여기 우리는 캘리포니아2 + 이미징 신경 그리고 glial 세포, 캘리포니아2 + 신호 subcellular 해상도 해 부를 수 있게 하는 프로토콜을 제시. 이 프로세스는 유전자 인코딩된 Ca2 + 지표의 식을 허용 하는 모든 셀 형식에 적용 됩니다.
칼슘 이온 (캘리포니아2 +)은 다양 한 생물 학적 출력으로 이어지는 여러 개의 신호 경로 드라이브 보편적인 세포내 메신저 분자 이다. 두 캘리포니아2 + 신호 소스 조정-“Ca2 + 유입”에서 셀 외부 “캘리포니아2 + 릴리스”에서 세포내 Ca2 + 저장 바인딩과 그물 (ER)-기초 캘리포니아의 다양 한 spatio 시간적 패턴으로 간주 됩니다 2 + 셀에서 여러 생물 학적 기능을 일으키는 원인이 되는 신호. 이 프로토콜의 목적은 설명 새로운 Ca2 + 이미징 방법 “캘리포니아2 + 유입”와 “캘리포니아2 + 릴리스” 순간의 모니터링 하는 것입니다. OER-GCaMP6f는 유전으로 인코딩된 Ca2 + 표시기 (GECI) 구성 된 GCaMP6f는 응급실 외부 막에 대상 이다. OER-GCaMP6f Ca2 + 출시 기존의 GCaMP6f 보다 더 높은 시간 해상도 모니터링할 수 있습니다. 원형질 막 대상 GECIs와 결합, subcellular 해상도 spatio 시간적 캘리포니아2 + 신호 패턴을 설명할 수 있습니다. Subcellular 대상 Ca2 + 지표 설명, 원리, 모든 세포 유형에 사용할 수 있는에 vivo에서에 이미지 꼬마 선 충 의입니다. 이 프로토콜에서 우리 세포, 뉴런, 그리고 해리 주 문화, glial 세포에서 캘리포니아2 + 영상 셀에 소개 하 고 쥐 대뇌 피 질의 뉴런의 냉동된 재고의 준비를 설명.
캘리포니아2 + 신호는 세포내 캘리포니아2 + 농도의 고 도를 나타냅니다. 캘리포니아2 + 진 핵 세포에 대 한 보편적인 두 번째 메신저입니다. 를 사용 하 여 Ca2 +세포 다양 한 세포내 신호 통로 통해 작동 하 고 다양 한 생물 학적 출력을 유도. 예를 들어 뉴런, 시 냅 스 소포 릴리스 연 접 맨끝에 있는 유전자 발현, 핵에는 postsynapse에서 시 냅 스가 소성의 유도 고유한 Ca2 + 신호를 정확 하 게 적절 한 활성화에 의해 통제 된다 다운스트림 효소와 정확한 타이밍1오른쪽 사이트에서.
캘리포니아2 + 신호 특정 spatiotemporal 패턴 특정 다운스트림 효소를 활성화합니다. 캘리포니아2 + 신호를 두 개의 서로 다른 Ca2 + 소스 사이의 조정에 의해 생성 됩니다: 세포 외 공간 및 바인딩과 그물 (응급실), 세포내 캘리포니아 2 +역할에서 Ca2 + 방출 캘리포니아2 + 유입 저장. 의미 있는 spatiotemporal 캘리포니아2 + 신호 패턴을 유도 하는 특정 세포의 기능 10-100 µ M Ca2 + 캘리포니아2 + 원형질 막 또는 ER 막2채널 주변에서 생성 된 nanodomains에 의해 지원 됩니다. 중요 한 것은, 캘리포니아2 + 신호 소스 다운스트림 생물 출력을 결정 하는 가장 중요 한 요인 중 하나입니다. 신경에 있는 캘리포니아2 + 유입 및 캘리포니아2 + 릴리스는 감마-aminobutyric 산 (GABA)A 수용 체 (GABAAR) GABAergic 시 냅 스에서의 클러스터링에 대 한 반대 효과의 저해에 대 한 책임은 신경 흥분3. 캘리포니아2 + 유입 대규모 신경 흥분을 동반 시 냅 스 GABAAR 클러스터의 분산을 유도, 영구 캘리포니아2 + 응급실에서 출시 하는 반면 시 냅 스 GABAARs의 클러스터링을 촉진. 다른 그룹 또한 성장 콘의 튜닝 방향 비판적으로 Ca2 + 신호 소스에 의존은 보고: 캘리포니아2 + 유입 유도 반발, 동안 캘리포니아2 + 릴리스 가이드 신경 성장의 매력 콘4. 따라서, 완벽 하 게 이해 하는 캘리포니아2 + 특정 세포 출력 기본 경로 신호, 그것은 캘리포니아2 + 신호 subcellular 해상도 설명 하 여 캘리포니아2 + 신호 소스를 식별 하는 것이 중요.
이 프로토콜에 우리는 Ca2 + 이미징 메서드를 Ca2 + 신호 Ca2 + 신호 소스 (그림 1)의 평가 허용 한다 subcellular 해상도에 대해 설명 합니다. 바로 아래에 원형질 막 캘리포니아2 + microdomains는 성공적으로 지표에 의해 유전으로 인코딩된 캘리포니아2 + (GECIs) 플라즈마 멤브레인 지역화 신호 Src 내 Lck의 첨부 파일을 통해 플라즈마 멤브레인을 대상으로 모니터링 GECIs5의 N termini에 니. Ca2 + 신호 패턴 더 나은 공간과 시간 해상도 응급실 주변 감지, 우리 최근 개발 OER-GCaMP6f, 어느 GCaMP6f6 대상 응급실 외부 막에서 ER 막 횡단 단백질을 사용 하 여. OER-GCaMP6f 캘리포니아2 + 그리고 GECIs의 확산을 방지 하 여 민감하게 COS-7 셀7 와 HEK293 세포8, 기존의 nontargeted GCaMP6f 보다는 더 나은 spatiotemporal 해상도에 응급실에서 Ca2 + 자료를 보고할 수 있습니다. . 우리는 또한 사이트-GCaMP6f에 의해 보고 된 교양 hippocampal 이다에서 자발적인 Ca2 + 고도 다른 spatiotemporal 패턴을 보여 확인 원형질 막 표적으로 GCaMP6f에 의해 모니터링에 비해 (Lck-GCaMP6f)7 ,9, 나타내는 Lck-GCaMP6f와 함께에서 OER-GCaMP6f와 함께 캘리포니아2 + 이미징 캘리포니아2 + 신호 그들의 소스를 식별 하기 위해 subcellular 해상도 해 부에 기여.
현재, 우리는 캘리포니아2 + 신호 해 부 HeLa 세포와 신경-사이토 혼합 유리 coverslips에 도금 하는 문화에 대 한 프로토콜을 선발. 캘리포니아2 + 이미징 기술은 GECIs와 표시 여기, Lck-GCaMP6f, 플라즈마 막 대상 RCaMP210 (Lck-RCaMP2), 고 OER-GCaMP6f (그림 1) 이러한 GECIs를 표현할 수 있는 모든 셀에 적용 됩니다.
다양 한 생물 학적 출력 캘리포니아2 + 신호에 의해 시작 됩니다. 캘리포니아2 + 다양 한 세포내 신호 메신저입니다. 근본적인 생물학 질문 되었습니다 특정 출력 연상 캘리포니아2 + 신호 디코딩 그리고 캘리포니아2 + 이미징 기술을 캘리포니아2 + 신호의 다양성을 설명 하기 위해 필요 합니다. 현재 상세한 프로토콜 고유 Ca2 + 원형질 막 및 응급실 (그림 3 및 그림 4)와 로컬 Ca2 + microdomains (그림 4 및 그림 5) 셀 내에서 신호 감지 수 있습니다. 이 세포내 캘리포니아2 + 신호의 다양성을 설명 하는에 공헌 한다. 캘리포니아2 + 의 시간적 해상도 또한 캘리포니아2 + 그리고 GECIs,의 3 차원 확산의 효과 피할 수 있고 그것이 검출 가능성이 있기 때문에 원형질 막에 응급실 GECIs를 대상으로 개량 되었다 신호는 캘리포니아2 + 유입 또는 캘리포니아2 + , 막에 발생 하는의 아주 순간.
프로토콜에는 몇 가지 제한이 있습니다. 사용자가 검색 된 신호는 “캘리포니아2 + 유입 또는 릴리스 순간”의 합계 염두에 두어야 할 “캘리포니아2 + 확산 밖으로 캘리포니아2 + 원본에서”, 특히 큰 캘리포니아2 + 신호에 대 한 및. 예를 들어 비록 HeLa 세포에서 그의 자극 끝 캘리포니아2 + 릴리스 응급실, ER 대상 사이트-GCaMP6f에 의해 뿐만 아니라 플라즈마 막 대상 Lck-RCaMP2 (그림 3)에 의해2 + 신호 감지의 결과 Ca에서. 또 다른 한계는 캘리포니아2 + 신호 spatiotemporal 패턴 캘리포니아2 + 신호 출력의 유일한 결정 요인이 되지 않을 수 있습니다. 다운스트림 effector 단백질의 분포 (Ca2 +같은-종속 kinases와 가수분해)2요소를 결정할 수도 있습니다. 완전히 세포내 캘리포니아2 + 신호 디코딩,이 프로토콜에 적용 되지 않습니다, 다운스트림 효소 행동의 분석은 절대적으로 필요 하다.
성공적인 캘리포니아2 + 이미징에 대 한 가장 중요 한 측면 중 하나는 이미지 설정 및 이미지 인수 조건, 뿐만 아니라 다른 라이브 이미징 연구에 관해서는. 우리는 이전 캘리포니아2 + 응답 셀에는 높게 지 기간 및 흥분의 강도에 노출 시간 및 수집 주파수16를 포함 한 이미지 획득 조건에 보였다. 조명 전원을 광 독성 및 photobleaching GECIs의 발생할 수 있습니다 가장 중요 한 요소입니다. 노출 시간, 주파수, 흥분 빛의 강도, 및 기간 기록의 기록의 기록 조건 실험의 목적에 따라 최적화 되어야 합니다. 노출 시간 및 흥분 빛의 강도 photobleaching와 phototoxicity 셀을 피하기 위해 가능한 한 많이 감소 하는 것이 좋습니다. 녹음 주파수와 녹음 기간 Ca2 + 상승 이벤트 관심을 커버 하기에 충분 해야 하지만 또한 photobleaching 및 phototoxicity을 피하기 위해 가능한 한 낮게 유지 되어야 한다. 먼저 녹음 주파수와 기간을 결정 하 고는 GECIs photobleaching 최소화 되도록 노출 시간과 빛의 강도 최적화는 것이 좋습니다. 또 다른 중요 한 요소는 GECIs 식 수준입니다. GECIs는 캘리포니아2 +-그들은 캘리포니아2 +효과 버퍼링-바인딩 단백질. 따라서, GECIs의 overexpression 셀에 대 한 생리 적으로 필요한의 캘리포니아2 +, 버퍼링 발생 합니다. GECI 식의 양은 GECIs의 높은 금액을 표현 하는 이미징 셀을 피하기 위해 최소화 한다.
결론적으로, 캘리포니아2 + 신호 subcellular 해상도 해 부 세포내 캘리포니아2 + 출력 생물 학적 현상을 결정 하는 신호를 해독 하는 가장 중요 한 단계 중 하나입니다. 이 프로토콜의 이러한 신호 중 다양성을 설명 하기 위해 캘리포니아2 + 신호 해 부에 대 한 새로운 방법을 제공 합니다. 현재,이 기술은 체 외 실험에 대 한 제한 됩니다. 그러나, Lck-GCaMP6f 이미 쥐17, vivo에서 캘리포니아2 + 이미징에 사용 되 고 그리고 OER GCaMP6f 모니터링 Ca2 + C. 선 충7에서에서 VD 모터 뉴런에 생체 신호 확인 했다. 따라서, subcellular 격실에 있는 GECIs를 타겟팅 vivo에서 이미징 미래에, 따라서 사용 하면 Ca2 + vivo에서 해 부에 확장 될 가능성이 있다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 다음 교부 금에 의해 지원: 일본 과학 및 기술 기관 (JST) / Precursory 연구 배아 과학 및 기술 (프레스 토) (JPMJPR15F8, 일본); 과학 (JSP)의 승진을 위한 일본 사회 / 다케다 기초 과학 연구 (KAKENHI) (JP18H05414, JP17H05710, JP16K07316)에 대 한 원조에 부여. 저자 RCaMP2 및 아서 재 황 제공 Haruhiko Bito (도쿄 대학)를 감사 하 고 토마스 맥 휴 (RIKEN CBS) AAV 벡터를 제공 하 고 대 한 지침은 AAV 준비에 관한. 저자는 또한 편집자 저널의 시각 실험 비디오 촬영 및 편집 그들의 도움에 감사 하 고 싶습니다.
(RS)-3,5-Dihydroxyphenylglycine (DHPG) | Tocris | #0342 | |
0.5% DNase I stock solution | Sigma-Aldrich | #11284932001 | Prepare 0.5% DNase I (w/v) in Hanks' Balanced Salt Solution supplemented with 120 mM MgSO4. Prepare 160 µL aliquots and store at -30°C. |
0.5% Trypsin-EDTA solution | Thermo Fisher Scientific | #25300054 | |
100 mM L-glutamine (×100 stock) | Thermo Fisher Scientific | #25030081 | Preparing small aliquots of 250–750 µL and store at -30°C. |
100 mM Sodium pyruvate (×100 stock) | Thermo Fisher Scientific | #11360070 | Aliquots (10 mL) can be stored at -20°C. After thawing, the solution can be maintained at 4°C for 2 months. |
12-Well multiwell culture plates with low-evaporation lid | Falcon | #353043 | Low-evaporation lid is critical for culturing neuron-glia mixed culture. For cell line cells, alternative culture dishes can be used. |
18-mm diameter circular coverslips | Karl Hecht "Assistent" | #41001118 | Thickness 1, 18-mm diameter circular coverslips; alternative coverslips can be used. |
1M HEPES | Thermo Fisher Scientific | #15630080 | pH 7.2 – 7.6 |
2.5% Trypsin stock solution (×20 stock) | Sigma-Aldrich | #T4674 | Prepare 150 µL aliquot and store at -30°C. |
50% Poly(ethyleneimine) (PEI) solution | Sigma-Aldrich | #P3143 | Prepare 2% (V/V) PEI stock solution (×50) with distilled water sterilized by filtration. Store stock solution at -30°C after preparing small aliquots of 250-750 µL. Prepare 0.04% PEI solution with distilled water on the day of coverslip coating. |
70% Ethanol | Kept in a spray bottle to be used for surface disinfection. | ||
Adeno-associated virus (AAV) for Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2, and OER-RCaMP2 expression under the direction of the EF1a promoter | AAV can be prepared using AAV Helper Free System (Agilent Technologies) and HEK293 cells, or alternative methods. pAAV.EF1a.Lck-GCaMP6f, pAAV.EF1a.Lck-RCaMP2, and pAAV.EF1a.OER-GCaMP6f are available upon request. | ||
B-27 supplement (×50 stock) | Thermo Fisher Scientific | #17504044 | This can be replaced by B-27 plus supplement (Thermo Fisher Scientific; #A3582801) or MACS NeuroBrew-21 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany; #130-093-566). |
B57BL/6 | Japan SLC, Inc. | ||
Camera for microscopic image recording | The following cameras were available for use: cooled-CCD camera (e.g., Hamamatsu Photonics, OECA-ER), EM-CCD camera (e.g., Hamamatsu Photonics, ImagEM; Andor, iXon) or CMOS camera (e.g., Hamamatsu Photonics ORCA-Flash4.0) | ||
Cell freezing container | Sarstedt K.K. | #95.64.253 | Alternative cell freezing container can be used. |
Cell strainer | Falcon | #352350 | |
CO2 incubator | Maintain at 37°C, 5% CO2. | ||
Cryogenic tube | Corning | #430661 | Alternative cryogenic tubes can be used. |
Cryopreservation medium | Zenoaq | "CELLBANKER1" | |
Culture medium (for HeLa cells) | Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum, and penicillin-streptomycin solution (final concentration: Penicillin 100 units/mL and Streptomycin 100 µg/mL) | ||
Dissection medium | One milliliter of 1 M HEPES (final concentration 20 mM) to 49 mL DMEM | ||
DMEM | Nacalai | #08456-65 | Alternative DMEM can be used. |
DMEM | Nacalai | #08456-65 | Low glucose |
DNA transfection reagent | Sigma-Aldrich | #6366244001 | "X-tremegene HP DNA transfection reagent" Alternative transfection reagents can be used. |
Glass jar with a lid | 500 mL jar (for mouse) or 1500 mL jar (for rat) to anesthetize the animal | ||
HBSS | Thermo Fisher Scientific | #14170161 | HBSS free of calcium and magnesium |
Heat inactivated bovine serum | Thermo Fisher Scientific | #10100147 | |
HeLa cells | RIKEN BioResource Center | #RCB0007 | |
Histamine | Sigma-Aldrich | #H7125 | |
Image analysis software | Such as Metamorph (Molecular Devices), Image J (NIH), and TI Workbench14 (custom made) | ||
Image splitting optics | Hamamatsu Photonics | #A12801-01 | W-view GEMINI |
Image splitting optics dichroic mirror | Semrock | #FF560-FDi01-25×36 | For separation of green fluorescent protein/red fluorescent protein (GFP/RFP) signal |
Image splitting optics emission filters | Semrock | #FF01-512/25-25, #FF01-630/92-25 | For emission of GFP/RFP signal, respectively |
Imaging medium and buffer | Use optimal medium or buffer for the experiment. When medium is used, medium without phenol red is desirable to reduce background fluorescence. Add 20 mM HEPES to maintain pH outside of CO2 incubator. | ||
Incubation saline | Add 1 mL of 1 M HEPES (20 mM) to 49 mL HBSS | ||
Inverted fluorescence microscope | Such as IX73 (Olympus) or Eclipse TI (Nikon Instech) | ||
Isoflurane | Pfizer | Used for anesthesia | |
Maintenance medium (for 4 × 12 well dishes) | 48.5 mL Neurobasal-A medium supplemented with 1 mL B-27, 500 µL of L-glutamine stock and 25 µL Penicillin-Streptomycin solution. | ||
Maintenance medium for frozen cortical cells (for 1 × 12 well dishes) | 12.2 mL Neurobasal plus medium supplemented with 250 µL B-27, 125 µL of L-glutamine stock and 6.2 µL Penicillin-Streptomycin solution. | ||
MEM (Minimum Essential Medium) | Thermo Fisher Scientific | #11090-081 | |
Microscope filter set for GCaMP6f imaging | Appropriate filter for GFP (excitation, 480 ± 10 nm; emission, 530 ± 20 nm) | ||
Microscope filter set for RCaMP2 imaging | Appropriate filter for RFP (excitation, 535 ± 50 nm; emission, 590 nm long pass) | ||
Microscope filter sets for double imaging of RCaMP2 and GCaMP6f | Semrock | #FF01-468/553-25, #FF493/574-FDi01-25×36, #FF01-512/630-25 | Dual excitation filter, Dual dichroic mirror, and emission filter for GFP/RFP imaging. |
Microscope heating system | A heating system to maintain cells at 37°C during the imaging. To avoid drift caused by thermal expansion, heating systems covering the entire microscope itself (e.g., Tokai Hit, Thermobox) are recommended. | ||
Microscope light source for excitation | Mercury lamp (100 W), xenon lamp (75 W), Light-emitting diode (LED) illumination system (e.g., CoolLED Ltd., precisExcite; Thorlabs Inc., 4-Wavelength LED Source; Lumencor, SPECTRA X light engine). In case of mercury lump and xenon lamp, use ND filter to reduce the excitation intensity. | ||
Microscope objective lens | Plan-Apochromat oil immersion objective with numerical aperture higher than 1.3 is highly recommended for the recording of spontaneous Ca2+ activity in neurons and astrocytes. | ||
Neurobasal plus medium | Thermo Fisher Scientific | #A3582901 | |
Neurobasal-A Medium | Thermo Fisher Scientific | #10888022 | Neurobasal plus medium (Thermo Fisher, A3582901) can be used instead of Neurobasal-A medium. |
PBS(-): Phosphate-buffered saline free of Ca2+ and Mg2+ | Fujifilm Wako Pure Chemical Cooperation | #164-23551 | The absence of Ca2+ and Mg2+ is critical not to inhibit the trypsin activity. An alternative to PBS(-) can be used. |
PC and image acquisition software | Such as Metamorph (Molecular Devices); Micromanager; TI Workbench14. | ||
Penicillin-Streptomycin solution | Thermo Fisher Scientific | #15140122 | Penicillin 10,000 units/mL and Streptomycin 10,000 µg/mL |
Plasmid for Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2, and OER-RCaMP2 expression under cytomegalovirus promoter 7-9 | Available upon request | ||
Plating medium (for 4 × 12 well dishes) | 48 mL MEM supplemented with 1 mL B-27 supplement, 500 µL L-glutamine stock (final concentration: 2 mM), 500 µL of sodium pyruvate stock (1 mM) and 25 µL Penicillin-Streptomycin solution (penicillin 5 u/mL, streptomycin 5 µg/mL). This concentration of Penicillin-Streptomycin, which is 1/20 of the concentration recommended by the manufacturer, is critical for neuronal survival. | ||
Recording chamber | Elveflow | Ludin Chamber | This recording chamber is for 18 mm diameter round coverslips. |
Reduced serum media | Thermo Fisher | #11058021 | Opti-MEM |
Stereomicroscope | Used to dissect hippocampi. Olympus SZ60 or equivalent stereomicroscopes are available. | ||
Surgical instruments | Standard dissecting scissors to cut the abdomen of a mouse or a rat, tweezers to pinch the uterus, delicate dissecting scissors to cut the uterus and the head of embryo, ring forceps to pinch the embryos, 13-cm curved Semken forceps (Fine Science Tools #11009-13) to extract brains, 3 forceps with fine tips (Dumont Inox #5) | ||
Transfection reagent for neuron | Thermo Fisher Scientific | #L3000008 | "Lipofectamine 3000" reagent. It is composed of the the "supplement (P3000)" that should be mixed with plasmid DNA in the step 2.2.3, and the "transfection reagent (lipofectamine 3000)" used in the step 2.2.4. |
Trypan blue (0.4%) | Thermo Fisher Scientific | #15250061 | |
Wash medium for frozen cortical cells | 25 mL DMEM, supplemented with 250 µL heat-inactivated fetal bovine serum + 12.5 µL Penicillin Streptomycin. | ||
Wistar rats | Japan SLC, Inc | Pregnant rats (E18) |