Summary
靶向 DNA 表观基因组编辑是一种强有力的治疗方法。该协议描述了一种一体式慢病毒载体的生产、纯化和浓度, 这些载体窝藏 CRISPR9-DNMT3A 转导基因, 用于人类诱导的多能干细胞 (hiPSC) 衍生神经元的表观基因编辑应用。
Abstract
hipscs 衍生细胞的使用是研究人类神经退行性疾病的一种有价值的方法。在这里, 我们描述了一个优化的方案, 用于区分从患者的α-syecrin 基因 (Snca) 位点的α-syecin 基因 (Snca) 到帕金森病 (pd) 相关的多巴胺能神经元群的 hpsc。越来越多的证据表明,高 Snca水平是导致 pd 发展的原因. 认识到建立新的 pd 治疗方法的需求未得到满足, 特别是针对snca表达调控的方法, 我们最近开发了一个基于 Crisprce/dna 甲基的系统, 通过丰富Snca内带1调控区域的甲基化水平, 对 snca 转录进行表观调节.为了提供该系统, 包括一个死 (失活) 版本的 Cas9 (dCas9) 融合了 Dna 甲基转移酶 3 a (DMT3A) 的催化域, 使用了慢病毒载体。该系统应用于具有 Snca位点的神经, 通过snca内含子1的靶向 dna 甲基化, 可将 snca-mrna 和蛋白质水平降低约 30%. 对 SNCA 水平的微调下调, 可以拯救与疾病相关的细胞表型。在目前的协议中, 我们的目标是描述一个逐步的过程, 区分高维动物分为神经祖细胞 (Npc), 并建立和验证热测序检测, 以评估在 Snca中的甲基化剖面内德龙 1.为了更详细地概述这些实验中使用的小病毒-Crispr/cas9 系统, 该协议描述了如何生产、纯化和浓缩慢病毒载体, 并强调了它们是否适合于使用Hpsc 和 Npc。该协议易于适应, 可用于生产高滴度慢病毒的体外和体内应用。
Introduction
最近开发了多个表观基因组编辑平台, 针对控制基因表达1,2的区域中的任何 dna 序列。创建的表观基因组编辑工具旨在 (i) 调节转录, (ii) 改变翻译后组蛋白修饰, (iii) 修改 DNA 甲基化, (四) 调节调控元素相互作用。将转录-染色质改性剂固定到从以前开发的表观基因编辑平台 (如锌指蛋白 (Zfp) 和转录激活剂 (Tals) 中提出的失活 (死) Cas9 (Dcas9) 的方法,具有强大的转录效应域 (ED) 融合到设计的 dna 结合域 (DBD)3。所需表型 (如激活或抑制) 的结果由锚定在内源位点上的效应分子定义 (图 1)。为了创建可编程转录激活剂, dcas9/grna 模块与 vp164、5、6 (图 1a) 相连, 这是一个病毒激活域, 它招募了 pol ii 和一般转录机制。该系统的修改包括 vp64, vp16 域的四聚体, 提供了更强大的激活率5,6。该系统已成功地用于通过定位促进者和调控元素激活编码和非编码区域。重要的是, 尽管 VP64 分子不会直接改变目标区域中的染色质结构, 但它会招募染色质改性剂, 从而结合活性 (染色质) 标记的沉积, 包括 hh/H4 乙酰化和 H3-k4 二/三甲基化5,6。除 VP64 外, 人类 nf-b 复合体的 p65 亚基还与 dCas9/gRNA 模块7相连。有趣的是, 这些效应因子与转录起始位点 (Tss) 上游区域和启动子内的连接会导致强基因诱导。然而, vp64 和 p65 效应器也可以发挥激活作用, 同时与位于 tss 下游和远端增强器7,8的区域相连。为了获得更有力的转录反应, 需要招募多个 dcas9-vp64 或 dcas9-p65 融合到一个单一的目标位点9,10。因此, 与 Dcas9-vp64 融合对应者相比, 最近开发的下一代激活器通过 suntag 等单个 Dcas9-grna 复合体招募多个效应域,从而提高了激活能力11,12. 通过将 vp64、P65 和 RTA (vpr)----从γ-疱疹病毒到 dcas9 13 c-末端的转激活域----融合在一起, 获得了更好的转录激活 (图 1 a)。为针对具体目标的镇压开发了类似的 Crispr/cas9 系统 (图 1b)。
内源基因抑制可以通过工程抑制融合通过各种机制实现 (图 1b)。已经证明, crispr/dcas9 系统与抑制 dbd 相连 (即使没有效应因子 domain s), 可以有效地沉默基因表达, 同时与启动子或上流-向下-tss 区域3,6 ,14。转录因子结合和 RNA 聚合酶处理对转录的影响是由类固醇干扰引起的。然而, 需要更全面的方法, 因为仅仅通过位块来抑制基因往往不足以进行强有力的沉默。基于 Crispr/cas9 系统的消音器的最新发展, 该系统具有转录抑制域 (Trd)、组蛋白修饰剂 (H3-k9-Di-t"甲基化、H3-k27----三甲基化;h3-k36-/三甲基化, h h4 去乙酰化) 和 dna (cpg) 甲基化导致表观遗传工具的构建, 允许更强大的沉默效果4,5,15,16, 17,18,19,20。已经证明, 这些表观遗传修饰剂的制备 dna 可能会导致形成更封闭和浓缩的染色质, 这通常会产生更有效的沉默结果21,22。dbd 最常用的静音域是与 Krüppel-associated 的盒子 (krab)4,5。该因子的招募已被证明与染色质的变化相对应;然而, 这些修改的机制还有待阐明 16、17、18。最近, 已经证明, KRAB 定位 DNA 可以促进组蛋白甲基转移酶 SETDB1 和组蛋白去乙酰化 (HDAC) NuRD 复合物的组装, 这表明这些相互作用介导形成的可能性。染色质凝结和转录沉默3,13。作为另一种方法, 效应域可以与 Dbd 融合, 以创建自定义表观遗传沉默蛋白。该系统直接催化抑制性 DNA 标记或组蛋白修饰。
最近, 使用与 DNMT3A 酶结合的合成 Crispr/cas9 系统已被重新用于转录失活。dnmt3a 催化 dna 甲基化, 在内源性基因启动子和其他调控区域异染色质形成过程中进行转录抑制 (图 1b)18、20。McDonald等人, 18岁和 vojta等人, 是第一个报告 dna 甲基化可用于表观基因沉默或抑制的作者, 这表明等离子体交付的 dcas9-dnmt3a 融合系统可以有效地增强胞嘧啶甲基化在 tss18,20附近。麦当劳和同事证明, 该战略的使用可能会导致大幅减少 (约 40%)在肿瘤抑制基因中, CDKN2A mrna 水平为 18。同样, 针对bach或il6st基因的非甲基化启动子区域显示 cpg 甲基化增加, 这与基因表达20的两倍减少有关.我们的实验室最近重新使用 DNA 甲基化来减轻Snca过度表达的病理结果 (图 2)23。该策略的基础是选择性增强snca内含子1区域内的 dna 甲基化, 因为它以前曾报道过在 pd 和痴呆与莱维体 (dlb) 大脑24,25的低甲基化, 26岁这种低甲基化与snca过度表达有关, 从而为治疗干预提供了一个有吸引力的目标 24,27,28。我们最近在 hpscc 衍生的多巴胺能 npc 中的 Snca 内含子1区域中显示了低 DNA 甲基化水平, 这些 Nbc 是从一个患有 snca三联23的 pd 患者获得的. 这种实验模型的优点是, Npc 可以在培养中有力地繁殖或进一步分化为成熟的神经元, 从而能够有效地筛选, 以识别调节细胞表型的遗传因素, 包括氧化压力和细胞凋亡29。此外, 该模型系统使科学家能够重述患者症状出现前发生的发育事件。此外, hpsc 衍生的 Npc 是测试与基因表达相关的细胞和分子途径的重要工具。重要的是, hepc 衍生的 Npc 与最先进的 Crisprus-epigenome 技术相结合, 可以极大地促进许多神经退行性疾病的 "下一代药物" 的开发。
为了降低 SNCA 表达的病理水平, 我们最近开发了一个基于慢病毒的系统, 该系统携带了 DCAS9-DNMT3A 融合蛋白和 gRNA, 专门针对Snca内含子 1 (图 2a)中的 cpg 甲基化。该协议将详细描述慢病毒载体 (LV) 的设计和生产。Lv 是提供 Crispr/cas9 成分的有效手段, 原因有几个, 即: (一) 它们携带笨重 DNA 插入物的能力, (ii) 高效地传输广泛的细胞, 包括分裂和不分割细胞30和 (iii) 它们诱导最小细胞毒性和免疫原性反应的能力。最近, 我们将 LV 系统应用于具有 Snca位点的复用的患者的 hepc 衍生多巴胺能神经元, 并演示了 lv 在提供表观基因组编辑甲基化工具方面的治疗潜力 23 (图 2 b)。事实上, Lv-grna/dnt3a 系统会导致 Snca 内ss1 区域的 DNA 甲基化显著增加。这一增加与Snca mrna 和蛋白质23水平的降低相对应。此外, snca下调还将相关的表型恢复在snca三联/hipc 衍生的多巴胺能神经元 (例如, 线粒体 ros 的产生和细胞活力)23。重要的是, 我们证明了 Lv-grna-dnas3a 系统在 Snca 表达中的减少能够逆转 Hipc 衍生的多巴胺能神经元的表型, 而这些表型是 hipc 衍生的多巴胺能神经元的特征。SNCA三联, 如线粒体 ros 的产生和细胞活力23。本协议的目的是: 1) 概述用于生成高分病毒制剂的优化 LV 平台的生产和浓缩协议; 2) 描述 Hipsc 向 npc 的分化, 这些差异化模式是成熟的多巴胺能神经元31,32 和描述的甲基化水平的目标区域内 snca 内合子1。
与最流行的载体平台, 即腺相关载体 (aav) 相比, 慢病毒平台具有主要优势, 后者是前者容纳更大的基因插入33、34 的能力。Aav 的产量可以高得多, 但包装能力很低 (lt;4.8 kb), 这影响了其在提供一体机 CRISPR/Cas9 系统方面的使用。因此, 在交付 Crispr/cas9 工具所涉及的应用程序中, Lv 似乎是首选平台。因此, 这里概述的协议将是一个宝贵的工具, 研究人员希望有效地提供表观基因组编辑组件的细胞和器官。该协议进一步概述了通过修改矢量表达盒 30、35中的元素来增加向量的生产和表达能力的策略。该战略以我们实验室开发和研究的新系统为基础, 突出了其在 1010个病毒单位 (vu)/30,35范围内产生病毒颗粒的能力。
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Protocol
1. 系统设计和病毒生产
- 质粒设计与制造
请注意:利用 Ortinski 等人出版的生产和表达优化表达盒, 构建了一体机 Lv-grna-dna-dnt3a 矢量.矢量盒式磁带带有转录因子 sp1 的识别点的重复, 并在 3 ' 长的终端重复 (ltr) (ltr) (图 2a) 30、36的未翻译 (u3 ')区域内进行最先进的删除。病媒主干已被发现能够有效地传递和表达 crispr/cas9 30,35。- 通过站点定向诱变 (未显示数据) 获取 SpCas9 (dCas9) 的停用 (死) 版本。用 PBK301 29 中的活性 CAS9 取代 HNH 和 RuvC 催化域中的具有 D10A 和 H840A 突变的克隆, 在 Agi-bbanhi碎片之间交换 (图 3)。
- 通过放大 DNMT3A 部分 BAMHI-429/R 5, 从 Pdcas9-dnt3a-egfp (见材料表) 中衍生 DNMT3A 催化域 "gaggggatcccccccccg-3" Bahi-429l 5 '-ctccccccccgggggggg-3 ' (图 3)。要放大包含 DMT3A 的区域, 请使用以下条件: (1) 95°c 为 60秒, (2) 95°c 为 10秒, (3) 60°c 为 20秒, (4) 68°c 为60秒。对于最后的扩展, 请使用 68°c 3分钟, 并保持4°c。
- 将 DNMT3A 片段克隆到携带 dcas9 的改良 pBK301 载体的 Bahi 位点, 用 Bahi 限制酶消化。通过直接桑格测序验证克隆。请注意, 所产生的质粒 haspors-dnt3a-p2a-puromycin 转基因。质粒表达了来自人 U6 启动子的 gRNA 支架 (图 3)。
- 用绿色荧光蛋白 (GFP) 取代 puromycin 报告基因, 以产生 Dcas9-dnt3a-pcp。摘要 Dcas9-dnt3a-p2a-puro 质粒与 FseI。使用凝胶纯化方法纯化载体片段。用 FseI 消化 pBK201a (Pleti-gfp) 来准备插入物。将 FseI 片段克隆到矢量中。结果的质粒 pBK539 habs DCAS9-DNT3A-P2A-GFP 转基因 (图 3)。
- HEK-293T 细胞和转染用电镀细胞的培养
请注意:人类胚胎肾 293T (HEK-293T) 细胞在37°c 的37°c 培养在完全高血糖的 Dulbecco 改性的鹰培养基 (DMEM; 10% 的牛小牛血清, 1x 抗生素-抗真菌, 1x 亚鲁瓦酸钠, 1x 非必需氨基酸, 2 mM l-谷氨胺) 在37°c 与 5% co2. 为了该协议的重现性, 建议在切换到不同的批次时测试小牛血清。慢病毒生产需要多达 6个15厘米的板。- 使用低通道细胞开始新的培养 (低于第20段)。一旦细胞达到 90%-95% 的融合, 吸气培养基, 并用无菌的1x 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 轻轻清洗。
- 添加2毫升色氨酸 edta (0.05%)在37°c 孵育3-5分钟。为了不激活离解试剂, 加入8毫升的完整高血糖 DMEM, 并在移液器10x–15x 与10毫升血清学移液器, 以创建一个单细胞悬浮液 4 x 10 6 细胞/毫升。
- 对于转染, 涂15厘米板与0.2% 明胶。加入 22.5 mL 高糖培养基, 加入2.5 毫升细胞悬浮液 (共 ~ 1x 10 7 细胞板), 将细胞播种。在37°c 下, 用5% 的 CO2 将板材培育至 70%-80% 的融合。
- HEK-293T 细胞的转染
- 根据 Vijayraghavan 和 Kantor35的说法, 准备 2x bes 缓冲溶液 bbs 和 1M ccl2。通过0.22μm 过滤器对解决方案进行筛选, 并将其存储在4°c。转染组合在添加到细胞之前必须是明确的。如果混合物在孵育过程中变得混浊, 准备新鲜的 2倍 BBS (pH = 6.95)。
- 要准备质粒混合物, 请使用列出的四个质粒 (以下组合对于一个15厘米的板来说就足够了): 37.5 微克的 Crispr/dcas9 转移载体 (Pbmt3a-puro-no-grna] 或 PBK492 [DNT3A-GFP-NO-GRNA]);25μg 的 pBK240 (psPAX2);12.5 微克的 pMD2.G. g;6.25 微克的 pRSV-rev (图 4a)。根据浓度计算质粒的体积, 并将所需的数量添加到15毫升的锥形管中。加入312μl 的 1 m Ccl2 , 并使最终体积为 1.25 ml, 使用无菌 Dd-h2o. 轻轻加入 1.25 ml 的 2X bbs 溶液, 同时对混合.在室温下孵化30分钟。细胞一旦融合了 70%-80%, 就可以转染了。
- 吸收培养基, 用22.5 毫升的新鲜制备的高血糖 DMEM 代替, 不含血清。将转染混合物的2.5 毫升滴入每个15厘米的板。在37°c 下旋转板材并孵育, 用5% 的 CO2 孵育 2-3小时.
- 3小时后, 加入2.5 毫升 (10%)在37°c 条件下, 用5% 的 CO2 孵育.
- 在转染后的第1天, 观察细胞, 以确保没有或最小的细胞死亡, 细胞形成融合培养 (100%)。
- 在每个板中加入25毫升新鲜制备的高血糖 DMEM 和10% 的血清来改变培养基。
- 在37°c 下, 用5% 的 CO2 进行 48小时的孵化。
- 病毒的收获
- 从所有转染细胞中收集上清液, 并将其集中在50毫升的锥形管中。离心机以 400–450 x x g的速度进行10分钟的过滤, 通过0.45 微米的真空过滤器单元过滤上清液。过滤后, 上清液可保存在4°c 下短期储存 (最长 4天)。对于长期储存, 请准备等价物并将其存放在-80°c。
请注意:非浓缩病毒制剂预计为 ~ 2x10 7 至 3 x 10 7 Vu/vuml (参见第1.5 节, 用于滴度测定).强烈建议准备一次性的等价物, 因为多个冻融循环将导致功能滴度损失 10%-20%。
- 从所有转染细胞中收集上清液, 并将其集中在50毫升的锥形管中。离心机以 400–450 x x g的速度进行10分钟的过滤, 通过0.45 微米的真空过滤器单元过滤上清液。过滤后, 上清液可保存在4°c 下短期储存 (最长 4天)。对于长期储存, 请准备等价物并将其存放在-80°c。
- 病毒颗粒的浓度
请注意:在纯化过程中, 采用了两步双蔗糖法, 采用蔗糖梯度步骤和蔗糖垫步骤 (图 4B)。- 要创建蔗糖渐变, 按以下顺序制备锥形超离心管: 1x PBS 中70% 蔗糖的 0.5 mL、DMEM 中60% 蔗糖的 0.5 mL、DMEM 中30% 蔗糖的1毫升和 1x PBS 中20% 蔗糖的2毫升。
- 小心地将根据第1.4 节收集的上清液添加到梯度中。由于从 4个15厘米板收集的总体积为100毫升, 因此使用6个超离心管处理病毒上清液。
- 同样分布病毒上清液在每个超离心管。为避免在离心过程中堵塞管, 将超离心管填充到其总容量的至少四分之三。用 1x PBS 平衡管材。在17°c 条件下, 以 70 x g的速度将样品离心2小时。
请注意:为了在加速和减速步骤中保持蔗糖层, 允许超离心在旋转的第一个和最后3分钟分别缓慢地加速和减速转子从0到 200 x g 和从 200 x g 到 0 x g。 - 轻轻将 30%-60% 的蔗糖组分收集到干净的管中 (图 4b)。添加 1x PBS (冷) 高达总体积的100毫升。通过多次移液进行混合。
- 小心地, 通过在试管中加入4毫升的20% 蔗糖 (在 1x PBS 中), 在蔗糖垫上对病毒制剂进行分层。继续通过移液 ~ 20–25毫升的病毒溶液每管。如果管内含量小于四分之三, 则在管中填充 1x PBS。小心平衡管。在17°c 下以 70 x g 离心2小时。清空上清液, 倒置纸巾上的管子, 让剩余的液体排出。
- 通过谨慎地吸气剩余的液体来取出所有的液体。请注意, 在此步骤中, 含有病毒的颗粒几乎无法看到为小的半透明斑点。在第一管中加入70μl 的 1x PBS, 以重新悬浮颗粒。彻底移液悬浮液, 并将其转移到下一个管, 直到所有颗粒重新悬浮。
- 用额外的 50Μl 1x PBS 清洗管道, 并像以前一样混合。请注意, 在此步骤中, 最终悬架的体积为 ~ 120μl, 并显示为微微。为了获得明确的悬浮液, 请以 10, 000 x g 的速度进行60秒的离心。将上清液转移到新管中, 制成5Μl 的等价物, 并将其存放在-80°c。
请注意:慢病毒载体制剂对反复的冻融循环敏感。此外, 建议在组织培养遏制或在符合适当生物安全标准水平的指定地区采取其余步骤 (图 4B)。
- 病毒滴度的定量
请注意:病毒滴度的估计是使用 p24 酶联免疫吸附法 (ELISA) 法 (p24 gag elisa) 和根据国家卫生研究院 (nih) 艾滋病疫苗计划协议的 Hiv-1 P24 抗原捕获检测进行的。轻微的修改。- 在冷的 1x PBS (PBS-T) 中, 使用 0.05% tween 20 的200Μl 清洗96孔板3x 的井。
- 要覆盖板, 请使用100μl 的单克隆抗 p24 抗体在 1x P24 中以1:1500 稀释。在4°C 下将板材连夜孵化。
- 在 1x PBS 中制备阻断试剂 (1% 的牛血清白蛋白 [BSA]), 并在每口井中添加 200Μl, 以避免非特异性结合。使用200μl 的 PBS-T 在室温下清洗3x 至少1小时的井。
- 继续进行样品制备。在使用浓缩载体制剂时, 使用样品的1:100、dd-h 2 0 的89μl 和 triton X-100 的 10μl (最终浓度为 10%) 将矢量稀释为 1:100.对于非浓缩制剂, 将样品稀释在1:10。
- 通过使用双重连续稀释 (起始浓度为 5 ngml) 获得 HIV-1 标准。
- 在 RPMI 1640 中稀释浓缩样品 (1.6.4 步骤), 辅以 0.2% Tween 20 和 1% BSA, 以获得1:10000、1:500000 和 1:250 000 稀释。同样, 在 RPMI 1640 中稀释非浓缩样品 (步骤 1.6.4), 辅以 0.2% Tween 20 和 1% BSA, 以建立1:500、1:2500 和1:12500 稀释。
- 在板材上添加样品和标准, 以三重奏为形式。在4°C 下过夜。
- 第二天, 洗井6xx。
- 加入100μl 的多克隆兔抗 p24 抗体, 在 RPMI 1640 中稀释为 1:1000, 在10% 的胎儿牛血清 (FBS)、0.25% 的 BSA 和2% 的正常小鼠血清 (NMS) 中稀释, 在37°c 孵育4小时。
- 洗井6x。在 RPMI 1640 中加入山羊抗家兔辣根过氧化物酶 IgG, 补充5% 正常山羊血清、2% NMS、0.25% BSA 和 0.01% Tween 20, 稀释为1:10000。在37°c 下孵化1小时。
- 洗井6x。加入 TMB 过氧化物酶底物, 在室温下孵育15分钟。
- 要停止反应, 请加入100μl 的 1 n HCl。在微板读取器中, 测量450纳米的吸收率。
- 荧光报告强度的测量
- 使用病毒悬浮液在 1x PBS 中获得10倍的连续稀释 (从10-fold 到 10-fold).
- 在6孔板的每口井中都有 5 x10 5 hek-293t 电池。将每个病毒稀释的10Μl 应用于细胞, 并在37°c 孵育, 5% co2 , 48小时。
- 进行荧光活化细胞分选 (FACS) 分析, 方法如下: 通过添加 200Μl 0.05% 的胰蛋白酶-edta 溶液来分离细胞。在37°c 下将细胞培养 5分钟, 并在 DMEM 培养基 (血清) 2 毫升中重新悬浮。在4°C 下, 以 400 x g 的温度将样品收集到15毫升的锥形管和离心机中。在500μl 的冷 1x PBS 中重新填充颗粒。
- 通过添加500μl 的4% 甲醛 (PFA) 并在室温下孵育10分钟来固定细胞。
- 在4°C 下以 400 x g离心, 并在 1X pbs 的1毫升中重新悬浮颗粒。使用流式细胞仪分析 GFP 表达, 如 Ortinski 等人30中所述。若要确定病毒功能滴度, 请使用以下公式。
这里
Tg = gfp 阳性细胞的数量;
Tn = 细胞总数;
N = 被转移的细胞总数;
V = 用于转导的体积 (以微升为单位)。
- 对 gfp 阳性细胞进行计数
请注意:确定用于转导的感染 (MOI) 的多样性。测试范围广泛的 Moi (从 MOI = 1 到 MOI = 10)。- 种子 3 x10 5 至 4 x 10 5 Hek-293t 细胞每口井的一个6孔板。
- 当细胞达到 & & gt;80% 的融合时, 用感兴趣的 MOI 的载体将它们转化出来。
- 用5% 的 CO2 在37°c 下进行培养, 并监测细胞中的 gfp 信号1-7天。
- 计算 gfp 阳性细胞的数量。使用荧光显微镜 (计划4倍目标, 0.1 n. a., 40x 放大倍率) 使用 GFP 过滤器 (激发波长 = 470 nm, 发射波长 = 525 nm)。使用未转移的细胞来设置 gfp 阴性细胞的控制种群。
- 使用以下公式来确定病毒的功能滴度。
这里
N = gfp 阳性细胞的数量;
D = 稀释系数;
M = 放大倍率;
V = 用于转导的病毒体积。
注: 计算此示例后的结果: 对于 10个 gfp 阳性细胞 (n) 计数为稀释 (D) 10-4 (1 : 10000) 在10Μl 样品 (v) 中的20x 放大倍率 (m) 下, 每毫升的 tu 为 (10 x 10 4) x (20) x(10) x (100) = 2 x 108武姆
2. 多巴胺能神经祖细胞的分化
- 培养高保能和私营保安公司
注:来自 snca 位点 nd34391 的患者的 hpsc 是从国家神经疾病和中风研究所 (ninsd) 目录中获得的 (见材料表)。- 在无微弱独立的 ESC-iPSC 培养基 (见材料表) 中培养高维菌素, 贴在符合 hesco 条件的基本基质膜 (bmm) 涂层板上 (见材料表)。用1毫升的 DMEM/F12 清洗融合菌落, 加入1毫升的离解试剂 (见材料表), 并在室温下孵育3分钟。
- 吸收离解试剂, 加入1毫升无助推性 ESC-iPSC 培养基。
- 使用细胞提升器刮板, 并使用硼硅酸盐移液器移液4x–5x 在11毫升的无质 ESC-iPSC 培养基中重新悬浮菌落。
- 板2毫升的菌落悬浮在 bmm 涂层板上, 并将板放置在37°c 与 5% CO2。每天进行介质变化, 每5-7天拆分一次细胞。
- 多巴胺能神经祖细胞分化为多巴胺能
请注意:根据制造商的指示, 使用市售神经感应介质协议, 将高 psc 分化为多巴胺能神经祖细胞 (md npc), 略作修改31,32 (请参见材料表)。区分的第一天被考虑作为天 0。高质量的高 Psc 是高效神经分化所必需的。MD Npc 的诱导是利用基于胚胎体 (EB) 的协议进行的。- 在开始区分高聚多氯塞病药之前, 请根据制造商的说明准备一个微井培养板 (见材料表)。
- 制备微井培养板后, 加入1毫升的神经诱导介质 (NIM; 见材料表), 辅以 10μm y-27632。
- 把盘子放在一边, 直到可以使用。
- 用 DMEM/F12 清洗 Hispc, 加入1毫升的细胞分离溶液 (见材料表), 在37°c 孵育 5分钟, 用5% 的 co2 孵育。
- 在 DMEM/F12 中重新移植单个细胞, 并以 300 x g离心5分钟。
- 小心吸气上清液, 并重新悬浮 NIM + 10μm y-27632 中的细胞, 以获得 3 x10 6 细胞的最终浓度。
- 将单细胞悬浮液的1毫升加入微井培养板的单井, 并以 100 x g离心板3分钟。
- 在显微镜下检查板, 以确保细胞在微井中的均匀分布, 并在37°c 孵育细胞与5% 的 CO2.
- 在第1– 4天, 执行每日部分介质更改。
- 使用1毫升微移液器, 取出 1.5 mL 的介质并丢弃。慢慢地, 在没有 Y-27道理的情况下加入1.5 毫升新鲜的 NIM。
- 重复步骤2.2.10 直到第4天。
- 第5天, 用 bmm 覆盖6孔板的一口井.
- 将37微米可逆过滤器 (见材料表) 放在50毫升锥形管 (废物) 的顶部。向上点可逆过滤器的箭头。
- 在不干扰形成的 eb 的情况下, 从微井培养板上取出培养基。
- 加入1毫升的 dmemmef12, 及时收集 Eb 硅酸盐移液器, 并通过过滤器对其进行过滤。
- 重复步骤 2.2.15, 直到从微井培养板上取出所有 Eb。
- 将过滤器倒置在一个新的50毫升锥形管, 并添加2毫升的 NIM 来收集所有的 Eb。
- 板材2毫升的 EB 悬浮液进入 bmm 涂层板的单井, 采用硼硅酸盐移液器。用5% 的 CO2 在37°c 下培养 Eb.
- 第6天, 准备2毫升的 nim + 200 ngml shh (见材料表), 并执行每日介质变化。
- 第8天, 检查神经元诱导的百分比。
- 计算所有附加的 Eb, 具体确定每个充满神经玫瑰的 eb 的数量。使用以下公式对神经玫瑰诱导进行量化。
请注意:如果神经感应 lt;75%, 神经玫瑰的选择可能效率低下。 - 第12天, 用119毫升的神经基部培养基制备250毫升 n2b27 培养基, DMM/2 f12 培养基119毫升, 谷胱甘肽 2.5 ml, neaa 2.5 ml, na2 补充 2.5 ml, 没有维生素 a 的 B27 5 毫升, 庆大霉素 255μl (50 mgmml), 和 19.66微米 BSA (7 Mg/ml)。
- 制备50毫升的完整 N2B27 培养基, 加入 3μm CHIR99021, 2Μm SB431542, 20 ngml bfgf, 20 ngml EGF, 和 200 ngml SHH。
请注意:重要的是要在使用前准备好完成的介质。 - 从含有神经玫瑰的井中吸气培养基, 用 dmmmw f12 的1毫升清洗。
- 神经玫瑰选择试剂 (见材料表) 的 Ad 1 ml, 在37°c 下孵育, 5% co2为1小时。
- 取出选择试剂, 并使用1毫升移液器, 直接瞄准玫瑰团。
- 将悬浮液添加到15毫升锥形管中, 并重复步骤2.2.25 和 2.2.26, 直到收集了大部分的神经玫瑰簇。
请注意:为避免非神经元细胞类型的污染, 请不要过度选择。 - 以 350 x g离心玫瑰悬浮液 5分钟, 吸收上清液, 并重新悬浮 n2b27 + 200 Ng/ML shh 中的神经玫瑰。将神经玫瑰液悬浮液加入 bmm 涂层井中, 在37°c 下孵育板, 并采用 5% co 2。
- 在13–17天, 使用完整的 N2B27 介质执行每日介质更改。当培养物 80%-90% 融合时, 通过细胞。
- 要拆分电池, 请准备一个 bmm 涂层板。
- 用 DMEM/F12 的1毫升清洗细胞, 吸入培养基, 并添加1毫升的离解试剂 (见材料表)。
- 在37°c 下孵化 5分钟, 加入1毫升的 dmemmcaf12, 并通过上下移液移出附着的细胞。收集 Npc 悬浮液在一个15毫升锥形管。以 300 x g 离心 5分钟 。
- 在完整的 N2B27 + 200 ngml shh 的1毫升中吸吸上清液并重新悬浮细胞。
- 计数细胞, 并将它们按 1.25 x10 5 cellscm 2 的密度进行平板, 并在37°c 下孵育细胞, 使其具有5% 的co2。
- 每隔一天更换一次介质, 使用完整的 N2B27 + 200 ngml SHH。
请注意:在这篇文章中, Npc 被认为是通过 (P) 0。SHH 可以从 P2 的 N2B27 介质中提取。 - 一旦细胞达到 80%-90% 的融合。
- 在这一阶段, 用免疫细胞化学和 qPCR 证实细胞表达了 Nestin 和 Ffa2 标记。该协议为 Nestin 和 Ffas2 标记生成了85% 的双阳性细胞。
- 对于传代细胞, 重复步骤2.2.31 –2.2.36。
- 冻结细胞, 从 P2 通道开始。对于细胞的冷冻, 重复步骤 2.2.31--2.2.36, 然后使用冷神经祖体冷冻培养基将细胞颗粒重新悬浮在 2 x 10 6 至 4 x10 6 细胞中 (见材料表)。
- 将细胞悬浮液的1毫升转移到每个冷冻室中, 并使用标准的慢速控制冷却系统冷冻细胞。长期储存时, 将细胞保持在液氮中。
- 解冻 MD Npc
- 准备一个 bmm 涂层板和温暖完整的 N2B27。在15毫升锥形管中加入10毫升的温热 DMMM/F12。在37°c 的热块中放置一个冷冻瓶2分钟。
- 将细胞从冷冻瓶转移到含有 dmemmcf12 的试管中。以 300 x g 离心 5分钟 。
- 吸吸上清液, 将细胞重新悬浮在 N2B27 的2毫升中, 并将细胞悬浮液添加到 bmm 涂层板的一口井中。用5% 的 CO2 在37°c 下培养细胞.
- 准备一个 bmm 涂层板和温暖完整的 N2B27。在15毫升锥形管中加入10毫升的温热 DMMM/F12。在37°c 的热块中放置一个冷冻瓶2分钟。
3. MD Npc 的转导和甲基化变化分析
-
MD Npc 的传导
- 在 MOI = 2 的情况下, 用 Lv-grna准备9-Dnt3a 载体在70% 的融合中传递 MD Npc。替换 N2B27 中等16h 后传导。
- 在转导后48小时加入 N2B27, 加入 5μgml puromycin。将细胞培养到 N2B27 加 puromycin 中 3周, 以获得稳定的 MD 鼻咽癌线。细胞已准备好用于下游应用 (DNA、RNA、蛋白质分析、表型表征23、冷冻和传代)。
-
SNCA 内压子1甲基化剖面的表征
- 使用 DNA 提取试剂盒从每个稳定转移的细胞系中提取 DNA (见材料表)。
- 使用800纳克的 DNA, 使用商业上可获得的试剂盒进行亚硫酸盐转换 (见材料表)。在亚硫酸盐转化后, 将亚硫酸盐转化后的 DNA 提取为20ngμl。
-
用于热释电测分析的 PCR
- 在无核酸管中制备 PCR 主混合物。对于每个反应, 使用0.4μl 的反向底漆 (10μm), 0.4μl 的前向引物 (10μm), 1.6μl 的 MgCl 2 (25mm), 2μl 的 10x CoralLoad 浓度, 10μl 的 2x PCR 主混料, 4μl 的 5x q-溶液, 1Μl 的 DNA和0.6μl 的无核酸水。
- 将反应板转移到热环机, 并使用以下条件进行 PCR: 95°c 15分钟, 50°c 94°C 循环 30秒, 56°c 30秒, 72°c 30秒, 最后10分钟延长步骤在72°c。表 1、图 7A和补充图 1列出了用于 snca 内包括1的焦磷酸测序的引物。
- 扩增后, 用2μl 的 PCR 产物和溴化乙酯染色, 然后进行琼脂糖凝胶电泳, 将放大器可视化。
- 焦测序检测是通过使用非甲基化 (U) 和甲基化 (M) 双硫转换 Dna 的混合物在以下比率中验证的, 即100U:0M、75U:25M、50U:50M、25U:75M 和 0U:100M (见材料表)。
- 使用焦磷酸测序试剂进行热测序 (见材料表), 并使用焦磷酸测序软件计算每个 cpg 站点的甲基化值。有关详细的焦磷酸测序协议, 请参阅 Bassil 等人。
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Representative Results
与天真的 GFP 对应因素相比, 验证 Lv-dcas9-dnt3a-gfp-puro 载体的生产滴度
我们进行了 p24口型elisa 比较了 Lv-dcash9-dnt3a-gfp-puro 的物理滴度与天真的 Gfp/puro 同行。图 5A中给出的代表性结果表明, 使用本文概述的协议生成的向量的物理产量是可比较的。这表明, 优化的矢量主干的效用, 加上优化的生产协议, 产生了 Crispr/cas9 矢量的高产滴度。为了评估将 Dcas9-dnmt3a 转基因基因包装成病毒粒子的效率, 我们将浓缩载体转化为 HEK-293T 细胞 (图 5B)。尽管如此,图 5A中报告的结果显示, LV-DCAS9-DNMT3A-GFP 载体的传导速率明显低于天真的 GFP 载体 (图 5A)。事实上, LV-DCAS9-DNT3A-GFP 载体的功能滴度比天真的对应载体低四倍, 这表明 Crispr/cas9 RNA 的包装效率降低。此外, LV-DCAS9-DNT3A-PURO 载体形成了抗 puromycin-puro 菌落的速度比天真的 puro 载体低五倍。我们还测试了 LV-DCAS9-DNT3A-PURO 载体在 MD Npc 中的传导效率。为此, 细胞在 MOI = 1时被用天真的 LV-GFP 载体和 Lv-dcas9-dnt3a-puro 转化。如图5C 所示, 与 dcas9-dnmt3a 载体相比, puro 控制载体的传导速率高出五倍。这些结果是通过使用 KFP 版本的向量得到证实的 (图 5d)。正如讨论部分所建议的, 由于这里描述的 Lv-epigenome 编辑系统的包装表达特征较低, 其水平足以诱导目标序列上的可持续 DNA 甲基化。此外, 可以通过扩大生产过程来改善这些特性。
MD Npc 的分化
此处描述的基于 eb 的协议允许区分 MD Npc (图 6a)。我们在不同阶段使用特定标记来评估分化过程。Hipsc 表达了多能性标记 OCT4, 而 MD Npc 表达了 Nestin 和 FOXA2 (图 6BC)。我们以前报告说, 这种分化协议产生的细胞的83.3% 是双重阳性的 nestin 和 FOXA2 标记31, 证实了这些细胞的成功分化。至少75% –80% 的细胞需要显示细胞特异性标记。较低的收益率 (lt;50%)标记的阳性细胞将需要另一种分化协议。
SNCA 内合子1甲基化剖面的热测序检测验证
设计并验证了七种热测序检测 (表 1,补充图 1,图 7a), 用于量化snca 内包括1中的甲基化状态。Chr4:89836150-89836593 (GRCh38/hg38) 区域包含 23 Cg。以不同的非甲基化 (U) 和甲基化 (M) 双硫化 Dna 为标准, 验证了所设计的线性度。在以下比率中使用了混合物, 即100U:0M、75U:25M、50U:50M、25U:75M 和0U:100M。所有七项检测均经过验证 (图 7b), 并显示线性相关 r2 > 0.93。未经验证的检测被重新设计。使用经过验证的检测, 可以确定Snca内介绍1中 23个 CpGs 的甲基化水平 (图 7c)。
图 1: 用于基因激活和抑制的表观基因组编辑工具.(a) dna 的闭合构象显示异染色质组织。通过与 Dcas9-gna 系统配对, 可以将效应分子, 包括 VP64、P65、rta、dna 脱甲基化酶和 tet-1, 被吸收到调节区域 (启动子、内含子等)。该系统的招募导致染色质重塑, 导致建立开放染色质组织 (染色质) 与基因激活。(b) 基于表观的沉默可以通过招募 dCas9 抑制复合物来实现, 包括 krab、Hdac 和 dna 甲基化酶、DNMT3A 到监管区域 (促进剂、内含子等), 通过与 grna 成分的连接。该系统的招募导致基因失活 (沉默), 与 DNA 染色质重塑相关, 并导致一般转录机制无法进入染色质结构。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 在 SNCA 三联位点内设计靶向 dna 甲基化的慢病毒载体.(a) kantor 等人23、ortinski 等人、30岁和 Vijayraghavan 和 kantor35详细介绍了生产和表达优化的矢量主干。载体cis元素的注释是载体包装元素、psi)、rev 响应元素 (rre)、sp1 结合位点 (sp1)、人 u6 启动子 (hU6)、核心伸长率因子1α启动子 (efs-nc) 和木屑肝炎病毒转录后调节因子 (WPRE)。(b) snca三联位点的原理图表示。DNA 甲基化是直接或间接限制 DNA 可获得性的重要转录调控机制.在Snca内带 1 (绿色箭头标记了三段式 snca 位点的激活基因表达状态) 中, 同时观察到 snca 表达增加到低 CPG 甲基化水平。Lv-grna/dnt3a 载体的招募将甲基转移酶标记为Snca内带1区域。这将导致闭合染色质的组装, 从而导致Snca (红色箭头) 的转录下调。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 携带 dcas9-dnmt3a 转基因的慢病毒载体表达盒的结构.Ortinski 等人介绍了母代向量 pBK301.该载体是用 Dcas9-dnt3a-puro (pBK492) 或 Dcas9-dnt3a-gfp (PBK492) 克隆的 (克隆流可以在协议和Kantor 等人23 中找到。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 慢病毒载体包装、生产和纯化.(a) 用于生产 Lv-grna! nmt3a 的瞬态转染协议。为了产生载体, 用泡状口炎病毒 g 蛋白 (VSV-G)、包装和表达质粒23转染 HEK-293T 细胞.从培养上清液中收集病毒颗粒。第二代包装系统被用来补充表达盒式。该系统保存了 Tat 和 Rev 蛋白。分别补充了 rev 质粒----pRSV-REV。缩写: pCMV = 巨细胞病毒启动子;Ltr = 长终端重复;VSV-G = 泡状口炎病毒 g 蛋白;RRE = Rev 响应元素;Sp1 = 转录因子 Sp1 结合位点;= 矢量包装元件 (psi);WPRE = 土木肝炎病毒转录后调节因子;EFS-NC = 核心伸长率因子1α启动子;U6 = 人 U6 启动子。(b) 载体纯化和浓缩的执行方式如下: 采用双蔗糖梯度法对瞬态转染后的病毒颗粒进行纯化和浓缩 (见上文)。简单地说, 文化上清液 (SN) 被收集并加载到蔗糖梯度上。为了创建梯度, 使用了 70%, 60%, 30% 和20% 蔗糖溶液溶解在 1x PBS。净化的第二步包括对20% 蔗糖的垫子进行超离心。形成的颗粒在 1x PBS 中重新悬浮。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5: 病毒滴度的评估.(a) P24 elisa 检测。如 Kantor等人 23所述, 已经进行了一次发牢骚的程序。天真的 (GFP) 向量在黑色条形图中突出显示。LV-DCAS9-DNT3A-PURO 矢量 (浅蓝色棒) 和 LV-DCAS9-DNT3A-GFP 矢量 (绿条) 也突出显示。对矢量的物理粒子生成进行了评估。结果记录在每毫升的拷贝数, 其中1纳克的 p24 口子= 1 x10 4病毒颗粒。条形图数据表示三个独立实验的平均值±sd。(b) 评估转化为 hek-293t 细胞后的功能滴度。如代表性结果所述, 含有 pur 的 Lv 被转化为 HEK-293T 细胞。通过计算 puromycin 选择后的菌落数量, 测量了病毒产生的功能滴度。结果计算为从慢病毒载体-puro (对照载体) 获得的菌落数量相对于 DCAS9-DNT3A-PURO 对应的比率。条形图表示三个独立实验的平均值±sd。(c) 评估 HEK-293T 细胞 (上板) 和 npc (下板) 的转导效率和载体表达。左侧面板代表了幼稚的 (GFP) 矢量传输。正确的面板代表了 Dcas9-dnt3a-gfp 矢量的传输。在转导后三天, 使用荧光显微镜 (40x) 采集图像。(d) 评估转用于 npc 后的功能滴度。如代表性结果所述, 将含有 pur 的 Lv 转化为 Npc, 并对结果进行了计算, 如 b 组所述。条形图表示三个生物复制的平均± SEM。缩写: HEK-293T = 人类胚胎肾 293T;Npc = 神经祖细胞。请点击这里查看此图的较大版本.
图 6: hpscc 衍生的 MD Npc 的分化和表征.(a) 显示 hpscc 衍生的 Md npc 分化的时间线. 使用 (b和c) 免疫细胞化学和 (d和e) 实时 (rt) Pcr 对 md npc 标记物进行定量。利用 2- ct 方法, 相对于Gapdd-mrna和ppia-mrna参考对照控制的几何平均值计算了每个 mrna 的水平。每列表示两个生物和技术复制的平均值。误差线代表 SEM. 请点击这里查看此图的较大版本.
图 7: 针对 SNCA 内子1的热测序检测的定量验证.(a) snca内子1中的热测序检测概述。(b) 设计的检测方法采用不同比例的非甲基化 (u) 和甲基化 (m) 双硫转换 dna, 即100U:0M、75u:25m、50U:50M、25U:75M 和0u:100m 进行验证。(c) 经过验证的检测方法用于测量在 hpscs衍生的 md Npc 中, 在 HPSCS 衍生的 md npc 中, 23 CpGs的甲基化百分比。这些条形图代表了两个独立实验中甲基化 CpGs 百分比的平均值, 误差条显示 SEM. 请点击这里查看此图的较大版本.
| 检测 # | 底漆前进 (5 '-3 ') | 底漆反转 (5 '-3 ') | 测序底漆 (5 '-3 ') | 覆盖的 CpG | ||||||
| 1 | TTTTTGGGGTTTAAGGAAGAGA | AACCCTTACTCCATCAT * | GGAGTTTAAGGAAGA | 1 | ||||||
| 2 | TGGGGGTAAGGAAGAGATTT | a * | GGTAGAGAGATTTT | 2, 3, 4, 5, 6, 7 | ||||||
| 3个 | TTGGAGTTTAAGAGAGAGAT | a * | AGAGAGGATTTTTAG | 7, 8 | ||||||
| 4个 | TTTTTGGGGTTTAAGGAAGA * | CCTTACTCCATCATATT | CTTACTCCCATTATTAT | 9, 8 | ||||||
| 5 | TGGGGGTAAGGAAGAGATTT | CCCTATTACTAACA * | GAGTTGGTAATAGAA | 10、11、12、13、14、15、16、17 | ||||||
| 6 | GTGAGGAGTAAGTAAGG | ACACACACACACATATATATTAAT * | AGTTAAGTATAGGGGTAA | 17、18、19、20、21、22 | ||||||
| 7。 | TTTTTGGGGTTTAAGGAAGA * | CTCAACACACCAACCAAAT | CTCAACACACCAACCAAAT | 23、22、21、20 | ||||||
| * 表示活检引物 | ||||||||||
表 1: 用于评估 SNCA 内合子 1 CpG 甲基化水平的焦磷酸测序检测。
补充图 1: SNCA 内介绍1中的焦磷酸测序检测概述.请点击此处下载此文件.
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Discussion
Lv 已开始成为表观基因组编辑的首选载体, 特别是在遗传疾病的情况下, 主要是因为它们能够 (i) 容纳大量 DNA 有效载荷和 (ii) 有效地传输广泛的分裂和非分裂细胞。Lv 的大包装功效尤其适用于涉及超大尺寸 Crispr/cas9 系统包装的应用。从这个角度来看, Lv 代表了交付一体机 CRISPR/Cas9 系统的首选平台。事实上, AAV 平台, 这是通常用于临床前和临床基因治疗应用, 并不完全能够容纳大尺寸的 dCas9 效应系统。事实上, AAV 载体的严格包装要求禁止将其用于交付 CRISPR/dCas9 部件。为了提高 AAV 封装能力, 开发了几种新型的 aava 平台。例如, 最近构造了一个分整数方法, 将 Cas9 系统分成两个 AAV 盒.该方法提高了整体包装能力;然而, 它需要生产和复制两个 AAV 矢量38。sacas9 的发现来自金黄色葡萄球菌, 使 sacas9/指南 rna 系统的发展得到 39,40。SaCas9 是一种较短但同样有效的 Cas9 酶, 很容易被包装成 AAV 载体。体内实验表明, 该系统有效地靶向胆固醇调节基因 PCSK940.然而, 一体机 AAV 矢量的封装效率还有待进一步提高。考虑到 LV 运载系统的明显优势, 我们最近开发并使用了慢病毒背骨树 9-DNMT3A 转基因, 以及 gRNA 支架。为了测试该新系统的治疗潜力, 我们将其应用于 PD hepc 衍生神经元进行 SNCA 位点三联 23。我们验证了该系统的有效性, 从而对Snca-mrna和蛋白质水平23进行了微调。重要的是, 该系统展示了拯救与疾病有关的细胞表型的能力, 表明表观基因治疗方法的巨大潜力23。
为了增加向量的产生, 我们最近对矢量表达式盒式进行了一些修改, 包括集成 Sp1 位点、删除 3 ' LTR 中的表达式质粒 (见下一段)30.
对现有平台的修改
这里介绍的生产方法使 Lv-crisprus9 矢量能够在 1 x 10 10 Vu/ml 的范围内生成 Lv-crisprus9 矢量 (图 5).如上所述, 为了实现更高的生产滴度, 我们在一体机中添加了转录因子 Sp1 结合位点, 并引入了最先进的删除到 u3 区域的 3 ' Ltr。这些修改导致了载体包装效率 (~ 2.5倍) 以及转基因表达 (约七倍)30、35的显著提高。这些改进符合先前生成的数据 41、42、43、44。
关键步骤和故障排除
经过优化的矢量盒式磁带, 封装成病毒颗粒, 产生约 1 x10 Vu/ml/~ 5x 10 7 的生产者细胞滴度。在生产低滴度的向量的情况下, 应考虑以下改进。1) 在低通道数下使用 HEK-293T 细胞。在≥20通道后定期更换细胞。此外, 当细胞显示缓慢的生长速度时, 请替换它们。2) 定期检查培养基的成分, 因为它们可能会导致病毒滴度的变化。用具有成本效益的宇宙小牛血清替代胎儿血清。3) 用于矢量生成的不同细胞系表现出不同的生产适宜性。例如, HEK-293T 细胞能够在高于 HEK-293T 细胞的水平上生成载体三倍 (未显示数据)。4) 当细胞处于 70%-80% 的融合时, 可实现最佳转染。较低的密度会导致细胞过早死亡作为病毒毒性的因素。然而, 较高的密度将导致生产效率的显著降低。作为一般规则, 转染前的细胞密度应允许细胞在建立完全融合的培养之前分裂一次。5) 转染滴度还取决于 BBS 试剂的 pH 值。作为一般规则, 我们建议在使用之前在试点转染设置中测试一批新的 BBS。2倍 BBS ph 值应为6.95。
产量与转化效率的关系
需要指出的是, 尽管携带 Crispr/cas9 转基因的 Sp1-lv 能够在 1 x 10 Vu/ml///5x 10 7 产生细胞附近产生滴度, 这与天真的载体 (图 5A) 相当 (图 5a)。DCAS9-DNMT3A 转基因病毒的包装效率受到显著影响。事实上, 我们展示了 Lv-dcast9-dnt3a-proulegp 向量的功能滴度和表达能力大约减少了五倍 (图 5b-d)。包装效率的降低和矢量的表达可能是 DNMT3A 过度表达的结果。在这方面, 已经证明 DNA 甲基化可能在控制 HIV-1 复制及其基因表达方面发挥重要作用。因此, 有必要确定 Lv 是否受到类似的监管, 如果是这样, 则有必要制定战略, 在病媒生产阶段对 DNMT3A 的活动进行行业沉默。尽管产量较低, 但载体显示出体面的功能滴度 (在低 109 范围内, 这应该足以满足许多应用, 包括需要体内分娩的应用)。值得注意的是, 正如审查中所讨论的那样, 生产过程很容易升级, 这将允许与其他表达系统的滴度相匹配。
矢量处理和安全性
要生成 Lv, 应考虑以下安全点。首先, Lv 需要生物安全2级容器。尽管 Lv 相对安全 (这源于他们的 SIN 性质), 残留转录活动已被证明 22.此外, LV 基因组可以通过 HIV-122拯救。由于这一切, 我们强烈建议执行复制能力检测 (特别是在集中的准备工作)。关于处理慢病毒的安全程序, 我们这里参考的是疾病控制中心 (CDC; 可在线查阅) 出版的《微生物和生物医学实验室生物安全》第四版; 在线提供。对于临床应用, 请使用第三代包装系统。然而, 应当指出的是, 使用第三代包装系统与较低的滴度相比, 第二代包装系统。
意义和未来方向
这里概述的新平台增强了不断扩大的工具箱, 用于将表观基因组编辑组件和其他分子货物传递给细胞和器官。尽管最近在开发基于艾滋病毒-1 的系统方面取得了进展, 但只有少数平台展示了病毒生产的可持续产量。这里报告的矢量主干的优化使得有可能解决与矢量生产效率相对较低有关的一些问题。为了进一步改善矢量生产特性, 有必要通过添加相同绑定母题的多复制重复或通过使用识别点多路复用 Sp1 母题来提高矢量产量和表达式。其他因素。在这方面, 这里介绍的结果可能为改进相对薄弱的组织特异性促进剂提供了一个总体战略, 例如人类突触 i (hSyn) 和 Camkia。
我们最近证明, lv 提供的 cas9/引导 RNA 的长期表达可能会导致不良的非目标效应30。尽管这一概念主要适用于分裂细胞, 但开发能够短暂传递治疗性货物的会代病媒系统将是非常有益的。如上所述, AAV 矢量非常有价值, 可临时交付车辆;然而, 低包装能力极大地影响了它们的使用, 特别是在表观编辑应用程序中。因此, 缺乏整合的慢病毒载体 (Idlv) 将为基于 Crispr/cas9 的表观基因编辑工具的交付和表达提供一个有吸引力的手段。IDLV 平台的以下特点特别有吸引力: (一) 向广泛的细胞和器官运送基因货物的能力;(ii) 优越的包装能力--这与 AAV 矢量相比是一个相当大的优势;(iii) 交付的瞬态性质 (与综合能力强的 lv 相比, 这是一个相当大的优势)45,30。IDLV 基因组的共生性质突出了它们的整合率非常低, 因此, 极大地有利于降低插入突变的风险。我们最近优化了 IDLV 的生产和表达特性, 为交付 CRISPR/Cas9 组件30创建了安全高效的平台。事实上, 改进后的 Idlv 能够诱导 HEK-293T 细胞和有丝分裂后的脑神经元进行快速和持续的基因组编辑。该系统具有瞬态表达的特点, 被发现比相应的集成能力的 Lv 更安全。IDLV 载体的适应应用涉及表观基因组编辑操作将是非常有利的基因治疗领域。
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Disclosures
杜克大学提交了与这项研究有关的临时专利申请。
Acknowledgments
这项工作的部分资金来自卡恩神经技术发展奖 (致 o. c.) 和国家健康研究所/国家神经疾病和中风研究所 (NIH/NDS) (r01 NS085011 至 o. c.)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Optima XPN-80 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A99839 | |
| 0.22 μM filter unit, 1 L | Corning | 430513 | |
| 0.45-μm filter unit, 500 mL | Corning | 430773 | |
| 100 mm TC-Treated Culture Dish | Corning | 430167 | |
| 15 mL conical centrifuge tubes | Corning | 430791 | |
| 150 mm TC-Treated Cell Culture dishes with 20 mm Grid | Corning | 353025 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Corning | 430291 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| Aggrewell 800 | StemCell Technologies | 34811 | |
| Allegra 25R tabletop centrifuge | Beckman Coulter | 369434 | |
| BD FACS | Becton Dickinson | 338960 | |
| Conical bottom ultracentrifugation tubes | Seton Scientific | 5067 | |
| Conical tube adapters | Seton Scientific | PN 4230 | |
| Eppendorf Cell Imaging Slides | Eppendorf | 30742060 | |
| High-binding 96-well plates | Corning | 3366 | |
| Inverted fluorescence microscope | Leica | DM IRB2 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (50) | Qiagen | 27104 | |
| Reversible Strainer | StemCell Technologies | 27215 | |
| SW32Ti rotor | Beckman Coulter | 369650 | |
| VWR® Disposable Serological Pipets, Glass, Nonpyrogenic | VWR | 93000-694 | |
| VWR® Vacuum Filtration Systems | VWR | 89220-694 | |
| xMark™ Microplate Absorbance plate reader | Bio-Rad | 1681150 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture reagents | |||
| Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cells | ATCC | CRL-3216 | |
| Accutase | StemCell Technologies | 7920 | |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | StemCell Technologies | 7010 | |
| Anti-FOXA2 Antibody | Abcam | Ab60721 | |
| Anti-Nestin Antibody | Abcam | Ab18102 | |
| Antibiotic-antimycotic solution, 100x | Sigma Aldrich | A5955-100ML | |
| B-27 Supplement (50x), minus vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| BES | Sigma Aldrich | B9879 - BES | |
| Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) | Thermo Fisher Scientific | 15260037 | |
| CHIR99021 | StemCell Technologies | 72052 | |
| Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | 08-774-552 | |
| Cosmic Calf Serum | Hyclone | SH30087.04 | |
| DMEM-F12 | Lonza | 12-719 | |
| DMEM, high glucose media | Gibco | 11965 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | |
| EpiTect PCR Control DNA Set | Qiagen | 596945 | |
| EZ DNA Methylation Kit | Zymo Research | D5001 | |
| Gelatin | Sigma Aldrich | G1800-100G | |
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15750078 | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | stemCell Technologies | 7174 | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Human Recombinant bFGF | StemCell Technologies | 78003 | |
| Human Recombinant EGF | StemCell Technologies | 78006 | |
| Human Recombinant Shh (C24II) | StemCell Technologies | 78065 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 85850 | |
| N-2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502001 | |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Non-Essential Amino Acid (NEAA) | Hyclone | SH30087.04 | |
| PyroMark PCR Kit | Qiagen | 978703 | |
| RPMI 1640 media | Thermo Fisher Scientific | 11875-085 | |
| SB431542 | StemCell Technologies | 72232 | |
| Sodium pyruvate | Sigma Aldrich | S8636-100ML | |
| STEMdiff Neural Induction Medium | StemCell Technologies | 5835 | |
| STEMdiff Neural Progenitor Freezing Medium | StemCell Technologies | 5838 | |
| TaqMan Assay FOXA2 | Thermo Fisher Scientific | Hs00232764 | |
| TaqMan Assay GAPDH | Thermo Fisher Scientific | Hs99999905 | |
| TaqMan Assay Nestin | Thermo Fisher Scientific | Hs04187831 | |
| TaqMan Assay OCT4 | Thermo Fisher Scientific | Hs04260367 | |
| TaqMan Assay PPIA | Thermo Fisher Scientific | Hs99999904 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Gibco | 25300054 | |
| Y27632 | StemCell Technologies | 72302 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| p24 ELISA reagents | |||
| Monoclonal anti-p24 antibody | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | 3537 | |
| Goat anti-rabbit horseradish peroxidase IgG | Sigma Aldrich | 12-348 | Working concentration 1:1500 |
| Goat serum, Sterile, 10 mL | Sigma | G9023 | Working concentration 1:1000 |
| HIV-1 standards | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | SP968F | |
| Normal mouse serum, Sterile, 500 mL | Equitech-Bio | SM30-0500 | |
| Polyclonal rabbit anti-p24 antibody | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | SP451T | |
| TMB peroxidase substrate | KPL | 5120-0076 | Working concentration 1:10,000 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids | |||
| pMD2.G | Addgene | 12253 | |
| pRSV-Rev | Addgene | 52961 | |
| psPAX2 | Addgene | 12259 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Restriction enzymes | |||
| BsmBI | New England Biolabs | R0580S | |
| BsrGI | New England Biolabs | R0575S | |
| EcoRV | New England Biolabs | R0195S | |
| KpnI | New England Biolabs | R0142S | |
| PacI | New England Biolabs | R0547S | |
| SphI | New England Biolabs | R0182S |
References
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