Summary
生体内で実験的自己免疫性脳脊髄炎時単位の障害を調査するためのプロトコルを紹介します。具体的にはグリア limitans にわたってゼラチナーゼ活性の白血球の遊走に関与する血液-脳関門の透過性を確認する方法に取り組みます。
Abstract
単位 (NVU) は血液-脳関門 (BBB) 埋め込みペリサイトの内皮の基底膜を形成微小血管内皮細胞で構成され、グリア limitans 実質の基底膜とアストロ サイトの構成エンドフィード中枢神経系 (CNS) 微小血管の abluminal 側面を採用します。中枢神経系を維持するために加えて、NVU の恒常性は、免疫細胞が中枢神経系に人身売買を制御します。食餌中枢神経系の中に活性化リンパ球の数が少ないは BBB の機能不全や臨床疾患を引き起こすことがなく内皮の障壁を越えることができます。対照的に、多発性硬化症の動物モデルとしてなど neuroinflammation 中実験的自己免疫性脳脊髄炎 (EAE) の免疫細胞の数が多いことが出来る BBB とその後中枢神経系柔に最終的に到達するグリア細胞 limitans臨床病気に 。 中枢神経系細胞に免疫細胞の移動、異なる分子メカニズムを用いる NVU の内皮細胞およびグリア細胞の境界を越えたシーケンシャル移行は、2 段階のプロセスです。内皮バリアを越えた次の通路、T 細胞が発生するローカル再活動開始以降機構 gelatinases の焦点の活性化につながる血管抗原提示細胞上の同種抗原をグリアの関門を通過して中枢神経系実質 T 細胞になります。したがって、BBB 透過性と EAE の中に中枢神経系の免疫細胞集積に対する空間相関の MMP 活性の両方を評価する、NVU の内皮細胞およびグリアの障壁の完全性の損失を指定することができます。 能動免疫による c57bl/6 マウスに惹起を誘導する方法、およびその後 BBB 透過性外因性蛍光トレーサーの組み合わせを使用して体内を分析する方法を示します。我々 はさらに表示、視覚化および原 zymogaphy BBB 基底膜と CD45 + 侵略免疫細胞の免疫蛍光染色に結合によって EAE 脳中のゼラチナーゼ活性をローカライズする方法。
Introduction
中枢神経系 (CNS) は、すべてのボディおよび脊椎動物、精神機能を調整し、恒常性中枢神経系は神経細胞の適切なコミュニケーションのために不可欠。中枢神経系の恒常性は、血流の変化の環境から中枢神経系を保護する神経血管ユニット (NVU) によって保証されます。NVU は、ユニークな生化学的、連続クロストーク ペリサイト, アストロ サイト, ニューロン, と細胞外マトリックス (ECM) の血液脳関門 (BBB) を確立、中枢神経系血管内皮細胞ので構成されます 2 つの確立異なる基底膜1。内皮細胞基底膜 abluminal BBB 内皮細胞においてペリサイトの高番号を隠し持ってし、ラミニン α4 とラミニン α 5、に加えて他の ECM 蛋白質2で構成されて、ensheathes。対照的に、実質の基底膜はラミニン α 1 とラミニン α 2 から成り、アストロ サイト終わり足に包まれています。アストロ サイトのエンド フィートと共に実質の基底膜は、いっぱい脳脊髄血管周囲またはくも膜下スペース3から中枢神経系の神経ネットワークを分離するグリア細胞 limitans を作成します。人身売買の中枢神経系に免疫細胞は、末梢組織に免疫細胞で 2 段階のプロセスが必要とする、まず違反内皮 BBB とその後にグリア細胞 limitans とは異なる、NVU のユニークなアーキテクチャにより中枢神経系細胞に達する。
多発性硬化症 (MS) は中枢神経系、免疫細胞の数が多いが中枢神経系に入力し、neuroinflammation、脱髄、BBB 整合性4の焦点の損失を引き起こすの一般的なアミロイド疾患です。ガドリニウム コントラスト強化磁気共鳴画像 (MRI)5によって可視化として中枢神経系病変の存在によって示されるように、BBB の整合性の損失は MS の初期の特徴です。後毛細管小静脈; のレベルで中枢神経系に白血球の血管外漏出が発生しますただし、BBB 基底膜およびその後グリアのバリア間で免疫細胞漏出に関与する正確なメカニズムは、探検するために残ります。実験的自己免疫性脳脊髄炎 (EAE) MS の動物モデルとして機能し、MS の病因について私達の現在の知識に大きく貢献しています。例えば、EAE モデルを使用して発見されている最初のキャプチャを含むマルチ ステップ プロセスで白血球の血管外漏出が発生して注目していると P セレクチン糖タンパク質リガンド (PSGL)-1 などの粘液のような分子を介するローリング ステップインテグリン依存型会社逮捕と漏出6の寛容な側面に BBB 内皮細胞の T 細胞のクロールの順。
T 細胞は、血管内皮の BBB と内皮の基底膜に交差している、彼らの同種抗原マクロファージや樹状細胞が髄膜や血管周囲のスペースで戦略的にローカライズに遭遇する必要があります。この相互作用は、炎症性メディエーターの焦点生産グリア limitans7,8,9を介して免疫細胞の中枢神経系組織への浸潤のため後続のメカニズムに必要なトリガーを誘導します。マトリックスメタロプロテアーゼ (MMP)-2 および mmp-9 活性化焦点ケモカイン活性化を変更し、免疫の前提条件であるアストロ サイトの終わり足細胞外マトリックス受容体の分解を誘導する全体にグリア細胞 limitans 細胞移動、細胞、中枢神経系の実質および EAE10,11の臨床症状の発症を誘発します。
中枢神経系ティッシュ セクションの漏れとゼラチナーゼ活性 CNS BBB と免疫細胞の浸潤の検出を組み合わせた neuroinflammation のコンテキストで内皮細胞およびグリア細胞のバリアの機能の整合性に関する貴重な情報を提供します。例えば、最近調べた内皮タイト結合分子接合部接着分子 (ジャム) の構成の損失-EAE のコンテキストで人身売買、中枢神経系には免疫細胞の B。健康の野生型 c57bl/6 マウスと比較して、健康的なジャム B 欠乏同腹子を示さなかった BBB 整合性の減損内因性と外因性トレーサー12を使用して体内の透水性評価が示すように。EAE のコンテキストでジャム B 欠乏 c57bl/6 マウスは炎症細胞髄膜と血管周囲のスペース12トラップに関連付けられていた改善病気の徴候を示した。この現象を確認する適用の in situザイモグラフィー ジャム B 欠損マウス中のゼラチナーゼ活性の欠如が突破することが免疫細胞の数が減少する可能性がある場合をテストするためにゼラチナーゼ活性の同定を可能、グリア limitans12。
可用性を与え異なる遺伝子組み換えマウスのモデル、例えば、BBB 機能の変化を引き起こす可能性があります別の BBB タイト結合分子を欠けている BBB の整合性を調査するための方法論は、重要。さらに、新しく開発された薬 NVU 障壁に影響を与える可能性があります。ミエリン オリゴデンドロ サイト糖タンパク質 (モグ) による能動免疫による c57bl/6 マウスに惹起を誘導する方法を紹介-ペプチド aa35-55 Freund 完全アジュバントで。我々 は、外因性トレーサーとゼラチナーゼ活性の in situ 検出による内皮細胞およびグリア細胞の体内バリアの整合性をそれぞれ勉強の仕方、NVU の内皮細胞およびグリアの垣根を越えて免疫細胞浸潤をローカライズする方法を説明します。
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Protocol
すべての研究は動物の保護に関するスイスの法律によるとガイドラインの下で実施し、ベルン、スイスのカントンの獣医のオフィスによって承認された (許可番号: 31/17 そしてある 77/18)。
1. 特定病原体無料 (SPF) 条件の c57bl/6 マウスの住宅
- 12/12 h 光暗い個別換気ケージの家マウスのサイクルします。広告 libidum を水し、食糧を提供します。マウスの微生物学的品質を監督するには、実験的コホートは、次の FELASA の推奨事項13汚いベッド歩哨によって四半期モニタリングを施行した.
- 個別にマーク 8-12 週齢女性 c57bl/6 マウスに耳パンチを使用します。
2. c57bl/6 マウスの免疫
- ソリューション14の準備:
- Freund 完全アジュバント (CFA) のミックス 120 mg の新鮮な pestled の熱の不完全な Freund のアジェバントの 30 mL は、ヒューム フードの下で結核 (菌 H37RA) を不活化。4 ° C で原液を保存します。
- MOGaa35-55-ペプチド原液滅菌 PBS (4 mg/mL) で MOGaa35-55-ペプチドを溶解、-80 ° C で保存
- モグ エマルジョンを準備します。
- 1:2 とモグ ペプチド原液 2 mL マイクロ チューブに CFA を希釈します。
- フィルム シールで、チューブをシール、粘着テープでチューブを完全に覆うことによって渦のミキサーに修正します。4 ° C で 4 時間の渦乳剤
- 安定したエマルションと注射器を準備します。
- したマイクロ チューブを取るし、すぐに小さなテーブルの遠心分離機を用いたエマルション スピンダウンします。1 × 18 ' (1.2 mm × 40 mm) 注射針を用いた注射器にエマルジョンを収集します。
- マウスの数によると注射器 (100 μ L/マウス) エマルジョン音量を調整し、¾ × 27 ' (0.4 mm × 19 mm) 注射針 18 G 針を置き換えます。フィルム シールのついた注射器に接続されている注射針をシールします。
- 百日咳毒素 (PTx) 原液を 500 μ L の滅菌 PBS で凍結乾燥 PTx の 50 μ g 解散 (100 ng/μ L)。4 ° C で原液を保存します。
- PTx 作業ソリューション (腹腔内注射使用 ½ × 30 ' (0.3 mm × 13 mm) 針) のマウスあたり PTx 原液 (300 ng/100 μ L) の 3 μ L で 97 μ L の滅菌 PBS を混在させます。
- EAE 誘導
- C57bl/6 マウスを麻酔気化器システムを使用する isofluorane とします。マウスの麻酔、2.1 %isofluorane とフェイス マスクにマウスを転送する前に小さな培養室の酸素の 4.5 %isofluorane にマウスを公開します。マウスの低体温症を防ぐために加熱パッドが装備可能麻酔ユニットを使用します。
- 1 つの手で麻酔下マウスを修正し、まず後ろ足側面に皮下 MOG35 55 CFA エマルジョンの 30 μ L を注入 (図 1:1 + 2; 合計 60 μ L; 左フランク 30 μ L と右脇腹 30 μ L) 鼠径リンパ節に近くで。
- その腹の上にマウスを置くし、尾ルートで左と右の柔らかい脂肪組織に MOGaa35 55 CFA エマルジョンの 20 μ L を注入 (図 1:3 + 4; 合計 40 μ L; 左側尾ルート 20 μ L と右側テール ルート 20 μ L) と MOGaa35 55 CFA エマルジョン int の小さな液滴o マウスの首 (図 1: 5)。
- PTx 溶液 100 μ L をマウス腹腔内注入します。腸注入を避け体中央下マウスの頭を保持します。
- メンテナンスの食事を置き換える (押し出し大栄養素: 18.5% の粗蛋白質粗脂肪 4.5% 粗繊維 4.5%; 粗灰分 6.5%; 澱粉 35%; 代謝エネルギー: 13.1 MJ/kg) 食事飼育する (押し出し大栄養素: 粗蛋白質 23.5% 粗脂肪 5.5%; 粗繊維 3%;粗灰分 5.7%;澱粉 36%;代謝エネルギー: 14.3 MJ/kg) 前に期待される臨床疾患中に高エネルギーの内容の食物と一緒にマウスを提供するために。
- フェイス マスクを削除し、マウスを地球温暖化パッドとそのホームのケージに転送します。マウスが 10 分後に完全に目を覚まし、運動であることを確認します。
- PTx 注入 (2.2.4) 48 h 最初の治療後を繰り返します。
3. 得点 EAE マウスの
- みると、ケージの中で毎朝 EAE マウスの健康状態を確認します。
- 毎日午後には EAE マウスをスコアします。
- 尾は指で上方へ移動することによって緊張を持つかどうかケージとチェック アウト EAE 実験に含まれるすべての個々 のマウスを取る。健康なマウスの尾についていく (尾は、緊張を持っている)。臨床 EAE 始まりましたが、下、尾の漸進的な低下によって目に見える尾緊張になります。最終的にマウスはしっぽをすべて解除することができません。
- EAE 実験ではクリーン ベンチ内で含まれているすべての個々 のマウスを置きますと観察し、歩行動作を文書化します。病気の重症度の評価の採点基準表 115を参照してください (EAE スコア)。
- 評価実験に含まれているすべてのマウスの体重を文書化します。
- 臨床 EAE を表示するマウスで十分な食糧や水の摂取量を確保するため 1 のスコア ケージの底のプラスチック皿で湿らせた食品を供給しを毎日更新します。
4. 体内透過性アッセイ
- ソリューションの準備:
- デキストラン溶液、10 kDa デキストラン Alexa Fluor 488 として 3 kDa デキストラン テキサス赤 0.9% 塩化ナトリウム溶液 (20 mg/mL) 500 μ L での 10 mg を解散します。
- デキストラン作業ソリューションだけ 10 kDa デキストラン Alexa Fluor 488 のインジェクション ピペット 55 μ L 前に在庫ソリューション (20 mg/mL) フィルム シールの部分にし 3 kDa デキストラン テキサス赤原液 (20 mg/mL) の 55 μ L を追加します。ミックス (最終濃度 2 mg/100 μ L) 細かいシリンジに 100 μ L を収集しています。
- 10% ホルムアルデヒド (PFA) 原液、きれいなガラス ビーカー、マグネチックスターラー; を使用して攪拌下で正確に 56 ° C まで熱 1N NaOH の 200 μ L、100 mL の PBS、余分な純粋な粉体 PFA の 10 g を組み合わせてください。PFA を完全に溶解するまで 30 分 56 ° C で維持します。部屋の温度に冷却します。7.4; に pH を合わせなさいペーパー フィルターをフィルター処理します。-20 ° C でのストアPBS を使用するさらに原液を希釈することができます。
- まもなく健康 c57bl/6 マウスまたは苦しんで EAE イソフルラン (マウスは約 1 分の鎮静されます) を c57bl/6 マウスを麻酔します。ステップ 2.2.1 (マウスを 4.5% イソフルラン誘導チャンバー内酸素にさらされる、2.1% イソフルランとフェイス マスクに転送されますが) のように自動化されたシステムを使用します。
- テーブルの上の側臥位、静脈麻酔下のマウスを置く (例えばレトロ軌道) マウスが目覚める前にマウスに 100 μ L の蛍光トレーサーを注入します。
- すぐに、フェイス マスクを削除し、マウスが完全に目を覚まし、運動性短い麻酔後かどうかを確認します。15 分間循環トレーサーをしましょう。
- 5.1 手順に進みます。
5. マウスの灌流
-
体内透過性評価。
- 深いイソフルラン麻酔を誘導することによって蛍光トレーサー投与後 15 分の手順を開始します。誘導するには、マウスに深い麻酔は酸素のイソフルランの 2.3% を使用します。足引っ込め反射を利用して麻酔の深さを判断する (足の指の間の皮膚をつまんで; 屈曲の十分な深さを示す)、前肢と後肢 EAE マウスでの反射を調べる。
- その裏にマウスを修正し、エタノールと腹をスプレーします。ハサミを使用して胸部を開き横隔膜を削除します。ハサミを使用して心臓の右心房を開くし、10 mL の PBS の 4 %10 mL に続いて、心臓の左心室を通してマウスを灌流 PBS で PFA。
注意: PFA を吸い込むことを避けるため、マウスの発煙のフードを灌流します。 - セクション 6 に進んでください。
-
その場でザイモグラフィー: の
- EAE、苦しんでマウスの酸素の 2.3% イソフルランを使用して深いイソフルラン麻酔ステップ 5.1.1 のように麻酔の深さを確認してください。
- 次に、その裏にマウスを修正し、エタノールと腹をスプレーします。ハサミを使用して胸部を開き横隔膜を削除します。ハサミを使用して心臓の右心房を開き、20 ml の PBS の心臓の左心室を通してマウスを灌流します。
- セクション 6 に進んでください。
6. 解剖と脳の凍結
- 寒剤の準備:
- 砕いたドライアイスでフラット デュワー容器を満たし、液体ドライアイス パックの上約 1 cm に達するまで 2 methylbutane (イソペンタン) を追加します。カバーします緩いふた-例えば、アイスバ ケット カバー。
- 鋭いハサミで灌流のマウスの頭をクリップ、皮膚と耳はさみの小さいセットを使用して取り外します。
- 慎重に左および脳の upfold のスカル キャップできるように右側に前方後頭から切り出して、タツナミソウを解剖します。その後、慎重に持ち上げて頭蓋底からそのまま脳平らな金属のヘラを使用して光学神経を切断しながら。
- アルミ箔に脳を置き、2 つのコロナ カットを配置することで 3 個 (前頭葉脳、中間脳や小脳 + 脳幹) の脳をカットします。
- 最適温度切断 (O.C.T.) 行列で第 1 四半期に cryomold (25 mm × 20 × 5 mm) を埋める、個々 の脳の cryomold に下向きの前面側の脳のスライスを配置し、O.C.T. マトリックスを完全に組織を被覆します。
- 2 Methylbutane 風呂に水平方向に組織と cryomold を配置、組織フリーズ下部から上部に 1 分以内で全体組織ブロックをお風呂に浸漬を避けることによってかどうかを確認します。
- ストレージ-80 ° C まで凍結するティッシュを転送し、セクション 7 に進みます。
7. 凍結するティッシュ セクションの準備
- -20 ° c で 30 分用クライオスタット-80 ° C から凍結するティッシュから温度を平衡します。
- Cryomold と (-15 ° C に設定) クライオスタット ティッシュ ホルダーにマウントから組織ブロックを削除 O.C.T. 行列を用いたします。
- 鋭いメスのクライオスタットのホルダーにティッシュのブロックのエッジをトリムし、組織が表示されるまでに、クライオスタット ナイフで 20 μ m のセクションを削除することによって組織のブロックに切断を開始します。
-
生体内での BBB 透過性の分析。
- 6-10 μ m の切片を切り取り接着ガラス スライドにそれらを収集し、蛍光顕微鏡を用いたカバー スリップで覆われたセクションをすぐにイメージします。
- (非漏出血管漏出血管の観察される蛍光パターンの拡散と比較しての境界線をシャープに注意を払う) 脳内血管の外観を評価します。肯定的な制御として脳室周囲器官または、BBB が無い脈絡叢の間質にトレーサーの漏れを確認します。
-
その場でザイモグラフィー: の
- クライオスタットを用いた 6 μ m の切片を切るスライド ガラス接着、それらを収集し、凍結するティッシュ セクションで蓋にシリカゲルを含む凍結ボックス-20 ° C。
8 しますその場でザイモグラフィーはラミニン/CD45 蛍光染色と組み合わせて。
- ソリューションを準備します。
- 埋め込みソリューションを準備します。
- 0.2 M Tris バッファーは、pH 8、12 mL、6 mL ddH2O、ポリ (ビニル アルコール) の 2.4 g グリセロール (分析グレード) の 6 g を混合し、室温 (マグネチックスターラー) 4 h のためのソリューションをかき混ぜる
- 50 mL の遠心管に溶液を移し、室温 2 時間休ませてくださいその後 50 ° C (水槽) で 10 分のためのソリューションと室温で 2,700 × g で 20 分間遠心を孵化させなさい。
- 上清をとり因数-20 ° C で凍結
- 冷たいゼラチン溶液を準備します。
- 10 ml ddH2O の牛の皮膚から冷たいゼラチンの 0.1 g を溶解します。
- それは少なくとも 1 日浸し、4 ° C で因数を格納
- 冷たいメタノール (-20 ° C) を準備します。
- Coplin jar に 100% メタノールを入れ、-20 ° C まで冷却
- 10% アジ化ナトリウム ストック溶液を準備します。
- DdH2O の 10 mL に 1 g のアジ化ナトリウムを追加し、常温で保存します。
- 0.1% アジ化ナトリウム作業溶液を準備します。
- ミックス 99年 μ L の ddH2O の 10% アジ化ナトリウム ストック溶液 1 μ L で。
- 1 mg を 1 ml ソリューションとストアの 100 μ 因数 4 ° C で光から保護を作業のアジ化ナトリウムの豚皮から共役フルオレセイン色素焼 (DQ) ゼラチンを溶かす
- エタノール、-20 ° C でストアの 76 μ L で 1, 10-フェナントロリン一水和物の 30 mg を溶解します。
- 25 x プロテアーゼ阻害剤のソリューションを準備します。
- 2 mL ddH2O に EDTA 無料プロテアーゼ阻害剤 1 錠を追加します。-20 ° C にてストア
- 使用する直前には、反応液 (150 μ L/セクション) を準備します。
- 13,300 × gで 5 分間 1 mg/mL DQ ゼラチン溶液を遠心します。
- プロテアーゼ阻害剤ソリューション x 25 の 6 μ L、1 mg/mL DQ ゼラチン 1.5 μ 20 mg/mL 冷たいゼラチンの 0.3 μ L 反応バッファー (ゼラチナーゼ/コラゲナーゼ アッセイ キット; 参照テーブルの材料) x 10 の 15 μ L ddH2O のミックス 127.2 μ L。
- 使用する直前フェナントロリン ネガティブ コントロール反応液 (150 μ L/セクション) を準備します。
- 2 M 1, 10-フェナントロリン (MMP 阻害剤) の 2 μ、15 μ L 反応バッファー、プロテアーゼ阻害剤 EDTA 無料、25 の 6 μ L、1 mg/mL DQ ゼラチン 1.5 μ 20 mg/mL 冷たいゼラチンの 0.3 μ L x 10 の ddH2O のミックス 125.2 μ L。
- 使用前にだけ冷たいゼラチン (非蛍光性) のネガティブ コントロール反応溶液 (150 μ L/セクション) を準備します。
- 6 μ L EDTA 無料 25 x プロテアーゼ阻害剤の 20 mg/mL 冷たいゼラチンの 0.3 μ、15 μ L 反応バッファー x 10 の ddH2O のミックス 128.7 μ L。
- 一次抗体 counterstaining、例えばのためのカクテル、0.95 μ G/ml ポリクローナルウサギ抗ラミニンおよび 1 %bsa を PBS で 10 μ G/ml ラット ポリクローナル抗 CD45 抗体を準備し、一次抗体カクテル適切なアイソタイプ コントロールを準備します。
- 準備の二次抗体の解決、例えば、7.5 μ g/mL Cy3 ヤギ抗ラット + 15 μ G/ml で PBS で 1 %bsa マルチカウンタオートマタ抗家兎 (光から保護する)。
- 埋め込みソリューションを準備します。
- EAE マウス組織への水の滞留を避けるために、ペンをはじく水で線を描画することによって 1 つのスライド上の 2 の組織切片を別々 の発煙のフードで蓋にシリカゲルを含むプラスチック製の冷凍ボックスの中から 6 μ m 脳の非固定ティッシュ セクションを解凍します。
- 反応液 (手順 8.1.9-8.1.11) を用意し、部屋の温度、37 ° c 水のお風呂を使用して前の暖かい 13,400 x gで 5 分間遠心。
- 1 x 反応バッファーを使用して 37 ° C で 5 分間ティッシュ セクションを水分補給します。その後、反応バッファー x 1 を注ぐ, 切片中の反応液を追加して、37 ° C で 4 時間インキュベートDdH2O の 5 回スライドを洗ってください。
- -20 ° C で氷冷メタノールで 5 分間のセクションを修正し、その後室温で PBS で一度セクションを洗ってください。
- PBS で 1 %bsa をセクションに追加し、室温で 20 分間インキュベート (光から保護する)。一次抗体カクテルを追加セクションから PBS で 1 %bsa を破棄し、組織上のスライドを反転して、室温で 1 時間インキュベート (光から保護する)。
- PBS で 2 回のセクションを洗う、二次抗体カクテルを追加し、室温で 1 時間インキュベート (光から保護する)。
- セクション PBS で 2 回洗って、埋め込みソリューションのスライドをマウント、マウントされたセクション室温で一晩乾燥 (光から保護する)。最後に、蛍光顕微鏡を用いた染色組織切片を分析します。
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Representative Results
C57bl/6 マウス EAE の臨床研修の評価は、図 2 aおよび図 2 bに示されるように、マウスの体重の変化で表した病曲線の結果必要があります。通常 MOGaa35 55 で免疫した c57bl/6 マウスは、能動免疫 (図 1 a) 後病の症状は 1 日 10-12 の周りを開発し始めます。通常、免疫マウスは体重の一時的なドロップの乳剤の注入と百日咳毒素 (図 1 b) の最初の投与後の日を表示します。EAE 誘導後、2 日から、免疫マウスの体重徐々 に病開始まで体重通常臨床症状発症前に一日をしましたが、増加に減少が続いている、病の症状 (図 1 a,B)。EAE の疾患の重症度は、16 と EAE 誘導 (図 2 a) 後 20 日間が期待できる病気のピークまで増加します。臨床 EAE のピーク、マウスも EAE の投与で改善する病気 (図 2 a、B) の相関関係を増加させる最低体重 (図 2 b) を示します。C57bl/6 マウス慢性疾患の病理とマウス MOGaa35 55 結果を通常使用で EAE 誘導 (図 1 a) が完全に復元されません。
図 3 aは、脈絡叢の代表的な画像とを犠牲にする前に蛍光灯 3 kDa デキストラン (赤) と 10 kDa デキストラン (グリーン) 15 分静脈内注入された EAE 苦しんで c57bl/6 マウスの隣接する脳実質を示しています;バーの 50 μ m スケールします。以前を実証してきた、脈絡叢 (左と中央写真) のストーマに有窓血管の間で容易に拡散トレーサー、BBB は脳実質にトレーサーの拡散を許可しません示されました。破線 (写真右) である従って蛍光信号を欠いています。図 3 bを犠牲にする前に蛍光灯 3 kDa デキストラン (赤) と 10 kDa デキストラン (グリーン) 15 分静脈内注入された EAE 苦しんで c57bl/6 マウスの小脳で代表的な漏出血管を示しています。矢印の頭を示すトレーサー CNS 柔 (左と中央写真) に脳微小血管にわたって拡散これらの血管に BBB の機能が損なわれることを示唆しています。CNS 実質緑と赤の蛍光信号が破線で示されますが、血管の壁の外に表示されます。EAE, で小脳の炎症性の袖口がトレーサーを表示もあります血管内皮の基底膜内皮の BBB の整合性の機能喪失を示すグリア limitans 間隔で。トレーサーが脳実質内に拡散させる場合、グリア バリア12の追加機能障害を示しています。
図 4原ザイモグラフィーによって可視化し、抗汎ラミニン (青) との存在する特定の脳バリア コンパートメントにローカライズした c57bl/6 マウスの脳内 EAE ゼラチナーゼ (MMP) 活動の分析の代表的な写真を示しています。抗 CD45 (赤) 蛍光染色による炎症性細胞。染料焼 (DQ) ゼラチンの蛋白質分解開裂は、組織切片のゼラチナーゼ活性の局在化を可能にする蛍光信号を unquenches します。EAE マウス (上段) から脳のセクションでだけでなく、DQ ゼラチンで培養されているセクションで蛍光シグナルを検出できるグリーン冷たいゼラチン (非蛍光性制御) が抱卵するときフェナントロリン、強力な Zn + に統合-錯化剤と MMP 阻害剤 (中段)。下段、焦点ゼラチナーゼ/MMP 活動が矢印で強調表示された典型的な粒状明るい緑色蛍光信号として表示されます。EAE マウスの小脳の炎症性カフスで特定の白血球遊走に炎症細胞浸潤 (赤) のサイトで (青) グリア limitans を超えて発生します。
図 1: EAE 誘導のために注入サイトのグラフィカルな表現です。1) 注射部位 30 μ L の右脇腹にモグ エマルジョン、30 μ L の 2) 注射部位左のわき腹にモグ エマルジョン、20 μ L の 3) 注射部位左尾ルートにモグ エマルジョン、30 μ L の 4) 注射部位右尾ルートにモグ乳剤、少し首にモグ エマルジョン液滴の 5) 注射部位。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: EAE の代表的なコースです。(A) 時間をかけて c57bl/6 マウスの EAE の病気の症状。SEM の +/-平均が表示されます。(B) 時間をかけて EAE 中体重の変更。SEM の +/-平均が表示されます。 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 体内透過性の代表的な写真です。(A) 左画像: 緑の脈絡叢のレベルで蛍光 10 kDa デキストラン。真ん中の写真: 赤の蛍光 3 kDa デキストラン脈絡叢のレベルで。右の画像: 左と中央の写真のマージします。スケール バー 50 μ m (B) 左の画像: 緑のマウス小脳における蛍光 10 kDa デキストラン。真ん中の写真: マウス小脳赤蛍光 3 kDa デキストラン。右の画像: 左と中央の写真のマージ。破線が血管壁に対して示す矢印は、中枢神経系で蛍光トレーサーをポイントします。スケール バー 100 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4:その場でザイモグラフィーの代表的な写真です。最初の列: 緑蛍光チャネル (染料焼 (DQ) ゼラチンの消されていない信号)。2 列目: 青い蛍光チャネル (ラミニン)。3 列目: 赤蛍光チャネル (CD45)。4 列目: 蛍光チャネルの結合。上段: 冷たいゼラチン (非蛍光性) のネガティブ コントロール。中段: フェナントロリン (MMP 阻害剤) のネガティブ コントロール。下段: DQ ゼラチン。スケール バー 100 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 0 に 3 ポイントのスコア | 基準 | 重量変化 |
| 0 | 兆候 | 通常の体重 |
| ~ | 弱い尾 (弱い tonus) - 社内基準: 文書化されたスコアに含まれていません。 | 体重減少 (第 2 チェックの指標) |
| 0.5 | 尻尾をぐったり(尾低下) | 体重減少 |
| 1 | 後ろ足の弱さ、非定常歩行(マウスはアヒルのようなベンチに歩いていく) | 体重減少 |
| 2 | 後ろ足麻痺(マウスでは、後肢を移動しません) | 重度の体重減少 (第 2 チェックの指標) |
| 3 | 後ろ足の麻痺、失禁低いボディ制御の損失 (1 つにマウス滝側しますが、イスト frontlegs + 失禁; を使用してケージに移動することができます瀕死) | 非常に低体重 (第 2 チェックの指標) |
表 1: 採点 EAE 病気の重症度の評価基準。
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Discussion
ここでは、誘導し、女性の c57bl/6 マウスに惹起を監視するためのプロトコルを提案する.女性が優先的に選択されていると、女性の発症率がある: 3:1 MS での男性。EAE の重症度を評価するために行った 3 点得点シートの使用します。EAE の重大度は、運動機能障害の重症度に関してスコアは一般的にです。マウス先端 EAE の段階、すなわち 2 の上のスコアを示す動物の不必要な苦痛を避けるために犠牲にする必要があります。したがって、それは例えば近い間隔でマウスをスコアに勧めプロトコルで説明したように 1 日 2 回。 いくつかある 0 - 6 ポイント 0-3 からの達し採用ルーチンを得点、16,17,18,19あるいはそれ以上になります20ポイント。しかし、我々 は以前、おそらく洗練された EAE の得点にはつながらない全体的な疾患重症度15を考慮したとき、グループ間病で潜在的な統計的に有意の差を決定する際に任意の改善を示しています。マウスの処理時間を減らすために EAE で病気の進行を評価するために 3 段階の使用し、したがって、3 r 推進ルールを実装するマウスの苦痛を行ったこの観測に基づいています。EAE モデルを使用してノックアウトと野生型マウスの違いや、試験治療グループ間の違いを研究するもう一つの重要なポイントは、正確な実験計画を設定です。野生型マウスのノックアウト マウスに比較すると、比較同腹子ヘテロ接合交配から発信された EAE 実験で比較して野生型およびノックアウト マウスの同一の遺伝的背景を確保するために不可欠です。また、同じ条件の実験、例えばケージの変更、ウェット フードの管理に含まれているすべてのマウスを維持し、特にマウス住宅 (健康状態) することが重要です。捜査官によるケージ固有現象を避けるためにクロス予防接種を行わなければなりません。正確には、1 つ以上の注射器は、マウスの特定の数を接種する必要がある場合彼ら割り当てる必要がありますランダムに別の注射器を使用します。後者同様に適用されるべき治療研究の遂行のため。最後になりましたが、さまざまな動物施設に収容されてマウスの健康状態が発病と重症度に影響を与える、従ってより21または22以下の結核菌は、適切な臨床を誘導するために必要かもしれない病気。さらに、注射部位が発病に影響を与えます。このプロトコルで提案する 5 つの異なる皮下に比較的少量を注入する: 2 つの側面、左および右尾ルートに 20 μ L、首に小さな液滴に 30 μ L。その他のプロトコルで 50 μ L のデポは尾ルートのみ23か 4 側面21に皮下配置されます。小さい倉庫の注射はただし、スクラッチしようとするマウスの皮膚刺激を引き起こすリスクを最小化します。
EAE の中に BBB 漏れを評価する分子や薬物治療の特定の遺伝子欠失体内 BBB の整合性に影響を与えるかどうかを評価するためにも、体内の透水性が実行されます。これは生きているマウス24の循環に適用されますか IgG 預金12などの内因性プラズマ トレーサーの検出によって行われた、または外因性の証跡をすることができます。このプロトコルで行った 2 つ異なる外因性トレーサー (3 kDa と 10 kDa デキストラン) 同時に注入され、BBB の重症度を決定することができます異なるサイズで 2 つのトレーサーを使用して 15 分の定義された時間を循環させての使用機能障害とその拡散トレーサー サイズまたは BBB でないカットオフを定義できるように可能性があります。蛍光 dextrans は良い水容解性、低毒性、によって特徴付けられる親水性の多糖類で、免疫原性は比較的低い。さらに、dextrans から成るポリ-(α-D-1, 6 グルコース)、内因性細胞グリコシダーゼで胸の谷間に対して耐性があります。ここで、デキストラン共役に組み込むリジン残基を持つデキストラン バリアントを使用しました。Lysinated dextrans は、アルデヒド、修正可能な組織内のトレーサーを修正することができます。蛍光に分類された dextrans 以外にも他の化学物質は血清アルブミンに大きい部分をバインドしたエヴァンの青と組み合わせてヘキスト染料などの体内透過性を評価するために使用できます。ヘキスト汚れ BBB 内皮細胞の核が中枢神経系血管のライニングとエヴァンの青 BBB 機能不全時に血管領域で検出することができます、さらに、グリア limitans が邪魔25,26を拡散します。対照的に、内因性マーカーの蛍光抗体染色によって体内の透水性を評価する IgG 分子やフィブリノーゲン、時間をかけて、血液中を循環する糖タンパク質などの蓄積に洞察力を提供します。健康な状態で血管周囲のスペースが非常に狭い血管内皮の基底膜とグリア limitans が密接に接続されているし、したがって、ラミニン アイソ フォーム特異抗体染色27が必要です、NVU の 2 つの ECM 障壁を可視化.
内因性の IgG 分子が BBB に確立された12がない脳室周囲器官のティッシュのように健康と病気だけでなく血管内の中に存在。遺伝子で薬物治療中に脳バリア欠損マウスを変更または通常血液中を循環 neuroinflammation 内因性の分子の中に可能性がありますが抗ラミニンと counterstaining によって可視化することができる中枢神経系の実質に沈着どちらかすべてのラミニン アイソ フォーム (パン ラミニン抗体) やラミニン アイソ フォーム特異的抗体から内皮細胞基底膜とラミニン α 1、グリアからラミニン α 2 laminins、ラミニン α4 および α 5 を区別することができますを認識する抗体limitans。アミロイド条件中に内皮細胞の基底膜とパン ラミニン抗体を用いたグリア細胞 limitans の両方を識別できるように免疫細胞を浸透させることによって血管周囲スペースを拡大可能性があります。Laminins、NVU で現在の counterstaining 内因性かどうかを評価するためがまた CNS 実質で外因性トレーサーを沈殿でき、CD45 の counterstaining BBB の焦点の漏れが免疫細胞に関連付けられているかどうかを評価するために浸透。
中枢神経系細胞に免疫細胞の移動、NVU、内皮 BBB とその後グリア limitans28内にある 2 つの明瞭な障壁のシーケンシャルの横断が必要です。臨床 EAE29の発症と相関するグリア細胞 limitans と中枢神経系の免疫細胞のエントリを横断、中枢神経系、細胞髄膜の中に閉じ込め、血管周囲スペースは臨床 EAE をトリガーしません。免疫細胞基底膜間の髄膜血管周囲スペース トラップで観察されているいくつかの遺伝子改変マウスモデル例えば L-セレクチン ノックアウト マウス30、TNF ノックアウト マウス23MMP2/MMP9 ダブル ノックアウト マウス10とジャム B ノックアウト マウスの12。これらの調査結果アンダー BBB しますが、BBB とグリア limitans 間で免疫細胞の移動を仲介する分子メカニズムを強調するグリア細胞 limitans にではなくこれらの分子の不足が免疫細胞の移動を与えません異なる。ザイモグラフィーその場で脳は中枢神経系の病理学に正確な空間相関の組織切片中の焦点のゼラチナーゼ活性の検討をする手法です。MMP2/MMP9 活性を検出する原ザイモグラフィーを実行するとともに体内の BBB 透過性検出ように記述するグリア細胞障壁の妨害と内皮免疫細胞浸潤との相関で。パン ラミニンと CD45 蛍光 EAE 脳セクションの染色と組み合わせる, unquenching DQ ゼラチンによってゼラチナーゼ活性の局在と同時に免疫細胞を浸潤のローカリゼーションをことができます。DQ ゼラチン、ぼんやり緑色蛍光斑状組織切片には非特異的シグナル12として考慮されなければならない間に典型的な粒状明るい緑色蛍光シグナルの結果からフルオレセインの unquenching。したがって、その場でザイモグラフィーを実行するとき、ティッシュ セクションの適切なコントロールを慎重に評価が不可欠であります。このプロトコルでは CD45 とラミニン染色との組み合わせでその場でザイモグラフィーを行った。CD45 とラミニンに対して一次抗体のミックスとして同時に培養。同様に、二次抗体染色の手順で 2 番目のミックスとして培養。抗体のような組み合わせは、テスト第 2 ステージ抗体が他の Igg に対して交差反応性を避けるために吸収されることを確認する必要があります。
一緒に取られて、ここに示すプロトコルは、NVU の要素は EAE のアミロイド条件で障害者を詳細に調査するためのツールを提供します。外因性トレーサーによる体内透過性評価は、微小血管内皮細胞の整合性の現在の減損または、NVU の現在の減損を識別することができます。さらに、異なるサイズのトレーサーの導入は、BBB 障害の重症度を推定できます。その他原ザイモグラフィー CNS 実質10へのアクセスを取得する前に最後の障壁としてグリア細胞 limitans を突破するために必要な潜在的炎症性細胞とアストロ サイトの焦点のゼラチナーゼ活性の覆いを取る。
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Disclosures
利害の対立が宣言されていません。
Acknowledgments
リディア ・ ソローキン、私たちと彼女オリジナルの in situザイモグラフィー プロトコル10共有者は心より感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AMCA anti-rabbit antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-156-045 | Store at 4 °C; protect from light |
| Anti-CD45 Antibody (30F11) | Pharmingen | 07-1401 | Store at 4 °C |
| Anti-Laminin Antibody | DAKO | Z0097 | Store at 4 °C |
| Breeding food | e.g. PROVIMI KLIBA SA | 3336 | |
| Individually ventilated cages, Blue line Type II or III | e.g. Tecniplast | 1145T, 1285L | |
| BSA fraction V | Applichem | A1391 | Store at 4 °C |
| Cold gelatine | Sigma-Aldrich | G 9391 | |
| Coplin jar + rack | e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG | H554.1; H552.1 | |
| Cy3 anti-rat antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-156-144 | Store at 4 °C; protect from light |
| Cover slips 24 x 40 mm # 1 | e.g. Thermo Scientific | 85-0186-00 | |
| Dextran Alexa Fluor 488 (10,000 MW) | e.g. Molecular probes | D22910 | Store at -20 °C; protect from light |
| Dextran Texas Red (3000 MW) | Invitrogen | D3328 | Store at -20 °C; protect from light |
| EnzChek Gelatinase/Collagenase Assay Kit | Thermo Fisher Scientific; EnzCheck | E12055 | Store at -20 °C; protect form light |
| Female C57BL/6J mice (8-12 weeks) | e.g. Janvier Labs | Females, 8-12 weeks | |
| Freezing box for histology slides | e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG | 2285.1 | |
| 18G x 1½’’ (1.2mm x 40mm) injection needle | e.g. BD, BD Microlance 3 | 304622 | |
| 27G x ¾’’ – Nr. 20 (0.4mm x 19mm) injection needle | e.g. BD, BD Microlance 3 | 302200 | |
| 30G x ½’’ (0.3 mm x 13 mm) injection needle | e.g. BD, BD Microlance 3 | 304000 | |
| Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) | e.g. Santa Cruz Biotechnology | sc-24648 | Store at 4°C |
| Maintenance food | e.g. PROVIMI KLIBA SA | 3436 | |
| MOGaa35-55 peptide | e.g. GenScript | Store at -80 °C | |
| microscope slides (Superfrost Plus ) | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Mycobacterium tuberculosis H37RA | e.g. BD | 231141 | Store at 4 °C |
| NaCl 0.9 % | B. Braun | 3535789 | |
| O.C.T. compound (Tissue-Tek ) | Sakura | 4583 | |
| Omnican 50 30G x ½’’ | B. Braun | 9151125S | |
| Paraformaldehyde | Merck | 30525-89-4 | |
| Pertussis toxin | e.g. List biological laboratories, Inc. | 180 | Store at 4 °C |
| poly(vinyl alcohole) (Mowiol 4-88) | Sigma-Aldrich | 81381 | |
| Protease Inhibitor EDTA free (Roche) | Sigma-Aldrich | 4693132001 | Store at 4 °C |
| repelling pen e.g. DAKO Pen | e.g. DAKO | S2002 | |
| sealing film e.g. Parafilm M | e.g Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Silica gel | e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG | 9351.1 | |
| Stitch scissor | F.S.T | 15012-12 | |
| syringe 1 ml | e.g. PRIMO | 62.1002 | |
| syringe 10 ml | e.g. CODAN Medical ApS | 2022-05 | |
| vaporizer system Univentor 400 | UNO.BV |
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