Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Pluripotent kök hücre kaynaklı hastalık modelleri lentiviral vektör platformu için Epigenome düzenleme araçları verimli bir şekilde teslim insan içine indüklenen

Published: March 29, 2019 doi: 10.3791/59241
Automatic Translation
1,2, 3, 3, 1, 1,2, 4, 4, 1,2, 3
1Department of Neurology, Duke University Medical Center, 2Center for Genomic and Computational Biology, Duke University Medical Center, 3Viral Vector Core, Duke University Medical Center, 4Division of Gynecologic Oncology, Department of Obstetrics and Gynecology, Duke University Medical Center

Summary

DNA epigenome temsil düzenleme güçlü bir tedavi yaklaşımı hedef. Bu iletişim kuralı üretim, arıtma ve toplama tüm-içinde-bir lentiviral vektörlerin İnsan İndüklenmiş pluripotent kök hücre (hiPSC)'epigenome düzenleme uygulamaları için CRISPR-dCas9-DNMT3A transgene yataklık açıklar-nöronlar türetilmiş.

Abstract

HiPSC türetilmiş hücre kullanımı insan nörodejeneratif hastalıkları eğitim için değerli bir yaklaşım temsil eder. Burada, Alfa-synuclein gen (SNCA) locus triplication içine Parkinson hastalığı (PD) ile bir hastadan elde edilen hiPSCs farklılaşma için en iyi duruma getirilmiş bir protokol açıklamak-ilgili dopaminerjik nöron popülasyonları. Kanıt biriken SNCA yüksek düzeyde PD. yeni tedavi yaklaşımları PD için özellikle de SNCA ifade, Yönetmeliği hedeflemesi kurmak için karşılanmamış ihtiyaç tanımayı geliştirme için sorumlu olduğunu göstermiştir biz Son zamanlarda epigenetically SNCA intron 1 Düzenleyici bölgesi düzeylerinde metilasyonu zenginleştirici tarafından SNCA transkripsiyon modüle bir CRISPR/dCas9-DNA metilasyon-tabanlı sistem geliştiriyoruz. Bir ölü oluşan sistem, teslim etmek (devre dışı) yorum-in Cas9 (dCas9) erimiş DNA metiltransferaz enzim 3A katalitik etki alanı ile (DNMT3A), lentiviral bir vektör kullanılır. Bu sistem ile SNCA locus triplication hücrelere uygulanmış ve SNCA intron 1 hedeflenen DNA metilasyonu ile yaklaşık % 30 SNCA-mRNA ve protein düzeyleri azaltır. SNCA düzeyleri ince ayar downregülasyon hücresel fenotipleri hastalığı ile ilgili kurtarır. Geçerli protokol, amacımız hiPSCs nöral progenitör hücre (NPCs) ve kuruluş ve pyrosequencing deneyleri SNCA metilasyonu profilinde değerlendirilmesi için doğrulama differentiating için adım adım bir yordam tarif etmek intron 1. Daha ayrıntılı olarak bu deneylerde kullanılan lentivirus-CRISPR/dCas9 sistemi seviyelendirmek için bu iletişim kuralını üretmek için arındırmak ve lentiviral vektörler konsantre ve kullanarak epigenome ve genom düzenleme uygulamaları için uygunluk vurgulamak için açıklar hiPSCs ve NPCs. Kolayca uyarlanabilir ve yüksek titresi lentiviruses tüp bebek ve içinde vivo uygulamaları için üretmek için kullanılan iletişim kuralı.

Introduction

Birden çok platform epigenome düzenleme son zamanlarda herhangi bir DNA dizileri gene expression1,2kontrol bölgeleri hedeflemek için geliştirilmiştir. Oluşturulan epigenome düzenleme araçları (i) transkripsiyon düzenleyen, (II) alter ardından Histon değişiklikler, (III) DNA metilasyonu değiştirmek ve (iv) düzenleyici öğe etkileşimleri modüle için tasarlanmıştır. Devre dışı bırakılan bir (ölü) Cas9 için transkripsiyon/Kromatin değiştiriciler tutturmak yaklaşım (dCas9) yükseltilmiş üzerinden daha önce çinko gibi epigenome düzenleme Gelişmiş platformlar parmak proteinleri (ZFPs) ve transkripsiyon harekete geçirmek gibi effectors (hikayeler), güçlü transkripsiyon efektör etki alanı barındıran (ED) tasarlanmış DNA'ya bağlanıcı etki alanına (DBD)3erimiş. Etkinleştirme veya baskı gibi istenen fenotip sonucunu endojen loci (şekil 1) demirlemiş efektör molekül tarafından tanımlanır. Programlanabilir transkripsiyon aktivatörleri oluşturmak için dCas9/gRNA modülleri VP164,5,-6 (şekil 1A), Pol II ve genel transkripsiyon makine acemi bir viral harekete geçirmek etki alanına bağlıdır. Bu sistem modifikasyonu bile daha sağlam bir etkinleştirme oranı5,6sağlayan VP64, bir tetramer VP16 alanlarının yer verdi. Sistem başarıyla rehberleri ve onların düzenleyici elemanlarının hedefleyerek kodlama ve kodlamayan bölgeler etkinleştirmek için istihdam edilmiştir. VP64 molekülleri doğrudan hedef bölge Kromatin yapısında değişiklik yapmayın olsa bile, önemlisi, H3/H4 asetilasyon ve H3-K4 di da dahil olmak üzere etkin (euchromatin) işaretleri birikimi içinde sonuçları bağlama Kromatin değiştiriciler acemi / Tri-metilasyonu5,6. VP64 ek olarak, insan NF-κB kompleks p65 alt birim için dCas9/gRNA modül7gergin. İlginçtir, bu effectors bölgelere akıntıya karşı transkripsiyon başlangıç siteleri (TSSs) ve rehberleri içinde hayvan zinciri bir güçlü gen indüksiyon sonuçlanır. Yine de, VP64 ve p65 effectors da activatory etkileri uygulamayın aşağı TSSs ve distal arttırıcılar7,8bulunan bölgelere bağlı iken. Daha sağlam bir transkripsiyon yanıt temin için birden çok dCas9-VP64 veya dCas9-p65 füzyon bir tek hedef locus9,10' a işe gerekir. Bu nedenle, birden çok efektör etki alanı SunTag gibi bir tek dCas9-gRNA kompleksi tarafından işe yeni nesil harekete geçirmek son gelişmeler bir daha güçlü harekete geçirmek yetenek dCas9-VP64 füzyon karşılıkları11 ' e karşılaştırarak sonuçlandı , 12. geliştirilmiş bir transkripsiyon etkinleştirme VP64, p65 ve Rta (VPR), C-terminus dCas913 (şekil 1A) için gama-herpesviruses, bir transactivation etki alanı füzyon yoluyla elde etti. Benzer CRISPR/dCas9 sistemleri hedef özel baskı (şekil 1B) için geliştirilmiştir.

Endojen gen baskı mühendislik önleyici füzyon ile çeşitli mekanizmalar (şekil 1B) elde edilebilir. CRISPR/dCas9 sistemleri, önleyici DBD (bile olmadan bir efektör etki alanı/sn), bağlantılı verimli bir organizatörü veya akış yukarı/aşağı-TSS bölgeleri3,-6 gergin iken gen ekspresyonu sessizlik gösterilmiştir ,14. Transkripsiyon üzerindeki etkileri transkripsiyon faktörü bağlama ve RNA polimeraz işleme steric girişim tarafından neden oldu. Yine de, daha kapsamlı yaklaşımlar gerekli, steric engel yalnız gen baskı kez sağlam susturmak için yeterli değil gibi. Susturucular yeni nesil son geliştirme tabanlı transkripsiyon önleyici etki alanları (TRDs), Histon değiştiriciler taşıyan CRISPR/dCas9 sistemler üzerinde (H3-K9 di-/ tri-metilasyonu, H3-K27 di-/ tri-metilasyonu; H3-K36 di-/ tri-metilasyonu, H3/H4 deasetilasyonu) ve etkileri4,5,15,16, susturmak daha sağlam izin epigenetik araçlar inşaat için liderliğindeki (KSY) DNA metilasyonu 17,18,19,20. Bu epigenetik değiştiricileri için DNA alımı genellikle bir daha güçlü silencing sonucu21,22oluşturmak daha fazla kapalı ve yoğun Kromatin oluşumu için neden olabilir kanıtlanmıştır. DBDs ile kullanılan en yaygın silencing etki alanını Krüppel ilişkili kutusu (KRAB)4,5' tir. Faktör alımı Kromatin değişikliklerle karşılık göstermiştir; Bununla birlikte, bu değişiklikler mekanizmaları henüz aydınlatılmamıştır16,17,18olmak vardır. Son zamanlarda, bu KRAB DNA için yerelleştirme Histon metiltransferaz SETDB1 ve Histon deasetilasyonu (HDAC) NuRD kompleksleri, bu etkileşimler oluşumuna aracılık olasılığını ima kurul yükseltebilirsiniz gösterilmiştir Kromatin yoğunlaşma ve transkripsiyon susturmak3,13. Alternatif bir yaklaşım efektör etki alanları DBDs için özel bir epigenetik silencing protein oluşturmak için erimiş. Bu sistem doğrudan baskıcı DNA işaretleri veya Histon değişiklikler tromboksan.

DNMT3A enzim kaşif Balonlu keşif sentetik CRISPR/dCas9 sistemlerinin kullanımı son zamanlarda, transkripsiyon deaktivasyon için repurposed. DNMT3A endojen gen rehberleri ve diğer düzenleyici bölgeleri (şekil 1B)18,20heterochromatin oluşumu boyunca transkripsiyon baskı giderek artan DNA metilasyonu tromboksan. McDonald et al.18 ve Vojta vd.20 DNA metilasyonu epigenome-gen susturmak veya baskı, plazmid teslim dCas9-DNMT3A fusion sistemi kuvvetli artırabilir gösteren için kullanılabilir rapor için ilk yazarlar vardı sitozin metilasyonu TSS18,20civarında. McDonald ve iş arkadaşlarınızın istihdam stratejisinin önemli bir azalma (yaklaşık % 40) neden olabilir gösterdi bir Tümör baskılayıcı gen CDKN2A mRNA18düzeyleri. Benzer şekilde, BACH veya IL6ST genlerin bazlar organizatörü bölge hedefleme gen ifade20iki kat azalma ile ilişkili artan CpG metilasyonu gösterir. Laboratuarımızın son zamanlarda SNCA overexpression (Şekil 2)23patolojik sonuçlar inceltiyorum için DNA metilasyonu kullanımı repurposed. Daha önce hypomethylated PD ve demans Lewy organları (DLB) beyin24,25olduğu bildirilen gibi strateji DNA metilasyonu SNCA intron 1 bölgede seçici geliştirme dayanır, 26. Bu hypomethylation SNCA overexpression, böylece terapötik müdahale24,27,28için cazip bir hedef sunan bağlı. Biz son zamanlarda SNCA intron 1 hiPSC kaynaklı dopaminerjik NPCs bölgede bir PD hasta SNCA triplication23ile elde edilen DNA metilasyonu düşük düzeyde gösterdi. Bu deneysel model NPCs sağlam kültüründe yayılır veya daha fazla olgun nöronların hücresel fenotipleri oksidatif dahil olmak üzere, arabuluculuk genetik faktörlerin tanımlamak etkili bir tarama etkinleştirme ayrıştırılan avantajdır stres ve Apoptozis29. Ayrıca, bu modeli sistem belirti başlangıçlı hastalarda önce gelişim olayları özetlemek bilim adamları sağlar. Buna ek olarak, hiPSC elde edilen NPCs gen ekspresyonu ile ilişkili hücresel ve moleküler yollar test etmek için harika bir araç temsil eder. Önemlisi, state-of--art CRISPR/Cas9-epigenome teknoloji ile birlikte hiPSC elde edilen NPCs büyük ölçüde ilaçların"yeni nesil" pek çok nörodejeneratif hastalıklar için geliştirme kolaylaştırabilir.

Biz son zamanlarda bir dCas9-DNMT3A füzyon proteini ve gRNA için özel olarak hedef CpG metilasyonu SNCA intron 1 (şekil 2A) içinde taşıyan lentivirus tabanlı bir sistemin SNCA ifade patolojik düzeyde azaltmak için geliştirilen23. Bu iletişim kuralı lentiviral vektör (LV) tasarım ve üretim ayrıntılı olarak açıklanmıştır. CRISPR/dCas9 bileşenleri çeşitli nedenlerden ötürü teslim etmek için etkili bir yol LVs temsil, yani hantal DNA yürütmek için (i) kendi kapasitesi ekler, hücre bölünmesi ve nondividing hücreleri30 da dahil olmak üzere, geniş bir transducing (II) bir yüksek verimlilik ve (iii) yeteneklerini en az sitotoksik ve immünojenik yanıt-e doğru uyarmak için. Son zamanlarda, LV sistem SNCA locus triplication ile bir hastadan hiPSC kaynaklı dopaminerjik nöron için uygulanan ve LVs tedavi potansiyelini'dır epigenome düzenleme gösterdi metilasyonu23 ( araçları Şekil 2B). Gerçekten de, bir LV-gRNA/dCas9-DNMT3A sistemi DNA metilasyonu SNCA intron 1 bölge, önemli bir artış neden olur. Bu artış SNCA mRNA ve protein23düzeyde azalma ile karşılık gelir. Ayrıca, SNCA downregülasyon PD ile ilgili fenotipleri SNCA triplication/hiPSC-türetilmiş dopaminerjik nöron (örneğin, mitokondrial ROS üretim ve hücre canlılığı)23yılında kurtarır. Önemlisi, biz gösterdi SNCA ifade LV-gRNA-dCas9-DMNT3A sistem tarafından azalma hiPSC kaynaklı dopaminerjik nöron taşıyan bir PD hastadan için karakteristik olan fenotipleri geri yeteneğine SNCA triplication, mitokondrial ROS üretim ve hücre canlılığı23gibi. Bu iletişim kuralı 1) üretim Protokolü ve konsantrasyon viral hazırlıklar yüksek tittered oluşturmak için en iyi duruma getirilmiş bir LV platformu belirlemenizi ve 2) hiPSCs farklılaşma olgun dopaminerjik olmak için desenli NPCs içine açıklamak için hedeftir nöronlar31,32 ve SNCA intron 1 hedeflenen bölgeye metilasyon düzeyi karakterizasyonu.

Lentiviral platformlar eski büyük genetik ekler33,34uyum yeteneği olan yani adeno ilişkili vektörel çizimler (AAVs), en popüler vektör platformu üzerinde büyük bir avantaj var. AAVs önemli ölçüde daha yüksek verim-ebilmek var olmak oluşturmak ama düşük paketleme kapasitesine sahip (< 4,8 kb), All-In-one CRISPR/Cas9 sistemleri sunmak için bunların kullanımı ödün. Böylece, görünüşe göre LVs platformu-in-seçimi CRISPR/dCas9 araçların teslimi ilgili uygulamalarda olurdu. Bu nedenle, burada özetlenen Protokolü hücre ve organların epigenome düzenleme bileşenleri etkin bir şekilde teslim etmek isteyen araştırmacılar için değerli bir araç olacak. Daha fazla iletişim kuralı vektörel çizimler vektör ifade kaset30,35içindeki öğeler CIS içinde bir değişiklik ile üretim ve ifade yeteneklerini artırmak için strateji özetliyor. Strateji dayanır romanından sistem geliştirdi ve bizim laboratuarımızda okudu ve 1010 viral adet (VU) /mL30,35aralığında viral parçacıkların üretmek için onun yetenek vurgulamaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. sistem tasarımı ve virüs üretim

  1. Plazmid tasarım ve İnşaat
    Not: Bir all-in-one LV-gRNA-dCas9-DNMT3A vektörü inşaatı bir üretim kullanarak gerçekleştirilen- ve ifadesi en iyi şekilde ifade kaset Ortinski vd30tarafından yayınlandı. Vektör kaset transkripsiyon faktörü Sp1 ve state-of--art silme Çevrilmeyen içinde tanıma sitenin tekrarı taşır (U3') bölge bir 3' uzunluğundaki terminal tekrar (LTR) (şekil 2A)30,36. Vektör omurga CRISPR/Cas930,35ifade etme ve teslim içinde etkili olduğu tespit edilmiştir.
    1. SpCas9 devre dışı bırak (ölü) sürümünü edinmek (dCas9) üzerinden site yönettiği mutagenesis (veri gösterilmez). Katalitik etki alanı HNH ve RuvC D10A ve H840A mutasyonların enzim, sırasıyla, AgeI-BamHI parçaları (şekil 3) alışverişi tarafından pBK30129 aktif Cas9 ile yataklık klon değiştirin.
    2. DNMT3A katalitik etki alanı pdCas9-DNMT3A-eGFP türetmek ( Tablo malzemelerigörmek) DNMT3A yükseltecek tarafından BamHI-429/R 5 '- GAGCGGATCCCCCTCCCG - 3' BamHI-429/L 5' - CTCTCCACTGCCGGATCCGG - 3' (şekil 3) bölümü. DNMT3A içeren bölge yükseltmek için aşağıdaki koşullar kullanın: (1) 95 ° C 60 s, (2) 95 ° C 10 s, (3) 60 ° C 20 s, (4) 68 ° C 60 s. tekrar koşulları 2-4 30 x için. Son uzantısı 68 ° C 3 dakikadır kullanın ve 4 ° C. tutun
    3. DCas9 taşıyan değiştirilmiş pBK301 vektör BamHI siteye BamHI restriksiyon enzimi tarafından sindirilmiş DNMT3A parçası klon. Doğrudan Sanger tarafından klonlama doğrulayın sıralama. Neden plazmid dCas9-DNMT3A-p2a-puromisindir transgene limanlar unutmayın. Plazmid gRNA iskele insan U6 organizatörü (şekil 3) üzerinden ifade eder.
    4. Puromisindir muhabir gen yeşil flüoresan protein (dCas9-DNMT3A-p2a-GFP oluşturmak için GFP) ile değiştirin. FseI ile dCas9-DNMT3A-p2a-Puro plazmid sindirmek. Bir jel arıtma yöntemi kullanarak vektör parçası arındırmak. PBK201a sindirerek tarafından INSERT hazırlamak (pLenti-GFP) ile FseI. FseI parçası vektör kopyalayın. Neden plazmid pBK539 dCas9-DNMT3A-p2a-GFP transgene (şekil 3) liman.
  2. HEK-293T hücre kültürü çalışmalarının ve hücreler transfection için kaplama
    Not: İnsan embriyonik böbrek 293T (HEK-293T) hücreler kültürlü tam yüksek-glikoz Dulbecco kartal orta değiştiren'ın (DMEM; % 10 inek buzağı serum, 1 x antibiyotik antimycotic, 1 x sodyum pyruvate, 1 x önemli olmayan amino asit, 2 mM L-glutamin) % 5 ile 37 ° C'de CO 2. protokol tekrarlanabilirlik için bu farklı bir çok/toplu işlemine geçiş yaparken buzağı serum test etmek için tavsiye edilir. Altı 15 cm kadar tabak lentiviral üretim için ihtiyaç vardır.
    1. Düşük-geçiş hücreleri yeni bir kültür (geçit 20 daha düşük) başlatmak için kullanın. Hücreleri % 90-%95 izdiham ulaştığınızda, medya Aspire edin ve yavaşça steril 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x ile yıkayın.
    2. Tripsin-EDTA (% 0.05) 2 mL ekleyin ve 3-5 dk 37 ° C'de kuluçkaya. Ayrılma reaktif devre dışı bırakabilirsiniz tam yüksek glikoz DMEM ve pipet 10 x-15 x 10 mL serolojik pipet ile 4 x 106 hücre/mL bir tek hücreli askıya oluşturmak için 8 mL ekleyin.
    3. Transfections için % 0,2 jelatin ile 15 cm tabak kat. Yüksek glikoz orta 22,5 mL ekleyin ve hücreleri hücre süspansiyon (Toplam ~ 1 x 107 hücreler/plaka) 2.5 mL ekleyerek temel olarak belirler. % 70-%80 izdiham ulaşılana kadar 37 ° c % 5 CO2 tabak kuluçkaya.
  3. HEK-293T hücre transfection
    1. BES arabelleğe alınmış çözüm BBS x 2 ve 1 M CaCl2, Vijayraghavan ve Kantor35göre hazırlayın. 0,22 µm filtreden geçirerek çözümleri filtre ve onları 4 ° C'de depolayın Transfection mix kendi ek hücreleri olarak önce açık olmak zorunda. Mix kuluçka sırasında bulutlu olursa, taze 2 x BBS hazırlamak (pH 6,95 =).
    2. Plazmid karışım hazırlamak için dört plazmid listelendiği gibi kullanın (aşağıdaki karışımı bir 15 cm tabak için yeterlidir): 37,5 µg CRISPR/dCas9-transfer vektörünün (pBK492 [DNMT3A-Puro-NO-gRNA] veya pBK539 [DNMT3A-GFP-NO-gRNA]); pBK240 25 µg (psPAX2); pMD2.G 12.5 µg; 6.25 µg pRSV-rev (şekil 4A). Konsantrasyonları üzerinde dayalı plazmid hacmi hesaplamak ve gerekli miktarda 15 mL konik tüp içine ekleyin. 1 M CaCl2 312,5 µL eklemek ve son hacim için 1,25 mL getirmek, steril dd-H2o yavaşça kullanarak 1,25 mL vortexing karışımı ise 2 x BBS çözeltisi ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya. Sonra onları %70-%80 birleşmesi transfection için hazır hücrelerdir.
    3. Medya Aspire edin ve 22,5 mL serum olmadan taze hazırlanmış yüksek glikoz DMEM ile değiştirin. Transfection karışımı 2.5 mL dropwise her 15 cm plakasına ekleyin. Girdap plakaları ve % 5 CO2 için 2-3 h 37 ° C'de kuluçkaya.
    4. 3 saat sonra 2.5 mL (% 10) ekleyin plaka başına bir serum ve gecede %5 CO237 ° C'de kuluçkaya.
    5. 1 gün sonra transfection, olmasını sağlamak için hücre gözlemlemek yok veya çok az hücre ölümü ve hücreleri Konfluent kültür (% 100) kurdu.
      1. Medya her plaka için 25 mL taze hazırlanmış yüksek glikoz serum DMEM ve % 10 ekleyerek değiştirin.
    6. 48 saat için % 5 CO2 ile 37 ° C'de kuluçkaya.
  4. Hasat virüs
    1. Transfected hücrelerden süpernatant toplamak ve onları 50 mL konik tüplerde Havuzu. 10 dakika süreyle 400 – 450 x g , santrifüj süpernatant 0,45 µm vakum filtre ünitesi aracılığıyla filtre. Filtrasyon sonra süpernatant kısa süreli depolama (4 gün) 4 ° C'de tutulabilir. Uzun süreli depolama için aliquots hazırlamak ve onları-80 ° C'de depolayın
      Not: Nonconcentrated viral hazırlıklar ~ 2 x 10 olması beklenen7 3 x 107 vu/ml (titresi belirlenmesi için 1.5 bölümüne bakınız). Birden çok donma-çözülme çevrimleri fonksiyonel titreleri % 10-% 20 kaybına neden olur bu yana tek kullanımlık aliquots, hazırlamak için önerilir.
  5. Viral parçacıkların konsantrasyonu
    Not: Arıtma, sukroz degrade adım ve sukroz yastık adım içeren bir iki adım çift-Sükroz yöntemi (şekil 4B) gerçekleştirilen.
    1. Sükroz gradyan oluşturmak için aşağıdaki sırada konik ultrasantrifüj tüpleri hazırlayın: 1 x PBS, DMEM, DMEM % 30 Sükroz 1 mL ve 1 x PBS % 20 sukroz 2 mL % 60 Sükroz 0.5 mL % 70 Sükroz 0.5 mL.
    2. Dikkatle, süpernatant, Bölüm 1.4, göre toplanan degradeye ekleyin. Dört 15 cm tabak toplanan Toplam hacim 100 mL olduğu için altı ultrasantrifüj tüpler viral süpernatant işlemek için kullanın.
    3. Aynı derecede viral süpernatant her ultrasantrifüj tüp arasında dağıtın. Santrifüjü sırasında tüp kırılma önlemek için en az üç-dört toplam birim kapasitesinin ultrasantrifüj tüpleri doldurun. 1 x PBS tüplerini denge. 70.000 x g 17 ° C'de 2 h için de örnekler santrifüj kapasitesi
      Not: Sükroz katman hızlanma ve yavaşlama adımları boyunca korumak için yavaş yavaş hızlandırmak ve rotor 0'dan 200 g x ve 200 0 x g için ilk ve son 3 dk sırasında spin, sırasıyla yavaşlatmak ultracentrifuge izin verir.
    4. Yavaşça % 30-%60 Sükroz kesirler temiz tüpler (şekil 4B) içine toplamak. PBS (soğuk) up x 1 toplam hacminin 100 mL ekleyin. Birden çok kez pipetting karıştırın.
    5. Dikkatle, viral hazırlık Sükroz yastık üzerinde % 20 sukroz (içinde 1 x PBS) 4 mL tüp ekleyerek tabakalaşmak. Pipetting ~ 20-25 tarafından devam mL başına her tüpün viral çözeltisi. Bunların içeriğini birim tüp daha az üç dördüncü ise tüpler 1 x PBS ile doldurun. Dikkatle tüpler denge. 17 ° C'de 2 h için 70.000 x g , santrifüj Süpernatant boş ve kalan izin vermek için kağıt havlu üzerine boruları ters sıvı süzün.
    6. Tüm sıvı geri kalan sıvı aspirating tarafından dikkatli bir şekilde çıkarın. Bu adımda, virüs içeren granül küçük saydam spot renkleri görünür zor olduğunu, unutmayın. 1 x PBS 70 µL Pelet resuspend için ilk tüp ekleyin. İyice süspansiyon pipette ve tüm parçaları resuspended kadar sonraki tüp transferi.
    7. 1 x PBS ve karışımı olarak önce bir ek 50 µL tüplerini yıkayın. Bu adımda, son süspansiyon hacmi ~ 120 µL olduğunu ve biraz sütlü görünür, unutmayın. Açık bir süspansiyon elde etmek için 10.000 x gde 60 s aralıklarla devam. Süpernatant için yeni bir tüp aktarın, 5 µL aliquots yapmak ve onları-80 ° C'de depolayın
      Not: Lentiviral vektör hazırlıklar dondurma ve çözme yinelenen döngüleri için duyarlıdır. Buna ek olarak, bu geri kalan adımları doku kültürü kapsama bitmiş veya içinde Biyogüvenlik standartları (4B rakam) yeterli düzeyde olmak açısından nitelikli alanları belirlenmiş önerilmektedir.
  6. Viral titreleri miktar
    Not: Viral titreleri tahmini (p24gag ELISA) p24 enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA) yöntemi kullanılarak gerçekleştirilir ve ulusal kurumları Sağlık (NIH) AIDS aşısı programına göre HIV-1 p24 antijen tayini ile yakalamak için protokol hafif değişiklikler.
    1. 96-şey plaka 3 Kuyu yıkamak için 200 µL % 0.05 arası 20 içinde soğuk 1 x PBS (PBS-T) kullanın x.
    2. Plaka kat için 1 x PBS 1:1,500, seyreltilmiş monoklonal anti-p24 antikor 100 µL kullanın. Gecede 4 ° C'de plaka kuluçkaya
    3. Engelleme reaktif (%1 sığır serum albümin [BSA] 1 x PBS içinde) hazırlamak ve 200 µL nonspesifik bağlama önlemek için her şey için ekleyin. Oda sıcaklığında en az 1 h için de 3 x yıkamak için PBS-t 200 µL kullanın.
    4. Numune hazırlama ile devam edin. Konsantre vektör hazırlıkları ile çalışırken, vektör 1: 100, 1 µL örnek, dd-H20 89 µL ve Triton X-100 10 µL (bir son konsantrasyonu % 10) kullanarak oranında seyreltin. Nonconcentrated hazırlıkları örnekleri 1:10 oranında seyreltin.
    5. HIV-1 standartları (başlangıç konsantrasyonu 5 ng/mL'dir) bir iki kat seri seyreltme kullanarak elde.
    6. RPMI 1:10, 000, elde etmek için % 0,2 ara 20 ve % 1 BSA ile desteklenmiş 1640 konsantre örneklerinde (1.6.4 adımda hazırlanan) seyreltik 1:50, 000 ve 1:250,000 dilutions. Benzer şekilde, RPMI 1:500, 1:2, kurmak için % 0,2 ara 20 ve % 1 BSA ile desteklenmiş 1640 nonconcentrated örneklerinde (1.6.4 adımda hazırlanan) seyreltik 500 ve 1:12,500 dilutions.
    7. Örnekleri ve standartları triplicates plaka ekleyin. Gecede 4 ° C'de kuluçkaya
    8. Ertesi gün, kuyu 6 yıkama x.
    9. Poliklonal tavşan anti-p24 antikor, RPMI 1640, % 10 fetal sığır serum (FBS), % 0.25 BSA ve % 2 normal fare serum (NMS), 1:1,000, seyreltilmiş 100 µL ekleyin ve 4 h için 37 ° C'de kuluçkaya.
    10. Kuyu 6 yıkama x. Keçi Anti-tavşan horseradish peroksidaz adlı 1:10,000 RPMI %2 NMS, % 0.25 BSA ve % 0,01 ile % 5 normal keçi serum 1640 yılında seyreltilmiş IgG eklemek ara 20. 1s için 37 ° C'de kuluçkaya.
    11. Kuyu 6 yıkama x. TMB peroksidaz substrat ekleyin ve 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
    12. Reaksiyon durdurmak için 1 N HCL 100 µL ekleyin. Mikroplaka okuyucu içinde 450 Absorbans ölçmek nm.
  7. Floresan muhabir yoğunluğu ölçümü
    1. Viral süspansiyon (üzerinden 10-1 10-5) bir 10 kat seri seyreltme 1 x PBS içinde elde etmek için kullanın.
    2. 5 x 105 HEK-293T hücreleri her iyi 6-şey plaka plaka. Her viral seyreltme 10 µL hücrelere uygulayın ve % 5 CO2 48 h 37 ° C'de kuluçkaya.
    3. (FACS) analizi aşağıdaki gibi sıralama Floresans aktif hücre devam: hücreleri 200 µL % 0.05 tripsin-EDTA çözüm ekleyerek bağlantısını kesin. 5 min için 37 ° C'de hücreler kuluçkaya ve onları DMEM orta (serum ile) 2 ml resuspend. 15 mL konik tüp ve santrifüj 400 x g 4 ° C'de de örnekler toplamak Pelet soğuk 1 x PBS 500 µL içinde resuspend.
    4. %4 paraformaldehyde (PFA) 500 µL ekleyerek hücreleri tamir ve oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya.
    5. 400 x g 4 ° c de santrifüj kapasitesi ve Pelet 1 mL 1 x PBS resuspend. Ortinski ve ark.30' açıklandığı gibi bir FACS enstrüman kullanarak GFP ifade analiz. Virüs fonksiyonel titresi belirlemek için aşağıdaki formülü kullanın.
      Equation 1
      Burada,
      TG GFP pozitif hücreleri; =
      TN toplam sayısı; =
      N = toplam sayısı transduced hücreleri;
      V = (microliters içinde) iletim için kullanılan birim.
  8. GFP pozitif Hücre sayımı
    Not: Enfeksiyon (MOI) iletim için istihdam çeşitliliğini belirlemek. MOIs bir geniş aralığı test (MOI = 1 MOI = 10).
    1. 3 x 105 ' e 4 x 105 HEK-293T hücreleri her şey 6-şey plaka başına tohum.
    2. Hücreleri ulaştığınız zaman > % 80 izdiham, onlara ilgi MOI, vektör ile transduce.
    3. %5 CO237 ° C'de kuluçkaya ve hücrelerdeki GFP sinyal 1 – 7 gün boyunca izlemek.
    4. GFP pozitif hücreleri saydırmak. Floresan mikroskop istihdam (Plan 4 x amaç, 0,1 N.A., 40 x büyütme) GFP filtre kullanarak (uyarma dalga boyu 470 = nm, emisyon dalga boyu 525 = nm). Untransduced hücreleri kontrol nüfus GFP negatif hücre ayarlamak için kullanın.
    5. Virüsün fonksiyonel titresi belirlemek için aşağıdaki formülü kullanır.
      Equation 2
      Burada,
      N = sayısı GFP pozitif hücreler;
      D = seyreltme faktörü;
      M = büyütme faktörü;
      V iletimi için kullanılan virüs hacmi =.
      Not: Bu örnek takip sonuçları hesaplamak: 10-4 (1:10, 000) 20 x büyütme (M) bir 10 µL örnek (V) adlı bir seyreltme (D), sayılan 10 GFP pozitif hücreler için (N), (10 x 104) TU mililitre başına olacak x (20) x (10) x (100) = 2 x 108 vu/mL.

2. dopaminerjik nöral progenitör hücre farklılaşma

  1. HiPSCs kültürü
    Not: hiPSCs SNCA odağı, ND34391, triplication ile bir hastadan (bkz. tablo reçetesi) sinir hastalıkları Ulusal Enstitüsü ve kontur (NINDS) katalog elde.
    1. Kültür hiPSCs besleyici bağımsız koşullarda besleyici-Alerjik ESC-IPSC kültür ortamında ( Tablo malzemelerigörmek) temel matris hESC nitelikli membran (BMM) üzerine-kaplamalı plakalar (bkz: Malzemeler tablo). 1 mL DMEM/F12 ile Konfluent kolonileri yıka, ayrılma reaktif 1 mL ekleyin (bkz. Tablo reçetesi) ve oda sıcaklığında 3 min için kuluçkaya.
    2. Ayrılma reaktif Aspire edin ve besleyici-Alerjik ESC-IPSC kültür orta 1 mL ekleyin.
    3. Bir hücre lifter kullanarak plaka scrape ve besleyici-Alerjik ESC-IPSC kültür ortamının 11 mL kolonilerde borosilikat Pipetler kullanarak x pipetting 4 x-5 tarafından resuspend.
    4. Koloni süspansiyon BMM kaplı plakalar üzerine 2 mL plaka ve plaka %5 CO237 ° C'de yer. Bir günlük Orta değişiklik yapmak ve her 5-7 gün hücreleri bölme.
  2. Farklılaşma dopaminerjik nöral progenitör hücre içine
    Not: HiPSCs farklılaşma dopaminerjik nöral progenitör hücre (MD NPCs) içine üreticilerin yönergeler, her bir piyasada bulunan sinir indüksiyon orta protokolü kullanılarak hafif değişiklikler31,32 () ile gerçekleştirilir Malzemeler tablobkz.). Farklılaşma ilk gün gün 0kabul edilir. Yüksek kaliteli hiPSCs verimli sinirsel farklılaşması için gerekli değildir. MD NPCs indüksiyon performedusing bir embryoid vücut (EB) olduğunu-tabanlı protokol.
    1. HiPSCs farklılaşma başlatmadan önce microwell kültür plaka hazırlamak ( Tablo malzemelerigörmek) onun üreticinin yönergelerine uygun.
    2. Microwell kültür plaka hazırladıktan sonra sinirsel indüksiyon orta (NIM; bkz: Malzemeler tablo) ile 10 µM takıma 1 mL ekleyin Y-27632.
    3. Plaka kullanıma hazır kadar kenara koyun.
    4. HiPSCs DMEM/F12 ile yıkayın, hücre dekolmanı çözümü 1 mL ekleyin (bkz. Tablo reçetesi) ve % 5 CO237 ° C'de 5 min için kuluçkaya.
    5. DMEM/F12 Tek Kişilik hücrelerde resuspend ve onları vasıl 300 x g 5 dk santrifüj kapasitesi.
    6. Dikkatle süpernatant Aspire edin ve NIM + 10 µM hücrelerde resuspend 3 x 106 hücre/mL nihai bir konsantrasyon elde etmek için Y-27632.
    7. Tek hücreli süspansiyon 1 mL microwell kültür plaka tek bir şey için ekleyin ve 100 x g 3 dk de plaka santrifüj kapasitesi.
    8. Plaka hücreler microwell arasında eşit dağılımı sağlamak için mikroskop altında incelemek ve % 5 CO237 ° C'de hücreler kuluçkaya.
    9. Gün 1-4, bir günlük kısmi orta değiştirmek gerçekleştirin.
    10. 1 mL micropipette kullanarak, orta 1,5 mL kaldırmak ve atın. Yavaş yavaş, Y-27632 olmadan taze NIM 1,5 mL ekleyin.
    11. 2.2.10 4 güne kadar adımları yineleyin.
    12. 5. gün, BMM. 6-şey plakalı bir kuyu kat
    13. 37 µm tersinir süzgeç yerleştirin (bkz. Tablo reçetesi) 50 mL konik tüp (atık) üstüne. Tersine çevrilebilir süzgeç yukarı ok işaret.
    14. Orta microwell kültür plaka kurulan EBs bozmadan kaldırın.
    15. 1 mL DMEM/F12 ekleyin ve derhal EBs borosilikat pipet ile toplamak ve onları süzgeç aracılığıyla filtre.
    16. Tüm EBs kaldırıldı kadar microwell kültür plaka 2.2.15 tekrarlayın.
    17. Süzgeç bir yeni 50 mL konik tüp üzerinde ters çevir ve tüm EBs toplamak için NIM 2 mL ekleyin.
    18. EB süspansiyon 2 mL tek borosilikat pipet kullanarak BMM kaplı kalıbının kuyuya plaka. EBs %5 CO237 ° C'de kuluçkaya.
    19. 6. gün, NIM + 200 ng/mL ŞŞŞ 2 mL hazırlamak ( Tablo malzemelerigörmek) ve bir günlük Orta değişiklik yapmak.
    20. 8. gün, nöronal indüksiyon yüzdesi inceleyin.
    21. Tüm bağlantılı EBs saymak ve özellikle, sinirsel rozet ile dolu her bireysel EB sayısını belirleyin. Aşağıdaki formülü kullanarak sinirsel rozet indüksiyon ölçmek.
      Equation 3
      Not: Sinirsel indüksiyon ise < % 75, sinirsel rozet seçim verimsiz olabilir.
    22. Gün 12, N2B27 orta 250 mL neurobasal orta, 119 mL DMEM/F12 orta, GlutaMAX, 2.5 mL 2.5 mL NEAA, N2 ek, A vitamini olmadan 5 mL-B27 de 2.5 mL, gentamisin (50 mg/mL) 250 μL 119 mL ile hazırlamak ve 19. 66 μL BSA (7 mg/mL).
    23. Tam N2B27 orta 50 mL hazırlamak, 3 mikron ekleyin CHIR99021, 2 mikron SB431542, 20 ng/mL bFGF, 20 ng/mL EGF ve 200 ng/mL ŞŞŞ.
      Not: Tamamlanan hazırlamak önemlidir kullanmadan önce orta.
    24. Orta sinirsel rozet içeren kuyulardan Aspire edin ve 1 mL DMEM/F12 ile yıkayın.
    25. Reklam sinirsel rozet seçimi reaktif 1 mL ( Tablo malzemelerigörmek) ve % 5 CO2 için 1 h 37 ° C'de kuluçkaya.
    26. Seçim reaktif çıkarın ve 1 mL pipettor kullanarak, doğrudan rozet kümeleri nişan al.
    27. Süspansiyon 15 mL konik tüp eklemek ve adım 2.2.25 ve 2.2.26 sinir rozet kümeleri çoğunluğu kadar toplanan tekrarlayın.
      Not: Nonneuronal hücre tipleri ile kirlenmesini önlemek için overselect değil.
    28. 350 x g 5 dk. aspiratı de rozet süspansiyon süpernatant santrifüj kapasitesi ve sinirsel rozet N2B27 + 200 ng/mL ŞŞŞ resuspend. Sinirsel rozet süspansiyon BMM kaplı bir kuyu ekleyin ve 37 ° c % 5 CO2plaka kuluçkaya.
    29. Gün 13 – 17, bir günlük orta değiştirmek tamamlanmış N2B27 orta kullanarak gerçekleştirin. Kültürleri % 80-%90 birleşmesi olduğunda hücreleri geçiş.
    30. Hücreleri bölmek için BMM kaplı bir tabak hazırla.
    31. 1 mL DMEM/F12 hücrelerle yıkama, orta Aspire edin ve ayrılma reaktif 1 mL ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek).
    32. 37 ° C'de 5 min için kuluçkaya, DMEM/F12 1 mL ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetting tarafından eklenen hücreleri çıkarmak. 15 mL konik tüp NPC süspansiyon toplamak. 5 min için 300 x g , santrifüj.
    33. Süpernatant Aspire edin ve resuspend tam N2B27 1 mL hücrelerde + 200 ng/mL ŞŞŞ.
    34. Hücreleri saymak ve onları 1,25 x 105 hücreleri/cm2yoğunluğu, plaka ve % 5 CO237 ° C'de hücreler kuluçkaya.
    35. Orta her geçen gün, tam N2B27 + 200 ng/mL ŞŞŞ kullanarak değiştirin.
      Not: Bu pasaj NPCs geçiş (P) kabul edilir 0. ŞŞŞ, P2, N2B27 ortamdan çekilebilir.
    36. Bir kez onlar uzanmak % 80-%90 izdiham hücreleri geçiş.
    37. Bu aşamada hücreleri Nestin ve FoxA2 immunocytochemistry ve qPCR kullanarak hızlı onaylayın. Bu iletişim kuralı % 85 kişilik pozitif hücre üretimi için Nestin ve FoxA2 işaretleri yol açar.
    38. Hücreleri passaging için adımları 2.2.31–2.2.36 tekrarlayın.
    39. Geçiş P2 başlangıç hücreleri, dondur. Hücrelerin Dondurulması, tekrarlamak merdiven 2.2.31–2.2.36 ve 2 x 106 4 x 106 hücre/ml kullanarak orta buz gibi soğuk nöral progenitör hücre Pelet resuspend (bkz. Tablo malzeme).
    40. Hücre süspansiyon 1 mL her cryovial aktarmak ve standart bir yavaş hızı kontrollü soğutma sistemi kullanarak hücreleri dondurma. Uzun süreli depolama için hücreler sıvı azot içinde tutmak.
  3. MD NPCs çözdürme
    1. BMM kaplı bir tabak hazırlamak ve tam N2B27 sıcak. 10 mL sıcak DMEM/F12 15 mL konik tüp ekleyin. Bir cryovial için 2 dk 37 ° C ısı bloğu yerleştirin.
      1. Hücreleri cryovial DMEM/F12 içeren tüp aktarın. 5 min için 300 x g , santrifüj.
      2. Süpernatant Aspire edin, N2B27 2 mL hücrelerde resuspend ve hücre süspansiyon BMM kaplı plaka bir şey için ekleyin. %5 CO237 ° C'de hücreler kuluçkaya.

3. iletim MD NPCs ve metilasyonu değişiklikleri analiz

  1. MD NPCs iletim
    1. MOI, LV-gRNA/dCas9-DNMT3A Vektörler ile % 70 izdiham, MD NPCs transduce = 2. N2B27 orta 16 h posttransduction değiştirin.
    2. N2B27 5 µg/mL puromisindir, 48 h iletim sonra ekleyin. Hücreleri 3 hafta boyunca istikrarlı MD NPC hatlarını edinmeniz N2B27 artı puromisindir kültür. Hücreleri aşağı akım uygulamaları (DNA, RNA, protein analizleri, dondurma ve passaging fenotipik karakterizasyonu23,) için hazırsınız demektir.
  2. SNCA intron 1 metilasyonu profil karakterizasyonu
    1. DNA'sı stabil transduced her hücreden ayıklamak hattı ile DNA ekstraksiyon Kiti ( Tablo malzemelerigörmek).
    2. Ticari olarak kullanılabilir kullanarak bir Bisülfit dönüştürme gerçekleştirmek için DNA'ın kullanım 800 ng ( Tablo malzemelerigörmek) kit. Bisülfit dönüştürme işleminden sonra 20 ng/µL için Bisülfit dönüştürülmüş DNA elute.
  3. PCR pyrosequencing analizi için
    1. Nükleaz ücretsiz tüp ana PCR karışımında hazırlayın. Her reaksiyon için ters astar (10 µM), ileri astar (10 µM), MgCl2 (25 mM), 10 x CoralLoad konsantre, 2 x PCR ana Mix 10 µL, 5 4 µL 2 µL 1.6 µL 0.4 µL 0.4 µL kullanın x Q-çözüm, DNA'ın 1 µL ve 0.6 µL nükleaz ücretsiz su.
    2. Reaksiyon plaka bir thermocycler aktarmak ve PCR aşağıdaki koşullar kullanarak gerçekleştirmek: 15 dk, 30 50 devredir 94 ° c için 95 ° C s, 30 56 ° C s ve 72 ° C 30 s, 72 ° C'de son 10 dk uzantısı adımla Astar SNCA intron 1 pyrosequencing için kullanılan Tablo 1, şekil 7Ave tamamlayıcı şekil 1listelenir.
    3. Amplifikasyon sonra 2 µL PCR ürünü boyama, etidyum bromür ile aşağıdaki özel Jel Elektroforez kullanarak amplicons gözünün önüne getir.
    4. Pyrosequencing deneyleri karışımları bazlar (u) kullanılarak doğrulanır ve metillenmiş (M) DNA'lar aşağıdaki oranları, yani 100U:0M, 75U:25M, 50U:50M, 25U:75M ve 0U:100M ( Tablo malzemelerigörmek) içinde Bisülfit dönüştürülür.
    5. Pyrosequencing ( Tablo malzemelerigörmek) pyrosequencing reaktifler kullanarak yürütmek ve pyrosequencing yazılımı kullanan her CpG site metilasyonu değerlerini hesaplamak. Detaylı pyrosequencing iletişim kuralı için Bassil ve ark.37için başvurun.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Üretim titreleri saf GFP Özgününü karşılaştırıldığında LV-dCas9-DNMT3A-GFP/Puro vektörlerin doğrulama

P24gag ELISA LV-dCas9-DNMT3A-GFP/Puro fiziksel titreleri saf GFP/Puro meslektaşları ile arasında karşılaştırmak için gerçekleştirilen. Temsilcisi sonuçları şekil 5A', sunulan, burada özetlenen, iletişim kuralı kullanılarak oluşturulan Vektörler, fiziksel verimi karşılaştırılabilir olduğunu göstermektedir. Bu yardımcı programı en iyi duruma getirilmiş üretim iletişim kuralıyla birlikte en iyi duruma getirilmiş vektör omurga içinde CRISPR/dCas9 vektörlerin yüksek verimli titresi sonuçları göstermektedir. DCas9-DNMT3A transgene ambalaj viral parçacıkların içine verimliliğini değerlendirmek için konsantre vektör bir iletim HEK-293T hücrelere (şekil 5B) gerçekleştirilen. Her şeye rağmen şekil 5A ' rapor sonuçları LV-dCas9-DNMT3A-GFP vektör iletim oranları önemli ölçüde saf GFP vektör (5B rakam) daha düşük olduğunu gösterdi. Aslında, LV-dCas9-DNMT3A-GFP vektör fonksiyonel titresi dört kez CRISPR/dCas9 RNA'ın ambalaj verimliliği azalır düşündüren saf meslektaşı daha düşük. Ayrıca, LV-dCas9-DNMT3A-Puro vektör beş kat saf-Puro meslektaşı ile kıyasla daha düşük bir hızda puromisindir dayanıklı koloniler kurdular. Ayrıca LV-dCas9-DNMT3A-Puro vektörel çizimler iletim verimliliği MD NPCs test ettik. Bu amaçla, bir saf LV-GFP vektör ve LV-dCas9-DNMT3A-Puro MOI, hücreleri transduced = 1. Şekil 5Ciçinde gösterildiği gibi Puro denetim vektör iletim oranları daha ile dCas9-DNMT3A vektör göre beş kat. Bu sonuçlar GFP vektörel çizimler (şekil 5 d) sürümleri kullanılarak doğrulandı. Tartışma bölümünde, burada açıklanan LV epigenome düzenleme sistemi alt ambalaj/ifade özellikleri ile önerilen olarak kendi düzeyleri hedef sıraları üzerinde sürdürülebilir DNA metilasyonu ikna etmek yeterlidir. Ayrıca, bu özellikleri kadar üretim prosedürü ölçekleyerek geliştirilebilir.

MD NPCs farklılaşma

Burada açıklanan EB tabanlı protokol MD NPCs (şekil 6A) farklılaşma sağlar. Biz farklı aşamalarında belirli işaretçileri kullanarak farklılaşma süreci değerlendirildi. hiPSCs ifade edilen pluripotency marker OCT4, hem Nestin hem de FOXA2 MD NPCs ifade ederken (şekil 6B, C). Biz daha önce bu farklılaşma protokolü için Nestin ve FOXA2 işaretleri31, Çift Kişilik olumlu olan hücrelere yüzde 83.3 üretir bu hücreler başarılı farklılaşma teyit bildirdi. En az % 75-%80 hücre hücrenin özgü işaretleri göstermeniz gerekir. Bir alt verim (< % 50) veri işaretleyicilerini için pozitif hücre başka bir farklılaşma Protokolü gerektirir.

Pyrosequencing doğrulanması için SNCA intron 1 metilasyonu profil deneyleri.

Yedi pyrosequencing deneyleri (Tablo 1, tamamlayıcı şekil 1, şekil 7A) tasarlanmış ve SNCA intron 1 metilasyonu statüsünde miktar için doğrulanmış. Chr4: 23 CpGs 89,836,150-89,836,593 (GRCh38/hg38) bölge içerir. Tasarlanmış deneyleri için farklı karışımlar bazlar (u) kullanarak doğrusallık doğrulanır ve metillenmiş (M) DNA'lar standartları olarak Bisülfit dönüştürülür. Karışımlar aşağıdaki oranları, yani 100U:0M, 75U:25M, 50U:50M, 25U:75M ve 0U:100M kullanıldı. Tüm yedi deneyleri edildi (şekil 7B) doğrulanmış ve doğrusal korelasyon R2 > 0.93 gösterdi. Değil doğrulanmış deneyleri tasarlandı. Doğrulanmış deneyleri kullanarak, SNCA intron 1 (şekil 7C) 23 CpGs metilasyon düzeylerinde belirlemek mümkün.

Figure 1
Şekil 1: Epigenome düzenleme araçları gen harekete geçirmek ve baskı için. DNA'ın kapalı biçimi(a)heterochromatin organizasyon gösterir. VP64, P65, rta, DNA demethylation enzim ve tet-1 gibi efektör moleküllerin dCas9-gRNA sistemi ile eşleştirme ile düzenleyici bölgeleri (Organizatör, intron vb.) işe. İşe Alım sistemi Kromatin gen harekete geçirmek ile ilişkili açık Kromatin organizasyonu (euchromatin) kurulmasına yol açan remodeling sonuçlanır. (B) Epigenome tabanlı susturmak dCas9 repressory kompleksleri KRAB, HDACs ve DNA metilasyonu enzim, DNMT3A gRNA bileşeni ile hayvan zinciri yolu ile yasal bölgelere (Organizatör, intron, vb) dahil olmak üzere, işe alma tarafından elde edilebilir. Gen devre dışı bırakma (susturmak), sistem sonuçlarında alımı ilişkili DNA Kromatin remodeling ve erişilememesi genel transkripsiyon makine Kromatin yapısı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: tasarım için hedeflenen DNA metilasyonu SNCA içinde lentiviral vektörlerin loci triplicated. (A) üretim ve ifade-vektör omurga Kantor vd.23, Ortinski ve ark.30ve Vijayraghavan ve Kantor35tarafından ayrıntılı olarak anlatılan için optimize edilmiş. Ek açıklamaları vector öğesinin CIS öğelerin bir vektör ambalaj öğesi (ψ, PSI), Rev yanıt öğesi (RRE), Sp1 bağlayıcı siteleri (Sp1), insan U6 organizatörü (hU6), bir çekirdek-uzama faktör 1α organizatörü (EFS-NC) ve Dağ sıçanı hepatit virüsü vardır posttranscriptional yasal öğesi (WPRE). (B) SNCA şematik gösterimi odağıtriplicated. DNA metilasyonu doğrudan veya dolaylı olarak DNA erişilebilirlik21sınırlayan bir önemli transkripsiyon yönetmelik mekanizmasıdır. Artan SNCA ifade gözlenen tesadüfen SNCA intron 1 düşük CpG metilasyonu düzeylere (yeşil okları etiket triplicated SNCA odağı aktif gen ifade durumunu). LV-gRNA/dCas9-DNMT3A vektörler alımı SNCA intron 1 bölgesine metiltransferaz enzim sallanmak. SNCA (Kırmızı oklar) transkripsiyon downregülasyon içinde sonuçları kapalı Kromatin Meclisi sonuçlanır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Resim 3: bir inşaat dCas9-DNMT3A transgene taşıyan bir lentiviral vektör ifade kaset. Ebeveyn vektör, pBK301, Ortinski ve ark.30' u açıklanmıştır. Vektör dCas9-DNMT3A-Puro ile (pBK492) klonlanmış veya dCas9-DNMT3A-GFP (pBK539) (klonlama akış protokolü ve Kantor vd.23bulunabilir). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: Lentiviral vektör ambalaj, üretim ve arıtma. (A)geçici transfection LV-gRNA/dCas9-DNMT3A üretimi için kullanılan iletişim kuralı. Vektörel çizimler oluşturmak için HEK-293T hücreleri ile vesicular Stomatit virüs G-protein (VSV-G), transfected ambalaj ve ifade plazmid23. Viral parçacıkların kültür supernatants toplanmıştır. Paket yönetim sistemi ikinci nesil ifade kaset ek olarak kullanıldı. Sistem Tat ve Rev proteinler harbored. Rev plazmid pRSV-REV, ayrı ayrı takviye. Kısaltmalar: pCMV Sitomegalovirüs organizatörü; = LTRs = uzun terminal yineler; VSV-G vesicular Stomatit virüs G-protein; = RRE = Rev yanıt öğesi; SP1 transkripsiyon faktörü Sp1 bağlayıcı siteleri; = Ψ = vektör ambalaj öğesi (PSI); WPRE = Dağ sıçanı hepatit virüsü posttranscriptional düzenleyici öğesi; EFS-NC bir çekirdek-uzama faktör 1α organizatörü; = hU6 insan U6 organizatörü =. (B) vektör arıtma ve toplama yürütülen aşağıdaki gibi: Çift-Sükroz degrade Protokolü arındırmak ve viral parçacıkların geçici transfection (yukarı bakın) ardından konsantre için kullanıldı. Kısaca, kültür süpernatant (SN) toplanan ve sukroz degrade üzerinde yüklü. Degrade oluşturmak için % 70, % 60, % 30 ve % 20 Sükroz çözümler çözünmüş 1 x PBS kullanılmıştır. İkinci adım arınma ultrasantrifüj karşı % 20 Sükroz minder dahil. Kurulan Pelet 1 x PBS resuspended. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: viral titreleri değerlendirilmesi. (A)p24 ELISA tahlil. Tittering bir yordam Kantor vd.23tarafından açıklandığı gibi yapıldı. Saf (GFP) vektör siyah çubuğunda vurgulanır. LV-dCas9-DNMT3A-Puro vektör (açık mavi bar) ve LV-dCas9-DNMT3A-GFP vektör (yeşil bar) de vurgulanır. Vektörlerin fiziksel parçacık üretim değerlendirilmiştir. 1 burada mililitre, başına kopya rakamlarla sonuçları kaydedildi ng p24gag , 1 x 104 viral parçacıkların =. Çubuk grafik veri ortalama ± SD üç bağımsız deneylerden temsil eder. (B) iletim HEK-293T hücrelere aşağıdaki işlev titreleri değerlendirilmesi. Puro içeren LVs HEK-293T hücrelere temsilcisi sonuçları açıklandığı gibi transduced. Fonksiyonel titreleri viral üretim puromisindir seçimi takip kolonileri sayılması tarafından ölçüldü. Sonuçları lentiviral vektör-Puro (Denetim vektör) dCas9-DNMT3A-Puro muadili göre elde edilen kolonileri sayısı oranı olarak hesaplanmıştır. Çubuk grafik ortalama ± SD üç bağımsız deneylerden temsil eder. (C) iletim verimliliği ve ifade vektörlerin HEK-293T hücrelerinde (üst paneli) ve NPCs (alt paneli) değerlendirilmesi. Sol kapı aynası naif (GFP) vektör transductions temsil eder. Doğru kapı aynası dCas9-DNMT3A-GFP vector'ün transductions temsil eder. Üç gün posttransduction, görüntüleri bir floresan mikroskop (40 x) kullanarak toplanmıştır. İletim NPCs aşağıdaki işlev titreleri (D) değerlendirme. Puro içeren LVs temsilcisi sonuçları açıklandığı gibi NPCs transduced ve sonuçlar paneli olduğu gibi Bhesaplanmıştır. Çubuk grafiği üç biyolojik SEM çoğaltır ortalama ± temsil eder. Kısaltmalar: HEK-293T insan embriyonik böbrek 293T; = NPCs = nöral progenitör hücre. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6: farklılaşma ve hiPSC elde edilen MD NPCs karakterizasyonu. (A)(B ve C) immunocytochemistry ve (D ve E) gerçek zamanlı (RT) PCR kullanarak hiPSC kaynaklı MD NPCs. miktar, MD NPC işaretleri farklılaşma gösterilen zaman çizelgesi. Her mRNA düzeyde GAPDH-mRNA ve 2- ΔΔCT yöntemini kullanarak PPIA-mRNA referans kontrolleri geometrik ortalamasını göre hesaplanır. Her sütun iki biyolojik ve teknik çoğaltır ortalamasını temsil eder. Hata çubukları SEM temsil Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 7
Şekil 7: pyrosequencing nicel doğrulanmasını deneyleri hedefleme SNCA intron 1. (A)1 SNCA intron pyrosequencing deneyleri genel bakış. (B) tasarlanmış deneyleri bazlar (U) farklı oranları kullanılarak doğrulanır ve metillenmiş (M) Bisülfit dönüştürülmüş DNA, yani 100U:0M, 75U:25M, 50U:50M, 25U:75M ve 0U:100M. (C) Validated deneyleri hiPSC kaynaklı MD NPCs bir hastadan içinde SNCA intron 1 23 CpGs metilasyonu ile SNCA locus triplication yüzdesi ölçmek için kullanılmıştır. Çubuklar iki bağımsız deneylerde metillenmiş CpGs yüzdesi ortalamasını gösterir ve hata çubukları SEM gösterir Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tahlil # Astar ileri (5' - 3') Astar ters (5' - 3') Astar (5' - 3') sıralama KSY kaplı
1 TTTTTGGGGAGTTTAAGGAAAGA AACCTCCTTACACTTCCATTTCAT * GGGGAGTTTAAGGAAAGA 1
2 TGGGGAGTTTAAGGAAAGAGATTT ACCTCCTTACACTTCCATTTCATT * GGTTGAGAGATTAGGTTGTT 2,3,4,5,6,7
3 TTGGGGAGTTTAAGGAAAGAGAT ACCTCCTTACACTTCCATTTCATT * AGAGAGGATGTTTTATG 7,8
4 TTTTTGGGGAGTTTAAGGAAAGA * CCTCCTTACACTTCCATTTCATT CTTACACTTCCATTTCATTAT 9,8 üzerinden
5 TGGGGAGTTTAAGGAAAGAGATTT CCCTCAACTATCTACCCTAAACA * GAGTTTGGTAAATAATGAA 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17
6 GTGTAAGGAGGTTAAGTTAATAGG ACAACAAACCCAAATATAATAATTCTAAT * AGGTTAAGTTAATAGGTGGTAA 17, 18, 19, 20, 21, 22
7 TTTTTGGGGAGTTTAAGGAAAGA * CTCAAACAAACAACAAACCCAAAT CTCAAACAAACAACAAACCCAAAT 23, 22, 21, 20
* biotyniliated astar gösterir

Tablo 1: Pyrosequencing SNCA intron 1 CpG metilasyonu düzeyleri değerlendirme için deneyleri.

Ek şekil 1: pyrosequencing bakış deneyleri SNCA intron 1. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

LVs epigenome düzenleme, özellikle genetik hastalıklar bağlamında için Seçim aracı olarak ortaya çıkmaya başladık, (i) karşılamak için esas olarak yeteneklerini nedeniyle büyük DNA payloads ve (ii) bölme geniş bir yelpazesi verimli bir şekilde transduce ve nondividing hücreleri. LVs büyük ambalaj etkinliğinin ambalaj büyük boyutlu CRISPR/dCas9 sistemleri içeren uygulamalar için özellikle yararlıdır. Bu açıdan bakıldığında, LVs platformu-in-seçim tüm-içinde-bir CRISPR/Cas9 sistemleri teslim etmek için temsil eder. Nitekim, preklinik ve klinik gen terapisi uygulamaları için yaygın olarak kullanılan, AAV platform büyük ambalaj boyutlarının dCas9-efektör sistemleri tam olarak yeteneğine sahip değildir. Aslında, katı ambalaj gereksinimleri AAV vektörlerin kullanımları CRISPR/dCas9 bileşenlerinin teslimatlar için yasaklayan. AAV ambalaj yeteneği geliştirmek için birkaç roman AAV tabanlı platformlar geliştirilmiştir. Örneğin, iki AAV kaset sisteme son zamanlarda bir Cas9 ayıran bir split-intein yaklaşım38inşa. Genel yaklaşım artmıştır paketleme kapasitesi; Ancak, üretim ve cotransduction iki AAV vektörel çizimler38gerekli. SaCas9, Staphylococcus aureus, elde edilen keşfi SaCas9/rehber RNA sistem39,40gelişimine izin. SaCas9 daha kısa, ama aynı derecede güçlü Cas9 enzim, kolayca AAV vektörel çizimler paketlenmiş olduğunu. İn vivo deneyler bu sistem verimli kolesterol düzenleme gene PCSK940hedefler göstermiştir. Yine de, tüm-içinde-bir AAV vektörel çizimler ambalaj verimliliğini daha da iyileştirilmesi gerektiğini. LV iletim sistemi açık avantajları, göz önüne alındığında son zamanlarda geliştirilen ve lentiviral omurga harbored dCas9-DNMT3A transgene bir gRNA iskele kullanılan. Bu yeni sistem tedavi potansiyelini test etmek için biz bu PD hiPSC kaynaklı nöronlar taşınan SNCA loci triplication23için uygulanır. SNCA-mRNA ve protein düzeyleri23ince ayar downregülasyon içinde sonuçlandı bu sistemin verimliliği geçerliliği. Önemlisi, sistem yaklaşım epigenome tabanlı terapiler23potansiyelini düşündüren hastalığı ile ilgili hücresel fenotipleri kurtarmak için yetenek gösterdi.

Biz vektörler üretimini artırmak için son zamanlarda birçok değişikliği Sp1 siteleri, silme içinde 3' soldan sağa ve aşağı boyutlandırma ifade plazmid (sonraki paragrafa bakınız) ile entegrasyonu da dahil olmak üzere vektör ifade kaset içine tanıttı30 .

Değişiklikler mevcut platformlar

Burada sunulan üretim yöntemi titreleri 1 x 1010 vu/mL (şekil 5) aralığında, LV-CRISPR/dCas9 vektörler nesil sağlar. Olarak yukarıda vurgulanan, yüksek üretim titreleri, elde etmek için biz transkripsiyon faktörü Sp1-bağlama sitesi tekrarı bir all-in-one CRISPR/Cas9 ifade vektör kaset eklendi ve state-of--art silinmesiyle U3 bölgeye 3' soldan sağa tanıttı. Bu değişiklikler önemli bir upregulation vektör ambalaj verimlilik (~2.5x) yanı sıra bir transgene ifade (yaklaşık sevenfold) sonuçlandı30,35. Önceden oluşturulan veri41,42,43,44ile uyum içinde bu gelişmeler vardır.

Kritik adımlar ve sorun giderme

Viral parçacıklar halinde paketlenmiş en iyi duruma getirilmiş vektör kaset titreleri olarak yaklaşık 1 x 1010 vu/mL başına ~ 5 x 107 üretici hücreler oluşturur. Vektörel çizimler alt titreleri, üretim söz konusu olduğunda, aşağıdaki geliştirmeleri düşünülmelidir. 1) HEK-293T hücreleri düşük geçiş numaradan kullanın. Hücreleri ≥20 pasajlar sonra düzenli olarak değiştirin. Ayrıca, yavaş büyüme oranı gösterdiğinizde hücrelerin yerini alır. 2) virüs titresi değişikliklere katkıda bulunabilir bu yana düzenli olarak orta bileşenleri seçin. Düşük maliyetli kozmik buzağı serum ile fetal serum yerine. 3) vektör oluşturulmasında kullanılan farklı hücre hatları farklı üretim fitness göstermektedir. Örneğin, HEK-293T tarafından üç kez daha HEK - 293 FT hücre daha yüksek düzeylerde vektörel çizimler üretme yeteneğine sahip hücrelerdir (veri gösterilmez). 4) hücreleri %70-%80 izdiham olduğunda en iyi transfection elde. Alt yoğunlukları viral toksisite faktör olarak erken hücre ölümüne neden olur. Ancak, daha yüksek yoğunlukları üretim verimliliği önemli bir azalma neden olacaktır. Genel bir kural olarak, tamamen Konfluent kültür kurmadan önce bir kez bölmek hücreleri hücre yoğunluğu transfection önce izin vermelisiniz. 5) transfection titreleri da BBS reaktif pH üzerinde bağlıdır. Genel bir kural olarak, biz kullanımı önce bir pilot transfection ortamda BBS yeni bir dizi test öneririz. 2 x BBS pH 6,95 olmalıdır.

Üretim verimleri iletim verimliliği/deyim karşı

Olması gereken bu olsa bile Sp1-LVs işaret taşıyan CRISPR/dCas9 transgenes 1 x 1010 vu/saf vektör (şekil 5A) ile karşılaştırılabilir olan mL başına ~ 5 x 107 üretici hücreler, çevresinde titreleri üretme yeteneğine sahip Ambalaj virüs RNA'ın verimliliğini önemli ölçüde dCas9-DNMT3A transgene ile güvenilir değil. Nitekim, biz göstermek bir işlevsel titreleri ve LV-dCas9-DNMT3A-Puro/GFP vektörel çizimler (şekil 5B-D) yeteneklerini ifade yaklaşık beş kat azalma. Ambalaj verimliliği ve vektörler ifade azalma DNMT3A overexpression bir sonucu olabilir. Bu bağlamda, DNA metilasyonu HIV-1 çoğaltma ve onun gen ifadesinin kontrolünde önemli bir rol oynayabilir kanıtlanmıştır. Bu nedenle, LVs tabi benzer bir düzenleme olup ve vektör üretim aşamasında indüklenebilir-sessizlik DNMT3A etkinliği için stratejiler geliştirmek, öyle belirlemek gerekli olacaktır. Bir alt üretim verim rağmen vektörel çizimler (hangi içinde vivo teslimat gerektiren dahil olmak üzere bir çok uygulama yeterli olacaktır aralığındaki düşük 109 ) iyi fonksiyonel titreleri göstermektedir. Bu üretim yordamı kolayca upscaled ki, diğer ifade sistemleri ile elde edilen titreleri için uygun izin vermelidir inceleme, anlatıldığı gibi dikkati çekiyor.

Vektör işleme ve güvenlik

LVs üretmek için aşağıdaki güvenlik noktaları dikkate alınmalıdır. İlk olarak, LVs Biyogüvenlik seviye 2 fıçıların gerektirir. (Bu onların günah doğadan kaynaklanıyor) LVs göreceli güvenlik rağmen kalan transkripsiyon faaliyet gösterdiği22oldu. Ayrıca, LV genleri HIV-122tarafından kurtarıldı. Bu nedenle, çoğaltma yeterlilik deneyleri (özellikle üzerinde konsantre hazırlıklar) gerçekleştirme önerilir. Lentiviruses kullanımı ile ilgili güvenlik prosedürleri için biz burada təhlillər Biyogüvenlik bakın ve biyomedikal laboratuar, 4 edition, hastalık kontrol merkezleri tarafından yayınlandı (CDC; kullanılabilir çevrimiçi). Klinik uygulamalarda, paket yönetim sistemi üçüncü nesil kullanın. Yine de, bu üçüncü nesil ambalaj sistemlerin kullanımı ikinci nesil paketleme sistemleri ile karşılaştırıldığında daha düşük titreleri ilişkilendirir unutulmamalıdır.

Önemi ve gelecekteki yol tarifi

Burada özetlenen roman platform sürekli genişleyen toolbox epigenome düzenleme bileşenlerinin teslimatlar ve diğer moleküler gönderileri için hücre ve organların için geliştirir. Gelişmekte olan HIV-1-esaslı sistem son gelişmeler rağmen birkaç platformlarında sadece viral üretim sürdürülebilir verimi göstermektedir. Vektör omurga optimizasyonu burada bazı vektörler nispeten düşük üretim verimliliği ile ilişkili sorunları gidermek mümkün kılan bildirdi. Vektör üretim özellikleri daha da geliştirmek için bu vektör verimleri ve ifade çok kopyalanan tekrarlar aynı bağlama motif ya da tanıma siteleri ile Sp1 motifi çoğullama ilavesi ile geliştirilmiş olup olmadığını sınamak için değerli olacaktır diğer faktörler. Bu bağlamda, burada sunulan sonuçları synapsin ben (hSyn) ve CamKIIa insan gibi nispeten zayıf doku özel Organizatör geliştirilmesi için genel bir strateji sunabilir.

Biz son zamanlarda LV teslim Cas9/rehber RNA uzun vadeli ifade istenmeyen hedef kapalı etkileri30' a neden olabilir gösterdi. Bu kavramı çoğunlukla hücre bölünmesi için uygulanmış rağmen episomal vektör sistemleri geçici tedavi yükleri teslim etmek mümkün geliştirmek son derece faydalı olacaktır. Anma yukarıda AAV vektörel çizimler çok değerli, geçici araç teslim; Yine de, düşük ambalaj yeteneği büyük ölçüde epigenome düzenleme uygulamaları için özellikle bunların kullanımı etkisi. Bu nedenle, integrase-eksik lentiviral vektörler (IDLVs) bir çekici araç teslimi ve ifade CRISPR/dCas9 üzerinde dayalı epigenome düzenleme araçları için sunacak. Özellikle çekici IDLV platformu aşağıdaki özellikleridir: (i) genetik yükleri hücre ve organların; geniş bir yelpazesi sunmak için kapasite (ii) bir üstün ambalaj kapasite — AAV vektörel çizimler; önemli bir avantaj olduğu (III) (integrase-yetkili LVs karşılaştırıldığında önemli bir avantaj olan) teslimat geçici doğasını45,30. IDLV genleri episomal doğa çok düşük Tümleştirme oranlarında vurgular ve bu nedenle, büyük ölçüde insertional mutagenesis riski azaltma için yararlıdır. Son zamanlarda IDLV üretim ve ifade özellikleri, güvenli ve verimli CRISPR/Cas9 bileşenleri30teslimi için platform oluşturmak optimize. Nitekim, geliştirilmiş IDLVs hızlı ve sürekli genom HEK-293T hücreleri ve postmitotic beyin sinir hücreleri düzenleme ikna yeteneğine sahip olduğu. Sistem geçici ifade tarafından karakterize ve karşılık gelen integrase yetkili LVs güvenli olduğu anlaşıldı. IDLV vektörler epigenome düzenleme uygulamaları içeren uygulamalar için adaptasyon gen terapisi alan için son derece avantajlı olur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Duke Üniversitesi, bu çalışma için ilgili geçici bir patent başvurusunda.

Acknowledgments

Bu eser kısmen Kahn NÖROTEKNOLOJİ geliştirme Ödülü (OC) ve ulusal kurumları, sağlık/Ulusal Enstitüsü, nörolojik bozukluklar ve kontur (NIH/NINDS) tarafından finanse edildi (R01 NS085011 O.C. için).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Optima XPN-80 Ultracentrifuge Beckman Coulter A99839
0.22 μM filter unit, 1 L Corning 430513
0.45-μm filter unit, 500 mL Corning 430773
100 mm TC-Treated Culture Dish Corning 430167
15 mL conical centrifuge tubes Corning 430791
150 mm TC-Treated Cell Culture dishes with 20 mm Grid Corning 353025
50 mL conical centrifuge tubes Corning 430291
6-well plates Corning 3516
Aggrewell 800 StemCell Technologies 34811
Allegra 25R tabletop centrifuge Beckman Coulter 369434
BD FACS Becton Dickinson 338960
Conical bottom ultracentrifugation tubes Seton Scientific 5067
Conical tube adapters Seton Scientific PN 4230
Eppendorf Cell Imaging Slides Eppendorf 30742060
High-binding 96-well plates Corning 3366
Inverted fluorescence microscope Leica DM IRB2
QIAprep Spin Miniprep Kit (50) Qiagen 27104
Reversible Strainer StemCell Technologies 27215
SW32Ti rotor Beckman Coulter 369650
VWR® Disposable Serological Pipets, Glass, Nonpyrogenic VWR 93000-694
VWR® Vacuum Filtration Systems VWR 89220-694
xMark™ Microplate Absorbance plate reader Bio-Rad 1681150
Name Company Catalog Number Comments
Cell culture reagents
Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cells ATCC CRL-3216
Accutase StemCell Technologies 7920
Anti-Adherence Rinsing Solution StemCell Technologies 7010
Anti-FOXA2 Antibody Abcam Ab60721
Anti-Nestin Antibody Abcam Ab18102
Antibiotic-antimycotic solution, 100x Sigma Aldrich A5955-100ML
B-27 Supplement (50x), minus vitamin A Thermo Fisher Scientific 12587010
BES Sigma Aldrich B9879 - BES
Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) Thermo Fisher Scientific 15260037
CHIR99021 StemCell Technologies 72052
Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix Corning 08-774-552
Cosmic Calf Serum Hyclone SH30087.04
DMEM-F12 Lonza 12-719
DMEM, high glucose media Gibco 11965
DNeasy Blood & Tissue Kit Qiagen 69504
EpiTect PCR Control DNA Set Qiagen 596945
EZ DNA Methylation Kit Zymo Research D5001
Gelatin Sigma Aldrich G1800-100G
Gentamicin Thermo Fisher Scientific 15750078
Gentle Cell Dissociation Reagent stemCell Technologies 7174
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050061
Human Recombinant bFGF StemCell Technologies 78003
Human Recombinant EGF StemCell Technologies 78006
Human Recombinant Shh (C24II) StemCell Technologies 78065
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) Thermo Fisher Scientific 11140050
mTeSR1 StemCell Technologies 85850
N-2 Supplement (100x) Thermo Fisher Scientific 17502001
Neurobasal Medium Thermo Fisher Scientific 21103049
Non-Essential Amino Acid (NEAA) Hyclone SH30087.04
PyroMark PCR Kit Qiagen 978703
RPMI 1640 media Thermo Fisher Scientific 11875-085
SB431542 StemCell Technologies 72232
Sodium pyruvate Sigma Aldrich S8636-100ML
STEMdiff Neural Induction Medium StemCell Technologies 5835
STEMdiff Neural Progenitor Freezing Medium StemCell Technologies 5838
TaqMan Assay FOXA2 Thermo Fisher Scientific Hs00232764
TaqMan Assay GAPDH Thermo Fisher Scientific Hs99999905
TaqMan Assay Nestin Thermo Fisher Scientific Hs04187831
TaqMan Assay OCT4 Thermo Fisher Scientific Hs04260367
TaqMan Assay PPIA Thermo Fisher Scientific Hs99999904
Trypsin-EDTA 0.05% Gibco 25300054
Y27632 StemCell Technologies 72302
Name Company Catalog Number Comments
p24 ELISA reagents
Monoclonal anti-p24 antibody NIH AIDS Research and Reference Reagent Program 3537
Goat anti-rabbit horseradish peroxidase IgG Sigma Aldrich 12-348 Working concentration 1:1500
Goat serum, Sterile, 10 mL Sigma G9023 Working concentration 1:1000
HIV-1 standards NIH AIDS Research and Reference Reagent Program SP968F
Normal mouse serum, Sterile, 500 mL Equitech-Bio SM30-0500
Polyclonal rabbit anti-p24 antibody NIH AIDS Research and Reference Reagent Program SP451T
TMB peroxidase substrate KPL 5120-0076 Working concentration 1:10,000
Name Company Catalog Number Comments
Plasmids
pMD2.G Addgene 12253
pRSV-Rev Addgene 52961
psPAX2 Addgene 12259
Name Company Catalog Number Comments
Restriction enzymes
BsmBI New England Biolabs R0580S
BsrGI New England Biolabs R0575S
EcoRV New England Biolabs R0195S
KpnI New England Biolabs R0142S
PacI New England Biolabs R0547S
SphI New England Biolabs R0182S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  2. Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. 3rd ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
  3. Thakore, P. I., Black, J. B., Hilton, I. B., Gersbach, C. A. Editing the epigenome: technologies for programmable transcription and epigenetic modulation. Nature Methods. 13 (2), 127-137 (2016).
  4. Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
  5. Gilbert, L. A., et al. Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation. Cell. 159 (3), 647-661 (2014).
  6. Perez-Pinera, P., et al. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).
  7. Chavez, A., et al. Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming. Nature Methods. 12 (4), 326-328 (2015).
  8. Horlbeck, M. A., et al. Nucleosomes impede Cas9 access to DNA in vivo and in vitro. eLife. 5, (2016).
  9. Chavez, A., et al. Comparison of Cas9 activators in multiple species. Nature Methods. 13 (7), 563-567 (2016).
  10. Zhou, H., et al. In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice. Nature Neuroscience. 21 (3), 440-446 (2018).
  11. Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 159 (3), 635-646 (2014).
  12. Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).
  13. Holtzman, L., Gersbach, C. A. Editing the Epigenome: Reshaping the Genomic Landscape. Annual Review of Genomics and Human Genetics. , (2018).
  14. Perez-Pinera, P., et al. Synergistic and tunable human gene activation by combinations of synthetic transcription factors. Nature Methods. 10 (3), 239-242 (2013).
  15. Thakore, P. I., et al. Highly specific epigenome editing by CRISPR-Cas9 repressors for silencing of distal regulatory elements. Nature Methods. 12 (12), 1143-1149 (2015).
  16. Amabile, A., et al. Inheritable Silencing of Endogenous Genes by Hit-and-Run Targeted Epigenetic Editing. Cell. 167 (1), 219-232 (2016).
  17. Liu, X. S., et al. Editing DNA Methylation in the Mammalian Genome. Cell. 167 (1), 233-247 (2016).
  18. McDonald, J. I., et al. Reprogrammable CRISPR/Cas9-based system for inducing site-specific DNA methylation. Biology Open. 5 (6), 866-874 (2016).
  19. Huang, Y. H., et al. DNA epigenome editing using CRISPR-Cas SunTag-directed DNMT3A. Genome Biology. 18 (1), 176 (2017).
  20. Vojta, A., et al. Repurposing the CRISPR-Cas9 system for targeted DNA methylation. Nucleic Acids Research. 44 (12), 5615-5628 (2016).
  21. Razin, A., Kantor, B. DNA methylation in epigenetic control of gene expression. Progress in Molecular and Subcellular Biology. 38, 151-167 (2005).
  22. Kantor, B., Ma, H., Webster-Cyriaque, J., Monahan, P. E., Kafri, T. Epigenetic activation of unintegrated HIV-1 genomes by gut-associated short chain fatty acids and its implications for HIV infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (44), 18786-18791 (2009).
  23. Kantor, B., et al. Downregulation of SNCA Expression by Targeted Editing of DNA Methylation: A Potential Strategy for Precision Therapy in PD. Molecular Therapy. , (2018).
  24. Jowaed, A., Schmitt, I., Kaut, O., Wullner, U. Methylation regulates alpha-synuclein expression and is decreased in Parkinson's disease patients' brains. Journal of Neuroscience. 30 (18), 6355-6359 (2010).
  25. Wang, Y., et al. A DNA methyltransferase inhibitor, 5-aza-2'-deoxycytidine, exacerbates neurotoxicity and upregulates Parkinson's disease-related genes in dopaminergic neurons. CNS Neuroscience & Therapeutics. 19 (3), 183-190 (2013).
  26. Matsumoto, L., et al. CpG demethylation enhances alpha-synuclein expression and affects the pathogenesis of Parkinson's disease. PLOS One. 5 (11), e15522 (2010).
  27. Desplats, P., et al. Alpha-synuclein sequesters Dnmt1 from the nucleus: a novel mechanism for epigenetic alterations in Lewy body diseases. Journal of Biological Chemistry. 286 (11), 9031-9037 (2011).
  28. Ai, S. X., et al. Hypomethylation of SNCA in blood of patients with sporadic Parkinson's disease. Journal of the Neurological Sciences. 337 (1-2), 123-128 (2014).
  29. Tagliafierro, L., Chiba-Falek, O. Up-regulation of SNCA gene expression: implications to synucleinopathies. Neurogenetics. 17 (3), 145-157 (2016).
  30. Ortinski, P. I., O’Donovan, B., Dong, X., Kantor, B. Integrase-Deficient Lentiviral Vector as an All-in-One Platform for Highly Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Gene Editing. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 5, 153-164 (2017).
  31. Tagliafierro, L., et al. Genetic analysis of alpha-synuclein 3' untranslated region and its corresponding microRNAs in relation to Parkinson's disease compared to dementia with Lewy bodies. Alzheimer’s & Dementia. 13 (11), 1237-1250 (2017).
  32. Tagliafierro, L., Zamora, M. E., Chiba-Falek, O. Multiplication of the SNCA locus exacerbates neuronal nuclear aging. Human Molecular Genetics. , (2018).
  33. Kantor, B., McCown, T., Leone, P., Gray, S. J. Clinical applications involving CNS gene transfer. Advances in Genetics. 87, 71-124 (2014).
  34. Kantor, B., Bailey, R. M., Wimberly, K., Kalburgi, S. N., Gray, S. J. Methods for gene transfer to the central nervous system. Advances in Genetics. 87, 125-197 (2014).
  35. Vijayraghavan, S., Kantor, B. A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. Journal of Visualized Experiments. (130), e56915 (2017).
  36. Bayer, M., et al. A large U3 deletion causes increased in vivo expression from a nonintegrating lentiviral vector. Molecular Therapy. 16 (12), 1968-1976 (2008).
  37. Bassil, C. F., Huang, Z., Murphy, S. K. Bisulfite pyrosequencing. Methods in Molecular Biology. 1049, 95-107 (2013).
  38. Truong, D. J., et al. Development of an intein-mediated split-Cas9 system for gene therapy. Nucleic Acids Research. 43 (13), 6450-6458 (2015).
  39. Nishimasu, H., et al. Crystal Structure of Staphylococcus aureus Cas9. Cell. 162 (5), 1113-1126 (2015).
  40. Ran, F. A., et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).
  41. Van Lint, C., Ghysdael, J., Paras, P., Burny, A., Verdin, E. A transcriptional regulatory element is associated with a nuclease-hypersensitive site in the pol gene of human immunodeficiency virus type 1. Journal of Virology. 68 (4), 2632-2648 (1994).
  42. Van Lint, C., et al. Transcription factor binding sites downstream of the human immunodeficiency virus type 1 transcription start site are important for virus infectivity. Journal of Virology. 71 (8), 6113-6127 (1997).
  43. Goffin, V., et al. Transcription factor binding sites in the pol gene intragenic regulatory region of HIV-1 are important for virus infectivity. Nucleic Acids Research. 33 (13), 4285-4310 (2005).
  44. Kim, Y. S., et al. Artificial zinc finger fusions targeting Sp1-binding sites and the trans-activator-responsive element potently repress transcription and replication of HIV-1. Journal of Biological Chemistry. 280 (22), 21545-21552 (2005).
  45. Kantor, B., et al. Notable reduction in illegitimate integration mediated by a PPT-deleted, nonintegrating lentiviral vector. Molecular Therapy. 19 (3), 547-556 (2011).

Tags

Genetik sayı: 145 lentiviral Vektörler DNMT3A CRISPR-dCas9 SNCA hiPSCs metilasyon pyrosequencing epigenome düzenleme Parkinson hastalığı
Pluripotent kök hücre kaynaklı hastalık modelleri lentiviral vektör platformu için Epigenome düzenleme araçları verimli bir şekilde teslim insan içine indüklenen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tagliafierro, L., Ilich, E.,… More

Tagliafierro, L., Ilich, E., Moncalvo, M., Gu, J., Sriskanda, A., Grenier, C., Murphy, S. K., Chiba-Falek, O., Kantor, B. Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models. J. Vis. Exp. (145), e59241, doi:10.3791/59241 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter