivo er ved sammenkobling immunofluorescence analyse med krets bredt manipulasjoner. Immunofluorescence analyse av voksen NSCs er en vanlig benyttet teknikk, hvor antistoffer mot spesifikke molekylære markører brukes for å indikere utviklingstrinn av voksen NSCs. Disse markørene inkluderer: nestin som en radial glia celle og tidlig neural stamfar markør, Tbr2 som en mellomliggende stamfar markør, og dcx som en neuroblast og umodne Nevron markør7. Ved å administrere tymidin analogs, for eksempel BrdU, CidU, IDu og edu, kan celle populasjoner som er under S fase, være individuelt merket og visualisere8,9,10. Ved å kombinere disse to tilnærmingene kan et bredt spekter av spørsmål undersøkes fra hvordan spredning reguleres ved spesifikke utviklingstrinn, til hvordan ulike signaler påvirker NSC-differensiering og neurogenesis.
Det finnes flere alternativer for effektivt å manipulere nevrale kretser, inkludert elektrisk stimulering, optogenetics og chemogenetics, hver med sine egne fordeler og ulemper. Elektrisk stimulering innebærer en omfattende operasjon der elektroder blir implantert til en bestemt hjerne region som senere brukes til å overføre elektriske signaler for å modulere en målrettet hjerne region. Men denne tilnærmingen mangler både mobilnettet og krets spesifisitet. Optogenetics innebærer levering av viral partikler som koder en lys aktivert reseptor som stimuleres av en laser slippes ut gjennom en implantert optisk fiber, men krever omfattende manipulasjoner, store kostnader, og komplekse operasjoner11. Chemogenetics innebærer levering av viral partikler som koder en designer reseptor utelukkende aktiveres av designer narkotika eller DREADDs, som senere aktiveres av en bestemt og biologisk inert ligand kjent som Clozapine N-oksid (CNO)12 . Fordelen med å utnytte DREADDs å manipulere lokale nevrale kretser som regulerer voksen NSCs ligger i letthet og ulike ruter i CNO administrasjon. Dette gir en mindre tidkrevende tilnærming med redusert dyr håndtering, som er lett tilpasses for langsiktige studier til modulere nevrale kretser.
Tilnærmingen er beskrevet i denne protokollen er en omfattende samling av ulike protokoller som kreves for å kunne forhøre krets regulering av voksen hippocampus neurogenesis som kombinerer både immunofluorescence teknikker og krets manipulasjoner bruker chemogenetics. Metoden beskrevet i følgende protokoll er hensiktsmessig for å stimulere eller hemme en eller flere kretser samtidig in vivo for å bestemme deres regulatoriske funksjon på voksen neurogenesis. Denne tilnærmingen er best brukt hvis spørsmålet ikke trenger en høy grad av timelig oppløsning. Spørsmål som krever presis timelig kontroll av stimulering/hemming ved en viss frekvens, kan bli bedre adressert ved hjelp av optogenetics13,14. Tilnærmingen er beskrevet her er lett tilpasses for langsiktige studier med minimal dyr håndtering spesielt der stress er en stor bekymring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer inkluderer dyr emner ha blitt anerkjent av det institusjonell dyr bekymre og bruk komité (IACUC) for universitetet av Nord Carolina kapell ås.
1. Stereotaxic injeksjon av viral partikler
- Bestem de nevrale kretser i spørsmålet. Denne ville avgjøre det virus og musa line anvende for det fulgte fremgangsmåte.
Merk: I dette eksempelet stimuleres kontralateral mosegrodd celle anslag for å analysere dens virkninger på voksen neurogenesis. Viral partikler koding AAV5-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry er levert til DG av 5ht2A-grobunn mus15. - Administrer meloksikam (5 mg/kg, subkutant) minst 30 min pre-operativt for å gi forkjøps analgesi til en 8-ukers-gammel mannlig heterozygot 5ht2A-grobunn-mus.
- Bedøve musa ved hjelp av en 4% isoflurane oksygen blandingen til pusten bremser ned og musen er bevisstløs ved hjelp av en isoflurane kammer. Toe klype musen for å sikre at det ikke er responsive.
- Plasser musen i stereotax på en liten dyr oppvarming pad for termisk regulering og påfør øye smøremiddel til hvert øye. Reduser isoflurane til 1,5% når dyret er inne i stereotax.
Merk: Ear bar plassering i løpet av denne fasen er viktig. Sørg for at hodet er Plant etter at du har plassert øret bar. Mer detaljerte instruksjoner finnes i Geiger et al.16. - Plasser hårfjerning produktet på hodet og la det sitte i opptil 1 min maksimum. Fjern håret ved å tørke hodet med etanol kluter. Hvis håret ikke er helt fjernet, gjenta denne prosessen til toppen av hodet er naken.
- Desinfisere det barberte området med en povidon-jod-løsning minst 3 ganger.
- Plasser aktuell lidokain løsning på naken hud på hodet og vente i 1 min. Fjern aktuell lidokain fra hodet og lage et lite snitt på hodet fra starten av øynene til starten av ørene ca 2 mm ved hjelp av en kirurgisk skalpell.
Merk: Toe klype musen for å sikre at det er helt bedøvet før du gjør noen snitt. - Trekk tilbake hodebunnen og rengjør bindevevet på toppen av hodet ved å bruke sterilisert bomullspinner til bregma er lett identifiserbare.
- Finn bregma og justere hodet slik at bregma og lambda er begge på samme planet ved å plassere bore på begge koordinater og sikre de align. I tillegg kan du justere venstre og høyre halvkule ved å plassere boret til venstre/høyre for en region mellom bregma og lambda.
Merk: Dette trinnet er svært viktig; feiljustert hode plassering vil forstyrre stereotaxic koordinater. - Bor på følgende koordinater fra bregma ved hjelp av en 0,5 mm Drill bit: fremre bakre akse (AP)-2,00 mm, midtre lateral akse (ML) + 1,50 mm. Lag en 0,5 mm til 1 mm i diameter borehullet.
Merk: Endre dette trinnet med koordinater som er spesifikke for den aktuelle kretsen. Dette eksempelet mål ensidig dentate gyrus inneholder mosegrodd celler og bestemmer deres effekt på voksen nevrale stamceller på kontralateral side. - Bytt drill til 5 μL sprøyte og 26 − 33 G nål. Null ved bregma og deretter injisere ved følgende koordinater ved å plassere nålen i borehullet på fremre bakre akse-2,00 mm, midtre lateral akse-1,50 mm, rygg ventrale akse-2,3 mm.
- Sette mot 500 nL av adeno-assosiert virus (AAV) fra en viral kjerne eller kommersiell kilde til den aktuelle halvkule, ved 50 − 100 nL/min ved hjelp av en infusjons pumpe (tabell av materialer). Vent minst 5 min innlegg injeksjon før langsomt fjerne nålen fra hjernen.
Merk: Disse koordinatene kan kreve justering basert på alder og størrelse på musen. Visse viral serotypene har ulike diffusjon mønstre, er det best å utføre pilot eksperimenter for å teste viral spres før et komplett eksperiment. - Rengjør hodebunnen og huden rundt snittet ved hjelp av saltvann, og deretter forsegle snitt ved hjelp av vev lim (tabell av materialer) mens du holder huden sammen med pinsett. Utfør alle postoperativ prosedyrer som overvåking under utvinning på en varmepute til musen er aktiv, påføre smertestillende på såret, og administrere smertestillende i to dager.
Merk: Mange eksperimenter krever 2 − 4 ukers ventetid etter viral infusjon for riktig viral uttrykk.
2. Clozapine N-oksid administrasjon
- Forbered en lager CNO løsning ved å oppløse 10 mg CNO i 100 μL av dimethyl sulfoxide (DMSO) og virvlingen.
Merk: Hvis løsningen ikke oppløses helt, øke volumet av DMSO, men for mye DMSO kan gjøre vannet bitter. Ikke overstige 0,1% DMSO i CNO vann løsning eller mer enn 200 μL av DMSO for en 200 mL løsning. CNO lagerløsning kan oppbevares ved-20 ° c i opptil to uker. - Tilsett 10 − 50 μL av 10 mg/100 μL CNO lagerløsning på hver 200 mL vann til en endelig konsentrasjon på 1 − 5 mg/200 mL. Forbered CNO vann blandingen frisk hver dag.
Merk: Noen grupper har supplert opp til 1% saccharin i vannet for å maskere bitterhet hvis mus er avstå fra drikking. Kretsen undersøkt viste et annet svar basert på omfanget av aktiveringen. Generelt er 1 mg CNO/200 mL tilstrekkelig til å stimulere de fleste kretser17. - Plasser CNO-løsningen i en folie dekket eller lett beskyttet beholder ved administrering til mus to uker etter utvinning fra stereotaxic injeksjon fra trinn 1,13 over en periode på 4 dager.
Merk: CNO er lysfølsom; redusere eksponering for lys under hele prosessen. - Mål og ta opp konsumert CNO vann løsning hver dag når du forbereder frisk CNO løsning. I gjennomsnitt vil en voksen mus forbruke ca 4 mL CNO vann blanding. I tillegg registrerer musen vekt daglig for å sikre at de drikker.
- Kontroller at det brukes riktige kontroller for hvert eksperiment. Inkluder både en CNO-og DREADD-kontroll. Et eksempel på en eksperimentell oppsett vil inkludere: (1) kjøretøy + autonome Amfibisk kjøretøy (AAV) med viral reporter ingen DREADD, (2) CNO + AAV med viral reporter ingen DREADD, og (3) CNO + AAV DREADD.
Merk: Alle grupper inkluderer DMSO i løsningen. DMSO-kontroller er ikke inkludert fordi dyrene får mindre enn 0,1% DMSO, som ikke har vist å ha negative effekter på voksen nevrale stamceller i mus. Hvis det er bekymringer om DMSO bruk i drikkevann, legge til en ekstra ingen DMSO og saltvann kontroll.
3. tymidin analog merking
-
På vevs innsamlings dagen, 4 dager etter administrering av CNO, merker voksende celler ved å utføre en rekke tymidin analoge, 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (edu) intraperitoneal injeksjoner.
Merk: denne protokollen bruker edu. Det er imidlertid flere tymidin analogs som effektivt kan merke voksende celle populasjoner, inkludert Brdu, IDu og Cidu8.- Veie edu og oppløses i veterinær klasse 0,9% natriumklorid injeksjons løsning ved 4 mg/mL av virvlingen og plassering på en rotor i 15 min.
Merk: Tymidin analogs er giftige og lysfølsomme. Følg Material sikkerhetsdatablad (muskel-og skjelett) ved håndtering og dekk løsning fra lys eksponering ved hjelp av aluminiumsfolie. - Administrere edu intraperitonealt ved 40 mg/kg eller 0,1 mL/10 g kroppsvekt av 4 mg/mL edu-løsningen 4 ganger hver 2.
Merk: Doser over 50 mg/kg rekkevidde nær metningsnivåer og vil ikke øke mengden merket voksende celler betydelig18. Det er avgjørende at alle mus får samme antall edu injeksjoner siden uriktig merking kan skew resultater.
- Veie edu og oppløses i veterinær klasse 0,9% natriumklorid injeksjons løsning ved 4 mg/mL av virvlingen og plassering på en rotor i 15 min.
4. vevs forberedelser og prosessering
- To timer etter den siste edu injeksjon, bedøve musen ved hjelp av en isoflurane kammer til pusten er betydelig redusert og tå knipe for å sikre at det er helt bedøvet.
- Fest musen til overflaten ved hjelp av nåler og lage et lite snitt utsette hjertet. Sett en 25 G nål til venstre aorta og skjær høyre ventrikkel for transcardial med fosfat bufret saltvannsoppløsning (PBS) med en strømningshastighet på 1 − 4 mL/min inntil lever vevet er tømt.
- Bytt til 4% paraformaldehyde (PFA) og perfuse rundt 15 − 20 mL for å fikse hjernevevet.
Merk: Du finner mer detaljerte instruksjoner om prosessen i Gage et al.19. Animal rystelser vil bli observert når det gjøres riktig. - Fjern hodet ved hjelp av et par store saks og deretter utføre en rekke forsiktig snitt for å frigjøre hjernen fra skallen. Oppbevar hjernevevet ved 4 ° c i 4% PFA over natten for å fortsette å feste.
- Fjern hjernevevet fra 4% PFA løsning og plasser i en 10% sukrose oppløsning i PBS å cryoprotect vev for 24 h ved 4 ° c. Deretter overføre vev til en 30% sukrose PBS løsning for en annen 24 h ved 4 ° c før snitting.
Merk: Hjernevevet synker i sukrose når det er klart for mikrotomen snitting. Hjernevevet kan lagres på lang sikt i 30% sukrose. - § Hjernevev koronalt i 40 μm seksjoner ved hjelp av en mikrotomen. Samle seksjoner begynner ved starten av dentate gyrus, ca-1,20 mm fra bregma, og slutter etter at platen er ferdig med den første delen er den mest fremre og den siste delen er den mest bakre. Konsultere en mus hjernen Atlas å nøyaktig identifisere DG og starter vev samling koordinater.
- Serielt lagre hver seksjon i rader av 6 i en 48 brønn plate fylt med frostvæske løsning (tabell 1).
| Frostvæske løsning | Etylen-glykol 150 mL + sukrose 150 g + fyll til 500 mL 0,1 M PB for 500 mL oppløsning |
| Citrate buffer | 9 mL sitronsyre lager + 41 mL av Tri-Sodium citrate buffer + 450 mL ddH2O |
| Sitronsyre lager | [0,1 på M] Sitronsyre 21 g/1 L ddH2O |
| Tri-Sodium citrate lager | [0,1 på M] Tri-Sodium citrate 29,4 g/1 L ddH2O |
| Tris bufret Saline-Triton (TBS-Triton) | 0,05% 100-x Triton i TBS |
| Permeabilization buffer | 0,5% 100-x Triton i TBS |
| Blokkering buffer | 0,33 mL Donkey serum i 10 mL TBS-Triton |
| Edu reaksjon løsning | Lag en CuSO4· 5h2o løsning ved å tilsette 1 mg CuSO4· 5h2O i 4 ml oppløsning av [0,1 M] Tris pH 8,5. Deretter legger 1:40 av en 600 μM Alexa488-Natriumazid løsning og 10 mg/mL av L-na+ ascorbate til CuSO4· 5h2O løsning før påføring på vev. |
Tabell 1: løsninger benyttet for immunhistokjemi.
5. immunhistokjemi
- Grunnleggende flytende protokoll
Merk: Hvis farging nestin, hopper du over avsnitt 5,1 og fortsetter til seksjon 5,2. Den grunnleggende flytende protokollen er for Tbr2 eller doublecortin (DCX) bare uten tymidin analoge edu farging.- Overfør seksjoner fra frostvæske løsningen til Tris-bufret saltvann (TBS) i seriell orden i en 48 brønn plate.
- Vask seksjoner to ganger i TBS-Triton (0,05% TBS-Triton, tabell 1) i 5 min ved aspirating løsningen hver gang mens risting eller på en rocker ved langsomme hastigheter.
- Permeabilize seksjoner bruker permeabilization buffer (0,5% TBS-Triton, tabell 1) for 20 − 30 min mens risting ved langsomme hastigheter.
- Gjør blokkerings bufferen ved å tilsette 0,33 μL av esel serum til 10 mL TBS-Triton. Gjør fersk og bruk innen 3 dager.
- Aspirer permeabilization buffer og ruge seksjoner i blokkerende buffer i 30 min til 1 t ved romtemperatur (RT).
- Gjør den primære antistoff løsning i blokkering buffer og legge til hver brønn. 500 μL/brønn er tilstrekkelig for at alle vevs deler skal være helt nedsenket. Ruge over natten på RT på en rocker eller shaker.
- Aspirer løsning og skyll seksjoner i TBS-Triton 3x i 10 min hver for å fjerne spor av primære antistoff.
- Ruge i fluoroforen bøyd sekundært antistoff mot primære antistoffer fremstilt i blokkerende buffer løsning for 2 timer på RT på en rocker.
- Vask seksjoner 3x for 5 min hver i TBS-Triton og deretter ruge seksjoner i 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) løsning (300 μM løsning på 1:100) fortynnet i PBS for 15 min.
- Vask seksjoner 3x i PBS og montere seksjoner opprettholde seriell rekkefølge fra fremre til bakre på et positivt ladet lysbilde. La vevet tørke ved RT til fukt er synlig borte, vanligvis ca 2 − 5 min, før påsetting med monterings medier.
- Antigen henting
Merk: Denne delen er bare nødvendig for nestin. Hvis farging nestin, Utfør denne seksjonen før tymidin analoge farging (avsnitt 5,3). Hopp over for Tbr2-eller DCX-farging med edu.- Plasser vevs deler i PBS og Monter 5 − 8 seksjoner på et positivt ladet lysbilde som opprettholder serie rekkefølgen fra fremre til bakre. La vevs delene tørke på RT for å holde seg helt til lysbildene, noe som tar ca 2 − 5 min. vev bør være synlig fraværende av fuktighet.
- Forbered citrate buffer (tabell 1) i en beholder, vanligvis en 1 000 μL pipette tip-boks.
- Heat citrate buffer i en mikrobølgeovn (1 000 W) i 5 min til løsningen er kokende. Mens løsningen er oppvarming, plasser montert seksjoner i en 20-Slide glass Slide holderen. Etter 5 minutter, plasser skyve holde ren forsiktig med delene inn i pipette boksen.
- Sett mikrobølgeovn strøm til 50% og kok tid for 7 min. Start en tidtaker i 7 min og se på mikrobølgeovnen. I løpet av disse 7 minuttene, stoppe mikrobølgeovnen når løsningen begynner å koke og fortsette mikrobølgeovnen etter koking stopper.
Merk: Målet med dette trinnet er å holde vanntemperaturen rett under koke temperaturen i 7 min. stopp etter at timeren går ut selv om kokken tid på mikrobølgeovnen ikke er ferdig. Mer detaljerte instruksjoner finnes i Hussaini et al.20. - Ta ut den varme boksen med citrate buffer og vev lysbilder og legg den i en is bøtte til å avkjøle. Deksel for å forhindre is eller andre materialer fra å komme inn i løsningen. Vente på om 30 min eller til løsning er avkjøle å berøring.
- Fortsett til tymidin analoge farge trinn 5.3.2 Hvis du bruker tymidin analog.
- Tymidin analoge flekker
Merk: Start her hvis flekker edu og Tbr2 eller edu og DCX.- Plasser vevs deler i PBS og Monter 5 − 8 seksjoner på et positivt ladet lysbilde som opprettholder serie rekkefølgen fra fremre til bakre og samme retning. La vevs delene tørke slik at de fester seg helt til lysbildene og tegner en kantlinje ved hjelp av en hydrofobe penn eller PAP-penn.
- Permeabilize seksjoner med permeabilization buffer (0,5% TBS-Triton) i 20 − 30 min. Deretter vaskes seksjoner 2x med TBS-Triton i 5 minutter hver.
Merk: Permeabilization hjelpemidler intracellulære antistoff penetrasjon. Permeabilization tid kan justeres avhengig av vevs tykkelse og antistoff effektivitet. Alternativt kan man øke vaskemiddel konsentrasjon for å øke permeabilization potens. Imidlertid bør forsiktighet tas til ikke permeabilize for lenge siden vev skjørhet øker med forlenget permeabilization tid. - Forbered edu reaksjons løsning i henhold til tabell 1. Den endelige konsentrasjonen av Alexa488-Natriumazid er 15 μM i 1 mL edu reaksjons løsning.
- Ruge seksjoner i edu reaksjons løsning for 30 min til 1 t og vask deretter 3x i TBS-Triton i 5 min hver. Cover glir i aluminiumsfolie for å beskytte mot lys etter dette trinnet. På dette stadiet Sjekk om edu reaksjonen fungerer ved hjelp av et fluorescerende mikroskop. Edu-merkede celler vil fluorescerer under et epifluorescence mikroskop.
- Seksjon for montert vevs protokoll
- Blokker vevs seksjoner montert på et lysbilde fra trinn 5.3.4 ved hjelp av blokkering buffer hevet i de samme dyrene som sekundær antistoff, f. eks, esel serum, for 30 min til 1 t og deretter vaske 2x i TBS-Triton i 5 min hver.
- Klargjør primær antistoff (dvs. kylling anti-nestin) løsning under blokkerings trinnet ved å blande primære antistoffer i blokkerings bufferløsningen på 1:200. 250 μL per slide er tilstrekkelig for å sikre at vevet er fullstendig nedsenket i oppløsning.
- Ruge vev seksjoner i en primær antistoff løsning over natten på RT etter blokkering vasker. Endre dette trinnet avhengig av primær antistoff som brukes.
Merk: Hvis antistoffer har høy bakgrunn eller ikke-spesifikk binding, kan incubating ved 4 ° c i stedet for RT forbedre resultatene. Antistoffer med dårlig vev penetrasjon kan overlates til ruge for 2 dager hvis nødvendig. - Ruge vev seksjoner 3x i TBS-Triton i 5 min for å fjerne overflødig primære antistoff. Deretter ruge vev seksjoner i fluoroforen bøyd sekundære antistoffer (dvs. Alexa 647 anti-kylling på 1:200) forberedt på blokkering buffer løsning for 2 h ved RT.
- Ruge vev seksjoner 3x i TBS-Triton i 5 min for å fjerne overflødig sekundært antistoff og anvende 300 μM DAPI løsning på 1:100 i PBS for 15 min ved RT.
- Ruge vev seksjoner 3x i PBS for 5 min for å fjerne overflødig DAPI og fjerne PAP pennen sirkelen fra rundt vev ved hjelp av en bomullspinne eller en delikat oppgave tørk. La delene tørke og deretter bruke monterings medier og deksel slip. La monterings medier tørke før bilde lysbildene.
6. bildesamling
- Blind eksperimentelle grupper fra kontroll grupper ved å dekke lysbilde etiketter og bilde på samme side av DG ved hjelp av et konfokalmikroskopi mikroskop (tabell av materialer) med 40x olje forstørrelse optisk linse ved 1 μm trinn størrelse eller en 20x 2x Zoom på 1 μm.
Merk: Den 40x olje forstørrelsen vil gi økt oppløsning, men tar lengre tid enn den 20x 2x zoom. - Sett objektiv linse til 40x og klikk deretter på Finn kategorien i øvre venstre hjørne i konfokalmikroskopi programvare (tabell av materialer) og angi ønsket DG delen i midten av synsfeltet.
- Finn DG, Bytt til kategorien Anskaffelse i øvre venstre hjørne, og Merk av i følgende bokser: Z-stack, Tile-Scan, og posisjon.
- Angi Kanalinnstillinger mellom 600 − 750 gevinst, 1% − 15% laser intensitet og 1 − 10 forskyvning. Ikke overstige 20% laser intensitet for noen av kanalene. Kontroller at ingen bildepunkter er overmettet når du angir forsterkning og intensitet.
Merk: Disse områdene vil variere avhengig av effektiviteten av utstyret utnyttes og farging effektivitet. - Sett flisene til 7 horisontalt med 3 vertikale i flisen skanne vinduet og trykk Scan oversikt bilde ved hjelp av de samme innstillingene som de som er i bruk. Bruk for eksempel 7 horisontalt med 3 vertikale og 20x mål med 2x zoom.
- Kontroller at DG er fullstendig innenfor det forventede bildet etter oversikts skanningen. Hvis ikke, justerer du visningen av DG til den er helt i oversikts bildet siden dette er et representativt bilde som man vil få.
- Angi bildedybde ved å bla gjennom ulike Z-stakker ved hjelp av knappen for fin fokusering. Sørg for at hele DG er innenfor start-og sluttpunktene. Forutsatt en trinn størrelse på 1 μm, bør hvert bilde være ca 40 trinn.
- Angi skannehastigheten til 9 med toveis skanning og ikke gjennomsnitt i vinduet for anskaffelses modus. Legg deretter til posisjon i stillings vinduet.
Merk: Gjenta trinn 6.3 − 6.8 til bilde flere DGs samtidig. Hvis du øker skannehastigheten, reduseres bildekvaliteten, men det reduserer den generelle bilde tiden. Hvis bildekvaliteten er for lav, reduserer du skannehastigheten eller øker i snitt. - Klikk Start eksperiment knappen når du er klar. Skann 5 deler av DG per mus langs fremre til bakre akse. For eksempel, hvis venstre DG er avbildet for Seksjon en, bildet den nest mest bakre venstre DG for del to.
- Sting separate bilder sammen for å danne et komplett bilde av dentate gyrus ved hjelp av sting funksjonen under kategorien prosess i konfokalmikroskopi programvare. Alternativt kan du bruke FIJI (ImageJ) til å sy sammen bilder for å danne en fullstendig dentate gyrus.
- Lagre sydd bilder for kvantifisering.
7. image analyse
- Åpne hvert bilde av hver dentate gyrus delen bruker FIJI som både maksimal projeksjon og som et sammensatt bilde med kanalene fusjonert i forskjellige farger for å lett visualisere colocalization.
- Målområdet for DG for hver del av det maksimale projeksjonsbildet ved hjelp av polygon markeringsverktøyet (tredje boks fra venstre) og post for hver del av hver mus. Dette vil være det området av DG brukes til å beregne tettheten.
- Registrere antall celler i DG fra det sammensatte bildet som har colocalizing primære antistoff (dvs. nestin) og tymidin analog edu, ved hjelp av FIJI plugin celle telleren funnet under plugins | analyser | celle telleren | celle teller. I tillegg kan du registrere det totale antallet edu positive og nestin positive celler med en radial prosess.
Merk: I tilfelle av nestin, er det svært viktig å ta hensyn til morfologi. Hvis kvantifisere nevrale stamceller, sikre at bare celler med en radial prosess er kvantifisert. Når kvantifisere dentate gyrus deler, bruker du de samme kriteriene for alle, spesielt når du visualiserer celler utenfor et fokal plan. Hvis cellene ikke er innenfor fokalplanet, må du ikke telle dem. Vennligst se West et al.21 for mer detaljerte instruksjoner om stereological kvantifisering. - Angi celle antall i et regnearkprogram for å kompilere alle datadeler for analyse senere.
- Beregn tettheten av colocalized celler for hver del ved å dele det totale antallet colocalized celler med det totale volumet for hver del i hvert dyr. For eksempel, få Stamcelle tetthet ved å dele summen av nestin +/edu + celler i ett dyr av summen av DG volum i ett dyr. Beregn volumet for hver del ved å multiplisere området med totalt Z-trinn trinn, forutsatt at hvert trinn er 1 μm.
Merk: I denne protokollen, bør totale skritt være nær 40, siden vevet er delt på 40 μm. Sørg for at hvert dyr er et datapunkt siden målet med denne tilnærmingen er å anslå totale mengden av colocalized celler i en halvkule av en hippocampus. - Utfør flere nødvendige beregninger for spørsmålet en prøver å ta opp. I dette eksempelet, beregne det totale antallet voksende celler, total stilk cellen befolkning, og prosent av voksende stamceller etter stimulerende kontralateral mosegrodd celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter eksperimentelle prosedyrer som er beskrevet ovenfor (figur 1a,B), var vi i stand til å bestemme effekten av stimulerende kontralateral mosegrodd celle anslag på neurogenic nisje i hippocampus. Ved å benytte en grobunn-avhengige GQ-kombinert stimulerende DREADD virus sammen med en mosegrodd cellemerking 5-HT2A grobunn-linje, kunne vi selektivt aktivere eksitatoriske anslag fra mosegrodd celler på kontralateral DG og fastslått at sterke mosegrodd celle stimulering fremmet Stamcelle fredfulle omgivelser (figur 1C). Vi bekreftet nøyaktig viral levering før analyse av vev (figur 2a, B). I tillegg har vi verifisert aktivering av mosegrodd celler via c-Fos immunhistokjemi eksperimenter (data ikke vist). I tilfelle av upassende viral injeksjon, utelukke dyr fra videre analyse. En uriktig injeksjon er en som ikke klarer å målrette de ønskede koordinatene, har det meste av uttrykket utenfor ønsket region, eller har liten eller ingen viral levering. For dette eksperimentet var mosegrodd celler i hilus til DG det tiltenkte målet, og hvis injeksjoner var utenfor hilus, ble de ekskludert. Ved å bruke en tymidin analog, edu, og antigen henting for nestin farging skissert i seksjoner 5,2 og 5,3, var vi i stand til å kunne merke voksende nevrale stamceller (figur 3a). I tillegg, ved å utelate antigen henting trinn, § 5,2, vi var i stand til å merke Tbr2 positive neural stamfar og neuroblast, og DCX positive neuroblast og umodne neurons (figur 3a). Vi viser et eksempel på området kvantifisert og brukes til å beregne tetthet og gi et eksempel på montert vev på et lysbilde (figur 3b og figur 4a). Videre er både vellykkede og sub-par eksperimenter gitt som referanser for eksperimentelle tilnærminger (figur 4b). Til slutt er det flere forskjellige quantifications som kan fås fra et vellykket eksperiment (figur 5a-D)15. Quantifications inkluderer tettheten av voksende nevrale stamceller (Nestin +/edu +/Volume), prosentandelen av voksende nevrale stamceller (Nestin +/edu +/total Nestin), totalt voksende celler (edu +/Volume) og totalt Stamcelle basseng (Nestin +/Volume ). Ved kontralateral stimulering av en mosegrodd celler, ble det observert en reduksjon i nevrale Stamcelle spredning. Lignende quantifications kan fås for neural stamfar og umodne neurons ved hjelp av riktig antistoff.
Figur 1: eksperimentell tilnærming til analysen krets regulering av voksne nevrale stamceller. (A) skjematisk fremstilling av de ulike trinnene som er skissert i protokollen. (B) tidslinje av eksperimentell tilnærming brukes til å stimulere mosegrodd celler i gnagere. (C) injeksjon skjematisk målretting kontralateral mosegrodd celler for stimulering. (D) skjematisk av den utviklingsmessige avstamning av voksne nevrale stamceller i subgranular SONEN (SGZ), granule celle lag (GCL), og molekylær lag (ml) med tilsvarende antistoffer som brukes på ulike utviklingstrinn. De ulike utviklingsmessige stadier inkluderer enten Quiescent eller aktivert radial nevrale stamceller (NSC), neural forfedre (NP), neuroblast (NB), umodne granule celler (GC), og modne GC. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: demonstrasjon av effektiv viral levering. (A) Immunofluorescence bilder av nøyaktig viral levering. Viral partikler uttrykke en mCherry fluorescerende etikett som mål mosegrodd celler i hilus (hvit eske region). DAPI etiketter cellekjerner. Bildet side av nøyaktig viral levering demonstrerer klare mosegrodd fiber anslag fra kontralateral injeksjon side. (B) Immunofluorescence bilder av av målet viral injeksjoner. Merk at i dette tilfellet kontralateral mosegrodd fibre er fraværende i bildet side. Scale bar = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: analyse av voksende nevrale stamceller og avkom. (A) immunhistokjemi bilder av Tymidin analoge edu colocalizing med spesifikke celle scene markører nestin (nevrale stamceller og forfedre), Tbr2 (nevrale stamceller, neural forfedre), og dcx (neuroblast, umodne neurons) indikert av hvite pilspisser. Scale bar = 10 μm. (B) representativ måling av arealet innenfor dentate gyrus som brukes til å beregne tetthet. Scale bar = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: demonstrasjon av immunofluorescence forberedelser. (A) skjematisk demonstrere stereological separasjon av monterte vev seksjoner fra fremre til bakre akse. Rød boks betegner siden avbildet. (B) demonstrasjon av vellykkede og sub-par immunofluorescence eksperimenter for neuronal avstamning markører. Scale bar = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: kontralateral aktivering av mosegrodd celler reduserer nevrale stilk cellen spredning. (A) immunhistokjemi Quantifications av Nestin +/edu + celler i dentate gyrus demonstrere en nedgang i spredning etter stimulering av kontralateral mosegrodd celler. (B) nedgang i prosent av voksende nevrale stamceller i gruppen med aktiverte kontralateral mosegrodd celler. (C) det var ingen signifikant endring i nevrale stilk celle tetthet i begge grupper. (D) det var ingen endring i den totale nivåer av voksende celler i dentate gyrus. Verdier representerer betyr ± standard feil måling. p < 0,05 (n = 3 for kontroll, n = 5 for hM3D-gruppen). Dette tallet er tilpasset fra Yeh et al.15. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Målet med denne protokollen er å vurdere hvordan manipulere spesifikke nevrale kretser regulerer voksen hippocampus neurogenesis in vivo ved hjelp av en rekke immunhistokjemi teknikker. Assaying aktivitet avhengig regulering av voksen neurogenesis formidlet av spesifikke nevrale kretser er en verdifull teknikk med stort potensial for modifikasjoner for å studere et mangfoldig utvalg av nevrale kretser. Suksessen til disse typer eksperimenter avhenger av flere faktorer, inkludert nøyaktig viral levering, riktig viral utvalg for ønsket manipulasjon, riktig levering av en tymidin analog, dyre alder, immunostaining effektivitet, vellykket transcardial perfusions og objektiv kvantifisering av bilder. Unøyaktig viral levering kan for eksempel forårsake av mål effekter som resulterer i en fenotype som ikke er relatert til den aktuelle kretsen. I tillegg kan lav kvalitet immunofluorescence teknikker skjule det sanne antall nåværende celler og dermed produsere en fenotype som ikke er biologisk relevant. En annen svært viktig faktor å kontrollere er alderen på mus når du utfører eksperimenter, med tanke på at voksen neurogenesis er alderen avhengig22. Til slutt er det viktig at hver del er unbiasedly scoret. For å redusere bias, ta en metodisk tilnærming og sikre at personen scoring er dyktige til å identifisere stadier av voksen NSC utvikling ved hjelp morfologiske informasjon. I tillegg blinde både kontroll og behandling grupper og avslører deres identitet etter bilde quantifications. Som et ekstra tiltak for å redusere bias, kan to separate individer kvantifisere de samme datasett for å validere observerte resultater.
Det er flere begrensninger knyttet til denne tilnærmingen til å studere krets aktivitet avhengig regulering av voksne NSCs og nyfødte avkom. Den første begrensningen er at denne tilnærmingen ikke gir informasjon om de spesifikke celletyper innenfor en krets som megle den samlede effekten på NSCs fra manipulere kretsen i spørsmålet. Dette betyr at selv om det kan være en fenotypiske effekt på voksen NSCs, effekten kan opptre gjennom en eller flere mellomliggende celletyper. En effektiv måte å løse denne bekymringen er å pare disse studiene med elektrofysiologi å peke ut mellom menn. En ytterligere begrensning av denne protokollen er behovet for å ha enten en bestemt grobunn mus (5-HTR2A) linje eller en viral konstruere (AAV5-camKII-hM3d-mcherry) som kan målrette ønsket krets. Hvis en effektiv celle spesifikke grobunn musen linjen ikke er lett tilgjengelig for et spørsmål av interesse, evnen til å studere denne kretsen blir stadig vanskeligere. Imidlertid har mange celletyper i hjernen grobunn spesifikke muse linjer. En mindre begrensning av denne protokollen er relatert til CNO som en effektiv inert ligand. I den seneste tid, studier bevist det CNO, det inert kjemikalie pleide aktivere DREADDs, metabolizes å Clozapine, hvilke kanskje anledning opptreden fenotyper23. Det er imidlertid en effektiv måte å ta med riktige kontroller i hvert eksperiment. Et eksempel på riktig kontroll omfatter både en CNO-og DREADD-kontroll, der CNO administreres i kombinasjon med et kontroll reporter virus (AAV5-DIO-mCherry), og en saltvann kontroll der ingen CNO administreres til en reporter virus gruppe. Ved å inkludere disse kontrollene, kan effekten av bare CNO isoleres. Alternativt, en sekundær inert ligand kjent som C21, har nylig blitt demonstrert for å ha tilsvarende effekt og potens med ingen demonstrert atferds effekter24. Endelig, en endelig begrensning av denne protokollen er å kontrollere mengden av CNO at hvert dyr forbruker under eksperimentet. Forskjellige dyr drikker CNO-inneholdende vann i varierende grad og kan derfor ha en rekke effekter på voksen neurogenesis. Generelt har en mus en tendens til å drikke ca 4 mL CNO vann i en 24 h periode. Dette betyr at ved konsentrasjonen av 1 mg/200 mL dyr får totalt 0,02 mg CNO per dag som kan sammenlignes med mengden av en enkelt CNO dose injisert intraperitonealt. Hvis rettidig koblet administrasjon av CNO er en bekymring, bytte til intraperitoneal injeksjoner kan være et bedre alternativ.
Fordelen med å bruke denne protokollen er graden av spesifisitet oppnås når modulerende voksen neurogenesis. Tidligere neurogenesis studier har benyttet systemisk administrert farmakologiske Agonistiske eller motstander til å modulere krets komponenter. Disse ikke-spesifikke manipulasjoner kan produsere fenotypiske forskjeller, men gir liten innsikt om mekanismer involvert i voksen nevrale stilk cellen regulering. I tillegg kan denne protokollen enkelt endres for å undersøke ulike krets vid effekter på voksen neurogenesis. For eksempel, ved å bytte til en hemmende DREADD, eller ved å målrette en eller flere hjerneregioner på en gang, kan man spørre en rekke spørsmål for å forstå kretsen spesifikk regulering av voksen neurogenesis. En annen fordel med å bruke denne protokollen over tidligere tilnærminger er at bruk av et nestin antistoff eliminerer transgene Animal avl av fluorescensmerkete kodet nevrale stilk cellen journalister som nestin: GFP, øke effektiviteten og redusere tiden per eksperiment8. Videre begrenser denne teknikken gnager håndtering ved administrering av CNO, noe som reduserer gnager belastningen under eksperimenter. Det er viktig å redusere stress når du studerer stress-sensitive prosesser. Til slutt, denne tilnærmingen er lett amendable å inkludere en atferdsdata analysen, for eksempel hvis man var interessert i å spørre om kontralateral mosegrodd celle krets som modulerer NSCs spiller også en rolle i romlig læring eller stress elastisitet.
De viktigste tekniske problemer når du bruker denne tilnærmingen er nøyaktig viral levering. Å bli en dyktig gnager kirurg tar praksis og kan ta betydelig feilsøking. Det er derfor tilrådelig å utføre en rekke pilot eksperimenter for å teste viral titer, merking effektivitet, og viral spredning. Vi har funnet at visse serotypene har ulike sprer mønstre og at AAV2 serotype sprer seg mindre enn AAV5 eller AAV8. I tillegg er det best å ha en klarert viral emballasje leverandør for hvert av disse eksperimentene. Ved å utføre pilot operasjoner, kan mange av disse bekymringene tas opp og man kan spare tid. Det anbefales også at en test forskjellige CNO konsentrasjoner å stimulere eller hemme ønsket kretser. Generelt vil 1 mg/kg tilstrekkelig aktivere testede kretser, men enkelte celletyper kan kreve mer eller mindre CNO. Det er viktig å merke seg at dosen av CNO administrasjon kan differensielt påvirke visse kretser spesielt når man ser på noe som mosegrodd celler15.
Alternative anvendelser av denne protokollen inkluderer simultan atferds testing, modulering av alternative kretser, og ytterligere analyse av neurogenesis funksjoner. Å utføre opptreden tester, ettall kunne følge etter etter protokollen beskrevet og etter administrere CNO, utføre en spesifikk opptreden oppgave, som en romersk plasseringen analysen, eller en romlig styringen oppgave. Fordelen med denne tilnærmingen er at et enkelt eksperiment vil gi både atferds-og krets spesifikk informasjon som kan føre til en krets bestemt atferdsdata fenotype. Å modulere alternative kretser, kan man bruke en kombinasjon av ulike grobunn linjer og viral vektorer. For eksempel, hvis man var interessert i å forstå hvordan hemme dopaminerg neurons fra ventrale tegmental området (VTA) eller VTA modulerer voksen neurogenesis, kunne man bruke en tyrosin hydroksylase grobunn muse linje og injisere en grobunn avhengige hM4D (hemmende) DREADD virus inne å det VTA å avgjøre dopaminerg spesifikk reguleringen av voksen neurogenesis. Mulighetene til å målrette alternative hjerneregioner ved hjelp av denne tilnærmingen er store og kan være strategisk brukes til å forhøre overbevisende nevrale kretser. Til slutt gjør denne tilnærmingen en til å undersøke flere stadier av voksen neurogenesis. Hvis for eksempel en ønsket å forstå hvordan stimulerende mosegrodd celler påvirker arborization eller dendrittiske lengde av umodne neurons, ville man følge en lignende protokoll, men utføre alternative analyser som sholl analyse.
Oppsummert denne protokollen gir en detaljert steg-for-trinn prosess til analysen krets aktivitet avhengig regulering av voksne NSCs og neurogenesis via DREADD teknologi. Styrken i denne protokollen ligger i sin evne til å være lett endres for å løse et bredt spekter av spørsmål om kretsen spesifikke voksen nevrale stilk cellen regulering. Med fremme av gruppert regelmessig oppdelt korte palindromic gjentar (CRISPR) teknologi, er det nå lettere å generere celle spesifikke grobunn muse linjer til å pare med sofistikerte viral konstruksjoner til adressen stadig mer komplekse spørsmål utvide anvendelsen av denne protokollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
L.J.Q. ble støttet av National Institute of Mental Health i National Institutes of Health under mangfold supplement R01MH111773 samt en T32 trening stipend T32NS007431-20. Dette prosjektet ble støttet fra tilskudd tildelt JS fra NIH (MH111773, AG058160, og NS104530).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| 48 Well Plate | Denville Scientific | T1049 | |
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (Edu) | Carbosynth | NE08701 | |
| Alcohol 70% Isopropyl | Thermo Fisher Scientific | 64-17-5 | |
| Alcohol Prep Pads | Thermo Fisher Scientific | 13-680-63 | |
| Alexa-488 Azide | Thermo Fisher Scientific | A10266 | |
| Anti-Chicken Nestin | Aves | NES; RRID: AB_2314882 | |
| Anti-Goat DCX | Santa Cruz | Cat# SC_8066; RRID: AB_2088494 | |
| Anti-Mouse Tbr2 | Thermo Fisher Scientific | 14-4875-82; RRID: AB_11042577 | |
| Betadine Solution (povidone-iodine) | Amazon | ||
| Citiric Acid Stock [.1M] Citric Acid (21g/L citric acid) | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| Clozapine N- Oxide | Sigma-Aldrich | C08352-5MG | |
| Confocal Software (Zen Black) | Zeiss Microscopy | Zen 2.3 SP1 FP1 (black) | |
| Copper (II) Sulfate Pentahydrate | Thermo Fisher Scientific | AC197722500 | |
| Cotton Swabs | Amazon | ||
| Coverslip | Denville Scientific | M1100-02 | |
| Delicate Task Wipe Kimwipes | Kimtech Science | 7557 | |
| Drill Bit 0.5 mm | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Ethylene Glycol | Thermo Fisher Scientific | E178-1 | |
| Hamilton Needle 2 inch | Hmailton Company | 7803-05 | |
| Hamilton Syringe 5 μL Model 75 RN | Hmailton Company | Ref: 87931 | |
| High Speed Drill | Foredom | 1474 | |
| Infusion Pump | Harvard Apparatus | 70-4511 | |
| Injectable Saline Solution | Mountainside Health Care | NDC 0409-4888-20 | |
| Insulin Syringe | BD Ultra-Fine Insulin Syringes | ||
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| Stereotax For Small Animal | KOPF Instruments | Model 942 | |
| Leica M80 | Leica | ||
| Leica Microtome | Leica | SM2010 R | |
| LSM 780 | Zeiss Microscopy | ||
| Nair (Hair Removal Product) | Nair | ||
| Paraformaldahyde 4% | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Plus Charged Slide | Denville Scientific | M1021 | |
| Phosphate Buffered Solution (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | |
| Puralube Vet Ointment | Puralube | ||
| Slide Rack 20 slide unit | Electron Microscopy Science | 70312-24 | |
| Slide Rack holder | Electron Microscopy Science | 70312-25 | |
| Small Animal Heating Pad | K&H | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Super PAP Pen 4 mm tip | PolySciences | 24230 | |
| Surgical Scalpel | MedPride | 47121 | |
| Tris Buffered Solution (TBS) | Sigma-Aldrich | T5912 | |
| Tri-sodium citrate Stock [0.1 M] Tri-sodium Citrate (29.4g/L tri-sodium citrate) | Sigma-Aldrich | C8532 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Tweezers | Amazon | ||
| Vet Bond Tissue Adhesive | 3M | 1469SB |
References
- Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. Mechanisms and Functional Implications of Adult Neurogenesis. Cell. 132 (4), 645-660 (2008).
- Spalding, K. L., et al. Dynamics of hippocampal neurogenesis in adult humans. Cell. 153 (6), 1219-1227 (2013).
- Hill, A. S., Sahay, A., Hen, R. Increasing Adult Hippocampal Neurogenesis is Sufficient to Reduce Anxiety and Depression-Like Behaviors. Neuropsychopharmacology. 40 (10), 2368-2378 (2015).
- Clelland, C. D., et al. A functional role for adult hippocampal neurogenesis in spatial pattern separation. Science. 325, (2009).
- Sahay, A., et al. Increasing adult hippocampal neurogenesis is sufficient to improve pattern separation. Nature. 472 (7344), 466-470 (2011).
- Anacker, C., et al. Hippocampal neurogenesis confers stress resilience by inhibiting the ventral dentate gyrus. Nature. , 1 (2018).
- Kuhn, H. G., Eisch, A. J., Spalding, K., Peterson, D. A. Detection and Phenotypic Characterization of Adult Neurogenesis. Cold Spring Harb Perspect Biol. , (2016).
- Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis. Journal of Visualized Experiments. (98), 1-13 (2015).
- Podgorny, O., Peunova, N., Park, J. H., Enikolopov, G. Triple S-Phase Labeling of Dividing Stem Cells. Stem Cell Reports. 10 (2), 615-626 (2018).
- Taupin, P. BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: Paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Research Reviews. 53 (1), 198-214 (2007).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (12), 5163-5168 (2007).
- Sidor, M. M., Davidson, T. J., Tye, K. M., Warden, M. R., Diesseroth, K., Mcclung, C. A. In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System. J Vis Exp. , (2015).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Primer Optogenetics in Neural Systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
- Yeh, C., Asrican, B., Moss, J., Lu, W., Toni, N., Song, J. Mossy Cells Control Adult Neural Stem Cell Quiescence and Maintenance through a Dynamic Balance between Direct and Indirect Pathways. Neuron. , 1-18 (2018).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable Stereotaxic Surgery in Rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), 20-22 (2008).
- Roth, B. L. Primer DREADDs for Neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
- Zeng, C., et al. Evaluation of 5-ethynyl-2 ′ -deoxyuridine staining as a sensitive and reliable method for studying cell proliferation in the adult nervous system. Brain Research. 1319, 21-32 (2010).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), 1-9 (2012).
- Hussaini, S. M. Q., Jun, H., Cho, C. H., Kim, H. J., Kim, W. R., Jang, M. Heat-induced antigen retrieval: an effective method to detect and identify progenitor cell types during adult hippocampal neurogenesis. J Vis Exp. , (2013).
- West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. G. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. The Anatomical Record. 231 (4), 482-497 (1991).
- Kuhn, H., Dickinson-Anson, H., Gage, F. Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat: age-related decrease of neuronal progenitor proliferation. The Journal of Neuroscience. 16 (6), 2027-2033 (1996).
- Gomez, J. L., et al. Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine. Science. 357 (6350), 503-507 (2017).
- Thompson, K. J., et al. Dreadd Agonist 21 (C21) Is an Effective Agonist for Muscarnic-Based Dreadds in Vitro and in Vivo. ACS Pharmacology & Translational Science. 72 (3), (2018).
