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Immunology and Infection

Beeinträchtigung der Endothelzellen und glialen Barrieren des Referats neurovaskuläre während experimentelle Autoimmune Enzephalomyelitis In Vivo Visualisierung

doi: 10.3791/59249 Published: March 26, 2019

Summary

Hier präsentieren wir Ihnen Protokolle, um die Beeinträchtigung der neurovaskuläre Einheit während experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis in vivo zu untersuchen. Wir gezielt auf Durchlässigkeit der Blut - Hirn-Schranke und Gelatinase Tätigkeit in Leukozyte Migration über die Glia Limitans ermitteln.

Abstract

Die neurovaskuläre Einheit (NVU) besteht aus mikrovaskuläre Endothelzellen bilden die Blut - Hirn-Schranke (BBB), einer endothelialen Basalmembran mit eingebetteten Perizyten und die Glia Limitans komponiert von parenchymatösen Basalmembran und astrocytic Ende-Feed den abluminalen Aspekt des zentralen Nervensystems (ZNS) Mikrogefäßen umarmen. Neben der Aufrechterhaltung CNS steuert Homöostase der NVU Immunzelle Menschenhandel in das ZNS. Während der Tumorüberwachung des ZNS können niedrige Anzahl von aktivierten Lymphozyten die endotheliale Barriere überqueren, ohne BBB Dysfunktion oder klinische Krankheit zu verursachen. Im Gegensatz dazu kann bei Neuroinflammation wie z. B. Multiple Sklerose oder seine Tiermodell experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) eine große Anzahl von Immunzellen die BBB und anschließend die Glia Limitans erreicht schließlich die CNS Parenchym durchqueren zum klinischen Erkrankung. Immunzelle Migration in das CNS-Parenchym ist somit ein zweistufiger Prozess, der eine sequentielle Migration über die Endothelzellen und glialen Barriere der NVU beschäftigt verschiedene molekulare Mechanismen beinhaltet. Wenn ihre Passage über die endotheliale Barriere, T-Zellen begegnen ihr cognate Antigen auf perivaskuläre Antigen-präsentierenden Zellen ihre lokale Reaktivierung löst weitere Mechanismen, die die fokale Aktivierung des Gelatinases, die die T-Zellen, die Glia-Schranke, und geben die CNS Parenchym ermöglicht. So erlaubt die Bewertung BBB Permeabilität sowohl MMP-Aktivität in räumliche Korrelation zu Immunzelle Akkumulation im ZNS bei EAE Verlust der Integrität der Endothelzellen und glialen Barrieren der NVU angeben. Wir zeigen hier wie induzieren EAE bei C57BL/6 Mäusen durch aktive Immunisierung und anschließend BBB Permeabilität in-vivo mit einer Kombination von exogenen Fluoreszenz Tracer analysieren. Weiter zeigen wir, wie zu visualisieren und Gelatinase Aktivität in EAE Gehirnen von in-situ Zymogaphy gekoppelt an immunofluorescent Färbungen von BBB Keller Membranen und CD45 + eindringenden Immunzellen zu lokalisieren.

Introduction

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Das zentrale Nervensystem (ZNS) koordiniert alle Körper und geistige Funktionen bei Wirbeltieren und CNS Homöostase ist essentiell für eine ordnungsgemäße Kommunikation von Nervenzellen. CNS-Homöostase ist gerechtfertigt durch die neurovaskuläre Einheit (NVU), schützt das ZNS aus dem veränderten Milieu den Blutstrom. Die NVU besteht aus CNS mikrovaskuläre Endothelzellen, die biochemisch einzigartig und die Blut - Hirn-Schranke (BBB) in kontinuierlichen Übersprechen mit Perizyten, Astrozyten und Neuronen Komponenten der extrazellulären Matrix (ECM) zu etablieren, über zwei ausgeprägte Keller Membranen1. Der endothelialen Basalmembran, Ensheathes der abluminalen Aspekt der BBB Endothelzellen birgt eine hohe Anzahl von Perizyten und besteht aus Laminin α4 und Laminin α5, neben anderen ECM-Proteine-2. Im Gegensatz dazu der parenchymatösen Basalmembran besteht aus Laminin α1 und α2 Laminin und ist umgeben von astrocytic Ende-Füße. Die parenchymatösen Basalmembran zusammen mit den Astrozyten Ende-Füßen komponiert die Glia Limitans, die das CNS neuronale Netz aus dem Liquor cerebrospinalis gefüllt perivaskuläre oder Subarachnoidalraum Räume3segregiert. Durch die einzigartige Architektur der NVU unterscheidet sich Immunzellen in das ZNS Menschenhandel aus, dass in peripheren Geweben da es einen zweistufiger Prozess mit den Immunzellen erfordert, zuerst die endotheliale BBB und anschließend die Glia Limitans zur Verletzung Das CNS-Parenchym zu erreichen.

Multiple Sklerose (MS) ist eine häufige schwere Erkrankung des ZNS, in denen eine große Anzahl der zirkulierenden Immunzellen geben Sie die CNS und Neuroinflammation, Demyelinisierung und fokal Verlust von BBB Integrität4verursachen. Verlust der Integrität der BBB ist eine frühe Markenzeichen von MS, wie durch die Anwesenheit von Gadolinium Kontrast Verbesserung der Läsionen im ZNS als visualisierte durch Magnetresonanz-Bildgebung (MRI)5angezeigt. Leukozyte Extravasation in das ZNS tritt auf der Ebene der postcapillary Venolen; Allerdings bleiben die genauen Mechanismen beteiligt Immunzelle Diapedese der BBB Basalmembran und anschließend die glialen Barriere um erkundet zu werden. Experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) dient als Tiermodell für MS und hat maßgeblich zu unserem aktuellen Wissen über die Pathogenese der MS. Zum Beispiel wurde mit dem EAE-Modell entdeckt, dass Leukozyte Extravasation in einem mehrstufigen Prozess erfolgt, wie z. B. eine anfängliche Capture und Rollen Schritt durch Selectins und Mucin-ähnliche Moleküle wie z. B. P-Selektin Glykoprotein Liganden (PSGL) -1 vermittelt, gefolgt von Integrin-abhängige feste Verhaftung und kriechen von T-Zellen auf BBB Endothelzellen zu freizügigen Seiten für Diapedese6.

Wenn T-Zellen die endotheliale BBB und der endothelialen Basalmembran überquert haben, müssen sie ihre cognate Antigen auf Makrophagen oder dendritischen Zellen strategisch lokalisiert in den Leptomeningeal oder perivaskuläre Räumen begegnen. Diese Interaktion induziert Schwerpunkt Produktion von Pro-inflammatorischen Mediatoren diesen Auslöser die folgenden Mechanismen für CNS-Gewebe-Invasion von Immunzellen über die Glia Limitans7,8,9erforderlich. Fokale Aktivierung von Matrix-Metalloproteinasen (MMP) -2 und MMP-9 ändert Chemokin Aktivierung und induziert Abbau der extrazellulären Matrix Rezeptoren auf Astrozyten Ende-Füße, eine Voraussetzung für Immune Zelle Migration über die Glia Limitans in der CNS Parenchym und Beginn der klinischen Symptome von EAE10,11zu induzieren.

Kombiniert Erkennung des ZNS infiltrieren Immunzelle mit BBB liefert Leckage und Gelatinase Tätigkeit in CNS Gewebeschnitten wertvolle Informationen über die Funktionsfähigkeit der Endothelzellen und glialen Barriere im Rahmen des Neuroinflammation. Zum Beispiel haben wir vor kurzem untersucht den konstitutiven Verlust der endothelialen tight Junction Molekül Knoten Adhäsionsmolekül (JAM)-B Menschenhandel Immunzellen in das ZNS im Zusammenhang mit EAE. Im Vergleich zu gesunden Wildtyp C57BL/6 Mäusen, gesunde Marmelade-B-defizienten Wurfgeschwistern zeigte keine Beeinträchtigung der BBB Integrität über endogene als auch exogene Tracer12Durchlässigkeit in-vivo-Tests belegen. Im Rahmen der EAE JAM-B-defizienten C57BL/6 Mäusen zeigte verbesserte Krankheitssymptome, die wurde im Zusammenhang mit entzündlichen Zelle Überfüllung in den Leptomeningeal und perivaskuläre Räume12. Dieses Phänomen untersuchen wir zugewiesen in Situ Zymography zur Identifizierung von Gelatinase Aktivität um zu testen, ob mangelnde Gelatinase Aktivität in den JAM-B-defizienten Mäusen möglicherweise verantwortlich für die reduzierte Zahl der Immunzellen in der Lage zu durchbrechen die Glia Limitans12.

Angesichts der Verfügbarkeit von veränderten verschiedenen gentechnisch Maus Modelle fehlen, z. B. verschiedene BBB tight Junction-Moleküle, die Änderungen in der BBB-Funktion verursachen könnten Methoden für die Untersuchung von BBB Integrität wichtig sind. Darüber hinaus könnte neu entwickelte Medikamente auf NVU Barrieren auswirken. Hier zeigen wir wie bei C57BL/6 Mäusen durch aktive Immunisierung mit Myelin Oligodendrozyt Glykoprotein (MOG) induzieren EAE-Peptid aa35-55 in komplette Freund Adjuvantien. Wir erklären dann wie Immunzelle Infiltration über die NVU Endothelzellen und glialen Barrieren hinweg zu lokalisieren und in-vivo Endothelzellen und glialen Barriereintegrität durch in-situ Detektion von exogenen Tracer und Gelatinase Aktivität, bzw. zu studieren.

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Protocol

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Alle Studien wurden durchgeführt in den Leitlinien nach der schweizerischen Gesetzgebung über den Schutz der Tiere und durch das Veterinäramt des Kantons Bern in der Schweiz angenommen wurden (Erlaubnis Zahlen: BE 31/17 und werden 77/18).

1. Gehäuse von C57BL/6 Mäusen in spezifischen Erreger frei (SPF) Bedingungen

  1. Hausmäuse in einzelnen belüftete Käfige mit einem 12/12 h hell-dunkel-Zyklus. Nahrung und Wasser Ad Libidum. Um mikrobiologische Qualität der Mäuse zu überwachen, wurde die experimentelle Kohorte vierteljährliche Systemüberwachung durch schmutzige Bettwäsche Wächter nach FELASA Empfehlungen13.
  2. Verwendung Ohr Schläge, 8-12 Wochen alten weibliche C57BL/6 Mäusen individuell zu markieren.

2. Immunisierung von Mäusen C57BL/6

  1. Zubereitung von Lösungen14:
    1. Für komplette Freund Adjuvans (CFA), inaktiviert Mischung 30 mL unvollständig Freund-Adjuvans mit 120 mg frisch gestoßenen Hitze Mycobacterium Tuberculosis (H37RA) unter einem Abzug. Shop-Stammlösung bei 4 ° C.
    2. Für die MOGaa35-55-Peptid-Stammlösung MOGaa35-55-Peptid in sterilen PBS (4 mg/mL) auflösen und bei-80 ° c lagern
    3. Bereiten Sie die MOG-Emulsion:
      1. Verdünnen Sie CFA 1:2 mit MOG-Peptid-Stammlösung in ein 2 mL Reaktionscup.
      2. Versiegeln Sie die Reaktionscup mit dichten Film und auf einem Vortex-Mixer komplett bedeckt das Rohr mit Klebeband fixieren. Vortex-Emulsion für 4 h bei 4 ° C.
    4. Bereiten Sie Spritzen mit stabilen Emulsion:
      1. Nehmen Sie die Reaktionscup und schnell spin-down der Emulsion mit einem kleinen Tisch-Zentrifuge. Sammeln Sie Emulsion in eine Spritze mit einer Injektionsnadel 18 x 1½'' (1,2 x 40 mm).
      2. Nach der Anzahl der Mäuse die Emulsion Lautstärke in der Spritze (100 µL/Maus) und ersetzen Sie die 18 G-Nadel mit einer Injektionsnadel 27 x ¾'' (0,4 x 19 mm). Versiegeln Sie die Injektionsnadel befestigt an der Spritze mit Abdichtung Film.
    5. Für die Pertussis-Toxin (PTx)-Stammlösung auflösen 50 µg des lyophilisierten PTx in 500 µL PBS steril (100 ng/µL). Shop-Stammlösung bei 4 ° C.
    6. Mischen Sie für die Arbeitslösung PTx 97 µL steriler PBS mit 3 µL PTx-Stammlösung (300 ng/100 µL) pro Maus (für die intraperitoneale Injektion Verwendung einer 30 x ½'' (0,3 x 13 mm) Nadel).
  2. EAE Induktion
    1. C57BL/6 Mäusen mit Isofluorane mit einem Vaporizer zu betäuben. Anästhesie bei Mäusen zu induzieren, setzen Sie die Maus, um 4,5 % Isofluorane Sauerstoff in einer kleinen Inkubation Kammer bevor Sie die Maus auf eine Gesichtsmaske mit 2,1 % Isofluorane übertragen. Verwenden Sie eine Anästhesie-Einheit ausgestattet mit Heizkissen, um Unterkühlung der Maus zu verhindern.
    2. Narkotisierten Maus in der einen Hand zu beheben und 30 µL MOG35-55/CFA-Emulsion in Hinterbein Flanken zuerst subkutan injizieren (Abbildung 1:1 + 2; insgesamt 60 µL; linke Flanke 30 µL und Rechte Flanke 30 µL) in unmittelbarer Nähe zu den inguinalen Lymphknoten.
    3. Platzieren Sie den Mauszeiger auf dem Bauch und injizieren 20 µL MOGaa35-55/CFA-Emulsion in die Links und rechts weiche Fettgewebe an der Rute Wurzel (Abbildung 1:3 + 4; insgesamt 40 µL; rechts und links Schweif Wurzel 20 µL tail Wurzel 20 µL) und ein kleines Tröpfchen des MOGaa35-55/CFA-Emulsion Int o den Hals der Maus (Abbildung 1: 5).
    4. Injizieren Sie 100 µL PTx-Lösung in der Maus intraperitoneal. Halten Sie den Kopf der Maus unterhalb der Körpermitte Injektion in den Darm zu vermeiden.
    5. Wartung-Diät zu ersetzen (Extrudat Hauptnährstoffe: Rohprotein 18,5 %; Rohöl Fett 4,5 %; Rohfaser 4,5 %, Rohasche 6,5 %; Stärke 35 % metabolischer Energie: 13.1 MJ/kg), Zucht, Ernährung (Extrudat Hauptnährstoffe: Rohprotein 23,5 %, Rohöl Fett 5,5 %, Rohfaser 3 %; Rohasche 5,7 %; Stärke 36 %; metabolische Energie: 14,3 MJ/kg) um die Mäuse Essen der höheren Energiegehalt vor und während der erwarteten klinischen Erkrankung bieten.
    6. Entfernen Sie die Gesichtsmaske und übertragen Sie die Maus zu seinem Hause Käfig mit einem wärmenden Pad. Stellen Sie sicher, dass die Maus vollständig wach und bewegliche nach 10 Minuten ist.
    7. Wiederholen Sie die PTx Injektion (2.2.4) 48 h nach der ersten Behandlung.

3. Bewertung von EAE Mäusen

  1. Überprüfen Sie den Gesundheitszustand von EAE Mäusen jeden Morgen mit einem Blick in den Käfigen.
  2. Ergebnis EAE Mäusen jeden Nachmittag.
  3. Nehmen Sie jeden einzelnen Maus enthalten in der EAE-Experiment aus dem Käfig und prüfen Sie, ob das Heck Tonus hat, indem Sie ihn mit einem Finger nach oben bewegen. Eine gesunde Maus wird Schwanzspitze mithalten (die Rute hat eine Tonus). Wenn klinische EAE gestartet wurde, wird die Rute Tonus auch niedriger sein, sichtbar durch einen allmählichen Rückgang der Rute. Schließlich wird die Maus ihre Ladebordwand überhaupt nicht.
  4. Jeden einzelnen Maus in der EAE-Experiment auf der sauberen Bank aufgenommen und beobachten und dokumentieren das walking Verhalten. Siehe Tabelle 1-15 für die Bewertungskriterien für die Beurteilung der Schwere der Erkrankung (EAE-Score).
  5. Bewerten Sie und dokumentieren Sie das Gewicht jeder Maus in das Experiment einbezogen.
  6. Gewährleistung ausreichender Ernährung und Wasseraufnahme bis Mäuse Anzeige einer klinischen EAE Score von 1 liefern angefeuchteten Essen in einer Plastikschale auf den Boden des Käfigs und täglich zu aktualisieren.

4. In-vivo Durchlässigkeit assay

  1. Vorbereitung der Lösungen:
    1. Dextran Stammlösungen lösen sich auf 10 mg 10 kDa Dextran Alexa Fluor 488 sowie 3 kDa Dextran Texas Red in 500 µL 0,9 % Natriumchlorid-Lösung (20 mg/mL).
    2. Für die Dextran-Arbeitslösung nur vor Injektion Pipettieren 55 µL 10 kDa Dextran Alexa Fluor 488 auf Lager Lösung (20 mg/mL) auf ein Stück Film Abdichtung und 55 µL 3 kDa Dextran Texas Red-Stammlösung (20 mg/mL). Mischen Sie und sammeln Sie 100 µL in eine feine Einwegspritze (Endkonzentration 2 mg/100 µL).
    3. Kombinieren Sie für die 10 % Formaldehyd (PFA)-Stammlösung 10 g extra reines Pulver, 100 mL PBS und 200 µL 1N NaOH in ein sauberes Glasgefäß und Hitze bis zu genau 56 ° C unter Rühren mit einem Magnetrührer PFA; halten Sie bei 56 ° C für 30 min, bis die PFA vollständig gelöst ist; kühlen Sie lassen auf Raumtemperatur ab; pH auf 7,4 einstellen; und Filter durch einen Papierfilter. Shop bei - 20 ° C. Die Stammlösung kann weiter mit PBS verdünnt werden.
  2. Betäuben Sie kurz gesunden C57BL/6 Mäusen oder C57BL/6 Mäusen EAE mit Isofluran (die Maus wird für ca. 1 min sediert) leiden. Verwenden Sie ein automatisiertes System wie in Schritt 2.2.1 (Mäuse werden 4,5 % Isofluran in Sauerstoff in einer Induktion Kammer ausgesetzt und dann in eine Gesichtsmaske mit 2,1 % Isofluran übertragen).
  3. Platzieren Sie die narkotisierten Maus in Seitenlage auf dem Tisch, dann intravenös (z.B. Retro-Orbital) 100 µL der Fluoreszenz Tracer in der Maus zu injizieren, bevor die Maus aufwacht.
  4. Entfernen Sie die Gesichtsmaske sofort und stellen Sie sicher, dass die Maus vollständig wach und bewegliche nach der kurzen Narkose ist. Die Tracer für 15 min zirkulieren zu lassen.
  5. Fahren Sie fort mit Schritt 5.1.

(5) Perfusion von Mäusen

  1. Für in-vivo Durchlässigkeit Bewertung:
    1. Beginnen Sie das Verfahren 15 min nach Fluoreszenz Tracer Injektion durch Induktion Tiefe Isoflurane Narkose. Induzieren Tiefe Narkose bei Mäusen 2,3 % von Isofluran in Sauerstoff verwenden. Verwenden Sie die Pfote Rückzug Reflex um zu beurteilen, die Tiefe der Narkose (drücken Sie die Haut zwischen den Zehen, ein Fehlen der Flexion zeigt eine ausreichende Tiefe), und erforschen die Reflexe der Vordergliedmaße und die Megalosauridae bei Mäusen EAE unterzogen.
    2. Beheben Sie die Maus auf dem Rücken und sprühen Sie den Bauch mit Ethanol. Öffnen Sie Thorax mit einer Schere und entfernen Sie die Membrane. Öffnen Sie den rechten Vorhof des schlagenden Herzens mit einer Schere und durchspülen die Maus durch den linken Ventrikel des Herzens mit 10 mL PBS gefolgt von 10 mL 4 % PFA mit PBS-Puffer.
      Achtung: Um zu vermeiden, PFA einatmen, Durchspülen Sie die Maus in einer Dampfhaube.
    3. Fahren Sie mit Abschnitt 6.
  2. Für in Situ Zymography:
    1. Induzieren Sie Tiefe Isofluran-Narkose mit 2,3 % Isofluran in Sauerstoff in einer Maus EAE leiden, und prüfen Sie die Tiefe der Narkose wie in Schritt 5.1.1.
    2. Als nächstes befestigen Sie die Maus auf dem Rücken und sprühen Sie den Bauch mit Ethanol. Öffnen Sie Thorax mit einer Schere und entfernen Sie die Membrane. Öffnen Sie den rechten Vorhof des schlagenden Herzens mit einer Schere und durchspülen der Maus durch den linken Ventrikel des Herzens mit 20 mL PBS.
    3. Fahren Sie mit Abschnitt 6.

6. Dissektion und Einfrieren der Gehirne

  1. Vorbereitung der Kühlung Bad:
    1. Füllen Sie einen flachen Dewar Behälter mit zerkleinerten Trockeneis und fügen Sie 2-Methylbutane (Isopentane hinzu), bis die Flüssigkeit ca. 1 cm oberhalb der Trockeneis-Packung erreicht. Decken Sie mit einem losen Deckel – z. B. eine Eiskübel-Abdeckung.
  2. Clip aus dem Kopf der perfundierten Maus mit einer scharfen Schere und Haut und Ohren mit einer kleineren Gruppe von Schere entfernen.
  3. Sorgfältig zu sezieren die Schädeldecke durch Schneiden aus dem Foramen Magnum nach vorne links und rechts ermöglichen upfold die Schädeldecke in das Gehirn. Dann sorgfältig herausheben der intakten Gehirns aus der Schädelbasis beim Durchtrennen der optischen Nerven mit einem flachen Metallspatel.
  4. Gehirn auf Alufolie legen und das Gehirn in drei Stücken (Frontalhirn, Mittelhirn, und Kleinhirn + Hirnstamm) indem man zwei koronale Schnitten schneiden.
  5. Füllen Sie ein Cryomold (25 x 20 x 5 mm) bis zum ersten Quartal mit optimaler Temperatur schneiden (O.C.T.) Matrix, legen Sie Gehirnscheiben mit der Vorderseite nach unten in die Cryomold der einzelnen Gehirn, und Gewebe komplett mit O.C.T. Matrix.
  6. Legen Sie die Cryomold mit dem Gewebe in eine horizontale Ausrichtung in der 2-Methylbutane Bad und stellen Sie sicher, dass das Gewebe von unten nach oben innerhalb von 1 Minute friert durch Eintauchen des gesamten Gewebe-Blocks in das Bad zu vermeiden.
  7. Übertragen Sie gefrorenes Gewebe bis-80 ° C für die Lagerung zu und fahren Sie mit Abschnitt 7.

7. Vorbereitung der gefrorene Gewebeschnitte

  1. Temperatur von tiefgefrorenem Gewebe von-80 ° C bis-20 ° C in den Kryostaten für 30 min Equilibrate.
  2. Das Cryomold und die Halterung auf dem Kryostat-Gewebe-Halter (eingestellt auf-15 ° C) Gewebe Block entfernen mit O.C.T. Matrix.
  3. Schneiden Sie die Kanten des Gewebes Blocks auf dem Halter des Kryostaten mit einem scharfen Skalpell, und Fang an zu schneiden in den Gewebe-Block von 20 µm Abschnitte mit den Kryostaten Messer entfernen, bis das Gewebe sichtbar ist.
  4. Für die Analyse von in-vivo BBB Permeabilität:
    1. Schnitt 6 bis 10 µm Gewebeschnitte, sammeln sie auf Objektträgern Adhäsion und Bild sofort in den Abschnitten mit einem Deckglas mit einem Fluoreszenzmikroskop abgedeckt.
    2. Darstellung der Blutgefäße im Gehirn (Achten Sie auf scharfe Grenzen nicht undichten Blutgefäße im Vergleich zur Fluoreszenz-Muster für undichte Blutgefäße beobachtet diffundieren) zu beurteilen. Als Positivkontrolle überprüfen Sie die Leckage des Tracers in das Stroma Circumventricular Organe oder choroid Plexus, die ein BBB fehlt.
  5. Für in Situ Zymography:
    1. Schneiden Sie 6 µm Gewebeschnitte mit einem Kryostat, sammeln sie auf Objektträgern Adhäsion und frieren Sie Gewebeschnitte bei-20 ° C in einer eisigen Box mit Silica-Gel im Deckel ein.

8. in Situ Zymography kombiniert mit Laminin/CD45 Immunfluoreszenz-Färbung

  1. Bereiten Sie Lösungen:
    1. Bereiten Sie einbetten Lösung:
      1. Mischen Sie 6 g Glycerin (analysenrein), 2,4 g Poly (Vinyl-Alkohol), ddH2O 6 mL und 12 mL 0,2 M Tris-Puffer, pH 8, und rühren Sie (Magnetrührer) die Lösung für 4 h bei RT
      2. Übertragen Sie die Lösung auf eine 50 mL Zentrifugenröhrchen und 2 h bei RT ruhen lassen Inkubieren Sie anschließend die Lösung für 10 min bei 50 ° C (Wasserbad) und Zentrifuge für 20 min bei 2.700 x g bei Raumtemperatur.
      3. Den Überstand zu nehmen und Einfrieren in Aliquote bei-20 ° C.
    2. Bereiten Sie kalte Gelatine-Lösung:
      1. 0,1 g kalte Gelatine aus bovine Haut in 10 mL ddH2O auflösen.
      2. Lassen Sie es für mindestens 1 Tag einweichen und Aliquote bei 4 ° c lagern
    3. Bereiten Sie eiskalte Methanol (-20 ° C):
      1. Setzen Sie 100 % Methanol in einem Coplin Glas und kühlen Sie bis zu-20 ° C.
    4. 10 % Natrium-Azid Stammlösung vorbereiten:
      1. 10 mL ddH2O 1 g Natriumazid hinzu und bei Raumtemperatur lagern.
    5. Bereiten Sie 0,1 % Natrium-Azid funktionierende Lösung:
      1. Mix 99 µL des ddH2O mit 1 µL der Stammlösung 10 % Natrium-Azid.
    6. Lösen Sie 1 mg konjugierte Fluorescein Farbstoff abgeschreckt (DQ) Gelatine aus Schweinehaut in 1 mL der Lösung und Store 100 µL Aliquots lichtgeschützt bei 4 ° c arbeiten Natriumazid auf
    7. Auflösen von 30 mg 1,10-Phenanthroline-Monohydrat in 76 µL Ethanol und Speicher bei-20 ° C.
    8. Bereiten Sie 25 x Protease-Inhibitor-Lösung:
      1. 1 Tablette von EDTA-freie Protease-Inhibitor zu 2 mL ddH2O hinzufügen. Shop bei-20 ° C.
    9. Kurz vor dem Einsatz bereiten Sie Reaktionslösung (150 µL/Abschnitt):
      1. Zentrifugieren Sie 1 mg/mL-DQ-Gelatine-Lösung für 5 min bei 13.300 X g.
      2. Mix 127,2 µL ddH2O 15 µL 10-fach Puffer Reaktion (Gelatinase/Collagenase Assay Kit; siehe Tabelle der Materialien), 0,3 µL 20 mg/mL kalte Gelatine, 1,5 µL 1 mg/mL DQ Gelatine und 6 µL 25 x Protease-Inhibitor-Lösung.
    10. Kurz vor dem Einsatz bereiten Sie Phenantroline Negativkontrolle Reaktionslösung (150 µL/Abschnitt):
      1. Mix-125,2 µL ddH2O, 15 µL 10 x Reaktion Puffer, 0,3 µL 20 mg/mL kalte Gelatine, 1,5 µL 1 mg/mL DQ Gelatine, 6 µL 25 x Protease-Inhibitor EDTA frei und 2 µL 2 M 1,10-Phenantroline (MMP-Hemmer).
    11. Kurz vor dem Einsatz bereiten Sie kalte Gelatine (nicht fluoreszierend) Negativkontrolle Reaktionslösung (150 µL/Abschnitt):
      1. Mix 128,7 µL ddH2O, 15 µL 10-fach Puffer Reaktion und 0,3 µL 20 mg/mL kalte Gelatine 6 µL EDTA-frei 25 X Protease-Inhibitor.
    12. Bereiten Sie Primärantikörper cocktail für Gegenfärbung, zum Beispiel, 0,95 µg/mL polyklonale Kaninchen Anti-Laminin-Antikörper und 10 µg/mL polyklonale Ratte Anti-CD45 Antikörper in 1 % BSA mit PBS-Puffer, und bereiten Sie entsprechende Isotype Kontrolle Primärantikörper Cocktails.
    13. Bereiten Sie Sekundärantikörper Lösung, z. B. 7,5 µg/mL Cy3 Ziege Anti-Ratte + 15 µg/mL AMCA Anti-Kaninchen mit 1 % BSA mit PBS-Puffer (vor Licht schützen).
  2. Tauen Sie 6 µm nicht fixierten Gehirn Gewebeschnitte von EAE Mäusen in der eiskalten Kunststoffbox mit Silica-Gel im Deckel in einer Dampfhaube Retention von Wasser des Gewebes zu vermeiden und trennen 2 Gewebeschnitte auf einer Folie durch Zeichnen von Linien mit einem Wasser abstoßenden Stift
  3. Bereiten Sie Reaktionslösungen (Schritte 8.1.9-8.1.11), für 5 min bei 13.400 X g bei Raumtemperatur und vor warmen bis 37 ° C mit einem Wasserbad zentrifugieren.
  4. Rehydrieren Sie die Gewebeschnitte für 5 min bei 37 ° C mit 1 x Reaktion Puffer. 1 x Reaktion Puffer dann abgießen, die Gewebeschnitte Reaktionslösung Add-on und 4 h bei 37 ° c inkubieren Waschen Sie Objektträger in ddH2O 5 Mal.
  5. Beheben Sie Abschnitte für 5 min mit eiskalten Methanol bei-20 ° C zu und danach waschen Sie einmal mit PBS bei Raumtemperatur.
  6. 1 % BSA mit PBS-Puffer zu den Abschnitten hinzufügen und 20 min bei Raumtemperatur inkubieren (vor Licht schützen). Verwerfen Sie 1 % BSA mit PBS-Puffer aus den Abschnitten durch Umklappen der Folien auf Gewebe, Primärantikörper Cocktail hinzufügen und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren (vor Licht schützen).
  7. Zweimal mit PBS waschen, Sekundärantikörper Cocktail hinzufügen und 1 h bei Raumtemperatur inkubieren (vor Licht schützen).
  8. Zweimal mit PBS waschen, montieren Sie die Folien mit Einbettung Lösung, montierten Teile über Nacht bei Raumtemperatur trocknen lassen (vor Licht schützen). Zu guter Letzt analysieren Sie gefärbten Gewebeschnitten mit einem Fluoreszenz-Mikroskop.

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Representative Results

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Bewertung der klinische Verlauf der EAE bei C57BL/6 Mäusen sollte eine Krankheit Kurve wie in Abb. 2A und Änderungen in der Maus Körpergewicht wie dargestellt in Abbildung 2 bdargestellt führen. C57BL/6 Mäusen immunisiert mit MOGaa35-55 in der Regel beginnen Krankheitssymptome rund um 10-12. Tag nach der aktiven Immunisierung (Abbildung 1A) zu entwickeln. Immunisierten Mäusen zeigen in der Regel vorübergehend sinken des Körpergewichts am Tag nach der Injektion der Emulsion und die erste Dosis Pertussis-Toxin (Abbildung 1 b). Ab Tag 2 nach der EAE Induktion steigt das Körpergewicht von immunisierten Mäusen dann allmählich bis die Krankheit beginnt, wenn das Körpergewicht in der Regel eines Tages vor der Entwicklung der klinischen Symptome fällt und weiterhin sinkt auf den zunehmenden korrelieren die Symptome der Krankheit (Abb. 1A,B). Die Schwere der Erkrankung EAE steigt bis zu dem Höhepunkt der Krankheit, die zwischen 16 und 20 nach EAE Induktion (Abbildung 2A) Tagen zu rechnen ist. Auf dem Höhepunkt der klinischen EAE zeigen Mäuse auch die niedrigsten Körpergewicht (Abb. 2 b), die in Korrelation zur Verbesserung der EAE in der Remissionsphase der Erkrankung (Abb. 2A,B) erhöht. EAE Induktion bei C57BL/6 Mäusen mit MOGaa35-55 Ergebnisse in eine chronische Krankheit-Pathologie und Mäuse in der Regel nicht vollständig erholen (Abbildung 1A).

Abbildung 3A zeigt ein repräsentatives Bild von choroid Plexus und die angrenzenden in Anwesenheit von Mausklick C57BL/6 leiden EAE, die mit fluoreszierenden 3 kDa Dextran (rot) und 10 kDa Dextran (grün) 15 min vor Einbußen bei intravenös injiziert wurde ; Skala bar 50 µm. Wie wir bereits gezeigt haben, während die BBB nicht, die Diffusion zulässt des zirkulierenden Tracer in das Gehirn Parenchym angegeben Tracer leicht diffus über die gefensterten Mikrogefäßen in das Stoma choroid Plexus (Bild links und Mitte), durch die gestrichelte Linie (rechtes Bild) ist die so frei von jeder Fluoreszenzsignal. Abbildung 3 b zeigt repräsentative undichten Blutgefäße im Kleinhirn Mausklick C57BL/6 leiden EAE, die mit fluoreszierenden 3 kDa Dextran (rot) und 10 kDa Dextran (grün) 15 min vor Einbußen bei intravenös injiziert wurde. Pfeilspitzen zeigen Tracer verbreitet über das Gehirn Mikrogefäßen in CNS Parenchym (Bild links und Mitte), was darauf hindeutet, dass in diesen Gefäßen die BBB-Funktion beeinträchtigt wird. In der CNS-Parenchym ist grün und rot Fluoreszenzsignal sichtbar außerhalb der Wände der Blutgefäße, die durch gestrichelte Linien angedeutet sind. In EAE das Kleinhirn, wo entzündliche Manschetten die Tracer erscheinen, auch im perivaskulärer Raum zwischen der endothelialen Basalmembran und die Glia Limitans Angabe Funktionsverlust der endothelialen BBB Integrität entnehmen. Wenn Tracer in der Anwesenheit von verbreiten gefunden wird, zeigt es zusätzliche Dysfunktion der glialen Barriere12.

Abbildung 4 zeigt repräsentative Bilder der Analyse der Gelatinase (MMP) Tätigkeit in einer EAE Gehirn einer C57BL/6-Maus durch in-situ Zymography sichtbar gemacht und lokalisiert auf bestimmten Gehirn-Schranke Fächer durch anti-pan-Laminin (blau) und das Vorhandensein von Entzündungszellen durch Anti-CD45 (rot) Immunfluoreszenz Färbung. Proteolytische Spaltung der Farbstoff abgeschreckt (DQ) Gelatine unquenches ein Fluorescein-Signal, das Lokalisierung von Gelatinase Aktivität im Abschnitt Gewebe ermöglicht. Wenn kalte Gelatine (nicht-fluoreszierende Kontrolle) ausgebrütet wird, kein grün fluoreszierendes Signal detektiert werden, in den Gehirn-Abschnitten von EAE Mäusen (obere Reihe) sowie in den Abschnitten, die mit DQ-Gelatine inkubiert worden kombiniert mit Phenantroline, ein potenter Zn +- Komplexbildner und MMP-Inhibitor (mittlere Reihe). In der unteren Zeile ist fokale Gelatinase/MMP-Aktivität als typische körnige hell grün fluoreszieren Signal, wie die Pfeilspitzen sichtbar. Bei entzündlichen Manschetten im Kleinhirn einer EAE-Maus tritt spezifische MMP-Aktivität jenseits der Glia Limitans (blau) an den Standorten der entzündlichen Zelle Infiltration (rot).

Figure 1
Abbildung 1 : Grafische Darstellung der Injektionsstellen für EAE Induktion. (1) Injektionsstelle für 30 µL MOG-Emulsion in der rechten Flanke, 2) Injektionsstelle für 30 µL MOG-Emulsion in der linken Flanke, 3) Injektionsstelle für 20 µL MOG-Emulsion in die linke Heck-Wurzel, (4) Injektionsstelle für 30 µL MOG-Emulsion in die richtige Rute Wurzel 5) Injektionsstelle für ein kleines Tröpfchen des MOG-Emulsion in den Hals. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Repräsentative Kurs von EAE. (A) Krankheitssymptome der EAE bei C57BL/6 Mäusen im Laufe der Zeit. Mittelwert +/-SEM wird angezeigt. (B) Änderung des Körpergewichts während EAE im Laufe der Zeit. Mittelwert +/-SEM wird angezeigt.  Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3 : Repräsentatives Bild von in-vivo Durchlässigkeit. (A) Bild links: grün fluoreszierende 10 kDa-Dextran auf der Ebene der choroid Plexus. Bild Mitte: rot fluoreszierende 3 kDa Dextran auf der Ebene der choroid Plexus. Bild rechts: der linken und mittleren Bilder zu verschmelzen. Skala Bar 50 µm. (B) Bild links: grün fluoreszierende 10 kDa-Dextran im Kleinhirn Maus. Bild Mitte: rot fluoreszierende 3 kDa Dextran im Kleinhirn Maus. Bild rechts: Zusammenführung der linken und mittleren Bilder. Gestrichelte Linien sind bezeichnend für die Wände der Blutgefäße; Pfeilspitzen weisen auf Fluoreszenz Tracer in der CNS Parenchym. Skala bar 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4 : Repräsentative Bilder von in Situ Zymography. Erste Spalte: grün fluoreszierende Kanal (ungestillten Signal Farbstoff abgeschreckt (DQ) Gelatine). Zweiten Spalte: fluoreszierende Blaukanal (Laminin). Dritte Säule: fluoreszierende Rotkanal (CD45). Vierte Spalte: Zusammenführung von fluoreszierenden Kanäle. Obere Reihe: kalte Gelatine (nicht fluoreszierend) negativ-Kontrolle. Mittlere Reihe: Negativkontrolle Phenantroline (MMP-Hemmer). Unterste Reihe: DQ-Gelatine. Skala bar 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

0 bis 3 Punkte Kriterien Gewichtsveränderung
0 keine Anzeichen normales Gewicht
~ schwache Tail (schwache Tonus) - inhouse-Kriterien: nicht dokumentierte Scorer enthalten Gewichtsverlust (indikativ für 2. Check)
0,5 Tail Limp (Tail-Tropfen) Gewicht-Verlust
1 Hinterbein Schwäche, Gangunsicherheit (Maus geht auf der Bank wie eine Ente) Gewicht-Verlust
2 Hinterbein Querschnittslähmung (Maus bewegt seine Hinterbeine nicht) starkem Gewichtsverlust (indikativ für 2. Check)
3 Hinterbein Paraplegie, Inkontinenz Kontrollverlust unteren Körper (Maus fällt auf einer Seite aber können in den Käfig mit ist Vorderbeine + Inkontinenz; moribund) sehr niedriges Körpergewicht (indikativ für 2. Check)

Tabelle 1: Bewertungskriterien für die Beurteilung der Schwere der Erkrankung EAE.

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Discussion

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Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll überwachen EAE in weiblichen C57BL/6 Mäusen zu induzieren. Frauen werden bevorzugt ausgewählt, und es gibt eine Inzidenz von Frauen: Männer 3:1 im MS. Zur Beurteilung der Schwere der EAE, wir haben eine 3-Punkt-Wertungsblatt nutzen. EAE Schweregrad wird in der Regel in Bezug auf den Schweregrad der motorischen Funktionsstörungen bewertet. Mäuse mit fortgeschrittenen Stadien der EAE, d.h. ausstellen eine Punktzahl über 2 geopfert werden sollte, um unnötiges Leiden der Tiere zu vermeiden. So, es wird empfohlen, die Mäuse in engen Abständen Beispiel: Spielstand zweimal täglich im Protokoll erklärt.  Es gibt mehrere scoring Routinen beschäftigt, 0-6 Punkte erreichen von 0-3 Punkte,16,17,18,19 , oder sogar noch mehr subpoints20. Wir haben jedoch bisher gezeigt, dass vermeintlich raffinierten EAE scoring nicht zu einer Verbesserung bei der Ermittlung möglicher statistisch signifikante Unterschiede in Krankheit Partituren zwischen Gruppen, wenn man die gesamte Krankheit schwere15führt. Basierend auf dieser Beobachtung machten wir nutzen die 3-Punkte-Skala Krankheitsverlauf in EAE beurteilen, um Maus, die Bearbeitungszeit zu reduzieren und so Elend für Mäuse 3R Durchführungsbestimmungen. Ein weiterer kritischer Punkt mit dem EAE-Modell Unterschiede zwischen Knockout und Wildtyp Mäusen oder Unterschiede zwischen den Behandlungsgruppen zu studieren ist eine präzise Planung experimentelle einrichten. Beim Wildtyp Mäusen mit Knockout-Mäusen verglichen werden, unbedingt vergleichen Wurfgeschwistern aus heterozygot Paarungen um identische genetische Hintergründe der Wildtyp und Knockout Mäuse im Vergleich in der EAE-Experiment zu gewährleisten. Es ist auch wichtig, die gleichen Bedingungen für alle Mäuse enthalten in einem Experiment, z.B. Käfig Änderungen, Verwaltung von Nassfutter, und vor allem Maus Wohnverhältnisse (Gesundheitszustand). Zur Vermeidung von Käfig-spezifische Phänomene induziert durch den Prüfarzt sollte Kreuz-Immunisierung durchgeführt werden. Genauer gesagt, wenn mehr als eine Spritze erforderlich ist, um eine bestimmte Anzahl von Mäusen zu immunisieren, sollte sie nach dem Zufallsprinzip verschiedene Spritzen verwendet zugewiesen werden. Letzteres sollte ebenfalls für die Durchführung der Behandlungsstudien angewendet werden. Nicht zuletzt, der Gesundheitszustand von Mäusen in verschiedenen tierischen Einrichtungen untergebracht könnte Auswirkungen auf die Krankheitsinzidenz und Schweregrad und somit weitere21 oder weniger Mycobacterium Tuberculosis22 induzieren eine korrekte klinische erforderlich sein könnten Erkrankung. Darüber hinaus kann der Injektionsstelle auf Krankheitsentwicklung auswirken. In diesem Protokoll schlagen wir vor, relativ kleine Volumen in fünf verschiedenen Standorten subkutane injizieren: 30 µL in beiden Flanken, 20 µL in die linken und rechten Rückleuchten Wurzel und einen kleinen Tropfen in den Nacken. In anderen Protokollen sind 50 µL Depots subkutan in den Schweif Wurzel nur23 oder in die vier Flanken21angeordnet. Injektionen von kleineren Depots, jedoch Risiko das von Haut Irritationen, welche Mäuse zu kratzen versuchen können.

In-vivo Durchlässigkeit könnte BBB Leckage in EAE zuweist, sondern auch zu beurteilen, ob die spezifische genetische Löschung ein Molekül oder eine medikamentöse Behandlung wirkt sich auf BBB Integrität in-vivo durchgeführt werden. Dies ist erfolgt entweder durch den Nachweis des endogenen Plasma Tracer wie IgG Ablagerungen12 oder exogene Trancen, die in den Blutkreislauf ein lebendig Maus24angewendet werden. Wir haben in diesem Protokoll Verwendung von zwei verschiedenen exogenen Tracer (3 kDa und 10 kDa Dextran), die gleichzeitig injiziert wurden und zirkulieren für eine definierte Zeit von 15 min. mit zwei Taster mit verschiedenen Größen erlaubt es, den Schweregrad der BBB bestimmen durfte Dysfunktion und gestatten, um eine Abkürzung für Tracer Größen das diffuse oder nicht über die BBB zu definieren. Fluoreszierende Dextrans sind hydrophil Polysaccharide zeichnet sich durch gute Wasserlöslichkeit, geringe Toxizität, und die relativ geringen Immunogenität. Darüber hinaus bestehen Dextrans aus Poly-(α-D-1,6 Glukose), die Spaltung von endogenen zellularen Glycosidases resistent sind. Hier verwendeten wir Dextran-Varianten, die Lysin-Rückstände, Dextran-Konjugat eingearbeitet haben. Lysinated Dextrans sind Aldehyd feststellbar, wodurch um die Tracer im Gewebe zu beheben. Neben Eindringmittel beschrifteten Dextrans können andere Chemikalien zur in-vivo Durchlässigkeit, z. B. Hoechst Farbstoff in Kombination mit Evan blau, bewerten die zu einem großen Teil an Serum-Albumin bindet. Hoechst Flecken die BBB Endothelzellen Kerne CNS Mikrogefäßen Futter und Evan blau im Bereich perivaskuläre auf BBB Dysfunktion nachweisbar und diffundiert weiter, wenn die Glia Limitans gestört25,26ist. Im Gegensatz dazu gibt Beurteilung in-vivo Durchlässigkeit von immunofluorescent Färbung endogener Marker Einblick in Anhäufung von z. B. IgG-Moleküle oder Fibrinogen, ein Glykoprotein, das im Laufe der Zeit in das Blut zirkuliert. Unter gesunden Bedingungen perivaskulärer Raum ist sehr schmal und der endothelialen Basalmembran und die Glia Limitans sind eng miteinander verbunden und erfordert daher visualisieren die beiden ECM-Barrieren von der NVU Laminin Isoform-spezifischen Antikörper Färbung27 .

Endogene IgG-Moleküle sind vorhanden in Gesundheit und Krankheit im Inneren der Blutgefäße sowie wie das Gewebe der Circumventricular Organe, wo kein BBB etablierten12. In gen verändert Mäuse mit Gehirn-Schranke Mängel während der medikamentösen Behandlung oder während Neuroinflammation endogene Moleküle, die normalerweise im Blut zirkulieren könnte in der CNS Parenchym, die durch Gegenfärbung mit Anti-Laminin visualisiert werden kann hinterlegt werden Antikörper erkennen entweder alle Laminin Isoformen (Pan-Laminin-Antikörper) oder Laminin Isoform-spezifische Antikörper ermöglichen die endothelialen Basalmembran und Laminin α1 und α2 Laminin aus der Glia Laminins, Laminin α4 und α5 unterscheiden Limitans. Während schwere Bedingungen könnte der perivaskulärer Raum erweitert werden, durch die Infiltration von Immunzellen, so dass der endothelialen Basalmembran sowohl der Glia Limitans mit einem Pan-Laminin-Antikörper zu identifizieren. Gegenfärbung der Laminins bei der NVU zu um beurteilen, ob endogene ermöglicht aber auch exogene Tracer sind hinterlegt in der CNS Parenchym und von CD45 Gegenfärbung ermöglicht es um zu beurteilen, ob fokale Leckage der BBB Immunzelle zugeordnet ist Infiltration.

Immunzelle Migration in das Parenchym CNS erfordert das sequentielle überschreiten der zwei unterschiedliche Barrieren innerhalb der NVU, die endotheliale BBB und anschließend der Glia Limitans28. Kreuzung der Glia Limitans und CNS-Eintrag von Immunzellen mit dem Beginn der klinischen EAE29korreliert, während CNS Zellen infiltrieren in Leptomeningeal gefangen und perivaskuläre Räume lösen keine klinischen EAE. Immunzelle Fallenjagd in Leptomeningeal und perivaskuläre Zwischenräume Keller Membranen wurde in mehreren gen veränderte Mausmodelle z. B. L-Selektin Knockout Mäuse30, TNF Knockout Mäuse23, MMP2/MMP9 double Knockout-Mäusen10 beobachtet , und JAM-B Knockout Mäuse12. Diese Ergebnisse unterstreichen, dass Mangel an diese Moleküle nicht beeinflusst Immunzelle Migration über die BBB, sondern eher in der Glia Limitans, unterstreicht, dass molekulare Mechanismen vermitteln Immunzelle Migration über die BBB und die Glia limitans unterschiedliche. Gehirn in Situ Zymography ist eine Methode, für fokale Gelatinase Aktivität in einem Gewebe-Abschnitt in präzise räumliche Korrelation zur CNS Pathologie zu untersuchen. Erkennung von in-vivo BBB Permeabilität sowie Durchführung von in-situ Zymography um MMP2/MMP9 Aktivität erkennen ermöglicht somit abzugrenzen endotheliale versus Glia Barriere Störung in Korrelation zu Immunzelle Infiltration. In Kombination mit Pan-Laminin und CD45 Immunfluoreszenz-Färbung auf EAE Gehirn Abschnitte kann es Lokalisierung von Gelatinase Aktivität von unquenching DQ-Gelatine und Lokalisierung von Immunzellen zur gleichen Zeit zu infiltrieren. Unquenching von Fluorescein von DQ-Gelatine-Ergebnisse in einem typische körnige hell grün fluoreszieren Signal, während uneinheitliche schwach grün fluoreszierende Bereiche auf Gewebeschnitte müssen als unspezifische Signal12berücksichtigt werden. So sorgfältige Auswertung von Gewebeschnitten und geeignete Kontrollen sind unverzichtbar, wenn in Situ Zymography ausführen. In diesem Protokoll haben wir in Situ Zymography in Kombination mit CD45 und Laminin Färbung durchgeführt. Primäre Antikörper gegen CD45 und Laminin wurden zur gleichen Zeit als Mix inkubiert. In ähnlicher Weise wurden als eine Mischung in einem zweiten Schritt Färbung Sekundärantikörper inkubiert. Eine solche Kombination von Antikörpern braucht Tests, um sicherzustellen, dass die zweite Phase Antikörper gegen andere IgGs aufgenommen werden, um Kreuzreaktivität zu vermeiden.

Zusammengenommen bieten die Protokolle, die hier vorgestellten Tools, um im Detail zu untersuchen, welche Bestandteil der NVU in schwere Bedingungen der EAE beeinträchtigt wird. In-vivo Durchlässigkeit Beurteilung durch exogene Tracer ermöglicht, um aktuelle Beeinträchtigung der mikrovaskuläre Endothelzellen Integrität oder aktuelle Beeinträchtigung der NVU zu identifizieren. Darüber hinaus ermöglicht die Einführung von Tracern mit verschiedenen Größen, um die Schwere der Beeinträchtigung der BBB zu schätzen. Zusätzliche in-situ Zymography deckt fokale Gelatinase Aktivität in Astrozyten und potenziell Entzündungszellen, die benötigt wird, der Glia Limitans als letzte Barriere zu brechen, bevor man Zugang zu den CNS Parenchym10.

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Disclosures

Keine Interessenkonflikte erklärt.

Acknowledgments

Wir erkennen dankbar Lydia Sorokin, die ihre ursprüngliche in Situ Zymography Protokoll10 mit uns geteilt hat.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AMCA anti-rabbit antibody Jackson ImmunoResearch 111-156-045 Store at 4 °C; protect from light
Anti-CD45 Antibody (30F11) Pharmingen 07-1401 Store at 4 °C
Anti-Laminin Antibody DAKO Z0097 Store at 4 °C
Breeding food e.g. PROVIMI KLIBA SA 3336
Individually ventilated cages, Blue line Type II or III e.g. Tecniplast 1145T, 1285L
BSA fraction V Applichem A1391 Store at 4 °C
Cold gelatine Sigma-Aldrich G 9391
Coplin jar + rack e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG H554.1; H552.1
Cy3 anti-rat antibody Jackson ImmunoResearch 111-156-144 Store at 4 °C; protect from light
Cover slips 24 x 40 mm # 1 e.g. Thermo Scientific 85-0186-00
Dextran Alexa Fluor 488 (10,000 MW) e.g. Molecular probes D22910 Store at -20 °C; protect from light
Dextran Texas Red (3000 MW) Invitrogen D3328 Store at -20 °C; protect from light
EnzChek Gelatinase/Collagenase Assay Kit  Thermo Fisher Scientific; EnzCheck E12055 Store at -20 °C; protect form light
Female C57BL/6J mice (8-12 weeks) e.g. Janvier Labs Females, 8-12 weeks
Freezing box for histology slides e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG 2285.1
18G x 1½’’ (1.2mm x 40mm) injection needle e.g. BD, BD Microlance 3 304622
27G x ¾’’ – Nr. 20 (0.4mm x 19mm) injection needle e.g. BD, BD Microlance 3 302200
30G x ½’’ (0.3 mm x 13 mm) injection needle e.g. BD, BD Microlance 3 304000
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) e.g. Santa Cruz Biotechnology sc-24648 Store at 4°C
Maintenance food e.g. PROVIMI KLIBA SA 3436
MOGaa35-55 peptide e.g. GenScript Store at -80 °C
microscope slides (Superfrost Plus ) Thermo Scientific J1800AMNZ
Mycobacterium tuberculosis H37RA e.g. BD 231141 Store at 4 °C 
NaCl 0.9 % B. Braun 3535789
O.C.T. compound (Tissue-Tek ) Sakura 4583
Omnican 50 30G x ½’’ B. Braun 9151125S
Paraformaldehyde Merck 30525-89-4
Pertussis toxin e.g. List biological laboratories, Inc. 180 Store at 4 °C
poly(vinyl alcohole) (Mowiol 4-88) Sigma-Aldrich 81381
Protease Inhibitor EDTA free (Roche) Sigma-Aldrich 4693132001 Store at 4 °C
repelling pen e.g. DAKO Pen e.g. DAKO S2002
sealing film e.g. Parafilm M e.g Sigma-Aldrich P7793
Silica gel e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG 9351.1
Stitch scissor F.S.T 15012-12
syringe 1 ml e.g. PRIMO 62.1002
syringe 10 ml e.g. CODAN Medical ApS 2022-05
vaporizer system Univentor 400 UNO.BV

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Beeinträchtigung der Endothelzellen und glialen Barrieren des Referats neurovaskuläre während experimentelle Autoimmune Enzephalomyelitis In Vivo Visualisierung
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Tietz, S. M., Engelhardt, B. Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo. J. Vis. Exp. (145), e59249, doi:10.3791/59249 (2019).More

Tietz, S. M., Engelhardt, B. Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo. J. Vis. Exp. (145), e59249, doi:10.3791/59249 (2019).

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