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Immunology and Infection

वीवो में प्रयोगात्मक Autoimmune Encephalomyelitis के दौरान न्यूरोवैस्कुलर यूनिट के Endothelial और Glial बाधाओं के Visualizing हानि

Published: March 26, 2019 doi: 10.3791/59249

Summary

यहाँ, हम विवो में प्रयोगात्मक स्व-प्रतिरक्षित encephalomyelitis के दौरान neurovascular इकाई की हानि की जांच करने के लिए प्रोटोकॉल उपस्थित । हम विशेष रूप से पता कैसे रक्त मस्तिष्क बाधा पारगम्यता और जिलेटाइनसे glia लिमिटेंस भर में ल्यूकोसाइट प्रवास में शामिल गतिविधि का निर्धारण करने के लिए ।

Abstract

neurovascular इकाई (NVU) माइक्रोवास्कुलर endothelial रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB), एम्बेडेड pericytes के साथ एक endothelial तहखाने झिल्ली, और पैरेन्काइमल तहखाने झिल्ली और astrocytic द्वारा रचित glia लिमिटेंस बनाने कोशिकाओं से बना है केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) माइक्रोवेसल्स के abluminal पहलू को गले लगाने के अंत फ़ीड । सीएनएस homeostasis बनाए रखने के अलावा NVU सीएनएस में प्रतिरक्षा सेल के अवैध व्यापार को नियंत्रित करता है । सक्रिय लिम्फोसाइटों की कम संख्या सीएनएस की प्रतिरक्षा निगरानी के दौरान BBB शिथिलता या नैदानिक रोग के कारण के बिना endothelial बाधा पार कर सकते हैं । इसके विपरीत, ऐसे मल्टीपल स्केलेरोसिस या अपने पशु मॉडल प्रयोगात्मक स्व-प्रतिरक्षित encephalomyelitis में (eae) प्रतिरक्षा कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या के रूप में neuroinflammation के दौरान bbb पार कर सकते है और बाद में glia लिमिटेंस अंततः cns पैरेन्काइमा तक पहुंचने नैदानिक रोग के लिए अग्रणी. सीएनएस पैरेन्काइमा में प्रतिरक्षा सेल माइग्रेशन इस प्रकार एक द्वि-चरणीय प्रक्रिया है जिसमें एनवु के एंडोथीलियल और ग्लाइकल बैरियर में एक क्रमिक प्रवास शामिल है जो विशिष्ट आण्विक तंत्रों को नियोजित करता है । यदि endothelial बाधा भर में उनके पारित होने के बाद, टी कोशिकाओं परिसंवहनी प्रतिजन पर अपने सजाना antigen मुठभेड़-कोशिकाओं को अपने स्थानीय पुनर्सक्रियण बाद में gelatinases के फोकल सक्रियण के लिए अग्रणी तंत्र शुरू होगा पेश, जो टी कोशिकाओं glial बाधा पार और सीएनएस पैरेन्काइमा दर्ज करने के लिए सक्षम हो जाएगा । इस प्रकार, दोनों का आकलन, BBB पारगम्यता और EAE के दौरान सीएनएस में प्रतिरक्षा कोशिका संचय करने के लिए स्थानिक सहसंबंध में एमएमपी गतिविधि NVU के endothelial और glial बाधाओं की अखंडता की हानि निर्दिष्ट करने के लिए अनुमति देता है । हम यहां कैसे सक्रिय प्रतिरक्षण द्वारा C57BL/6 चूहों में eae प्रेरित करने के लिए और बाद में कैसे vivo में bbb पारगम्यता का विश्लेषण करने के लिए बहिर्जात फ्लोरोसेंट tracers का एक संयोजन का उपयोग कर दिखाते हैं । हम आगे दिखाने के लिए, कैसे और कल्पना करने के लिए EAE दिमाग में gelatinase गतिविधि स्थानीयकृत द्वारा सीटू zymogaphy BBB तहखाने झिल्ली और CD45 + प्रतिरक्षा कोशिकाओं पर आक्रमण के immunofluorescent धुंधला करने के लिए युग्मित ।

Introduction

केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) कशेरुका में सभी शरीर और मानसिक कार्यों निर्देशांक, और सीएनएस homeostasis ंयूरॉंस के एक उचित संचार के लिए आवश्यक है । सीएनएस होमियोस्टैसिस न्यूरोवैस्कुलर यूनिट (NVU), जो रक्त प्रवाह के बदलते वातावरण से सीएनएस की रक्षा करता है द्वारा warranted है । NVU CNS माइक्रोवास्कुलर endothelial कोशिकाओं से बना है, जो biochemically अद्वितीय है और रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) pericytes, astrocytes, ंयूरॉंस के साथ निरंतर crosstalk में स्थापित है, और extracellular मैट्रिक्स (ECM) घटकों, दो की स्थापना अलग तहखाने झिल्ली1. एंडोथीलियल तहखाने झिल्ली कि BBB endothelial कोशिकाओं के abluminal पहलू ensheathes pericytes की एक उच्च संख्या बंदरगाहों और अंय ECM प्रोटीन2के अलावा laminin α और laminin α 5, से बना है । इसके विपरीत, पैरेन्काइमल तहखाने झिल्ली में लैमिनिन हैं1 और लैमिनिन α 2 होते हैं और इन्हें एस्ट्रोसाइटिक एंड-फीट से अपनाया जाता है । पैरेन्काइमल तहखाने झिल्ली एक साथ astrocyte अंत फुट के साथ glia लिमिटेंस composes कि मस्तिष्कमेरु द्रव भरा परिसंवहनी या अवजालतनिका रिक्त स्थान3से सीएनएस न्यूरोनल नेटवर्क को अलग करता है । NVU के अद्वितीय वास्तुकला के कारण, सीएनएस में प्रतिरक्षा सेल के अवैध व्यापार परिधीय ऊतकों में से अलग है के रूप में यह प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ एक दो कदम प्रक्रिया की आवश्यकता है, पहले endothelial BBB और बाद में glia लिमिटेंस उल्लंघन करने के लिए सीएनएस पैरेन्काइमा तक पहुंचें ।

मल्टीपल स्केलरोसिस (एमएस) सीएनएस की एक आम न्यूरोभड़काऊ बीमारी है, जिसमें परिसंचारी प्रतिरक्षा कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या में सीएनएस दर्ज करें और कारण neuroinflammatory, ग्रासलेल्या, और BBB अखंडता4के फोकल नुकसान. bbb अखंडता की हानि एमएस की एक प्रारंभिक पहचान है, के रूप में केएनएस में गैडोलिनियम कंट्रास्ट बढ़ाने घावों की उपस्थिति के रूप में चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई)5द्वारा कल्पना द्वारा संकेत दिया । ल्यूकोसाइट CNS में बहिर्वेशन postcapillary venules के स्तर पर होता है; हालांकि, सटीक BBB तहखाने झिल्ली भर में प्रतिरक्षा कोशिका diapedesis में शामिल तंत्र और बाद में glial बाधा का पता लगाया जा करने के लिए रहते हैं । प्रायोगिक ऑटोइम्यून एनसेफेलोमाइलाइटिस (EAE) एमएस के लिए एक पशु मॉडल के रूप में कार्य करता है और काफी एमएस रोगजनन के बारे में हमारे वर्तमान ज्ञान के लिए योगदान दिया है । उदाहरण के लिए, eae मॉडल का उपयोग कर यह पता चला है कि ल्यूकोसैट बहिर्वेशन एक बहुचरणी प्रक्रिया में होता है, एक प्रारंभिक कब्जा और रोलिंग चरण के रूप में चयनों और mucin द्वारा मध्यस्थता जैसे अणुओं जैसे पी selectin ग्लाइकोप्रोटीन संलग्नी (psgl)-1, integrin निर्भर फर्म गिरफ्तारी और BBB endothelial कोशिकाओं पर टी कोशिकाओं के रेंगने के बाद diapedesis6के लिए स्वतंत्र पक्षों के लिए ।

एक बार टी कोशिकाओं endothelial bbb और endothelial तहखाने झिल्ली को पार कर लिया है, वे मैक्रोफेज या डेन्द्रटिक कोशिकाओं में रणनीतिक रूप से लेप्टोमेनिंगयल या परिसंवहनी रिक्त स्थान में स्थानीयकृत पर अपने सजाना प्रतिजन मुठभेड़ की जरूरत है । यह बातचीत समर्थक भड़काऊ मध्यस्थों है कि बाद glia लिमिटेंस7,8,9के माध्यम से प्रतिरक्षा कोशिकाओं के सीएनएस ऊतक आक्रमण के लिए आवश्यक तंत्र को ट्रिगर के फोकल उत्पादन लाती है । मैट्रिक्स के फोकल सक्रियण-metalloproteinases (एमएमपी)-2 और एमएमपी-9 बदल chemokine सक्रियकरण और एस्ट्रोसाइट के अंत पर extracellular मैट्रिक्स रिसेप्टर्स की गिरावट लाती-पैर, जो में glia लिमिटेंस भर में प्रतिरक्षा सेल प्रवास के लिए एक शर्त है सीएनएस पैरेन्काइमा और EAE10,11के नैदानिक लक्षणों की शुरुआत को प्रेरित करने के लिए ।

सीएनएस के साथ घुसपैठ प्रतिरक्षा सेल का पता लगाने के संयोजन में BBB रिसाव और CNS ऊतक वर्गों में gelatinase गतिविधि neuroinflammation के संदर्भ में endothelial और glial बाधा के कार्यात्मक अखंडता के बारे में बहुमूल्य जानकारी प्रदान करता है । उदाहरण के लिए, हमने हाल ही में एन्डोथेलियल टाइट जंक्शन अणु जंक्शन आसंजन अणु (जैम)-बी की प्रतिरक्षा कोशिका के अवैध व्यापार में सी एन ई के संदर्भ में संवैधानिक हानि की जांच की । स्वस्थ जंगली-प्रकार C57BL/6 चूहों, स्वस्थ जाम बी की कमी के लिए की तुलना में साहित्यकार ने दिखाया bbb अखंडता की कोई हानि के रूप में vivo पारगम्यता आकलन में अंतर्जात का उपयोग कर के रूप में के रूप में अच्छी तरह से बहिर्जात tracers12। EAE के संदर्भ में, जाम बी की कमी C57BL/6 चूहों ameliorated रोग के लक्षण है, जो भड़काऊ कोशिका के साथ जुड़ा हुआ था दिखाया लेप्टोमेनिंगयल और पेरिवैस्कुलर रिक्त स्थान12में फँसाना । इस घटना हम सीटू zymography में लागू की जांच करने के लिए, gelatinase गतिविधि की पहचान की अनुमति के लिए अगर जाम में gelatinase गतिविधि की कमी बी-कमी चूहों प्रतिरक्षा कोशिकाओं को भंग करने में सक्षम की कम संख्या के लिए जिंमेदार हो सकता है परीक्षण करने के लिए ग्लिया लिमिटेंस12.

अलग आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस मॉडलों की कमी की उपलब्धता को देखते हुए, उदाहरण के लिए, अलग BBB तंग जंक्शन अणुओं कि BBB समारोह में परिवर्तन के कारण हो सकता है, BBB अखंडता की जांच के लिए तरीके महत्वपूर्ण हैं । इसके अलावा, नव विकसित दवाओं NVU बाधाओं पर प्रभाव सकता है । यहां हम बताएंगे कि कैसे C57BL/6 चूहों में myelin ओलिगोडेन्ट्रोसाइट ग्लाइकोप्रोटीन (MOG) के साथ सक्रिय प्रतिरक्षण द्वारा EAE-पेप्टाइड aa35-55 में पूरा Freund सहायक । हम तो समझाने कैसे endothelial और nvu के glial बाधाओं और कैसे vivo endothelial और glial बाधा अखंडता में अध्ययन करने के लिए में प्रतिरक्षा सेल घुसपैठ के लिए स्थानीय रूप से बहिर्जात tracers और gelatinase गतिविधि का पता लगाने में, क्रमशः ।

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Protocol

सभी अध्ययनों के दिशानिर्देशों के तहत पशुओं के संरक्षण पर स्विस कानून के अनुसार आयोजित किए गए थे और बर्न, स्विट्जरलैंड (अनुमति संख्या: 31/17 और BE 77/18) के केंटन के पशु चिकित्सा कार्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया ।

1. विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त (SPF) शर्तों में C57BL/6 चूहों का आवास

  1. एक 12/12 ज लाइट-डार्क चक्र के साथ व्यक्तिगत हवादार पिंजरों में घर चूहों । भोजन और पानी का विज्ञापन लीपेडियम प्रदान करें । चूहों की माइक्रोबायोलॉजिकल गुणवत्ता की निगरानी करने के लिए, प्रायोगिक सहगण फेलासा सिफारिशों13के बाद गंदे बिस्तर प्रहरी द्वारा त्रैमासिक स्वास्थ्य निगरानी किया गया ।
  2. कान घूंसे का प्रयोग करें व्यक्तिगत रूप से मार्क 8-12 सप्ताह पुरानी महिला C57BL/

2. C57BL/6 चूहों का प्रतिरक्षण

  1. समाधान की तैयारी14:
    1. पूरी तरह से है Freund सहायक (सीएफए) के लिए, एक धूआं डाकू के तहत १२० ताजा pestled गर्मी inएक्टिवेट Mycobacterium तपेदिक (H37RA) के साथ अधूरा है Freund सहायक के 30 मिलीलीटर मिश्रण । 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर स्टॉक समाधान ।
    2. MOGaa35-55-पेप्टाइड स्टॉक समाधान के लिए, बाँझ PBS में MOGaa35-55-पेप्टाइड भंग (4 मिलीग्राम/एमएल) और स्टोर-८० डिग्री सेल्सियस पर ।
    3. MOG-पायस तैयार करें:
      1. एक 2 मिलीलीटर microtube में MOG-पेप्टाइड स्टॉक समाधान के साथ पतला सीएफए 1:2 ।
      2. सील फिल्म और पूरी तरह से चिपकने वाला टेप के साथ ट्यूब को कवर करके एक भंवर मिक्सर पर फिक्स के साथ microtube मुहर । 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 ज के लिए भंवर पायस ।
    4. स्टेबाइल पायस के साथ सिरिंज तैयार करें:
      1. माइक्रोट्यूब ले लो और जल्दी से नीचे एक छोटी मेज सेंट्रीफ्यूज का उपयोग कर पायस स्पिन । एक 18G x 11/2 ' ' (१.२ मिमी x ४० मिमी) इंजेक्शन सुई का उपयोग कर एक सिरिंज में पायस लीजिए ।
      2. चूहों की संख्या के अनुसार सिरिंज (१०० μl/माउस) में इमल्शन मात्रा समायोजित करें और एक 27g x 3/4 ' ' (०.४ मिमी x 19 मिमी) इंजेक्शन सुई के साथ 18g सुई की जगह । सील फिल्म सील के साथ सिरिंज से जुड़ी इंजेक्शन सुई ।
    5. काली खांसी विष (ptx) स्टॉक समाधान के लिए, विखंडित pbs के ५०० μl में lyophilized ptx के ५० μg (१०० एनजी/ 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर स्टॉक समाधान ।
    6. ptx काम कर समाधान के लिए, मिश्रण ९७ ptx स्टॉक समाधान के 3 μl के साथ बाँझ pbs के μl (३०० एनजी/100 μl) प्रति माउस (intraperitoneal इंजेक्शन के लिए एक 30g x 1/2 ' ' (०.३ मिमी x 13 मिमी) सुई) का उपयोग करें ।
  2. EAE प्रेरण
    1. Anesthetize C57BL/6 चूहों एक वाष्पग्राही प्रणाली का उपयोग कर isofluorane के साथ । चूहों में संवेदनाहरण पैदा करने के लिए, २.१% isofluorane के साथ एक facemask करने के लिए माउस स्थानांतरित करने से पहले एक छोटे ऊष्मायन चैंबर में ऑक्सीजन में ४.५% isofluorane के लिए माउस को बेनकाब । माउस के हाइपोथर्मिया को रोकने के लिए हीटिंग पैड के साथ सुसज्जित एक संवेदनाहरण इकाई का प्रयोग करें ।
    2. एनस्थेटाइज्ड माउस को एक हाथ में ठीक करें और पहले MOG35-55/सीएफए-इमल्शन के 30 μL को पिछली टांग की फ्लैंकों में मिलाकर (चित्र 1:1 + 2; कुल ६० μL में; बाएं पार्श्व में 30 μL और दाएं पार्श्व 30 μL) वंक्षण लिम्फ नोड्स के निकट निकटता में ।
    3. इसके पेट पर माउस रखें और बाईं और सही नरम फैटी ऊतक में पूंछ रूट (चित्र 1:3 + 4; कुल ४० μL में, बाईं ओर पूंछ जड़ 20 μL और दाईं ओर पूंछ जड़ 20 μL) के 20 μL MOGaa35-55/सीएफए-emulsion इंजेक्शन और MOGaa35-55/सीएफए-इमल्शन int की थोड़ी छोटी बूंद माउस की गर्दन ओ (चित्रा 1: 5) ।
    4. माउस में PTx समाधान intraperitoneally के १०० μL सुई । शरीर के केंद्र के नीचे माउस के सिर पकड़ आंत में इंजेक्शन से परहेज ।
    5. रखरखाव आहार बदलें (extrudate प्रमुख पोषक तत्वों: क्रूड प्रोटीन १८.५%; क्रूड फैट ४.५%; क्रूड फाइबर ४.५%; क्रूड ऐश ६.५%; स्टार्च ३५%; मेटाबोलिक एनर्जी: १३.१ एमजे/किग्रा) प्रजनन आहार (extrudate प्रमुख पोषक तत्व: क्रूड प्रोटीन २३.५%; क्रूड फैट ५.५%; क्रूड फाइबर 3%; क्रूड राख ५.७%; स्टार्च ३६%; चयापचय ऊर्जा: १४.३ MJ/किग्रा) के लिए उच्च ऊर्जा सामग्री के भोजन के साथ चूहों से पहले और अपेक्षित नैदानिक रोग के दौरान प्रदान करने के लिए ।
    6. चेहरा मुखौटा निकालें और एक वार्मिंग पैड के साथ अपने घर पिंजरे के लिए माउस हस्तांतरण । सुनिश्चित करें कि माउस पूरी तरह से जाग और 10 मिनट के बाद गतिशील है ।
    7. दोहराएं PTx इंजेक्शन (2.2.4) ४८ एच प्राथमिक उपचार के बाद ।

3. EAE चूहों के स्कोरिंग

  1. cages के अंदर एक नज़र लेने के द्वारा EAE चूहों के स्वास्थ्य की स्थिति की जांच हर सुबह ।
  2. हर दोपहर चूहे EAE स्कोर ।
  3. हर व्यक्ति को पिंजरे से बाहर eae प्रयोग में शामिल माउस ले लो और जांच करें कि क्या पूंछ एक उंगली से ऊपर ले जाकर स्वर है । एक स्वस्थ माउस अपनी पूंछ रखना होगा (पूंछ एक tonus है) । यदि नैदानिक eae शुरू कर दिया है, पूंछ स्वर कम हो जाएगा, पूंछ की एक क्रमिक बूंद से दिखाई । अंततः चूहा अपनी पूंछ बिल्कुल नहीं उठा पाएगा.
  4. हर व्यक्ति को साफ बेंच पर EAE प्रयोग में शामिल माउस को रखें और निरीक्षण और घूमना व्यवहार दस्तावेज़ । रोग गंभीरता (EAE स्कोर) के मूल्यांकन के लिए स्कोरिंग मापदंड के लिए तालिका 115 देखें ।
  5. प्रयोग में शामिल हर माउस के वजन का आकलन और दस्तावेज़ ।
  6. करने के लिए पर्याप्त भोजन और पानी के एक नैदानिक EAE स्कोर प्रदर्शित चूहों द्वारा उत्साहित सुनिश्चित करने के लिए एक प्लास्टिक की डिश में पिंजरे के नीचे और ताज़ा दैनिक भोजन की आपूर्ति ।

4. vivo पारगम्यता परख में

  1. समाधानों की तैयारियाँ:
    1. dextran स्टॉक समाधान के लिए, 10 के 7 मिलीग्राम केडीए Dextran Alexa Fluor ४८८ के रूप में अच्छी तरह के रूप में 3 केडीए Dextran टेक्सास लाल ०.९% सोडियम क्लोराइड समाधान के ५०० μL में भंग (20 मिलीग्राम/
    2. dextran काम कर समाधान के लिए, बस से पहले इंजेक्शन पिपेट के ५५ μl 10 केडीए dextran Alexa fluor ४८८ स्टॉक समाधान (20 मिलीग्राम/फिल्म सील के एक टुकड़े पर और 3 केडीए dextran टेक्सास लाल स्टॉक समाधान के ५५ μl जोड़ें (20 मिलीग्राम/ मिश्रण और एक प्रयोज्य ठीक सिरिंज में १०० μL इकट्ठा (अंतिम एकाग्रता 2 मिलीग्राम/
    3. 10% formaldehyde (पीएफए) स्टॉक समाधान के लिए, 10 ग्राम खाद्य अपमिश्रण निवारण अतिरिक्त शुद्ध पाउडर, PBS के १०० मिलीलीटर, और 1N NaOH के २०० μL एक साफ गिलास बीकर में गठबंधन और एक चुंबकीय विलोडक का उपयोग कर सरगर्मी के तहत ठीक से ५६ डिग्री सेल्सियस तक गर्मी; पीएफए पूरी तरह से भंग है जब तक 30 मिनट के लिए ५६ डिग्री सेल्सियस पर रखें; कमरे के तापमान को शांत; ७.४ को पीएच समायोजित करें; और एक कागज फिल्टर के माध्यम से फिल्टर । -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर । शेयर समाधान और PBS का उपयोग कर पतला किया जा सकता है ।
  2. शीघ्र ही स्वस्थ C57BL/6 चूहों या C57BL/6 चूहों isoflurane के साथ eae से पीड़ित (माउस लगभग 1 मिनट के लिए बेहोश किया जाएगा) । 2.2.1 चरण में के रूप में एक स्वचालित प्रणाली का प्रयोग करें (चूहों ऑक्सीजन में एक प्रेरण चैंबर में ४.५% isoflurane को उजागर किया जाएगा और फिर २.१% isoflurane के साथ एक facemask को हस्तांतरित) ।
  3. मेज पर पार्श्व स्थिति में ऊपर माउस प्लेस, तो नसों के (उदा. रेट्रो-ऑर्कली) माउस में फ्लोरोसेंट ट्रेज़र के १०० μl सुई से पहले माउस जाग ।
  4. तुरंत facemask निकालें और सुनिश्चित करें कि माउस पूरी तरह से जाग और कम बेहोशी के बाद गतिशील है । ट्रेसर 15 मिनट के लिए प्रसारित करने दें ।
  5. चरण ५.१ के साथ आगे बढ़ें ।

5. चूहों का छिड़काव

  1. के लिए vivo पारगम्यता आकलन में:
    1. गहरी isoflurane बेहोशी उत्प्रेरण द्वारा फ्लोरोसेंट अनुरेखक इंजेक्शन के बाद प्रक्रिया 15 मिनट शुरू करते हैं । चूहों में गहरी संवेदनाहरण पैदा करने के लिए ऑक्सीजन में isoflurane के २.३% का उपयोग करें । anस्थेसिया की गहराई ंयायाधीश के लिए पंजा वापसी पलटा का प्रयोग करें (उंगलियों के बीच त्वचा चुटकी; आकोचन की कमी एक पर्याप्त गहराई इंगित करता है), और दोनों forelimb और eae के अधीन चूहों में हिंदलिंब की सजगता की जांच ।
    2. अपनी पीठ पर माउस ठीक करें और इथेनॉल के साथ पेट स्प्रे । एक कैंची का उपयोग कर छाती खोलें और डायाफ्राम को हटा दें । एक कैंची का उपयोग कर धड़क रहा है दिल की सही atrium खोलें और pbs के 10 मिलीलीटर 4% पीएफएस के 10 मिलीलीटर के साथ दिल के बाएं वेंट्रिकले के माध्यम से माउस शवद ।
      चेतावनी: पीएफए inhaling से बचने के लिए, एक धूआं हुड में माउस शवद ।
    3. धारा 6 पर आगे बढ़ें ।
  2. के लिए स्वस्थानी zymography में:
    1. गहरी isoflurane संवेदनाहरण प्रेरित EAE से पीड़ित एक चूहे में ऑक्सीजन में २.३% isoflurane का उपयोग कर, और कदम में के रूप में बेहोशी की गहराई की जांच करें 5.1.1 ।
    2. अगले, अपनी पीठ पर माउस को ठीक करने और इथेनॉल के साथ पेट स्प्रे । एक कैंची का उपयोग कर छाती खोलें और डायाफ्राम को हटा दें । एक कैंची का उपयोग कर दिल की धड़कन का सही atrium खोलें और pbs के 20 मिलीलीटर के साथ दिल की बाईं वेंट्रिकले के माध्यम से माउस शवद ।
    3. धारा 6 पर आगे बढ़ें ।

6. विच्छेदन और दिमाग की ठंड

  1. शीतलन स्नान की तैयारी:
    1. कुचल सूखी बर्फ के साथ एक फ्लैट देवर कंटेनर भरें और 2-methylbutane (आइसोफेंटा) जब तक तरल सूखी बर्फ पैक के ऊपर के बारे में 1 सेमी तक पहुंचता है । एक ढीला ढक्कन के साथ कवर-उदाहरण के लिए, एक बर्फ बाल्टी कवर ।
  2. तेज कैंची के साथ perfused माउस के सिर बंद क्लिप और कैंची के एक छोटे सेट का उपयोग कर त्वचा और कान को हटा दें ।
  3. ध्यान से बाईं और दाईं ओर पर सामने की ओर रंध्र मैग्नम से काटने के लिए मस्तिष्क पर skullcap का इजाफा करने की अनुमति skullcap विच्छेदन । फिर, ध्यान से बाहर खोपड़ी के आधार से बरकरार मस्तिष्क लिफ्ट जबकि ऑप्टिकल एक फ्लैट धातु spatula का उपयोग कर नसों विच्छेद ।
  4. एल्यूमीनियम पंनी पर जगह मस्तिष्क और तीन टुकड़ों में मस्तिष्क में कटौती (ललाट मस्तिष्क, मध्य मस्तिष्क, और सेरिबैलम + मस्तिष्क स्टेम) दो कोरोनल कटौती रखकर ।
  5. भरें एक cryomold (25 मिमी x 20 मिमी x 5 मिमी) इष्टतम तापमान काटने के साथ पहली तिमाही के लिए (O.C.T.) मैट्रिक्स, जगह मस्तिष्क स्लाइस cryomold में नीचे का सामना करना पड़ प्रत्येक मस्तिष्क टुकड़ा के पूर्वकाल के साथ, और कवर ऊतक पूरी तरह से O.C.T. मैट्रिक्स के साथ.
  6. 2 में एक क्षैतिज अभिविन्यास में ऊतक के साथ cryomold प्लेस-Methylbutane स्नान और सुनिश्चित करें कि ऊतक स्नान में पूरे ऊतक ब्लॉक सूई से बचने के द्वारा 1 मिनट के भीतर शीर्ष करने के लिए नीचे से जमा देता है.
  7. भंडारण के लिए जमे हुए ऊतक-८० डिग्री सेल्सियस स्थानांतरण और धारा 7 के साथ आगे बढ़ना ।

7. जमे हुए ऊतक वर्गों की तैयारी

  1. जमे हुए ऊतक से-८० ° c-20 ° c के लिए cryostat में 30 मिनट के लिए Equilibrate तापमान ।
  2. cryomold से ऊतक ब्लॉक निकालें और cryostat ऊतक धारक पर माउंट (सेट करने के लिए-15 डिग्री सेल्सियस) O.C.T. मैट्रिक्स का उपयोग.
  3. एक तेज स्केलपेल के साथ cryostat के धारक पर ऊतक ब्लॉक के किनारों ट्रिम कर दीजिए, और ऊतक दिखाई दे रहा है जब तक cryostat चाकू के साथ 20 μm वर्गों को हटाने के द्वारा ऊतक ब्लॉक में काटने शुरू करते हैं ।
  4. vivo BBB पारगम्यता में के विश्लेषण के लिए:
    1. कट 6-10 μm ऊतक वर्गों, उंहें आसंजन ग्लास स्लाइड पर ले लीजिए, और तुरंत एक आवरण एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग पर्ची के साथ कवर वर्गों छवि ।
    2. मस्तिष्क में रक्त वाहिकाओं की उपस्थिति का आकलन करें (टपका हुआ रक्त वाहिकाओं के लिए मनाया प्रतिदीप्ति प्रतिरूपों की तुलना में गैर-टपका हुआ रक्त वाहिकाओं की तेज सीमाओं पर ध्यान देना). सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, अनुरेखक के रिसाव की पुष्टि करने के लिए परिधि अंगों या रंजित जाल जो एक bbb की कमी के स्ट्रोमा में ।
  5. के लिए स्वस्थानी zymography में:
    1. एक cryostat का उपयोग कर 6 μm ऊतक वर्गों में कटौती, आसंजन कांच स्लाइड पर उन्हें इकट्ठा, और ढक्कन में सिलिका जेल युक्त एक ठंड बॉक्स में-20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज ऊतक वर्गों ।

8. सीटू zymography में laminin के साथ संयुक्त/CD45 इम्यूनोफ्लोरेसेंस अभिरंजक

  1. समाधान तैयार करें:
    1. एंबेडिंग समाधान तैयार करें:
      1. मिश्रण 6 जी ग्लिसरॉल (विश्लेषणात्मक ग्रेड), पाली के २.४ जी (vinyl शराब), ddH2O के 6 मिलीलीटर, और ०.२ मीटर Tris बफर, 8 पीएच के 12 मिलीलीटर, और हलचल (चुंबकीय विलोडक) RT पर 4 एच के लिए समाधान ।
      2. एक ५० मिलीलीटर सेंट्रीफ्यूज ट्यूब के लिए समाधान हस्तांतरण और इसे आर टी पर 2 एच के लिए आराम करो । बाद में 10 मिनट के लिए ५० डिग्री सेल्सियस (पानी स्नान) और सेंट्रीफ्यूज पर 20 मिनट के लिए समाधान सेते २,७०० एक्स जी में कमरे के तापमान पर ।
      3. -20 डिग्री सेल्सियस पर aliquots में supernatant और फ्रीज ले लो ।
    2. शीत जिलेटिन समाधान तैयार करें:
      1. ddH2O के 10 मिलीलीटर में गोजातीय त्वचा से ठंड जिलेटिन की ०.१ जी भंग ।
      2. इसे कम से 1 दिन के लिए भिगो दें और 4 ° c पर aliquots स्टोर करें ।
    3. आइस-कोल्ड मेथनॉल (-20 डिग्री सेल्सियस) तैयार करें:
      1. एक coplin जार में १००% मेथनॉल रखो और नीचे-20 डिग्री सेल्सियस शांत ।
    4. 10% सोडियम ऐज़ाइड स्टॉक समाधान तैयार करें:
      1. ddH2O के 10 मिलीलीटर और कमरे के तापमान पर स्टोर करने के लिए सोडियम ऐज़ाइड की 1 जी जोड़ें ।
    5. तैयार ०.१% सोडियम ऐज़ाइड काम कर समाधान:
      1. 10% सोडियम ऐज़ाइड स्टॉक समाधान के 1 μl के साथ ddH2O μl मिश्रण ९९ ।
    6. भंग 1 मिलीग्राम fluorescein संयुग्मित डाई-बुझते (dq) के 1 मिलीलीटर में सुअर त्वचा से जिलेटिन सोडियम ऐज़ाइड काम कर समाधान और स्टोर १०० μl aliquots 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रकाश से सुरक्षित ।
    7. 30 मिलीग्राम 1, 10-इथेनॉल के ७६ μL में और-20 डिग्री सेल्सियस में phenanthroline मोनोहाइड्रेट को भंग ।
    8. 25x protease अवरोध करनेवाला समाधान तैयार:
      1. ddH2O के 2 मिलीलीटर के लिए EDTA मुक्त protease अवरोध करनेवाला की 1 गोली जोड़ें । -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
    9. बस उपयोग से पहले, प्रतिक्रिया समाधान तैयार (१५० μL/खंड):
      1. सेंट्रीफ्यूज 1 मिलीग्राम/एमएल DQ जिलेटिन समाधान के लिए 5 मिनट में १३,३०० एक्स जी.
      2. मिक्स १२७.२ μL of ddH2O, 10x रिएक्शन बफर के 15 μL (Gelatinase/कोलेजीनेस परख किट; सामग्री की तालिकादेखें), 20 मिलीग्राम की ०.३ μl/मिलीलीटर ठंडा जिलेटिन, १.५ μl 1 मिलीग्राम/मिलीलीटर dq जिलेटिन, और 25x protease अवरोध करनेवाला समाधान के 6 μl ।
    10. बस का उपयोग करने से पहले, phenantroline नकारात्मक नियंत्रण प्रतिक्रिया समाधान तैयार (१५० μL/खंड):
      1. ddH2O का मिश्रण १२५.२ μl, 10x रिएक्शन बफर के 15 μl, 20 मिलीग्राम/मिलीलीटर ठंड जिलेटिन की, १.५ μl की 1 मिलीग्राम/मिलीलीटर dq जिलेटिन, 25x protease अवरोध करनेवाला edta मुक्त के 6 μl, और 2 एम 1, 10-phenantroline (एमएमपी संदमक) के 2 μl.
    11. बस का उपयोग करने से पहले, ठंड जिलेटिन (गैर फ्लोरोसेंट) नकारात्मक नियंत्रण प्रतिक्रिया समाधान तैयार (१५० μL/
      1. मिक्स १२८.७ μL of ddH2O, 10x रिएक्शन बफर के 15 μL, 20 मिलीग्राम की ०.३ μL/मिलीलीटर ठंडा जिलेटिन, और EDTA के 6 μL-मुक्त 25x protease अवरोध करनेवाला ।
    12. counterstaining के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी कॉकटेल तैयार, उदाहरण के लिए, ०.९५ μg/मिलीलीटर polyclonal खरगोश विरोधी laminin एंटीबॉडी और 10 μg/मिलीलीटर polyclonal चूहा विरोधी CD45 एंटीबॉडी pbs में 1% bsa में, और उचित समप्ररूप नियंत्रण प्राथमिक एंटीबॉडी कॉकटेल तैयार ।
    13. माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान तैयार, उदाहरण के लिए, PBS में 1% BSA में ७.५ μg/mL Cy3 बकरी विरोधी चूहा + 15 μg/मिलीलीटर AMCA विरोधी खरगोश (प्रकाश से रक्षा) ।
  2. पिघलना 6 μm गैर-फिक्स्ड मस्तिष्क ऊतक वर्गों के अंदर EAE चूहों से प्लास्टिक ठंड एक धूआं हुड में ढक्कन में सिलिका जेल से बचने के लिए ऊतक और एक स्लाइड पर अलग 2 ऊतक वर्गों के लिए पानी की अवधारण से बचें एक पानी repelling कलम के साथ लाइनों ड्राइंग द्वारा
  3. प्रतिक्रिया समाधान तैयार (कदम 8.1.9-8.1.11), कमरे के तापमान पर १३,४०० एक्स जी पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज, और पूर्व गर्म ३७ डिग्री सेल्सियस एक पानी स्नान का उपयोग करने के लिए ।
  4. 1 एक्स रिएक्शन बफर का उपयोग कर ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ऊतक वर्गों Rehydrate । फिर, बंद 1x प्रतिक्रिया बफर डालो, ऊतक वर्गों पर प्रतिक्रिया समाधान जोड़ने के लिए, और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 4 एच के लिए सेते । ddH2O में 5 बार स्लाइड धो लें ।
  5. -20 डिग्री सेल्सियस पर आइस-कोल्ड मेथनॉल के साथ 5 मिनट के लिए वर्गों को ठीक करें और बाद में कमरे के तापमान पर पीबीएस के साथ एक बार वर्गों को धोएं ।
  6. वर्गों के लिए पीबीएस में 1% BSA जोड़ें और कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए सेते (प्रकाश से रक्षा) । फिर, ऊतक पर स्लाइड flipping द्वारा वर्गों से PBS में 1% BSA त्यागें, प्राथमिक एंटीबॉडी कॉकटेल जोड़ने के लिए, और कमरे के तापमान पर 1 एच के लिए सेते (प्रकाश से रक्षा).
  7. धो वर्गों दो बार PBS के साथ, माध्यमिक एंटीबॉडी कॉकटेल जोड़ने के लिए, और कमरे के तापमान पर 1 ज के लिए सेते (प्रकाश से रक्षा) ।
  8. धो वर्गों दो बार PBS के साथ, एम्बेड समाधान के साथ स्लाइड माउंट, कमरे के तापमान (प्रकाश से रक्षा) पर रात में बढ़ वर्गों सूखी चलो । अंत में, एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग दाग ऊतक वर्गों का विश्लेषण ।

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Representative Results

C57BL/6 चूहों में EAE के नैदानिक पाठ्यक्रम का मूल्यांकन एक रोग वक्र में परिणाम के रूप में चित्रा 2A में चित्रित किया है और माउस शरीर के वजन में परिवर्तन के रूप में चित्रा 2aमें प्रस्तुत करना चाहिए । C57BL/6 चूहों के साथ प्रतिरक्षित MOGaa35-55 आम तौर पर सक्रिय प्रतिरक्षण के बाद दिन 10-12 के आसपास रोग लक्षण विकसित करने के लिए शुरू (चित्रा 1a). आमतौर पर, प्रतिरक्षित चूहों शरीर के वजन की एक क्षणिक बूंद पायस के इंजेक्शन और काली खांसी विष की पहली खुराक के बाद दिन दिखा (चित्र 1b). 2 दिन से EAE प्रेरण के बाद, रोगप्रतिरक्षण चूहों के शरीर के वजन तो धीरे-से रोग शुरू होता है जब तक बढ़ जाती है, जब शरीर के वजन आमतौर पर नैदानिक लक्षणों के विकास के लिए एक दिन पहले बूंदें और वृद्धि करने के लिए सहसंबद्ध कमी जारी रोग लक्षण (चित्र 1a,B) । EAE रोग गंभीरता रोग के शिखर तक बढ़ जाती है, जो EAE प्रेरण के बाद 16 और 20 दिनों के बीच की उम्मीद कर सकते हैं (चित्रा 2A). नैदानिक EAE के चरम पर, चूहों भी सबसे कम शरीर के वजन को दिखाने (चित्रा 2B), जो रोग के छूट चरण में eae के सुधार के संबंध में बढ़ जाती है (चित्रा 2b,बी). EAE प्रेरण C57BL/6 चूहों में MOGaa35-55 का उपयोग कर एक जीर्ण रोग विकृति में परिणाम, और चूहों आमतौर पर पूरी तरह से ठीक नहीं है (चित्रा 1a).

चित्रा 3a एक C57BL/6 eae से पीड़ित है कि नसों में फ्लोरोसेंट 3 केडीए dextran (लाल) और 10 केडीए dextran (हरा) 15 मिनट के त्याग से पहले के साथ इंजेक्शन था के एक प्रतिनिधि तस्वीर से पता चलता है रंजित जाल और आसन्न मस्तिष्क पैरेन्काइमा ; स्केल बार ५० μm । जैसा कि हम पहले का प्रदर्शन किया है, tracers तुरंत रंजित जाल के स्टोमा केर में गवाक्षित microvessels भर में फैलाना (बाएं और मध्य चित्र), जबकि bbb मस्तिष्क पैरेन्काइमा में परिसंचारी के प्रसार की अनुमति नहीं देता है, संकेत दिया धराशायी लाइन (सही चित्र) है, जो इस प्रकार किसी भी फ्लोरोसेंट संकेत से रहित है । चित्रा 3b एक C57BL के सेरिबैलम में प्रतिनिधि टपका हुआ रक्त वाहिकाओं से पता चलता है/6 eae से पीड़ित है कि नसों के साथ प्रतिदीप्त 3 केडीए dextran (लाल) और 10 केडीए dextran (हरा) 15 मिनट के त्याग से पहले इंजेक्शन था । तीर सिर संकेत tracers cns पैरेन्काइमा में मस्तिष्क microvessels में विसरित (बाएं और मध्य चित्र), सुझाव है कि bbb समारोह इन जहाजों में बिगड़ा हुआ है । सीएनएस पैरेन्काइमा में, हरे और लाल फ्लोरोसेंट संकेत रक्त वाहिका दीवारों के बाहर दिखाई देता है, जो डैश्ड लाइनों द्वारा दर्शाई जाती हैं । eae में, सेरिबैलम में जहां भड़काऊ कफ दिखाई tracers भी endothelial तहखाने झिल्ली और glia के बीच परिसंवहनी अंतरिक्ष में पाया जा सकता है endothelial bbb अखंडता के कार्यात्मक नुकसान का संकेत है । यदि अनुरेखक मस्तिष्क पैरेन्काइमा में फैलाना पाया जाता है, यह glial बाधा12की अतिरिक्त शिथिलता से पता चलता है.

चित्रा 4 एक C57BL के eae मस्तिष्क में gelatinase (एमएमपी) गतिविधि के विश्लेषण के प्रतिनिधि चित्रों से पता चलता है और स्वस्थानी zymography में द्वारा कल्पना माउस और विरोधी पैन-laminin (नीला) द्वारा विशिष्ट मस्तिष्क बाधा डिब्बों के लिए स्थानीयकृत और की उपस्थिति के लिए विरोधी CD45 (लाल) इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला द्वारा भड़काऊ कोशिकाओं । डाई-बुझते (DQ) जिलेटिन के प्रोटिओलाइटिक दरार एक fluorescein संकेत है, जो ऊतक खंड पर gelatinase गतिविधि के स्थानीयकरण की अनुमति देता है । जब ठंड जिलेटिन (गैर फ्लोरोसेंट नियंत्रण), कोई हरी फ्लोरोसेंट संकेत EAE चूहों (ऊपरी पंक्ति) से मस्तिष्क वर्गों में पता लगाया जा सकता है के रूप में अच्छी तरह के रूप में वर्गों है कि DQ के साथ किया गया है-जिलेटिन phenantroline के साथ संयुक्त, एक शक्तिशाली Zn +- कंपैक्सिंग एजेंट और MMP अवरोध करनेवाला (मध्य पंक्ति) । निचले पंक्ति में, फोकल जिलेटिनेज/एमएमपी गतिविधि ठेठ दानेदार उज्ज्वल हरी प्रतिदीप्ति संकेत के रूप में दिखाई दे रहा है, के रूप में ऐरोहेड द्वारा प्रकाश डाला । एक eae माउस के सेरिबैलम में भड़काऊ कफ में, विशिष्ट mmp गतिविधि भड़काऊ सेल घुसपैठ (लाल) की साइटों पर glia लिमिटेंस (नीला) से परे होता है ।

Figure 1
चित्रा 1 : EAE प्रेरण के लिए इंजेक्शन साइटों की चित्रमय प्रतिनिधित्व । 1) सही पार्श्व में 30 μl MOG-पायस के लिए इंजेक्शन साइट, 2) बाएं पार्श्व में 30 μL MOG-पायस के लिए इंजेक्शन साइट, 3) 20 μL mog-पायस के लिए बाईं पूंछ रूट में इंजेक्शन साइट, 4) 30 μL MOG-पायस के लिए सही पूंछ रूट में इंजेक्शन साइट , 5) गर्दन में MOG-पायस की थोड़ी छोटी बूंद के लिए इंजेक्शन साइट । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2 : EAE के प्रतिनिधि पाठ्यक्रम । () C57BL/6 चूहों में ईएई के रोग लक्षण समय के साथ । माध्य +/-SEM दिखाया गया है । () ईएई के दौरान शरीर के वजन में समय के साथ परिवर्तन । माध्य +/-SEM दिखाया गया है ।  कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3 : vivo पारगम्यता में के प्रतिनिधि चित्र । () वाम चित्र: हरी फ्लोरोसेंट 10 केडीए dextran रंजित जाल के स्तर पर । मध्य चित्र: लाल फ्लोरोसेंट 3 केडीए dextran रंजित जाल के स्तर पर । सही तस्वीर: बाईं और मध्य चित्रों का विलय । स्केल पट्टी ५० μm. () वाम चित्र: हरी फ्लोरोसेंट 10 केडीए dextran में माउस cerebellum । मध्य चित्र: लाल फ्लोरोसेंट माउस cerebellum में 3 केडीए dextran । सही तस्वीर: बाईं और मध्य चित्रों का विलय । डैश्ड रेखाएं रक्त वाहिका दीवारों के लिए संकेत कर रहे हैं; तीर सिर CNS पैरेन्काइमा में फ्लोरोसेंट ट्रेसर को इंगित करते हैं । स्केल बार १०० μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

Figure 4
चित्रा 4 : स्वस्थानी zymography में के प्रतिनिधि चित्र । पहला कॉलम: ग्रीन फ्लोरोसेंट चैनल (डाई-बुझते (DQ) जिलेटिन का अबुझते संकेत) । दूसरा कॉलम: ब्लू फ्लोरोसेंट चैनल (laminin) । तीसरा कॉलम: लाल फ्लोरोसेंट चैनल (CD45) । चौथा कॉलम: फ्लोरोसेंट चैनलों का विलय । ऊपरी पंक्ति: कोल्ड जिलेटिन (नॉन फ्लोरोसेंट) नकारात्मक नियंत्रण । मध्य पंक्ति: phenantroline (एमएमपी-अवरोध करनेवाला) नकारात्मक नियंत्रण. सबसे कम पंक्ति: DQ जिलेटिन । स्केल बार १०० μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

0 से 3 पॉइंट स्कोर मापदंड वजन में परिवर्तन
0 कोई संकेत नहीं सामान्य भार
~ कमजोर पूंछ (कमजोर tonus)-इनहाउस मानदंड: दस्तावेज स्कोरिंग में शामिल नहीं वजन घटाने (2 जांच के लिए संकेत)
०.५ लंगड़ा पूंछ (टेल ड्रॉप्स) वजन घटाने
1 हिंदलेग कमजोरी, अस्थिर चाल (चूहा एक बतख की तरह बेंच पर चलता है) वजन घटाने
2 हिंदलेग पैरालेजिआ (माउस अपने हिंदअंग नहीं चलता है) गंभीर वजन घटाने (2 जांच के लिए संकेत)
3 हिंदलेग पैरालेजिआ, कम शरीर नियंत्रण के असंयम नुकसान (एक तरफ माउस गिर जाता है, लेकिन ist frontlegs का उपयोग कर पिंजरे में स्थानांतरित कर सकते हैं + असंयम; मरणासन्न) बहुत कम शरीर के वजन (2 जांच के लिए संकेत)

तालिका 1: EAE रोग गंभीरता के आकलन के लिए स्कोरिंग मापदंड ।

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Discussion

यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करने के लिए प्रेरित और EAE की निगरानी में महिला C57BL/ महिलाओं को प्राथमिकता से चुना जाता है, और वहां महिला की एक घटना है: 3:1 के पुरुषों में MS । EAE की गंभीरता का आकलन करने के लिए, हम एक 3 सूत्री स्कोरिंग शीट का उपयोग किया । EAE गंभीरता आम तौर पर मोटर dysfunctions की गंभीरता के संबंध में बनाए गए है । EAE के उन्नत चरणों के साथ चूहों, यानी 2 से ऊपर एक स्कोर का प्रदर्शन जानवरों की अनावश्यक पीड़ा से बचने के लिए बलिदान किया जाना चाहिए. इस प्रकार, यह लगभग दो बार दैनिक के रूप में प्रोटोकॉल में समझाया जैसे करीब अंतराल पर चूहों स्कोर करने के लिए सिफारिश की है.  वहाँ कई स्कोरिंग दिनचर्या कार्यरत हैं, 0-3 अंक से 0-6 अंक16,17,18,19 या और भी अधिक उपअंक20तक पहुँचने. हालांकि, हम पहले से पता चला है कि माना जाता है कि परिष्कृत EAE स्कोरिंग संभावित सांख्यिकीय महत्वपूर्ण मतभेदों को समूहों के बीच रोग स्कोर में निर्धारित करने में कोई सुधार करने के लिए नेतृत्व नहीं करता है, जब समग्र रोग गंभीरता15विचार । इस प्रेक्षण के आधार पर हमने 3-सूत्री पैमाने का प्रयोग किया है ताकि चूहों को संभालने के समय को कम करने के लिए ईएई में रोग की प्रगति का आकलन हो सके और इस प्रकार, 3R नियमों को लागू करने के लिए परेशानी का पता लगाया जा सके । एक और महत्वपूर्ण बात EAE मॉडल का उपयोग कर नॉकआउट और जंगली प्रकार चूहों या उपचार समूहों के बीच मतभेदों के बीच मतभेदों का अध्ययन करने के लिए एक सटीक प्रयोगात्मक योजना स्थापित कर रहा है । जब जंगली प्रकार चूहों पीटकर चूहों की तुलना में कर रहे हैं, यह विषम से उत्पन्न होने वाले लिटमेट्स की तुलना करने के लिए आवश्यक है विषमयुग्मज matings के समान आनुवंशिक पृष्ठभूमि सुनिश्चित करने के लिए जंगली प्रकार और पीटकर चूहों EAE प्रयोग की तुलना में. यह भी एक प्रयोग में शामिल सभी चूहों के लिए एक ही स्थिति रखने के लिए महत्वपूर्ण है, जैसे पिंजरे परिवर्तन, गीला भोजन के प्रशासन, और विशेष रूप से माउस आवास (स्वास्थ्य राज्य) की स्थिति. आदेश में पिंजरे से बचने के लिए विशिष्ट जांचकर्ता द्वारा प्रेरित घटना, पार प्रतिरक्षण किया जाना चाहिए । अधिक ठीक है, अगर एक से अधिक सिरिंज चूहों की एक निश्चित संख्या में प्रतिरक्षण करने की जरूरत है, वे बेतरतीब ढंग से इस्तेमाल किया अलग सिरिंज को सौंपा जाना चाहिए. इसी तरह उपचार अध्ययन के प्रदर्शन के लिए लागू किया जाना चाहिए । अंतिम लेकिन कम नहीं, विभिंन पशु सुविधाओं में स्थित चूहों की स्वास्थ्य स्थिति रोग की घटनाओं और गंभीरता पर प्रभाव हो सकता है और इस प्रकार अधिक21 या कम माइकोबैक्टीरियम तपेदिक22 एक उचित नैदानिक प्रेरित करने के लिए आवश्यक हो सकता है रोग. इसके अलावा, इंजेक्शन की साइट रोग के विकास पर प्रभाव हो सकता है । इस प्रोटोकॉल में हम पांच अलग चमड़े के नीचे साइटों में अपेक्षाकृत छोटे संस्करणों सुई का प्रस्ताव: दो flanks में 30 μL, बाएं और दाएं पूंछ जड़ में 20 μL, और गर्दन में थोड़ा छोटी बूंद । अन्य प्रोटोकॉल्स में, ५० μL डिपुओं को केवल23 या चार flanks21में पूंछ रूट में उपचर्म दिया गया है । छोटे डिपो के इंजेक्शन, तथापि, त्वचा जलन, जो चूहों को खरोंच करने की कोशिश कर सकते है के कारण के जोखिम को कम ।

vivo पारगम्यता में EAE के दौरान BBB रिसाव का आकलन करने के लिए किया जा सकता है लेकिन यह भी आकलन है कि क्या एक अणु या vivo में BBB अखंडता पर एक दवा उपचार प्रभावों के विशिष्ट आनुवंशिक विलोपन । यह या तो इस तरह के igg जमा12 या बहिर्जात है कि एक जीवित माउस24के संचलन में लागू कर रहे है समाधियों के रूप में अंतर्जात प्लाज्मा tracers का पता लगाने के द्वारा किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल में हम दो अलग बहिर्जात tracers का उपयोग किया (3 केडीए और 10 केडीए dextran) कि एक साथ इंजेक्शन थे और 15 मिनट के एक निर्धारित समय के लिए प्रसारित करने की अनुमति दी । विभिंन आकारों के साथ दो tracers का उपयोग bbb की गंभीरता का निर्धारण करने के लिए अनुमति देता है शिथिलता और करने के लिए एक कटऑफ परिभाषित करने के लिए अनुरेखक आकार कि फैलाना या नहीं BBB भर की अनुमति हो सकती है. फ्लोरोसेंट dextrans अच्छा पानी घुलनशीलता, कम विषाक्तता, और अपेक्षाकृत कम immunogenicity द्वारा विशेषता हाइड्रोफिलिक पॉलीसैकेराइड हैं । इसके अलावा, dextrans पाली से बना रहे हैं-(α-D-1, 6 ग्लूकोज), जो अंतर्जात सेलुलर ग्लाइकोसिसेस द्वारा दरार के लिए प्रतिरोधी रहे हैं । यहां हम dextran वेरिएंट है कि lysine dextran संयुग्मी में शामिल अवशेष है इस्तेमाल किया । Lysinated dextrans एल्डिहाइड fixable, जो ऊतक में अनुरेखक को ठीक करने की अनुमति देता है । इसके अलावा प्रतिदीप्ति dextrans लेबल, अंय रसायनों vivo पारगम्यता में आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जैसे, इवान नीले, जो सीरम एल्ब्युम के लिए एक बड़े हिस्से को बांधता के साथ संयोजन में Hoechst डाई । hoechst दाग bbb endothelial सेल नाभिक अस्तर सीएनएस microvessels, और इवान ब्लू पर पेरिसंवहनी अंतरिक्ष में पता लगाया जा सकता है bbb शिथिलता और diffuses आगे जब glia लिमिटेंस25,26परेशान है । इसके विपरीत, vivo पारगम्यता में अंतर्जात मार्करों के immunofluorescent धुंधला द्वारा आकलन के संचय में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है, जैसे, IgG अणुओं या fibrinogen, एक ग्लाइकोप्रोटीन है कि रक्त में प्रसारित, समय के साथ. स्वस्थ परिस्थितियों में, परिसंवहनी अंतरिक्ष बहुत संकीर्ण है और endothelial तहखाने झिल्ली और glia लिमिटेंस बारीकी से जुड़े हुए हैं और, इस प्रकार, NVU के दो ECM बाधाओं visualizing की आवश्यकता है laminin आइसोफार्म विशिष्ट एंटीबॉडी धुंधला27 .

अंतर्जात IgG अणुओं स्वास्थ्य और रोग के दौरान रक्त वाहिकाओं के अंदर और साथ ही परिसंलयी अंगों के ऊतकों में मौजूद हैं, जहां कोई BBB12की स्थापना की है । मस्तिष्क बाधा दोषों के साथ जीन संशोधित चूहों में, दवा उपचार के दौरान, या neuroinflammation अंतर्जात अणुओं है कि आम तौर पर रक्त में प्रसारित cns पैरेन्काइमा में जमा किया जा सकता है, जो विरोधी laminin के साथ counterstaining द्वारा कल्पना किया जा सकता है एंटीबॉडी या तो सभी laminin आइसोफ़ॉर्म (पैन-laminin एंटीबॉडी) या laminin आइसोफार्म विशिष्ट एंटीबॉडी laminin अंतर करने के लिए अनुमति पहचानने, laminin α 4 और α 5 endothelial तहखाने झिल्ली से और laminin α 1 और laminin से α 2 glia लिमितानों. neuroinflammatory स्थितियों के दौरान परिसंवहनी अंतरिक्ष घुसपैठ प्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा चौड़ा किया जा सकता है दोनों की पहचान करने की अनुमति, endothelial तहखाने झिल्ली और glia एक पैन-laminin एंटीबॉडी का उपयोग कर लिमिटेंस । nvu में मौजूद laminins के counterstaining का आकलन करने की अनुमति देता है कि क्या अंतर्जात लेकिन यह भी बहिर्जात tracers सीएनएस पैरेन्काइमा में जमा हो जाती है और CD45 के counterstaining का आकलन है कि bbb के फोकल रिसाव प्रतिरक्षा सेल के साथ जुड़ा हुआ है की अनुमति देता है घुसपैठ.

सीएनएस पैरेन्काइमा में प्रतिरक्षा सेल माइग्रेशन NVU के भीतर दो अलग बाधाओं के क्रमिक पार की आवश्यकता है, endothelial BBB, और बाद में glia लिमिटेंस28। glia लिमिटेंस पार और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के सीएनएस प्रविष्टि नैदानिक EAE की शुरुआत के साथ संबंधित है29, जबकि cns लेप्रोमेनिंगीय और परिसंवहनी रिक्त स्थान में फंस कोशिकाओं घुसपैठ नैदानिक eae ट्रिगर नहीं है । प्रतिरक्षा सेल तलघर झिल्ली के बीच लेप्टोमेनिगेरियल और पेरिवैस्कुलर रिक्त स्थान में फँसाने कई जीन संशोधित माउस मॉडल में देखा गया है उदा. L-selectin पीटकर चूहों30, tnf पीटकर चूहों23, MMP2/MMP9 डबल नॉकआउट चूहों10 , और जाम-बी पीटकर चूहों को12. इन निष्कर्षों को रेखांकित करना है कि इन अणुओं की कमी BBB भर में प्रतिरक्षा सेल प्रवास को प्रभावित नहीं करता है बल्कि glia लिमिटेंस भर में, कि आणविक BBB और glia लिमिटेंस भर में प्रतिरक्षा सेल प्रवास mediating तंत्र underस्कोरिंग कर रहे है अलग. स्वस्थानी जाइमोग्राफी में मस्तिष्क सीएनएस विकृति के लिए सटीक स्थानिक सहसंबंध में एक ऊतक अनुभाग में फोकल gelatinase गतिविधि के लिए जांच करने के लिए एक पद्धति है । MMP2/MMP9 गतिविधि का पता लगाने के लिए स्वस्थानी zymography में प्रदर्शन के साथ vivo BBB पारगम्यता में की पहचान इस प्रकार प्रतिरक्षा सेल घुसपैठ के संबंध में endothelial बनाम glia बाधा अशांति चित्रित करने के लिए अनुमति देता है । पैन के साथ संयुक्त-laminin और eae मस्तिष्क वर्गों पर CD45 इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला, यह एक ही समय में unquenching dq-जिलेटिन और घुसपैठ प्रतिरक्षा कोशिकाओं के स्थानीयकरण द्वारा gelatinase गतिविधि के दोनों स्थानीयकरण की अनुमति देता है । एक ठेठ दानेदार उज्ज्वल हरी प्रतिदीप्ति संकेत में fluorescein से फ्लोरेसइन-जिलेटिन परिणाम, जबकि ऊतक वर्गों पर बद dimly हरी फ्लोरोसेंट क्षेत्रों अविशिष्ट संकेत12के रूप में माना जाना है । इस प्रकार, ऊतक वर्गों और उचित नियंत्रण का सावधानी से मूल्यांकन अपरिहार्य जब स्वस्थानी zymography में प्रदर्शन कर रहे हैं । इस प्रोटोकॉल में, हम CD45 और laminin धुंधला के साथ संयोजन में सीटू zymography में प्रदर्शन किया । CD45 और laminin दोनों के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी एक ही समय में एक मिश्रण के रूप में इनयूबेटेड थे । इसी प्रकार, द्वितीयक एंटीबॉडी को एक दूसरे अभिरंजक चरण में मिश्रण के रूप में इनयूबेटेड किया गया था । एंटीबॉडी के इस तरह के संयोजन के लिए यह सुनिश्चित करने के परीक्षण की जरूरत है कि दूसरे चरण एंटीबॉडी अंय IgGs के खिलाफ अवशोषित कर रहे है ताकि पार से बचने के लिए जेट ।

एक साथ लिया, प्रोटोकॉल प्रस्तुत यहां उपकरण प्रदान करने के लिए विस्तार से जांच करने के लिए जो NVU के तत्व EAE के neuroinflammatory परिस्थितियों में बिगड़ा हुआ है । बहिर्जात tracers द्वारा vivo पारगम्यता मूल्यांकन में माइक्रोवाहिकीय endothelial सेल अखंडता या nvu के वर्तमान हानि की वर्तमान हानि की पहचान करने के लिए अनुमति देता है । इसके अलावा, विभिंन आकारों के साथ tracers की शुरूआत BBB हानि की गंभीरता का अनुमान करने के लिए सक्षम बनाता है । सीटू में अतिरिक्त zymography astrocytes और संभावित भड़काऊ कोशिकाओं, जो CNS पैरेन्काइमा10तक पहुँच प्राप्त करने से पहले एक अंतिम बाधा के रूप में glia लिमिटेंस उल्लंघन करने की जरूरत है में फोकल जिलेटीनेज गतिविधि uncovers.

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Disclosures

हितों का टकराव नहीं घोषित ।

Acknowledgments

हम कृतज्ञता स्वीकार Lydia सोरोकिन, जो अपने मूल स्वस्थानी zymography प्रोटोकॉल10 में हमारे साथ साझा किया गया है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AMCA anti-rabbit antibody Jackson ImmunoResearch 111-156-045 Store at 4 °C; protect from light
Anti-CD45 Antibody (30F11) Pharmingen 07-1401 Store at 4 °C
Anti-Laminin Antibody DAKO Z0097 Store at 4 °C
Breeding food e.g. PROVIMI KLIBA SA 3336
Individually ventilated cages, Blue line Type II or III e.g. Tecniplast 1145T, 1285L
BSA fraction V Applichem A1391 Store at 4 °C
Cold gelatine Sigma-Aldrich G 9391
Coplin jar + rack e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG H554.1; H552.1
Cy3 anti-rat antibody Jackson ImmunoResearch 111-156-144 Store at 4 °C; protect from light
Cover slips 24 x 40 mm # 1 e.g. Thermo Scientific 85-0186-00
Dextran Alexa Fluor 488 (10,000 MW) e.g. Molecular probes D22910 Store at -20 °C; protect from light
Dextran Texas Red (3000 MW) Invitrogen D3328 Store at -20 °C; protect from light
EnzChek Gelatinase/Collagenase Assay Kit  Thermo Fisher Scientific; EnzCheck E12055 Store at -20 °C; protect form light
Female C57BL/6J mice (8-12 weeks) e.g. Janvier Labs Females, 8-12 weeks
Freezing box for histology slides e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG 2285.1
18G x 1½’’ (1.2mm x 40mm) injection needle e.g. BD, BD Microlance 3 304622
27G x ¾’’ – Nr. 20 (0.4mm x 19mm) injection needle e.g. BD, BD Microlance 3 302200
30G x ½’’ (0.3 mm x 13 mm) injection needle e.g. BD, BD Microlance 3 304000
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) e.g. Santa Cruz Biotechnology sc-24648 Store at 4°C
Maintenance food e.g. PROVIMI KLIBA SA 3436
MOGaa35-55 peptide e.g. GenScript Store at -80 °C
microscope slides (Superfrost Plus ) Thermo Scientific J1800AMNZ
Mycobacterium tuberculosis H37RA e.g. BD 231141 Store at 4 °C 
NaCl 0.9 % B. Braun 3535789
O.C.T. compound (Tissue-Tek ) Sakura 4583
Omnican 50 30G x ½’’ B. Braun 9151125S
Paraformaldehyde Merck 30525-89-4
Pertussis toxin e.g. List biological laboratories, Inc. 180 Store at 4 °C
poly(vinyl alcohole) (Mowiol 4-88) Sigma-Aldrich 81381
Protease Inhibitor EDTA free (Roche) Sigma-Aldrich 4693132001 Store at 4 °C
repelling pen e.g. DAKO Pen e.g. DAKO S2002
sealing film e.g. Parafilm M e.g Sigma-Aldrich P7793
Silica gel e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG 9351.1
Stitch scissor F.S.T 15012-12
syringe 1 ml e.g. PRIMO 62.1002
syringe 10 ml e.g. CODAN Medical ApS 2022-05
vaporizer system Univentor 400 UNO.BV

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References

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वीवो में प्रयोगात्मक Autoimmune Encephalomyelitis के दौरान न्यूरोवैस्कुलर यूनिट के Endothelial और Glial बाधाओं के Visualizing हानि
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Tietz, S. M., Engelhardt, B. Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo. J. Vis. Exp. (145), e59249, doi:10.3791/59249 (2019).

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