Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Визуализация обесценения эндотелия и глиальных барьеров нервно-сосудистого подразделения во время Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит в естественных условиях

Published: March 26, 2019 doi: 10.3791/59249

Summary

Здесь мы представляем протоколы для расследования ухудшение нервно-сосудистого подразделения во время Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит в естественных условиях. Мы конкретно рассмотреть способы определения проницаемости гематоэнцефалического барьера и gelatinase деятельности в лейкоцитарной миграции через глиальная мембрана.

Abstract

Нервно-сосудистого единицы (NVU) состоит из микрососудистой эндотелиальных клеток, образующих гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), эндотелиальные базальной мембраны с встроенный pericytes, и глиальная составе Паренхиматозный базальной мембраны и Астроцитарная конец канал охватывает аспект abluminal микрососудов центральной нервной системы (ЦНС). Помимо поддержания ЦНС гомеостаза NVU управляет людьми иммунных клеток в ЦНС. Во время immunosurveillance ЦНС низкое количество активированных лимфоцитов могут пересекать эндотелиальный барьер не вызывая BBB дисфункции или клинического заболевания. В отличие от этого во время neuroinflammation такие как рассеянный склероз или его животной модели Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (EAE) большое количество иммунных клеток могут пересекать BBB и впоследствии глиальная, в конечном счете достигая паренхимы ЦНС приводит к клинического заболевания. Миграция иммунных клеток в ЦНС паренхимы является таким образом двухэтапный процесс, который включает последовательные миграции через эндотелиальные и глиальных барьер NVU, используя собственный молекулярных механизмов. Если после их прохождения через эндотелиальный барьер, Т-клетки сталкиваются их родственных антигена на периваскулярной антиген представляющих клеток, их местные оживление будет инициировать последующих механизмов, ведущих к фокуса активации gelatinases, который позволят Т-клетки пересечь глиальных барьер и ввести ЦНС паренхимы. Таким образом оценки, BBB проницаемость и деятельность ММР в пространственной корреляции для накопления иммунных клеток в ЦНС при ЕАЕ позволяет указать потеря целостности эндотелия и глиальных барьеров NVU. Мы здесь показать, как вызвать ЕАЕ мышей C57BL/6, активная иммунизация и как впоследствии анализировать BBB проницаемости в естественных условиях, используя сочетание экзогенных Люминесцентные индикаторы. Мы также показать, как визуализировать и локализовать gelatinase активность в мозге ЕАЕ, на месте zymogaphy, в сочетании с immunofluorescent stainings BBB подвале мембран и CD45 + вторжение иммунных клеток.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Центральной нервной системы (ЦНС) координирует все тело и психических функций в позвоночных, и имеет важное значение для надлежащей коммуникации нейронов ЦНС гомеостаза. CNS гомеостаза оправдывается блок нервно-сосудистых (NVU), который защищает ЦНС от меняющейся обстановке поток крови. NVU состоит из ЦНС микрососудистой эндотелиальных клеток, которые биохимически уникальны и создании гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) в непрерывная связь с pericytes, астроциты, нейроны и компонентов внеклеточного матрикса (ECM), создания двух собственный подвал мембраны1. Эндотелиальные базальной мембраны, ensheathes, abluminal аспект BBB эндотелиальных клеток укрывает большое количество pericytes и состоит из Ламинин α4 и α5 Ламинин, помимо других ECM белки2. В противоположность этому Паренхиматозный базальной мембраны состоит из Ламинин α1 и α2 Ламинин и обнял Астроцитарная конце-ноги. Паренхиматозный базальной мембраны вместе с конца ноги экзоцитоз сочиняет глиальная который сегрегирует ЦНС нейронной сети из спинномозговой жидкости заполнены периваскулярной или субарахноидального пространства3. Благодаря уникальной архитектуре NVU иммунных клеток в ЦНС отличается от что в периферических тканях как он требует двухэтапный процесс с иммунных клеток, сначала нарушение эндотелиальных BBB и впоследствии глиальная мембрана для того чтобы достигать ЦНС паренхимы.

Рассеянный склероз (РС) является распространенным заболеванием neuroinflammatory центральной нервной системы, в которой большое количество циркулирующих иммунных клеток введите ЦНС и вызвать neuroinflammation, демиелинизации и фокуса потеря целостности BBB4. Потеря целостности BBB является ранней отличительной чертой МС, как указано наличие контраст гадолиния повышения поражений ЦНС как визуализированное магнитно-резонансная томография (МРТ)5. Лейкоцитарные кровоподтек в ЦНС происходит на уровне postcapillary венул; Однако точные механизмы, участвующие в иммунных клеток диапедез через BBB базальной мембраны и впоследствии глиальных барьер по-прежнему быть изучены. Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (EAE) служит животной модели для MS и внесла существенный вклад в наши текущие знания о патогенезе MS. Например с использованием модели ЕАЕ было обнаружено, что кровоподтек лейкоцитов происходит в многоэтапный процесс, включая первоначальный захват и подвижного шаг при посредничестве селектинов и молекулами муцина как например P селектина гликопротеина лиганда (PSGL) -1, следуют Интегрин зависимые фирмы арест и ползать Т-клеток на BBB эндотелиальных клеток разрешительной стороны для диапедез6.

После того, как Т-клетки пересекли эндотелиальных BBB и эндотелиальных базальной мембраны, они должны столкнуться их родственных антигена на макрофаги и дендритные клетки, стратегически локализованы в лептоменингеальных или периваскулярные пространства. Это взаимодействие индуцирует фокуса производства про воспалительных медиаторов, триггер, последующие механизмы, необходимые для вторжения ткани ЦНС иммунных клеток через глии limitans7,8,9. Фокуса Активация матрицы металлопротеиназ (СПП) -2 и MMP-9 изменяет хемокиновых активации и индуцирует Деградация внеклеточного матрикса рецепторов на конце экзоцитоз-ноги, которая является предпосылкой для иммунной клетки миграции через глиальная в Паренхима ЦНС и побудить появления клинических симптомов ЕАЕ10,11.

Сочетая обнаружения ЦНС, проникнув иммунных клеток с BBB утечки и gelatinase активность в разделах ткани ЦНС предоставляет ценную информацию о функциональной целостности эндотелия и глиальных барьера в контексте neuroinflammation. К примеру, мы недавно исследовали учредительного потеря эндотелиальной туго Джанкшен молекулы соединительной Межмицеллярная молекула (JAM)-B людьми иммунных клеток в ЦНС в контексте ЕАЕ. По сравнению с здоровых мышей C57BL/6 одичал типа, здоровый джем-B-недостаточным однопометники показал не нарушение целостности BBB как показано в естественных условиях проницаемость оценки с использованием как внутреннего, так и экзогенных Трейсеры12. В контексте ЕАЕ мышей C57BL/6 джем-B-недостаточным показали улучшенное болезни симптомы, который был связан с треппинга воспалительных клеток в лептоменингеальных и периваскулярные пространства12. Для изучения этого явления мы применили в situ Зимография, позволяя определение gelatinase активности для того чтобы проверить если отсутствие gelatinase активности в джем-B-недостаточным мышей может нести ответственность за снижение числа иммунных клеток способны нарушить глии limitans12.

Учитывая наличие различных генетически модифицированные мыши модели отсутствует, например, различные BBB жесткие соединения молекул, которые могут вызвать изменения в функции BBB, методологии для расследования BBB целостности имеют важное значение. Кроме того недавно разработанные препараты могут повлиять на NVU барьеров. Здесь мы покажем, как побудить ЕАЕ мышей C57BL/6 путем активной иммунизации с миелина Олигодендроциты гликопротеина (MOG)-пептидные aa35-55 в полной Фройнд адъювантов. Мы затем объяснить, как локализовать иммунных клеток инфильтрата через эндотелиальные и глиальных барьеры NVU и как учиться в естественных условиях эндотелия и глиальных барьер целостность, на месте обнаружения экзогенных Трейсеры и gelatinase деятельности, соответственно.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Все исследования были проведены в соответствии с руководящими принципами согласно швейцарского законодательства о защите животных и были утверждены Управлением ветеринарных кантона Берн, Швейцария (разрешение чисел: BE 31/17 и быть 77/18).

1. корпус мышей C57BL/6 в конкретных патогеном бесплатно (SPF) условиях

  1. Дом мышей в отдельных клетках вентилируемые с 12/12 h свето тени цикла. Предоставления продовольствия и воды libidum объявление. Контролировать микробиологического качества мышей, экспериментальный когорты претерпел ежеквартально работоспособностью, Грязные постельные принадлежности часовые после FELASA рекомендации13.
  2. Использование штампов уха отдельно отметить 8-12 неделя старый самок мышей C57BL/6.

2. Иммунизация мышей C57BL/6

  1. Подготовка решения14:
    1. Для полного Фройнд адъювантной (CFA), смесь 30 мл с 120 мг свеже pestled тепла Фройнд неполной адъювантной инактивированная микобактерии туберкулеза (H37RA) под вытяжного шкафа. Стоковый раствор хранить при 4 ° C.
    2. Стоковый раствор MOGaa35-55-пептид растворяют MOGaa35-55-пептида в стерильных PBS (4 мг/мл) и хранить при температуре-80 ° C.
    3. Подготовьте MOG-эмульсии:
      1. Разбавьте CFA 1:2 с MOG-пептид Стоковый раствор в 2 мл микропробирок.
      2. Уплотнение Микропробирка с пленки для запайки и исправить на вихревой смеситель, полностью покрывая трубку с клейкой лентой. Вихревой эмульсия для 4 ч при 4 ° C.
    4. Подготовьте шприцы с стабильной эмульсии:
      1. Возьмите Микропробирка и быстро уменьшается эмульсии, с использованием центрифуг небольшой стол. Сбор эмульсии в шприц с помощью инъекций иглой 18G x 1½'' (1,2 мм x 40 мм).
      2. По словам количество мышей громкость эмульсии в шприц (100 мкл/мышь) и заменить 18 G игла Инъекционная игла 27 g x ¾'' (0.4 мм x 19 мм). Уплотнение иглу, вложенное в шприц с пленки для запайки.
    5. Для коклюша токсин (PTx) раствор, растворяют 50 мкг лиофилизированные PTx в 500 мкл стерильных PBS (100 нг/мкл). Стоковый раствор хранить при 4 ° C.
    6. Для PTx рабочий раствор смесь 97 мкл стерильных PBS с 3 мкл раствора PTx штока (300 нг/100 мкл) на мышь (для использования внутрибрюшинной инъекции иглой 30G x ½'' (0,3 мм х 13 мм)).
  2. ЕАЕ индукции
    1. Анестезировать мышей C57BL/6 с isofluorane с помощью системы испарителем. Чтобы побудить анестезии в мышей, разоблачить мыши isofluorane 4,5% кислорода в камере небольшой инкубационный перед передачей мыши маску с 2,1% isofluorane. Используйте блок анестезии, оснащены грелку для предотвращения переохлаждения мыши.
    2. Исправить наркотизированных мышь в одной руке и впервые вставляют 30 мкл MOG35-55/CFA-эмульсии подкожно задняя нога бочки (рис. 1:1 + 2; в общей сложности 60 мкл; левый фланг 30 мкл и правый фланг 30 мкл) в непосредственной близости от паховые лимфатические узлы.
    3. Поместите курсор мыши на ее живот и залить 20 мкл MOGaa35-55/CFA-эмульсии в левую и правую жировой ткани в корне хвост (рис. 1:3 + 4; в общей сложности 40 мкл; левой стороне хвоста корень 20 мкл и правой стороне хвоста корень 20 мкл) и маленькая капелька int MOGaa35-55/CFA-эмульсии o шеи мыши (рис. 1: 5).
    4. Inject внутрибрюшинно 100 мкл раствора PTx в мышь. Держите голову мыши ниже центра тела, избегая инъекции в кишечнике.
    5. Заменить содержание диеты (extrudate основных питательных веществ: 18,5% сырого протеина; неочищенный жир 4.5%, сырая зола 6,5%; 35% крахмала; клетчатка 4,5%; метаболической энергии: 13.1 МДж/кг) для разведения диета (extrudate основных питательных веществ: неочищенный белок 23,5%, неочищенный жир 5,5%; непереработанные волокна 3%; сырая зола 5,7%; 36% крахмала; метаболической энергии: 14.3 МДж/кг) для того, чтобы предоставить мышей с пищей выше содержание энергии до и во время ожидаемого клинического заболевания.
    6. Удалите маску и передать его домой клетку с потепление площадку мыши. Убедитесь, что мышь полностью проснуться и подвижные после 10 минут.
    7. Повторите PTx инъекции (2.2.4) 48 ч после первого лечения.

3. Озвучивание ЕАЕ мышей

  1. Проверьте состояние здоровья ЕАЕ мышей каждое утро, принимая взглянуть внутрь клетки.
  2. Оценка ЕАЕ мышей каждый день.
  3. Возьмите каждый индивидуальный мыши, включены в эксперимент ЕАЕ из клетки и проверить имеет ли хвост тонус, перемещая его вверх с пальцем. Здоровой мыши будет держать его хвост (хвост имеет тонуса). Если клинические ЕАЕ началась, хвост тонус будет ниже, видимый постепенное падение хвоста. В конечном итоге мыши не сможет поднять свой хвост на всех.
  4. Поместите каждый индивидуальный мыши, включены в эксперимент ЕАЕ на чистой скамейке и наблюдать и документ пешеходных поведение. См таблицу 115 для озвучивания критерии для оценки тяжести заболевания (EAE балл).
  5. Оценивать и документировать вес каждой мыши, включены в эксперимент.
  6. Обеспечить достаточное питание и поглощение воды мышами, отображение клинических ЕАЕ Оценка 1 поставку смоченной пищи в пластиковых блюдо в нижней части клетки и обновления ежедневно.

4. In vivo проницаемости пробы

  1. Подготовка решений:
    1. Для фондовых растворов декстрана растворяют 10 мг 10 кДа 488 Fluor Alexa декстрана, а также 3 кДа красный Техас декстрана в 500 мкл раствора натрия хлорида 0,9% (20 мг/мл).
    2. Для рабочего раствора декстрана просто до инъекции накапайте 55 мкл 10 кДа декстрана Alexa Fluor 488 складе раствора (20 мг/мл) на кусок пленки для запайки и 55 мкл 3 кДа декстрана Техас красный Стоковый раствор (20 мг/мл). Смешать и собирать 100 мкл в одноразовый штраф шприц (конечная концентрация 2 мг/100 мкл).
    3. Стоковый раствор 10% формальдегида (PFA) объединить 10 g PFA дополнительный чистый порошок, 100 мл PBS и 200 мкл 1Н NaOH в стакан чистой стекла и тепла до точно 56 ° C при перемешивании с помощью магнитной мешалкой; Держите на 56 ° C за 30 мин до тех пор, пока полностью не растворится ППД; охладить до комнатной температуры; Отрегулируйте пэ-аш до 7,4; и процеживают через бумажный фильтр. Хранить при - 20 ° C. Стоковый раствор может быть разбавлен дальнейшее использование PBS.
  2. Вскоре анестезировать здоровых мышей C57BL/6 или мышей C57BL/6, страдает от ЕАЕ с изофлюрановая (мышь будет отключке примерно 1 мин). Использование автоматизированной системы как шаг 2.2.1 (мышей будут подвержены изофлюрановая 4,5% кислорода в камеру всасывание и затем переданы маску с 2,1% изофлюрановая).
  3. Место наркотизированных мышь в боковой позиции на стол, затем внутривенно (например ретро орбитально) придать мыши 100 мкл люминесцентные Индикаторы, прежде чем мыши просыпается.
  4. Немедленно удалите маску и убедитесь, что мышь полностью проснуться и подвижные после короткого анестезии. Пусть трассировщик распространить на 15 мин.
  5. Перейдите к шагу 5.1.

5. перфузии мышей

  1. Для оценки в естественных условиях проницаемость:
    1. Начала процедуры 15 мин после инъекции флуоресцентные трассирующими, вызывая глубокие изофлюрановая анестезии. Чтобы побудить глубокой анестезии у мышей использовать 2,3% изофлюрановая кислорода. Использовать рефлекс вывод лапы для оценки глубины анестезии (ущипнуть кожу между пальцами; отсутствие сгибания указывает достаточной глубины) и зонд рефлексы передних конечностей и задних конечностей у мышей подвергали ЕАЕ.
    2. Исправьте мышь на его спине и спрей живот с этанолом. Открыть с помощью ножниц грудной клетки и удалить диафрагмы. Откройте правое предсердие биение сердца с помощью ножниц и perfuse мыши через левого желудочка сердца с PBS, следуют 10 мл 4% 10 мл ПФА в PBS.
      Предупреждение: Чтобы избежать вдыхания PFA, perfuse мыши в зонта.
    3. Перейдите к разделу 6.
  2. Для в situ Зимография:
    1. Вызывают глубокую изофлюрановая анестезия с помощью изофлюрановая 2,3% кислорода в страдающих от ЕАЕ мыши и проверьте глубину анестезии как шаг 5.1.1.
    2. Далее исправить мышь на его спине и спрей живот с этанолом. Открыть с помощью ножниц грудной клетки и удалить диафрагмы. Откройте правое предсердие биение сердца с помощью ножниц и perfuse мыши через левого желудочка сердца с 20 мл ФСБ.
    3. Перейдите к разделу 6.

6. Вскрытие и замораживания мозга

  1. Подготовка охлаждающей ванны:
    1. Заполните контейнер плоского Дьюара с измельченного сухого льда и добавить 2-methylbutane (изопентан) до тех пор, пока жидкость достигает примерно на 1 см выше сухой лед. Закрыть крышкой свободные – например, обложку ведро льда.
  2. Клип от головы перфузии мыши с острыми ножницами и удалить кожу и уши, используя меньший набор ножницы.
  3. Тщательно анализировать тюбетейка, отрезав от затылочного к передней левой и с правой стороны, позволяя upfold тюбетейка над мозг. Затем осторожно поднимите нетронутыми мозга от основания черепа при разрыве оптических нервов, с помощью плоской металлической лопаткой.
  4. Место мозга на алюминиевой фольги и вырезать мозг в трех штук (фронтальный мозга, среднего мозга и мозжечке + ствола мозга), поставив два корональных сокращений.
  5. Заполнить cryomold (25 мм x 20 мм x 5 мм) в первом квартале с оптимальной температурой резания (O.C.T.) матрица, места срезов мозга с передней стороной каждой части мозга, вниз в cryomold и охватывают ткани полностью с O.C.T. матрицей.
  6. Место cryomold с ткани в горизонтальной ориентации в 2-Methylbutane ванну и убедитесь, что ткани замерзает от дна к верхней в течение 1 минуты, избегая погружения блока всей ткани в ванну.
  7. Передать-80 ° C для хранения замороженных ткани и перейдите к разделу 7.

7. Подготовка секций замороженные ткани

  1. Сбалансировать температуры от замороженных ткани от-80 ° C до-20 ° C в криостат для 30 мин.
  2. Удалить блок ткани из cryomold и горе на держатель ткани криостата (регулировка-15 ° C) с помощью матрицы O.C.T..
  3. Обрезать края ткани блока на держателе криостат с острый скальпель и начать сокращать в блок ткань, удаляя 20 мкм секции с криостата нож до тех пор, пока ткань является видимым.
  4. Для анализа в естественных условиях BBB проницаемость:
    1. Вырезать разделов ткани 6-10 мкм, собрать их на адгезии стеклянных скольжениях и сразу же изображения секций, покрыта крышка выскальзования с помощью микроскопа флуоресценции.
    2. Оцените внешний вид кровеносных сосудов в мозге (Обратите внимание на резкие границы не вытекающей кровеносных сосудов, по сравнению с диффузный характер флуоресценции для вытекающей кровеносных сосудов). Как положительный контроль Проверьте утечки tracer в строме circumventricular органов или сосудистое сплетение, которой не хватает BBB.
  5. Для в situ Зимография:
    1. Вырезать 6 мкм разделов ткани с помощью криостат, собирать их на адгезии стеклянных вставках и заморозить разделов ткани при-20 ° C в коробке замораживания, содержащий силикагель в крышке.

8. в situ Зимография в сочетании с Ламинин/CD45 иммунофлюоресценции пятнать

  1. Подготовка решения:
    1. Подготовка внедрения решения:
      1. Смешать 6 g глицерина (чда), 2.4 g поли (виниловый спирт), 6 мл ddH2O и 12 мл 0,2 М трис буфера, рН 8 и перемешать (Магнитная мешалка) раствор для 4 h на RT.
      2. Передача решения в 50 мл пластиковых пробирок и дайте ему отдохнуть в течение 2 ч в рт. Впоследствии Инкубируйте решение для 10 мин при температуре 50 ° C (водяная баня) и центрифуги для 20 минут, 2700 x g при комнатной температуре.
      3. Возьмите супернатант и заморозить в аликвоты при-20 ° C.
    2. Готовят раствор желатина холодной:
      1. Растворите 0,1 г холодного желатина из кожи крупного рогатого скота в 10 мл ddH2O.
      2. Дайте ему впитаться в течение по крайней мере 1 день и хранить аликвоты при 4 ° C.
    3. Подготовьте ледяной метанола (-20 ° C):
      1. 100% метанола в опарник coplin и охлаждения до-20 ° C.
    4. Подготовьте раствор азид натрия 10%:
      1. Добавьте 1 g азид натрия в 10 мл ddH2O и хранить при комнатной температуре.
    5. Подготовьте раствор рабочих азид натрия 0,1%:
      1. Mix 99 µL из ddH2O с 1 мкл 10% азид натрия раствор.
    6. Растворить 1 мг флуоресцеин конъюгированных закаленном краситель (DQ) желатина из кожи свиньи в 1 мл азид натрия работает решения и хранить 100 мкл аликвоты, защищенном от света при 4 ° C.
    7. Растворяют 30 мг моногидрата 1,10-фенантролиновый в 76 мкл этанола и хранить при-20 ° C.
    8. Подготовка 25 x решение ингибитор протеазы:
      1. Добавьте 1 таблетка ингибитора протеазы бесплатно ЭДТА в 2 мл ddH2O. Хранить при температуре от-20 ° C.
    9. Непосредственно перед использованием приготовляют раствор реакции (150 мкл/раздел):
      1. Центрифуга 1 мг/мл DQ желатин решение для 5 мин при 13,300 x g.
      2. Mix 127.2 мкл ddH2O, 15 мкл 10 x буфер реакции (Gelatinase/коллагеназы Assay Kit; см. Таблицу материалы), 0,3 мкл 20 мг/мл холодной желатина, 1.5 мкл 1 мг/мл DQ желатина и 6 мкл 25 x решения ингибитор протеазы.
    10. Непосредственно перед использованием Подготовьте фенантролина отрицательный контроль реакции раствора (150 мкл/раздел):
      1. Mix 125.2 мкл ddH2O, 15 мкл 10 x буфер реакции, 0,3 мкл 20 мг/мл холодной желатина, 1.5 мкл DQ желатина 1 мг/мл, 6 мкл 25 x ингибитор протеазы ЭДТА бесплатно и 2 мкл 2м 1,10-фенантролина (MMP ингибитора).
    11. Непосредственно перед использованием готовят холодные желатин (не люминесцентные) отрицательный контроль реакции раствор (150 мкл/секция):
      1. Mix 128.7 мкл ddH2O, 15 мкл 10 x буфер реакции, 0,3 мкл 20 мг/мл холодной желатина и 6 мкл ЭДТА бесплатно ингибитор протеазы 25 x.
    12. Подготовка основного антитела коктейль для counterstaining, например, 0,95 мкг/мл кролика polyclonal антитела анти Ламинин и антитела анти CD45 поликлональных крыса 10 мкг/мл в 1% BSA в PBS и подготовить соответствующие изотипа управления основное антитело коктейли.
    13. Подготовить раствор вторичных антител, например, 7.5 мкг/мл Cy3 коза анти крыса + 15 мкг/мл AMCA анти кролик в 1% BSA в PBS (защищает от света).
  2. Разморозить 6 мкм-Исправлена мозга разделов ткани от мышей ЕАЕ внутри окна пластиковые замораживания, содержащий силикагель в крышке в Зонта, чтобы избежать удержания воды в ткани и отделить 2 разделах ткани на одном слайде, Рисование линий с водой отталкивая перо
  3. Подготовка решения реакции (8.1.9-8.1.11 меры), центрифуги для 5 мин в 13400 x g при комнатной температуре и предварительно теплой до 37 ° C, с помощью водяной бане.
  4. Увлажняет разделов ткани на 5 минут при 37 ° C, с помощью 1 x буфер реакции. Затем слить 1 x буфер реакции, добавить решение реакции на разделах ткани и инкубировать в течение 4 ч при 37 ° C. Вымойте слайды 5 раз в ddH2O.
  5. Исправить разделы для 5 мин с ледяной метанола при-20 ° C и потом мыть разделы с PBS при комнатной температуре.
  6. Добавить 1% BSA в PBS на разделы и проинкубируйте втечение 20 мин при комнатной температуре (защищает от света). Затем, отменить 1% BSA в PBS из разделов, щелкая слайды на ткани, добавить основное антитело коктейлем и инкубировать 1 час при комнатной температуре (защищает от света).
  7. Вымойте секции дважды с PBS, добавить вторичные антитела коктейль и инкубировать 1 час при комнатной температуре (защищает от света).
  8. Вымойте секции дважды с PBS, смонтировать слайды с внедрения решения, пусть навесные секции сухие за ночь при комнатной температуре (защищает от света). Наконец анализ разделов окрашенных тканей, с использованием флуоресцентный Микроскоп.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Оценка клинического течения ЕАЕ мышей C57BL/6 должно привести к болезни кривой, как показано на рисунке 2А и изменения веса тела мыши, представленные на рисунке 2B. Мышей C57Bl/6, иммунизированных с MOGaa35-55 обычно начинают развиваться симптомы болезни около 10-12 день после активной иммунизации (рис. 1A). Как правило иммунизированная мышь показывают переходных падение веса тела на следующий день после инъекции эмульсии и первая доза токсина коклюша (рис. 1B). От 2 день после индукции ЕАЕ вес тела иммунизированной мыши затем постепенно увеличивается до начала болезни, когда вес тела обычно падает за один день до развития клинических симптомов и продолжает уменьшаться, соотнося увеличение Симптомы болезни (рис. 1A,B). ЕАЕ тяжести заболевания увеличивается до пика болезни, которые можно ожидать от дней 16 и 20 после индукции ЕАЕ (рисунок 2A). На пике клинических ЕАЕ мышей также показывают низкие веса тела (рис. 2B), который увеличивает в корреляции для мелиорации ЕАЕ в фазе ремиссии заболевания (рисунок 2A,B). ЕАЕ индукции в мышей C57BL/6, обычно с помощью MOGaa35-55 приводит к патологии в хроническое заболевание и мышей не полностью восстановиться (рис. 1A).

На рисунке 3A показывает представитель картину сосудистого сплетения и паренхиме прилегающих мозга мыши C57BL/6, страдает от ЕАЕ, внутривенно вводили с флуоресцентные 3 кДа декстрана (красный) и 10 кДа декстрана (зеленый) 15 мин до принесения в жертву ; масштаб бар 50 мкм. Как ранее мы показали, Трейсеры легко диффузных через перфорированную микрососудов в стомы сосудистое сплетение (левый и средний рисунок), в то время как BBB не допускает распространения циркулирующих Трейсеры в паренхимы мозга, указывается пунктирной линией (фото справа), который таким образом лишена любого флуоресцентного сигнала. Рисунок 3B показывает представитель вытекающей кровеносных сосудов мозжечка C57BL/6 мыши, страдает от ЕАЕ, внутривенно вводили с флуоресцентные 3 кДа декстрана (красный) и 10 кДа декстрана (зеленый) 15 мин до принесения в жертву. Стрел указывают Трейсеры распространяются через мозг микрососудов в паренхиме ЦНС (левой и средней фото), предполагая, что функция BBB нарушаются в этих судов. В паренхиме ЦНС красный и Зеленый флуоресцентный сигнал виден вне стен кровеносных сосудов, которые обозначаются пунктирными линиями. В ЕАЕ в мозжечке, где воспалительных манжеты появляются Трейсеры можно также найти в периваскулярные пространства между эндотелиальной базальной мембраны и глиальная указанием функциональных потери целостности эндотелия BBB. Если трассирующими диффундируют в паренхимы мозга, он показывает дополнительные дисфункции глиальных барьер12.

Рисунок 4 показывает представитель фотографии анализа деятельности gelatinase (СПП) в мозге ЕАЕ C57BL/6 мыши визуализированное на месте Зимография и локализованные для конкретных мозга барьер отсеков анти-pan-Ламинин (синий) и наличие воспалительные клетки путем пятнать иммунофлюоресценции анти CD45 (красный). Протеолитического расщепления краситель закалка желатина (DQ) unquenches флуоресцеин сигнал, который позволяет локализации gelatinase деятельности на участке ткани. Когда инкубировали холодной желатин (не люминесцентные контроль), не зеленого флуоресцентного сигнала могут быть обнаружены в разделах мозг от ЕАЕ мышей (верхняя строка), а также в разделах, которые были инкубировали с DQ-желатин в сочетании с фенантролина, мощным Zn +- комплексообразования агент и ингибитор MMP (посередине). В нижнем ряду фокуса деятельности gelatinase/MMP виден как типичный гранулированных яркий зеленый флуоресценции сигнал, как подчеркнул наконечники стрел. В воспалительных манжеты в мозжечке ЕАЕ мыши ММП активности происходит за пределами глиальная мембрана (синий) на участках воспалительных клеток инфильтрата (красный).

Figure 1
Рисунок 1 : Графическое представление инъекции сайтов для индукции ЕАЕ. 1) инъекции для 30 мкл MOG-эмульсии на правом фланге, 2) инъекции для 30 мкл MOG-эмульсии на левом фланге, 3) инъекции для 20 мкл MOG-эмульсии в корень левого, хвост, 4) инъекции для 30 мкл MOG-эмульсии в правый хвост корень 5) инъекции для маленькая капелька MOG-эмульсии в шею. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : Представитель курс ЕАЕ. (A) симптомы болезни ЕАЕ мышей C57BL/6 с течением времени. Показано среднее + / SEM. (B) изменение массы тела во время ЕАЕ с течением времени. Показано среднее + / SEM.  Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 : Представитель картину в естественных условиях проницаемости. (A) слева: Зеленый флуоресцентный 10 кДа декстрана на уровне сосудистого сплетения. Средняя картина: красный флуоресцентные 3 кДа декстрана на уровне сосудистого сплетения. Фото справа: слияние изображений левой и средней. Шкалы бар 50 µm. (B) слева: Зеленый флуоресцентный 10 кДа декстрана в мозжечке мыши. Средняя картина: красный флуоресцентные 3 кДа декстрана в мозжечке мыши. Фото справа: слияние изображений левой и средней. Пунктирные линии показательны для стены кровеносного сосуда; стрел указывают на флуоресцентные Трейсеры в паренхиме ЦНС. Шкалы и 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4 : Представитель фотографии в situ Зимография. Первый столбец: Зеленый флуоресцентный канал (неутоленной сигнал закаленном краситель (DQ) желатина). Второй столбец: синий флуоресцентный канал (Ламинин). Третья колонка: флуоресцентные красный канал (CD45). Четвертый столбец: слияние флуоресцентные каналов. Верхний ряд: холодный желатин (не люминесцентные) отрицательного контроля. Средний ряд: фенантролина (MMP-ингибитор) отрицательного контроля. Низкий ряд: DQ желатина. Шкалы и 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

0 до 3 очки критерии изменение веса
0 никаких признаков нормальный вес
~ слабая хвост (слабый тонус) - Просмотр критерии: не включены в документально Озвучивание Потеря веса (индикативный для второй проверки)
0.5 хромать хвост (хвост капли) Потеря веса
1 hindleg слабость, нестационарном походка (мышь прогулки на скамейке как утка) Потеря веса
2 hindleg паралич (мышь не переместить его гомотерия) тяжелые веса (индикативный для второй проверки)
3 hindleg параплегии, потеря мочи нижней орган управления (мыши падает на одной стороне, но можно переместить в клетке с помощью ist frontlegs + мочи; умирающий) очень низкой массой тела (индикативный для второй проверки)

Таблица 1: Озвучивание критерии для оценки тяжести заболевания ЕАЕ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Здесь мы представляем протокол стимулировать и контролировать ЕАЕ в самок мышей C57BL/6. Женщины преференциально выбраны, и число случаев заболевания женщин: мужчины 3:1 в мс. Для оценки тяжести ЕАЕ, мы сделали использовать 3-точка забил листа. ЕАЕ тяжести обычно забил в отношении серьезности моторных дисфункций. Мышей с передовых стадиях ЕАЕ, т.е. экспонируется оценка выше 2 должны быть принесены в жертву избежать ненужных страданий животных. Таким образом, рекомендуется набрать мышей закрыть интервалы, например два раза ежедневно, как описано в протоколе.  Существует несколько скоринга подпрограмм занятых, достигнув от 0-3 указывает на 0-6 очков,16,,1718,19 , или даже больше subpoints20. Однако мы показали ранее, что якобы изысканный ЕАЕ забил не привести к каких-либо улучшений в определении потенциальных статистически значимой разницы в болезни счеты между группами, при рассмотрении общей тяжести заболевания15. Основываясь на это замечание, которое мы сделали использовать по 3-балльной шкале оценить прогрессирования заболевания в ЕАЕ с тем, чтобы сократить время обработки мыши и таким образом, бедствие для мышей, 3R правила осуществления. Другой критической точки, с помощью модели ЕАЕ изучить различия между Выбивное и мышах одичал тип или различия между группами лечения является создание точного планирования экспериментальных. Когда мышах одичал типа по сравнению с нокаут мышей, важно сравнить однопометники возникая от гетерозиготных вязки для обеспечения одинаковых генетических стола по сравнению в эксперименте ЕАЕ мышей дикого типа и нокаут. Важно также сохранить одинаковые условия для всех мышей, включенных в эксперимент, например изменения Кейдж, администрация влажных продуктов питания и особенно мышь жилищных условий (состояние здоровья). Во избежание Кейдж конкретных явлений, вызванных следователь, кросс иммунизации должны быть выполнены. Более точно если более чем один шприц для иммунизации определенное количество мышей, они должны быть случайным различных шприцы используются. Последние также могут применяться для выполнения исследований лечения. Не в последнюю очередь, состояние здоровья мышей, размещены в разных животных зал может повлиять на заболеваемость и тяжести и таким образом более21 или меньше микобактерии22 может потребоваться навести надлежащей клинической болезни. Кроме того сайт инъекции могут повлиять на развитие болезни. В этом протоколе мы предлагаем придать сравнительно небольшие объемы в пяти различных подкожной сайты: 30 мкл на две бочки, 20 мкл в левой и правой хвост корень и маленькая капелька в шею. В другие протоколы 50 мкл складов помещены подкожно в хвост корень только23 или в четырех фланки21. Инъекции небольших складов, однако, сведения к минимуму риска нанесения раздражения кожи, который мышей может попытаться нуля.

In vivo проницаемость может выполняться для оценки утечки BBB во время ЕАЕ, но и оценить ли конкретные генетические исключить молекула или медикаментозное лечение влияет на BBB целостности в естественных условиях. Это может быть либо осуществляется обнаружение эндогенного плазмы Трейсеры как IgG депозиты12 или экзогенных транс, которые применяются в оборот живым мыши24. В этом протоколе мы сделали использование двух различных экзогенных Трейсеры (3 кДа и 10 кДа декстрана), которые были одновременно вводят и позволило распространить определенное время 15 мин, с использованием двух Трейсеры с разными размерами позволяет определить степень тяжести BBB дисфункции и может позволить определить отсечки для трассировочного размеров, что рассеянный или не через BBB. Флуоресцентный декстраны являются гидрофильные полисахаридов, характеризуется хорошей растворимостью в воде, низкой токсичностью и относительно низкой иммуногенностью. Кроме того декстраны состоят из поли-(α-D-1,6 глюкозы), которые устойчивы к декольте, эндогенного сотовой основу. Здесь мы использовали декстрана варианты, которые имеют остатков лизина, включены в декстрана конъюгата. Lysinated декстраны являются альдегид поправимо, который позволяет исправить tracer в ткани. Помимо дневно обозначенные декстраны другие химические вещества могут использоваться для оценки проницаемости в естественных условиях, например, Хойста в сочетании с синим Эвана, который связывает к большой части к сывороточного альбумина. "Хёхст" пятна ядер эндотелиальных клеток BBB, вагонка ЦНС микрососудов, и Эвана голубой может быть обнаружен в периваскулярные пространства после BBB дисфункции и рассеивает далее глиальная при нарушенной25,26. В отличие от оценки в естественных условиях проницаемости, immunofluorescent окрашивание эндогенного маркеров обеспечивает понимание накопление, например, молекул IgG или фибриноген, гликопротеин, который циркулирует в крови, с течением времени. В здоровых условиях периваскулярные пространства очень узкий и эндотелиальных базальной мембраны и глиальная тесно связаны и, таким образом, Визуализация двух ECM барьеры NVU требует Ламинин изоформы специфичные антитело пятная27 .

Эндогенных молекул IgG присутствуют в здоровье и болезни внутри кровеносных сосудов, а также как и ткани circumventricular органов, где нет BBB является установленным12. В гене изменен мышей с дефектами барьер мозга, во время лечения, или во время neuroinflammation эндогенных молекул, которые обычно циркулируют в крови могут храниться в паренхиме ЦНС, которые могут быть визуализированы counterstaining с анти Ламинин антитела, либо признания всех изоформ Ламинин (Пан Ламинин антитела) или Ламинин изоформы специфические антитела, позволяющие дифференцировать laminins, Ламинин α4 и α5 от эндотелия базальной мембраны и Ламинин α1 и α2 Ламинин от глии limitans. При neuroinflammatory условиях периваскулярные пространства могут быть расширены путем проникают в клетки иммунной системы, позволяющие идентифицировать, эндотелиальные базальной мембраны и глиальная мембрана с помощью Пан Ламинин антитела. Counterstaining из laminins на NVU позволяет оценить ли эндогенного но также экзогенные Трейсеры залегают в паренхиме ЦНС и counterstaining CD45 позволяет оценить ли фокуса утечки BBB связан с иммунных клеток проникновение.

Миграции иммунных клеток в ЦНС паренхимы требует последовательного пересечения двух различных барьеров в рамках NVU, эндотелиальных BBB и впоследствии глии limitans28. Пересекая глиальная мембрана и ЦНС вход иммунных клеток коррелирует с началом клинической ЕАЕ29, а ЦНС проникают в клетки ловушке в лептоменингеальных и периваскулярные пространства не запускают клинических ЕАЕ. Треппинг иммунных клеток в лептоменингеальных и периваскулярные пространства между подвале мембраны наблюдается в нескольких моделях генно модифицированных мыши например L-селектина нокаут мышей30, ФНО нокаут мышей23, мышей двойной нокаут Матриксная металлопротеиназа 2/MMP910 и джем-Б нокаут мышей12. Эти выводы подчеркнуть, что отсутствие этих молекул не влияет на миграцию иммунных клеток через BBB, но скорее через глиальная, подчеркнув, что молекулярные механизмы посредничества иммунных клеток миграции через BBB и глиальная являются собственный. Мозг в situ Зимография представляет собой методологию для расследования деятельности координационных gelatinase в разделе ткани в точной пространственной корреляции для патологии ЦНС. Обнаружение в естественных условиях BBB проницаемости наряду с выполнение на месте Зимография обнаруживать Матриксная металлопротеиназа 2/MMP9 деятельность таким образом позволяет разграничить эндотелиальной против глии барьер помеха в корреляции с иммунных клеток инфильтрата. В сочетании с Пан Ламинин и CD45 иммунофлюоресценции окрашивания на участках мозга ЕАЕ, она позволяет локализации gelatinase деятельности unquenching DQ-желатин и локализации проникновения иммунные клетки в то же время. Unquenching из флуоресцеин от DQ-желатин результаты в типичный гранулированных яркий зеленый флуоресценции сигнал, в то время как пятнистый тускло Зеленый флуоресцентный областей на разделах ткани должны рассматриваться как неспецифическим сигнал12. Таким образом тщательной оценки разделов ткани и надлежащего контроля необходимы при выполнении в situ Зимография. В этом протоколе мы провели в situ Зимография в сочетании с CD45 и Ламинин окрашивания. Первичного антитела против CD45 и Ламинин инкубировали как смесь в то же время. Аналогичным образом вторичные антитела были инкубировали как смесь на втором этапе окрашивания. Такое сочетание антител потребностей, тестирование, чтобы убедиться, что второй этап антитела поглощаются против других IgGs избежание перекрестной реактивности.

Вместе взятые, протоколы, представленные здесь предоставляют средства для расследования в деталях, какой элемент NVU нарушениями в neuroinflammatory условиях ЕАЕ. In vivo проницаемость оценка экзогенных Трейсеры позволяет идентифицировать текущий нарушение целостности микрососудистой эндотелиальных клеток или текущий обесценение NVU. Кроме того введение Трейсеры с разными размерами позволяет оценить серьезность нарушения BBB. Дополнительные на месте Зимография раскрывает фокуса gelatinase активности в астроциты и потенциально воспалительные клетки, которая необходима для нарушение глиальная как последний барьер перед получением доступа к ЦНС паренхимы10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Отсутствие конфликта интересов объявил.

Acknowledgments

Мы с благодарностью признаем Лидия Сорокин, который разделил ее оригинал в situ Зимография протокол10 с нами.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AMCA anti-rabbit antibody Jackson ImmunoResearch 111-156-045 Store at 4 °C; protect from light
Anti-CD45 Antibody (30F11) Pharmingen 07-1401 Store at 4 °C
Anti-Laminin Antibody DAKO Z0097 Store at 4 °C
Breeding food e.g. PROVIMI KLIBA SA 3336
Individually ventilated cages, Blue line Type II or III e.g. Tecniplast 1145T, 1285L
BSA fraction V Applichem A1391 Store at 4 °C
Cold gelatine Sigma-Aldrich G 9391
Coplin jar + rack e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG H554.1; H552.1
Cy3 anti-rat antibody Jackson ImmunoResearch 111-156-144 Store at 4 °C; protect from light
Cover slips 24 x 40 mm # 1 e.g. Thermo Scientific 85-0186-00
Dextran Alexa Fluor 488 (10,000 MW) e.g. Molecular probes D22910 Store at -20 °C; protect from light
Dextran Texas Red (3000 MW) Invitrogen D3328 Store at -20 °C; protect from light
EnzChek Gelatinase/Collagenase Assay Kit  Thermo Fisher Scientific; EnzCheck E12055 Store at -20 °C; protect form light
Female C57BL/6J mice (8-12 weeks) e.g. Janvier Labs Females, 8-12 weeks
Freezing box for histology slides e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG 2285.1
18G x 1½’’ (1.2mm x 40mm) injection needle e.g. BD, BD Microlance 3 304622
27G x ¾’’ – Nr. 20 (0.4mm x 19mm) injection needle e.g. BD, BD Microlance 3 302200
30G x ½’’ (0.3 mm x 13 mm) injection needle e.g. BD, BD Microlance 3 304000
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) e.g. Santa Cruz Biotechnology sc-24648 Store at 4°C
Maintenance food e.g. PROVIMI KLIBA SA 3436
MOGaa35-55 peptide e.g. GenScript Store at -80 °C
microscope slides (Superfrost Plus ) Thermo Scientific J1800AMNZ
Mycobacterium tuberculosis H37RA e.g. BD 231141 Store at 4 °C 
NaCl 0.9 % B. Braun 3535789
O.C.T. compound (Tissue-Tek ) Sakura 4583
Omnican 50 30G x ½’’ B. Braun 9151125S
Paraformaldehyde Merck 30525-89-4
Pertussis toxin e.g. List biological laboratories, Inc. 180 Store at 4 °C
poly(vinyl alcohole) (Mowiol 4-88) Sigma-Aldrich 81381
Protease Inhibitor EDTA free (Roche) Sigma-Aldrich 4693132001 Store at 4 °C
repelling pen e.g. DAKO Pen e.g. DAKO S2002
sealing film e.g. Parafilm M e.g Sigma-Aldrich P7793
Silica gel e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG 9351.1
Stitch scissor F.S.T 15012-12
syringe 1 ml e.g. PRIMO 62.1002
syringe 10 ml e.g. CODAN Medical ApS 2022-05
vaporizer system Univentor 400 UNO.BV

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tietz, S., Engelhardt, B. Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions. Journal of Cell Biology. 209, 493-506 (2015).
  2. Wu, C., et al. Endothelial basement membrane laminin alpha5 selectively inhibits T lymphocyte extravasation into the brain. Nature Medicine. 15, 519-527 (2009).
  3. Hannocks, M. J., et al. Molecular characterization of perivascular drainage pathways in the murine brain. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 38, 669-686 (2018).
  4. Kermode, A. G., et al. Breakdown of the blood-brain barrier precedes symptoms and other MRI signs of new lesions in multiple sclerosis. Pathogenetic and clinical implications. Brain. 113, (Pt 5), 1477-1489 (1990).
  5. Tommasin, S., Gianni, C., De Giglio, L., Pantano, P. Neuroimaging techniques to assess inflammation in Multiple Sclerosis. Neuroscience. (2017).
  6. Lopes Pinheiro, M. A., et al. Immune cell trafficking across the barriers of the central nervous system in multiple sclerosis and stroke. Biochimica Biophysica Acta. 1862, 461-471 (2016).
  7. Bartholomaus, I., et al. Effector T cell interactions with meningeal vascular structures in nascent autoimmune CNS lesions. Nature. 462, 94-98 (2009).
  8. Kyratsous, N. I., et al. Visualizing context-dependent calcium signaling in encephalitogenic T cells in vivo by two-photon microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, E6381-E6389 (2017).
  9. Lodygin, D., et al. A combination of fluorescent NFAT and H2B sensors uncovers dynamics of T cell activation in real time during CNS autoimmunity. Nature Medicine. 19, 784-790 (2013).
  10. Agrawal, S., et al. Dystroglycan is selectively cleaved at the parenchymal basement membrane at sites of leukocyte extravasation in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Experimental Medicine. 203, 1007-1019 (2006).
  11. Song, J., et al. Focal MMP-2 and MMP-9 activity at the blood-brain barrier promotes chemokine-induced leukocyte migration. Cell Reports. 10, 1040-1054 (2015).
  12. Tietz, S., et al. Lack of junctional adhesion molecule (JAM)-B ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis. Brain, Behavior, and Immunity. 73, 3-20 (2018).
  13. Mähler Convenor, M., Berard, M., Feinstein, R., Gallagher, A., Illgen-Wilcke, B., Pritchett-Corning, K., Raspa, M. FELASA working group on revision of guidelines for health monitoring of rodents and rabbits. FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units. Lab Anim. 48, (3), 178-192 (2014).
  14. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visual Experiments. (2014).
  15. Tietz, S. M., et al. Refined clinical scoring in comparative EAE studies does not enhance the chance to observe statistically significant differences. European Journal of Immunology. 46, 2481-2483 (2016).
  16. Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).
  17. Miller, S. D., Karpus, W. J. Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse. Current Protocols in Immunology. 15, Chapter 15 Unit 14 (2007).
  18. Sobel, R. A., Tuohy, V. K., Lu, Z. J., Laursen, R. A., Lees, M. B. Acute experimental allergic encephalomyelitis in SJL/J mice induced by a synthetic peptide of myelin proteolipid protein. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 49, 468-479 (1990).
  19. Westarp, M. E., et al. T lymphocyte line-mediated experimental allergic encephalomyelitis--a pharmacologic model for testing of immunosuppressive agents for the treatment of autoimmune central nervous system disease. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 242, 614-620 (1987).
  20. Klotz, L., et al. B7-H1 shapes T-cell-mediated brain endothelial cell dysfunction and regional encephalitogenicity in spontaneous CNS autoimmunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, E6182-E6191 (2016).
  21. Tietz, S. M., et al. MK2 and Fas receptor contribute to the severity of CNS demyelination. PLoS One. 9, e100363 (2014).
  22. Coisne, C., Mao, W., Engelhardt, B. Cutting edge: Natalizumab blocks adhesion but not initial contact of human T cells to the blood-brain barrier in vivo in an animal model of multiple sclerosis. Journal of Immunology. 182, 5909-5913 (2009).
  23. Korner, H., et al. Critical points of tumor necrosis factor action in central nervous system autoimmune inflammation defined by gene targeting. Journal of Experimental Medicine. 186, 1585-1590 (1997).
  24. Krueger, M., et al. Blood-brain barrier breakdown involves four distinct stages of vascular damage in various models of experimental focal cerebral ischemia. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 35, 292-303 (2015).
  25. Hawkins, B. T., Egleton, R. D. Fluorescence imaging of blood-brain barrier disruption. Journal of Neuroscience Methods. 151, 262-267 (2006).
  26. Graesser, D., et al. Altered vascular permeability and early onset of experimental autoimmune encephalomyelitis in PECAM-1-deficient mice. Journal of Clinical Investigation. 109, 383-392 (2002).
  27. Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Seminars in Immunopathology. 31, 497-511 (2009).
  28. Owens, T., Bechmann, I., Engelhardt, B. Perivascular spaces and the two steps to neuroinflammation. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 67, 1113-1121 (2008).
  29. Sixt, M., et al. Endothelial cell laminin isoforms, laminins 8 and 10, play decisive roles in T cell recruitment across the blood-brain barrier in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Cell Biology. 153, 933-946 (2001).
  30. Grewal, I. S., et al. CD62L is required on effector cells for local interactions in the CNS to cause myelin damage in experimental allergic encephalomyelitis. Immunity. 14, 291-302 (2001).
Визуализация обесценения эндотелия и глиальных барьеров нервно-сосудистого подразделения во время Экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит в естественных условиях
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tietz, S. M., Engelhardt, B. Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo. J. Vis. Exp. (145), e59249, doi:10.3791/59249 (2019).More

Tietz, S. M., Engelhardt, B. Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo. J. Vis. Exp. (145), e59249, doi:10.3791/59249 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter