Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Visualisere nedsatt Endothelial og Glial barrierer av nevrovaskulære under eksperimentelle Autoimmune immunsviktvirus i Vivo

Published: March 26, 2019 doi: 10.3791/59249

Summary

Her presenterer vi for å undersøke svekkelse av nevrovaskulære under eksperimentelle autoimmune immunsviktvirus i vivo. Vi adresse spesielt hvordan du fastslår blod - hjerne barrieren permeabilitet og gelatinase aktivitet involvert i leukocytter migrasjon over glia-limitans.

Abstract

Nevrovaskulære enheten (NVU) består av mikrovaskulær endotelceller danner blod - hjerne barrieren (BBB), en endothelial kjelleren membran med innebygd pericytes, og glia limitans består av parenchymal kjelleren membranen og astrocytic slutten-feed omfavner abluminal aspekt av sentralnervesystemet (CNS) microvessels. Tillegg til å opprettholde CNS styrer homeostase NVU immun celle menneskehandel i CNS. Under immunosurveillance av CNS kan lave antall aktivert lymfocytter krysse endothelial barrieren uten å forårsake BBB dysfunksjon eller kliniske sykdommen. Derimot under neuroinflammation som multippel sklerose eller dyr modell kan eksperimentelle autoimmune immunsviktvirus (EAE) et stort antall immunceller krysse BBB og senere glia limitans eventuelt nå CNS parenchyma fører til kliniske sykdommen. Immun celle migrasjon i CNS parenchyma er en prosess som involverer en sekvensiell overføring over endothelial og glial barrieren for NVU ansette distinkte molekylære mekanismer. Hvis etter deres passasje over endothelial barrieren, T celler møte deres beslektet antigen på perivascular antigen presentere celler deres lokale reaktivering starte etterfølgende mekanismer fører til fokal aktivering av gelatinases, som gjør de T-cellene til å krysse glial barrieren og angi CNS parenchyma. Derfor kan vurdere både BBB permeabilitet og MMP aktivitet i romlig sammenheng med immun celle akkumulering i CNS under EAE angi tap av integriteten til endotelial og glial barrierer av NVU. Her viser vi hvordan å indusere EAE i C57BL/6 mus av aktiv immunisering og deretter analysere BBB permeabilitet i vivo bruke en kombinasjon av eksogene fluorescerende tracers. Vi ytterligere vise, hvordan å visualisere og lokalisere gelatinase aktivitet i EAE hjernen av i situ zymogaphy koblet til immunofluorescent stainings av BBB kjelleren membraner og CD45 + invaderende immunceller.

Introduction

Sentralnervesystemet (CNS) koordinerer alle kropp og mentale funksjoner i virveldyr CNS homeostase er avgjørende for riktig kommunikasjon av neurons. CNS homeostase er garantert av nevrovaskulære enhet (NVU), som beskytter CNS fra blodet endring miljøet. NVU består av CNS mikrovaskulær endotelceller, som er biokjemisk unike og etablere blod - hjerne barrieren (BBB) i kontinuerlig crosstalk med pericytes, astrocyttene, nerveceller og ekstracellulær matrix (EFM) komponenter, etablere to forskjellige kjelleren membraner1. Endothelial kjelleren membranen som ensheathes abluminal aspekt av BBB endotelceller havner mange pericytes og består av laminin α4 og laminin α5, i tillegg til andre ECM proteiner2. Derimot parenchymal kjelleren membranen består av laminin α1 og laminin α2 og blir omfavnet av astrocytic slutten-fot. Den parenchymal kjelleren membranen med astrocytter slutten-føttene komponerer den glia limitans som segregerer CNS neuronal nettverket fra Cerebrospinalvæske fylt perivascular eller subarachnoid mellomrom3. På grunn av den unike arkitekturen i NVU er immun celle menneskehandel i CNS forskjellig fra at i perifere vev som det krever en prosess med immunceller, første brudd endothelial BBB og senere glia limitans for å nå CNS parenchyma.

Multippel sklerose (MS) er en vanlig neuroinflammatory sykdom i CNS, der et stort antall sirkulerende immunceller angi CNS og forårsake neuroinflammation, demyelinisering og fokal tap av BBB integritet4. Tap av BBB integritet er en tidlig kjennetegner MS, som indikert av tilstedeværelsen av gadolinium motsetning styrke lesjoner i CNS som visualisert av magnetisk resonans imaging (MRI)5. Leukocytter bloduttredelse til CNS oppstår på nivået av postcapillary venules; men gjenstår nøyaktig mekanismer involvert i immun celle diapedesis over BBB kjelleren membranen og glial barrieren å bli utforsket. Eksperimentell autoimmune immunsviktvirus (EAE) fungerer som en dyremodell for MS og har bidratt betydelig til vår nåværende kunnskap om MS patogenesen. For eksempel har bruker EAE modellen det blitt oppdaget at leukocytter bloduttredelse oppstår i en må prosess, inkludert en første fangst og rullende steg formidlet av selectins og mucin-lignende molekyler som P-selectin glykoprotein ligand (PSGL) -1, etterfulgt av integrin-avhengige fast arrestasjon og gjennomgang av T-celler på BBB endotelceller ettergivende sidene i diapedesis6.

Når T celler har krysset endothelial BBB og endothelial kjelleren membranen, trenger de å møte deres beslektet antigen på makrofager eller dendrittiske celler strategisk lokalisert i leptomeningeal eller perivascular mellomrommene. Dette samspillet induserer fokal produksjon av pro-inflammatoriske mediatorer den utløseren ytterligere mekanismer kreves for CNS vev invasjonen av immunceller via glia limitans7,8,9. Fokal aktivering av matrix-metalloproteinases (MMP) -2 og MMP-9 endrer chemokine aktivisering og induserer nedbrytning av ekstracellulær matrix reseptorer på astrocytter slutten-fot, som er en forutsetning for immun celle migrasjon over den glia limitans i den CNS parenchyma og å indusere utbruddet av kliniske symptomer EAE10,11.

Kombinere påvisning av CNS infiltrere immun celle med BBB gir lekkasje og gelatinase aktivitet i CNS vev delene verdifull informasjon om funksjonelle integriteten av endothelial og glial barrieren i sammenheng med neuroinflammation. For eksempel, vi nylig undersøkt konstituerende tap av endothelial tett krysset molekyl junctional vedheft molekyl (SYLTETØY)-B i immun celle menneskehandel i CNS i sammenheng med EAE. Sammenlignet med sunn vill-type C57BL/6 mus, sunn JAM-B-mangelfull littermates viste ingen nedskrivning av BBB integritet som vist i vivo permeabilitet vurdering ved hjelp av endogene samt eksogene tracers12. I forbindelse med EAE, JAM-B-mangelfull C57BL/6 mus viste ameliorated sykdomssymptomer, som var forbundet med inflammatorisk celle overlapping i leptomeningeal og perivascular mellomrom12. Undersøke fenomenet vi brukt i situ zymography, slik at ID gelatinase aktivitet for å teste om mangelen på gelatinase aktivitet i JAM-B-mangelfull mus kan være ansvarlig for redusert antall immunceller klarte å bryte den glia limitans12.

Ettersom finnes endret ulike genetisk musen modeller mangler, f.eks forskjellige BBB tett krysset molekyler som kan forårsake endringer i BBB funksjon, metoder for å undersøke BBB integritet er viktig. I tillegg kan nyutviklet narkotika påvirke NVU barrierer. Her viser vi hvordan å indusere EAE i C57BL/6 mus av aktiv immunisering med myelin oligodendrocyte glykoprotein (MOG)-peptid aa35-55 i fullstendig Freund adjuvans. Deretter forklarer vi hvordan å lokalisere immun celle infiltrasjon over endothelial og glial barrierer av NVU og studien i vivo endothelial og glial barriere integritet i situ påvisning av eksogene tracers og gelatinase aktivitet, henholdsvis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle studier ble utført under retningslinjene ifølge den sveitsiske lovgivningen om beskyttelse av dyr og ble godkjent av veterinær kontor Kantonen Bern, Sveits (tillatelse tall: være 31-17 og være 77/18).

1. boliger C57BL/6 mus i bestemte patogen gratis (SPF) forhold

  1. Huset mus i individuelle ventilert bur med en 12/12 h lys og mørke syklus. Skaffe mat og vann ad libidum. For å overvåke mikrobiologisk kvalitet av mus, gjennomgikk eksperimentelle kohort kvartalsvise helseovervåking av skitne sengetøy voktere etter FELASA anbefalinger13.
  2. Bruk øret slag individuelt merke 8-12 uke gamle kvinnelige C57BL/6 mus.

2. immunisering av C57BL/6 mus

  1. Utarbeidelse av løsninger14:
    1. For komplett Freund Adjuvant (CFA), inaktivert blanding 30 mL av ufullstendig Freund Adjuvant med 120 mg av ferske pestled varme Mycobacterium tuberculosis (H37RA) under avtrekksvifte. Lagre lagerløsning på 4 ° C.
    2. For MOGaa35-55-peptid lager løsningen, oppløse MOGaa35-55-peptid i sterilt PBS (4 mg/mL) og lagre på-80 ° C.
    3. Forbered MOG-emulsjon:
      1. Fortynne CFA 1:2 med MOG-peptid lagerløsning i en 2 mL microtube.
      2. Forsegle microtube med tetting film og løs på en Vortex mikser ved helt dekker røret med teip. Vortex emulsjon 4 h på 4 ° C.
    4. Forbered sprøyter med stabil emulsjon:
      1. Ta av microtube og raskt Nedspinning emulsjonen ved hjelp av et lite bord sentrifuge. Samle emulsjon i en sprøyte med en 18G x 1½'' (1,2 mm x 40 mm) injeksjon nål.
      2. Av antall mus lydstyrken emulsjon i sprøyten (100 µL/mus) og erstatte 18 G nålen med en 27G x ¾'' (0.4 mm x 19 mm) injeksjon nål. Forsegle injeksjon nålen knyttet til sprøyten med tetting film.
    5. For pertussis gift (PTx) lager løsningen, oppløse 50 µg av lyofilisert PTx i 500 µL av sterile PBS (100 ng/µL). Lagre lagerløsning på 4 ° C.
    6. PTx arbeider løsningen, blande 97 µL av sterile PBS med 3 µL PTx lager løsning (300 ng/100 µL) per mus (for intraperitoneal injeksjon bruk en 30G x ½'' (0,3 mm x 13 mm)-nål).
  2. EAE induksjon
    1. Bedøve C57BL/6 mus med isofluorane ved å bruke en vaporizer. For å indusere anestesi i mus, utsette musen til 4,5% isofluorane i oksygen i en liten inkubasjon kammer før du overfører musen til en ansiktsmaske med 2,1% isofluorane. Bruk en bedøvelse enheten utstyrt med oppvarming pad for å hindre nedkjøling av musen.
    2. Fastsette bedøvet musen i den ene hånden og første sprøyte 30 µL av MOG35-55/CFA-emulsjon subcutaneously i hind ben flankene (figur 1:1 + 2, i totalt 60 µL; venstre flanke 30 µL og høyre flanke 30 µL) i nærhet til lysken lymfeknutene.
    3. Plasser musen på magen og injisere 20 µL av MOGaa35-55/CFA-emulsjon i venstre og høyre myke fettvev roten hale (figur 1:3 + 4; i totalt 40 µL; venstre hale rot 20 µL og høyre hale rot 20 µL) og en liten dråpe MOGaa35-55/CFA-emulsjon int o av musen (figur 1: 5).
    4. Injisere 100 µL PTx løsning intraperitoneally i musen. Hold hodet av musen under kroppen midten unngå injeksjon i tarmen.
    5. Erstatte vedlikehold kosthold (extrudate viktigste næringsstoffene: råprotein 18,5%, råolje fett 4,5%, råolje fiber 4,5%; råolje aske 6,5%, stivelse 35%, metabolske energi: 13,1 MJ/kg) å formering kosthold (extrudate viktigste næringsstoffene: råprotein 23,5%; råolje fett 5,5% råolje fiber 3%. råolje aske 5,7%; stivelse 36%. Metabolsk energi: 14,3 MJ/kg) for å gi musene mat av høyere energiinnhold før og under forventet kliniske sykdommen.
    6. Fjern ansiktsmaske og overføre musen til buret sitt hjem med en oppvarming pad. Kontroller at musen er fullt våken og motile etter 10 minutter.
    7. Gjenta PTx injeksjon (2.2.4) 48 timer etter første behandling.

3. scoring EAE mus

  1. Sjekke helsetilstanden til EAE mus hver morgen ved å ta en titt inni merdene.
  2. Score EAE mus hver ettermiddag.
  3. Ta alle personlige musen med i EAE eksperimentet ut av buret og sjekk om halen har tonus ved å flytte det oppover med en finger. En sunn mus vil holde halen opp (halen har en tonus). Hvis klinisk EAE har startet, blir hale tonus lavere, synlig ved en gradvis nedgang av halen. Til slutt vil musen ikke kunne løfte halen på alle.
  4. Plasser hver individuelle musen i EAE eksperimentet på ren benken og observere og dokumentere gangavstand oppførselen. Se tabell 115 for scoring kriterier for vurdering av sykdommens alvorlighetsgrad (EAE poeng).
  5. Vurdere og dokumentere vekten av hver musen med i eksperimentet.
  6. For å sikre tilstrekkelig mat og vann opptak av mus viser en klinisk EAE score på 1 leverer fuktet mat i en plast rett på bunnen av byrået og oppdatere daglig.

4. In vivo permeabilitet analysen

  1. Forberedelser av løsninger:
    1. Dekstran lager løsninger oppløse 10 mg av 10 kDa dekstran Alexa Fluor 488 samt 3 kDa dekstran Texas rød i 500 µL 0,9% natriumklorid løsning (20 mg/mL).
    2. For det dekstran arbeider bare før injeksjon Pipetter 55 µL av 10 kDa dekstran Alexa Fluor 488 lagerløsning (20 mg/mL) på et stykke tetting film og legge 55 µL av 3 kDa dekstran Texas Red lagerløsning (20 mg/mL). Bland og samle 100 µL disponibel fine sprøyter (siste konsentrasjon 2 mg/100 µL) til.
    3. 10% formaldehyd (PFA) lager løsningen, kombinere 10 g PFA ekstra ren pulver, 100 mL PBS og 200 µL av 1N NaOH i en ren glass kanne og varme opp nøyaktig 56 ° C under omrøring bruker en magnetisk rørestang; holde på 56 ° C i 30 min før PFA er fullstendig oppløst; avkjøles til romtemperatur; justere pH 7,4; og filtrere gjennom et papirfilter. Butikken på - 20 ° C. Lager løsningen kan fortynnes videre med PBS.
  2. Like bedøve sunn C57BL/6 mus eller C57BL/6 mus lider EAE med isoflurane (musen vil bli bedøvet for ca 1 min). Bruk et automatisk system som i trinn 2.2.1 (mus vil være utsatt for 4,5% isoflurane i oksygen i en induksjon kammer og deretter overført til en ansiktsmaske med 2,1% isoflurane).
  3. Plassere bedøvet musen i lateral posisjon på bordet, deretter intravenøst (f.eks retro-orbitally) injisere 100 µL av fluorescerende tracers i musen før musen våkner.
  4. Umiddelbart fjerne på ansiktsmaske og kontroller at musen er fullt våken og motile bedøvelsen kort. La tracer sirkulere i 15 min.
  5. Fortsett med trinn 5.1.

5. perfusjon av mus

  1. I vivo permeabilitet vurdering:
    1. Begynne prosedyren 15 min etter fluorescerende tracer injeksjon av inducing dyp isoflurane anestesi. For å indusere bruke dyp anestesi i mus 2,3% av isoflurane i oksygen. Bruk det pote uttak refleks for å dømme dybde av bedøvelsen (klype i huden imellom toes, mangelen på strekking angir en tilstrekkelig dybde), og sonde reflekser av både forlemen og hindlimb i mus underlegges EAE.
    2. Rett musen på ryggen og spray magen med etanol. Åpne thorax bruker en saks og fjern mellomgulvet. Åpne høyre atriet ved det bankende hjertet med en saks og perfuse musen gjennom venstre ventrikkel hjertet med 10 mL PBS etterfulgt av 10 mL av 4% PFA i PBS.
      Advarsel: For å unngå innånding PFA, perfuse musen i avtrekksvifte.
    3. Videre til del 6.
  2. For i situ zymography:
    1. Indusere dyp isoflurane anestesi med 2,3% isoflurane i oksygen i en mus lider EAE, og sjekk dybden på anestesi som i trinn 5.1.1.
    2. Deretter rett musen på ryggen og spray magen med etanol. Åpne thorax bruker en saks og fjern mellomgulvet. Åpne høyre atriet ved det bankende hjertet med en saks og perfuse musen gjennom venstre ventrikkel hjertet med 20 mL PBS.
    3. Videre til del 6.

6. disseksjon og frysing av hjernen

  1. Utarbeidelse av kjøling bad:
    1. Fylle en flat dewar beholder med knust tørris og legge 2-methylbutane (Isopentane) til væsken når ca 1 cm over tørris pakken. Dekk med løs lokk-f.eks en isen bøtte dekke.
  2. Klippet hodet av perfused musen med skarp saks og fjerne hud og ører med en mindre saks.
  3. Nøye analysere skullcap ved å klippe fra de foramen magnum mot fronten på venstre og høyre side slik at upfold skullcap over hjernen. Deretter forsiktig løfte ut intakt hjernen fra bunnen av skallen mens kuttet optiske nervene bruker flat metall spatula.
  4. Plasser hjernen på aluminiumsfolie og kuttet hjernen i tre stykker (frontal hjernen, midterste hjernen, og lillehjernen + hjernestammen) ved å plassere to koronale kutt.
  5. Fylle en cryomold (25 mm x 20 x 5 mm) med første kvartal med optimal temperatur kutte (O.C.T.) matrix sted hjernen skiver med den fremre siden av hver hjernen stykke vendt nedover i cryomold og dekke vev helt med O.C.T. matrise.
  6. Plasser cryomold med vevet i en horisontal orientering i badekaret 2-Methylbutane og kontroller at vevet fryser fra bunnen til toppen i 1 minutt ved å unngå dyppe hele vev blokken i badekaret.
  7. Overføre frossent-80 ° c for lagring og fortsetter med del 7.

7. forberedelse av frossent

  1. Equilibrate temperaturer fra frossent fra-80 ° C til-20 ° C i kryostaten 30 min.
  2. Fjerne vev blokk fra cryomold og montere på kryostaten vev holderen (satt til-15 ° C) med O.C.T. matrise.
  3. Klippe kantene på vev blokken på omslag av kryostaten med en skarp skalpell og starte kutte i vev blokk ved å fjerne 20 µm deler med kryostaten kniven til vev er synlig.
  4. For analyse av i vivo BBB permeabilitet:
    1. Skjær 6-10 µm vev deler, samle dem på vedheft glass lysbilder, og umiddelbart bilde delene dekket med en cover slip bruker fluorescens mikroskop.
    2. Vurdere utseendet av blodårer i hjernen (ta hensyn til skarpe grenser ikke-leaky blodkar sammenlignet med diffus fluorescens mønstre observert i lekk blodkar). Som positive kontroll, kan du kontrollere lekkasje av tracer i stroma circumventricular organer eller den choroid plexus mangler en BBB.
  5. For i situ zymography:
    1. Kutte 6 µm vev seksjoner med en kryostaten, samle dem på vedheft glass lysbilder og fryse vev seksjoner ved 20 ° C i en fryser med silica gel i lokket.

8. i situ zymography kombinert med laminin/CD45 immunofluorescence flekker

  1. Forbered løsninger:
    1. Forbered innebygging løsning:
      1. Bland 6 g glyserol (analytisk grad), 2.4 g av poly (vinyl alkohol), 6 mL av ddH2O og 12 mL 0,2 M Tris buffer, pH 8, og rør (magnetisk rørestang) løsningen for 4 h på RT.
      2. Overføre løsningen til et 50 mL sentrifuge rør og la den hvile i 2 h på RT. Senere ruge løsningen for 10 min ved 50 ° C (vannbad) og sentrifuge for 20 min 2700 x g ved romtemperatur.
      3. Ta nedbryting og fryse i dele på 20 ° C.
    2. Forbered kaldt gelatin løsning:
      1. Oppløse 0,1 g av kald fra storfe huden i 10 mL av ddH2O.
      2. La den suge i minst 1 dag og lagre dele på 4 ° C.
    3. Forbered iskald metanol (20 ° C):
      1. Sette 100% metanol i en coplin krukke og kjøle ned 20 ° C.
    4. Forbered 10% natrium azide lager løsning:
      1. Legge 1 g av Natriumazid til 10 mL av ddH2O og lagre ved romtemperatur.
    5. Forbered 0,1% natrium azide fungerende løsning:
      1. Mix 99 µL av ddH2O med 1 µL av 10% natrium azide lager løsning.
    6. Oppløse 1 mg av fluorescein konjugert fargestoff-slukket (DQ) fra gris huden i 1 mL av Natriumazid arbeider løsning og lagre 100 µL dele beskyttet mot lys i 4 ° C.
    7. Oppløse 30 mg 1,10-phenanthroline monohydrat i 76 µL av etanol og butikk på 20 ° C.
    8. Forbered 25 x protease hemmer løsning:
      1. Legge til 1 tavle av EDTA gratis protease hemmer 2 mL ddH2O. Butikken på 20 ° C.
    9. Like før bruk, forberede reaksjon løsning (150 µL/inndelingen):
      1. Sentrifuge 1 mg/mL DQ gelatin løsningen for 5 min 13,300 x g.
      2. Blanding 127.2 µL av ddH2O, 15 µL av 10 x reaksjon buffer (Gelatinase/Collagenase analysen Kit, se Tabellen for materiale), 0,3 µL av 20 mg/mL kaldt, 1,5 µL av 1 mg/mL DQ og 6 µL 25 x protease hemmer løsning.
    10. Like før bruk, Forbered phenantroline negativ kontroll reaksjonen løsning (150 µL/inndelingen):
      1. Blanding 125.2 µL ddH2O, 15 µL av 10 x reaksjon buffer, 0,3 µL av 20 mg/mL kaldt gelatin, 1,5 µL av 1 mg/mL DQ, 6 µL 25 x protease hemmer EDTA gratis og 2 µL av 2 M 1,10-phenantroline (MMP hemmer).
    11. Like før bruk, forberede kaldt gelatin (ikke-fluorescerende) negativ kontroll reaksjonen løsning (150 µL/inndelingen):
      1. Blanding 128.7 µL av ddH2O, 15 µL av 10 x reaksjon buffer, 0,3 µL av 20 mg/mL kaldt og 6 µL av EDTA-fri 25 x protease inhibitor.
    12. Forberede primære antistoff cocktailparty for counterstaining, for eksempel, 0,95 µg/mL polyklonale kanin anti-laminin antistoffer og 10 µg/mL polyklonale rotten anti-CD45 antistoff 1% BSA i PBS, og forberede aktuelle isotype kontroll primære antistoff cocktailer.
    13. Klargjøre sekundære antistoff løsning, for eksempel 7,5 µg/mL Cy3 geit anti-rotte + 15 µg/mL AMCA anti-kanin i 1% BSA i PBS (beskytte fra lys).
  2. Tine 6 µm ikke-fast hjernen vev inndelinger fra EAE mus inne i plast frysing boksen som inneholder silica gel i lokket i avtrekksvifte å unngå oppbevaring av vann til vev og skille 2 vev seksjoner på ett lysbilde ved å tegne linjer med vann repelling penn
  3. Forberede reaksjon løsninger (trinn 8.1.9-8.1.11), sentrifuge for 5 min på 13,400 x g ved romtemperatur og pre varme 37 ° c ved hjelp av et vannbad.
  4. Rehydrate delene vev i 5 min på 37 ° C bruker 1 x reaksjon buffer. Deretter hell av 1 x reaksjon buffer legge reaksjon løsning på delene vev og ruge 4 h på 37 ° C. Vask lysbilder 5 ganger i ddH2O.
  5. Fikse delene i 5 min med iskald metanol på 20 ° C og etterpå vask deler én gang med PBS ved romtemperatur.
  6. Legg til 1% BSA i PBS delene og ruge for 20 min ved romtemperatur (beskytte fra lys). Deretter forkaste 1% BSA i PBS fra delene av bla lysbilder på vev, legger til primære antistoff cocktail og ruge 1t ved romtemperatur (beskytte fra lys).
  7. Vask deler to ganger med PBS, legge til sekundære antistoff cocktail og ruge 1t ved romtemperatur (beskytte fra lys).
  8. Vaske deler to ganger med PBS, montere lysbildene med innebygging løsning, la montert seksjoner tørke over natten i romtemperatur (beskytte fra lys). Til slutt, analysere farget vev seksjoner med fluorescerende mikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vurdering av klinisk selvfølgelig EAE i C57BL/6 mus skal resultere i en sykdom kurve som avbildet i figur 2A og endringer i kroppsvekt mus som presentert i figur 2B. C57BL/6 mus vaksinert med MOGaa35-55 vanligvis begynne å utvikle sykdomssymptomer rundt dag 10-12 etter aktiv immunisering (figur 1A). Vanligvis viser vaksineres mus en forbigående dråpe kroppsvekt dagen etter injeksjon av emulsjonen og den første dosen av kikhoste gift (figur 1B). Fra dag 2 etter EAE induksjon øker kroppsvekten vaksineres mus deretter gradvis til den sykdommen starter, når kroppsvekten vanligvis faller en dag før utviklingen av kliniske symptomer og fortsetter å redusere samkjøre den økende sykdomssymptomer (figur 1A,B). EAE sykdommens alvorlighetsgrad øker til toppen av sykdommen, som kan forventes mellom dager 16 og 20 etter EAE induksjon (figur 2A). På toppen av klinisk EAE viser mus også den laveste kroppsvekten (figur 2B), som øker i sammenheng med forbedring av EAE i remisjon fasen av sykdommen (figur 2A,B). EAE induksjon i C57BL/6 mus hjelp MOGaa35-55 resultatene i en kronisk sykdom patologi og mus vanligvis ikke fullt gjenopprette (figur 1A).

Figur 3A viser et representativt bilde av den choroid plexus og tilstøtende hjernen parenchyma C57BL/6 museklikk lider EAE som ble intravenøst injisert med fluorescerende 3 kDa dekstran (rød) og 10 kDa dekstran (grønn) 15 min før ofre ; skalere bar 50 µm. Som vi tidligere har vist, indikert tracers lett diffus over den fenestrated microvessels i stomi av den choroid plexus (venstre og den midterste bildet), mens BBB ikke tillater spredningen av sirkulerende tracers i hjernen parenchyma, av den stiplede linjen (høyre bilde), som er dermed uten alle fluorescerende signal. Figur 3B viser representant lekk blodkar i lillehjernen C57BL/6 museklikk lider EAE som ble intravenøst injisert med fluorescerende 3 kDa dekstran (rød) og 10 kDa dekstran (grønn) 15 min før ofre. Pilespisser angir tracers spredt over hjernen microvessels i CNS parenchyma (venstre og den midterste bildet), tyder på at funksjonen BBB er nedsatt i disse fartøyene. I CNS parenchyma er grønne og røde fluorescerende signalet synlig utenfor blod fartøy vegger, som angis av stiplede linjer. I EAE, kan i lillehjernen hvor inflammatorisk mansjetter vises tracers også finnes i perivascular rommet mellom endothelial kjelleren membranen og glia limitans som angir funksjonell tap av endothelial BBB integritet. Hvis tracer finnes for å spre inn i hjernen parenchyma, viser den flere dysfunksjon av glial barriere12.

Figur 4 viser representant bilder av analyse av gelatinase (MMP) aktivitet i en EAE hjernen C57BL/6 museklikk visualisert ved i situ zymography og lokalisert til spesifikke hjernens barriere avdelinger av pan laminin (blå) og tilstedeværelsen av inflammatoriske celler av anti-CD45 (rød) immunofluorescence flekker. Proteolytisk spalting av fargestoff-slukket (DQ) unquenches et fluorescein signal, som lar lokalisering av gelatinase aktivitet på delen vev. Når kald gelatin (ikke-fluorescerende kontroll) er ruges, ingen grønn fluorescerende signal kan oppdages delene hjernen fra EAE mus (øvre rad) og som har blitt ruget med DQ-gelatin kombinert med phenantroline, en potent Zn +- complexing agent og MMP hemmer (midterste rad). I den nederste raden vises fokal gelatinase/MMP aktiviteten som typisk detaljert lyse grønne fluorescens signal, som fremhevet av pilhodene. I inflammatorisk mansjetter i lillehjernen en EAE mus skjer MMP aktiviteten utover de glia limitans (blå) på steder av inflammatoriske celle infiltrasjon (rød).

Figure 1
Figur 1 : Grafisk representasjon av injeksjon nettsteder for EAE induksjon. 1) injeksjonsstedet for 30 µL MOG-emulsjon i høyre flanke, 2) injeksjonsstedet for 30 µL MOG-emulsjon i venstre flanke, 3) injeksjonsstedet for 20 µL MOG-emulsjon i venstre hale roten, 4) injeksjonsstedet for 30 µL MOG-emulsjon inn i retten halen roten 5) injeksjonsstedet for en liten dråpe MOG-emulsjon i nakken. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Representant selvfølgelig EAE. (A) sykdomssymptomer på EAE i C57BL/6 mus over tid. Betyr +/-SEM vises. (B) endre kroppsvekt under EAE over tid. Betyr +/-SEM vises.  Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Representativt bilde av i vivo permeabilitet. (A) venstre bilde: grønn fluorescerende 10 kDa dekstran på nivå med den choroid plexus. Midterste bildet: rød fluorescerende 3 kDa dekstran på nivå med den choroid plexus. Høyre bilde: flette venstre og den midterste bildene. Skaler bar 50 µm. (B) venstre bilde: grønn fluorescerende 10 kDa dekstran i musen lillehjernen. Midterste bildet: rød fluorescerende 3 kDa dekstran i musen lillehjernen. Høyre bilde: sammenslåing av venstre og den midterste bildene. Stiplede linjer er veiledende for blod fartøy vegger; pilespisser pek fluorescerende tracers i CNS parenchyma. Skala bar 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Representant bilder av i situ zymography. Første kolonne: grønn fluorescerende kanal (unquenched signal av fargestoff-slukket (DQ)). Andre kolonne: blå fluorescerende kanalen (laminin). Tredje kolonnen: røde fluorescerende kanalen (CD45). Fjerde kolonne: sammenslåing av fluorescerende kanaler. Øvre rad: kaldt gelatin (ikke-fluorescerende) negativ kontroll. Midtre rad: phenantroline (MMP-hemmer) negativ kontroll. Laveste: DQ gelatin. Skala bar 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

0-3 punktet scorer vilkår vekt endring
0 ingen tegn normal vekt
~ svak hale (svak tonus) - internt vilkår: ikke inkludert i dokumentert scoring vekttap (indikativ for 2 Sjekk)
0,5 Limp hale (hale dråper) vekttap
1 hindleg svakhet, ustø gangart (musen går på benken som en and) vekttap
2 hindleg paraplegia (musen flyttes ikke sin hindlimbs) alvorlig vekttap (indikativ for 2 Sjekk)
3 hindleg paraplegia, inkontinens tap av lavere kroppsbeherskelse (musen faller til en side, men kan flytte i buret med ist frontlegs + inkontinens; døende) svært lav kroppsvekt (indikativ for 2 Sjekk)

Tabell 1: Scoring kriterier for vurdering av EAE sykdommens alvorlighetsgrad.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her presenterer vi en protokoll for å indusere og overvåke EAE i kvinnelige C57BL/6 mus. Kvinner er preferentially valgt, og det er en forekomst av kvinner: menn 3:1 i MS. For å vurdere alvorlighetsgraden av EAE, vi gjort bruk av et 3-punkts scoring ark. EAE alvorlighetsgraden er generelt scoret med hensyn til alvorlighetsgraden av motor dysfunksjoner. Mus med avanserte stadier av EAE, dvs viser en score over 2 skal bli ofret for å unngå unødvendig lidelse av dyrene. Derfor er det anbefalt å score mus med like intervaller f.eks to ganger daglig som forklart i protokollen.  Det er flere scoring rutiner ansatt, strekker seg fra 0-3 poeng til 0-6 poeng16,17,18,19 eller enda mer subpoints20. Men har vi tidligere vist at angivelig raffinert EAE scoring ikke fører til noen forbedring å bestemme mulige statistisk signifikante forskjeller i sykdom score mellom grupper, når de vurderer de samlede sykdom alvorlighetsgrad15. Basert på denne observasjonen vi gjort bruk av 3-punkts skala for å vurdere sykdomsprogresjon i EAE for å redusere musen behandlingstiden og dermed utmattelse for mus implementere 3R reglene. En annen kritisk punkt ved hjelp av EAE modellen for å studere forskjellene mellom knockout og vill-type mus eller forskjeller mellom behandlingsgrupper er å sette opp en nøyaktig eksperimentelle planlegging. Sammenlignet med vill-type mus er knockout mus, er det viktig å sammenligne littermates fra heterozygote parring slik identiske genetisk bakgrunn av vill-type og knockout mus i EAE eksperimentet. Det er også viktig å holde samme forhold for alle mus i et eksperiment, f.eks bur endringer, administrasjon av våt næringen, og spesielt mus boliger (helse tilstand) forhold. For å unngå bur-spesifikke fenomener av etterforskeren, skal cross-immunisering utføres. Mer presist, hvis flere sprøyten er nødvendig å vaksinere et visst antall mus, skal de tilfeldig tilordnes til forskjellige sprøyter brukes. Sistnevnte bør likeledes brukes for utførelsen av behandlingsstudier. Sist men ikke minst, helsetilstanden til mus i forskjellige dyr fasiliteter kan påvirke på sykdom forekomsten og alvorlighetsgraden og dermed mer21 eller mindre Mycobacterium tuberculosis22 kan være nødvendig å indusere en skikkelig klinisk sykdom. Videre kan injeksjonsstedet påvirke sykdom utvikling. I denne protokollen foreslår vi å injisere relativt små volumer i fem forskjellige subkutan områder: 30 µL i to flanks, 20 µL til venstre og høyre hale roten, og en liten dråpe i nakken. Andre protokoller plasseres 50 µL depoter subcutaneously til halen rot bare23 eller fire flankene21. Injeksjoner av mindre depoter, men minimere risikoen for å forårsake hudirritasjon, hvilken mus kan prøve å klø.

In vivo permeabilitet kan utføres å vurdere BBB lekkasje under EAE, men også å vurdere om bestemt genetisk sletting av et molekyl eller en behandling påvirker BBB integritet i vivo. Dette kan utføres enten ved påvisning av endogene plasma tracers som IgG innskudd12 eller eksogene trances som brukes i sirkulasjonen av en levende mus24. I denne protokollen vi gjort bruk av to forskjellige eksogene tracers (3 kDa og 10 kDa dekstran) som ble samtidig injisert og lov til å sirkulere for et bestemt tidspunkt av 15 min. med to tracers med forskjellige størrelser kan fastslå alvorlighetsgraden av BBB dysfunksjon og kan definere en cutoff tracer størrelser som diffus eller ikke over BBB. Fluorescerende dextrans er hydrofile polysakkarider preget av god vannløselighet, lav toksisitet, og lav relativt immunogenisitet. Videre består dextrans av poly-(α-D-1,6 glukose), som er motstandsdyktig mot spalting av endogene mobilnettet glycosidases. Vi brukte her dekstran varianter som har lysin rester innlemmet i dekstran konjugert. Lysinated dextrans er aldehyd fixable, som tillater for å fikse tracer i vevet. Foruten fluorescently merket dextrans, kan andre kjemikalier brukes til å vurdere i vivo permeabilitet, f.eks Hoechst fargestoff i kombinasjon med Evan's blue, som binder seg til en stor del til serum albumin. Hoechst flekker BBB endothelial celle kjerner fôr CNS microvessels, og Evans blå kan oppdages i perivascular plass på BBB dysfunksjon og diffunderer videre når den glia limitans er forstyrret25,26. I kontrast gir vurdere i vivo permeabilitet av immunofluorescent farging av endogene markører innsikt i akkumulering av, f.eks IgG molekyler eller fibrinogen, en glykoprotein som sirkulerer i blodet, over tid. Sunt forhold, perivascular plassen er svært smale endothelial kjelleren membranen og glia limitans er nært koblet og dermed visualisere to ECM barrierer av NVU krever laminin isoformen-spesifikke antistoffer flekker27 .

Endogene IgG molekyler er tilstede i helse og sykdom i blodkar også som vev av circumventricular organer, der ingen BBB er etablert12. I genet endret mus med hjernen barriere defekter, under behandling eller under neuroinflammation endogene molekyler som normalt sirkulerer i blodet kan deponeres i CNS parenchyma, som kan visualiseres counterstaining med anti-laminin antistoffer enten gjenkjenne alle laminin isoformene (pan-laminin antistoffer) eller laminin isoformen-spesifikke antistoffer tillater for å skille laminins, laminin α4 og α5 fra endothelial kjelleren membranen og laminin α1 og laminin α2 fra glia limitans. Under neuroinflammatory forhold kan perivascular plassen utvides ved å infiltrere immunceller tillater for å identifisere både endothelial kjelleren membranen og glia limitans med et pan-laminin antistoff. Counterstaining av laminins i NVU kan vurdere om endogene men også eksogene tracers settes i CNS parenchyma og counterstaining av CD45 kan vurdere om fokal lekkasje av BBB er forbundet med immun celle infiltrasjon.

Immun celle migrasjon i CNS parenchyma krever sekvensiell krysset av to forskjellige barrierer innenfor NVU endothelial BBB og senere glia limitans28. Glia limitans og CNS oppføring av immunceller korrelerer med utbruddet av klinisk EAE29, mens CNS infiltrere celler fanget i leptomeningeal og perivascular områder utløse ikke klinisk EAE. Immun celle overlapping i leptomeningeal- og perivascular mellom kjelleren membraner har blitt observert i flere genet endret musen modeller f.eks L-selectin knockout mus30, TNF knockout mus23, MMP2/MMP9 dobbel knockout mus10 , og JAM-B knockout mus12. Disse funnene understreker at mangel på disse molekylene ikke påvirker immun celle migrasjon over BBB men heller over glia limitans, understreker at molekylære mekanismer formidling immun celle migrasjon BBB og glia limitans er tydelig. Hjernen i situ zymography er en metode for å undersøke fokal gelatinase aktivitet i en vev delen presis romlige korrelasjon til CNS patologi. Påvisning av i vivo BBB permeabilitet sammen med utfører i situ zymography for å oppdage MMP2/MMP9 aktivitet dermed kan avgrense endothelial versus glia barriere forstyrrelser i sammenheng med immun celle infiltrasjon. Kombinert med pan-laminin og CD45 immunofluorescence flekker på EAE hjernen deler, lar den både lokalisering av gelatinase aktivitet av unquenching DQ-gelatin og lokalisering av infiltrere immunceller samtidig. Unquenching av fluorescein fra DQ-gelatin resultater i et typisk detaljert lyse grønne fluorescens signal, mens usammenhengende svakt fluorescerende grøntområder på vev deler må betraktes som uspesifikke signal12. Dermed nøye vurdering av vev inndelinger og riktig kontroller er uunnværlig når du utfører i situ zymography. I denne protokollen utført vi i situ zymography i kombinasjon med CD45 og laminin flekker. Primære antistoffer mot både CD45 og laminin ble utviklet som en blanding på samme tid. Tilsvarende ble sekundære antistoffer utviklet som en blanding på en andre flekker. Slike kombinasjoner av antistoffer må testing for å sikre at andre scenen antistoffer opp mot andre IgGs for å unngå kryssreaktivitet.

Samlet tilbyr protokollene presenteres her verktøy for å undersøke i detalj hvilket element i NVU er nedsatt i neuroinflammatory forhold til EAE. In vivo permeabilitet vurdering av eksogene tracers kan identifisere gjeldende verdifall mikrovaskulær endothelial celle integritet eller gjeldende svekkelse av NVU. I tillegg kan innføring av tracers med forskjellige størrelser anslå alvorlighetsgraden av BBB verdifall. Flere i situ zymography avdekker fokal gelatinase aktivitet i astrocyttene og potensielt inflammatoriske celler, som er nødvendig for å bryte glia limitans som en siste barriere før du får tilgang til CNS parenchyma10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

Vi erkjenner takknemlig Lydia Sorokin, som delte hennes opprinnelige i situ zymography protokollen10 med oss.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AMCA anti-rabbit antibody Jackson ImmunoResearch 111-156-045 Store at 4 °C; protect from light
Anti-CD45 Antibody (30F11) Pharmingen 07-1401 Store at 4 °C
Anti-Laminin Antibody DAKO Z0097 Store at 4 °C
Breeding food e.g. PROVIMI KLIBA SA 3336
Individually ventilated cages, Blue line Type II or III e.g. Tecniplast 1145T, 1285L
BSA fraction V Applichem A1391 Store at 4 °C
Cold gelatine Sigma-Aldrich G 9391
Coplin jar + rack e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG H554.1; H552.1
Cy3 anti-rat antibody Jackson ImmunoResearch 111-156-144 Store at 4 °C; protect from light
Cover slips 24 x 40 mm # 1 e.g. Thermo Scientific 85-0186-00
Dextran Alexa Fluor 488 (10,000 MW) e.g. Molecular probes D22910 Store at -20 °C; protect from light
Dextran Texas Red (3000 MW) Invitrogen D3328 Store at -20 °C; protect from light
EnzChek Gelatinase/Collagenase Assay Kit  Thermo Fisher Scientific; EnzCheck E12055 Store at -20 °C; protect form light
Female C57BL/6J mice (8-12 weeks) e.g. Janvier Labs Females, 8-12 weeks
Freezing box for histology slides e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG 2285.1
18G x 1½’’ (1.2mm x 40mm) injection needle e.g. BD, BD Microlance 3 304622
27G x ¾’’ – Nr. 20 (0.4mm x 19mm) injection needle e.g. BD, BD Microlance 3 302200
30G x ½’’ (0.3 mm x 13 mm) injection needle e.g. BD, BD Microlance 3 304000
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) e.g. Santa Cruz Biotechnology sc-24648 Store at 4°C
Maintenance food e.g. PROVIMI KLIBA SA 3436
MOGaa35-55 peptide e.g. GenScript Store at -80 °C
microscope slides (Superfrost Plus ) Thermo Scientific J1800AMNZ
Mycobacterium tuberculosis H37RA e.g. BD 231141 Store at 4 °C 
NaCl 0.9 % B. Braun 3535789
O.C.T. compound (Tissue-Tek ) Sakura 4583
Omnican 50 30G x ½’’ B. Braun 9151125S
Paraformaldehyde Merck 30525-89-4
Pertussis toxin e.g. List biological laboratories, Inc. 180 Store at 4 °C
poly(vinyl alcohole) (Mowiol 4-88) Sigma-Aldrich 81381
Protease Inhibitor EDTA free (Roche) Sigma-Aldrich 4693132001 Store at 4 °C
repelling pen e.g. DAKO Pen e.g. DAKO S2002
sealing film e.g. Parafilm M e.g Sigma-Aldrich P7793
Silica gel e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG 9351.1
Stitch scissor F.S.T 15012-12
syringe 1 ml e.g. PRIMO 62.1002
syringe 10 ml e.g. CODAN Medical ApS 2022-05
vaporizer system Univentor 400 UNO.BV

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tietz, S., Engelhardt, B. Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions. Journal of Cell Biology. 209, 493-506 (2015).
  2. Wu, C., et al. Endothelial basement membrane laminin alpha5 selectively inhibits T lymphocyte extravasation into the brain. Nature Medicine. 15, 519-527 (2009).
  3. Hannocks, M. J., et al. Molecular characterization of perivascular drainage pathways in the murine brain. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 38, 669-686 (2018).
  4. Kermode, A. G., et al. Breakdown of the blood-brain barrier precedes symptoms and other MRI signs of new lesions in multiple sclerosis. Pathogenetic and clinical implications. Brain. 113 (Pt 5), 1477-1489 (1990).
  5. Tommasin, S., Gianni, C., De Giglio, L., Pantano, P. Neuroimaging techniques to assess inflammation in Multiple Sclerosis. Neuroscience. , (2017).
  6. Lopes Pinheiro, M. A., et al. Immune cell trafficking across the barriers of the central nervous system in multiple sclerosis and stroke. Biochimica Biophysica Acta. 1862, 461-471 (2016).
  7. Bartholomaus, I., et al. Effector T cell interactions with meningeal vascular structures in nascent autoimmune CNS lesions. Nature. 462, 94-98 (2009).
  8. Kyratsous, N. I., et al. Visualizing context-dependent calcium signaling in encephalitogenic T cells in vivo by two-photon microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, E6381-E6389 (2017).
  9. Lodygin, D., et al. A combination of fluorescent NFAT and H2B sensors uncovers dynamics of T cell activation in real time during CNS autoimmunity. Nature Medicine. 19, 784-790 (2013).
  10. Agrawal, S., et al. Dystroglycan is selectively cleaved at the parenchymal basement membrane at sites of leukocyte extravasation in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Experimental Medicine. 203, 1007-1019 (2006).
  11. Song, J., et al. Focal MMP-2 and MMP-9 activity at the blood-brain barrier promotes chemokine-induced leukocyte migration. Cell Reports. 10, 1040-1054 (2015).
  12. Tietz, S., et al. Lack of junctional adhesion molecule (JAM)-B ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis. Brain, Behavior, and Immunity. 73, 3-20 (2018).
  13. Mähler Convenor, M., Berard, M., Feinstein, R., Gallagher, A., Illgen-Wilcke, B., Pritchett-Corning, K., Raspa, M. FELASA working group on revision of guidelines for health monitoring of rodents and rabbits. FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units. Lab Anim. 48 (3), 178-192 (2014).
  14. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visual Experiments. , (2014).
  15. Tietz, S. M., et al. Refined clinical scoring in comparative EAE studies does not enhance the chance to observe statistically significant differences. European Journal of Immunology. 46, 2481-2483 (2016).
  16. Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).
  17. Miller, S. D., Karpus, W. J. Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse. Current Protocols in Immunology. 15, Chapter 15 Unit 14 (2007).
  18. Sobel, R. A., Tuohy, V. K., Lu, Z. J., Laursen, R. A., Lees, M. B. Acute experimental allergic encephalomyelitis in SJL/J mice induced by a synthetic peptide of myelin proteolipid protein. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 49, 468-479 (1990).
  19. Westarp, M. E., et al. T lymphocyte line-mediated experimental allergic encephalomyelitis--a pharmacologic model for testing of immunosuppressive agents for the treatment of autoimmune central nervous system disease. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 242, 614-620 (1987).
  20. Klotz, L., et al. B7-H1 shapes T-cell-mediated brain endothelial cell dysfunction and regional encephalitogenicity in spontaneous CNS autoimmunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, E6182-E6191 (2016).
  21. Tietz, S. M., et al. MK2 and Fas receptor contribute to the severity of CNS demyelination. PLoS One. 9, e100363 (2014).
  22. Coisne, C., Mao, W., Engelhardt, B. Cutting edge: Natalizumab blocks adhesion but not initial contact of human T cells to the blood-brain barrier in vivo in an animal model of multiple sclerosis. Journal of Immunology. 182, 5909-5913 (2009).
  23. Korner, H., et al. Critical points of tumor necrosis factor action in central nervous system autoimmune inflammation defined by gene targeting. Journal of Experimental Medicine. 186, 1585-1590 (1997).
  24. Krueger, M., et al. Blood-brain barrier breakdown involves four distinct stages of vascular damage in various models of experimental focal cerebral ischemia. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 35, 292-303 (2015).
  25. Hawkins, B. T., Egleton, R. D. Fluorescence imaging of blood-brain barrier disruption. Journal of Neuroscience Methods. 151, 262-267 (2006).
  26. Graesser, D., et al. Altered vascular permeability and early onset of experimental autoimmune encephalomyelitis in PECAM-1-deficient mice. Journal of Clinical Investigation. 109, 383-392 (2002).
  27. Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Seminars in Immunopathology. 31, 497-511 (2009).
  28. Owens, T., Bechmann, I., Engelhardt, B. Perivascular spaces and the two steps to neuroinflammation. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 67, 1113-1121 (2008).
  29. Sixt, M., et al. Endothelial cell laminin isoforms, laminins 8 and 10, play decisive roles in T cell recruitment across the blood-brain barrier in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Cell Biology. 153, 933-946 (2001).
  30. Grewal, I. S., et al. CD62L is required on effector cells for local interactions in the CNS to cause myelin damage in experimental allergic encephalomyelitis. Immunity. 14, 291-302 (2001).

Tags

Immunologi og infeksjon problemet 145 immunforsvaret anatomi Hemic og immunforsvar kardiovaskulære systemet nervesystemet sykdommer nervøse System sykdommer eksperimentelle autoimmune immunsviktvirus i vivo permeabilitet i situ zymography blod-hjerne barriere glia limitans nevrovaskulære enhet
Visualisere nedsatt Endothelial og Glial barrierer av nevrovaskulære under eksperimentelle Autoimmune immunsviktvirus i Vivo
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tietz, S. M., Engelhardt, B.More

Tietz, S. M., Engelhardt, B. Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo. J. Vis. Exp. (145), e59249, doi:10.3791/59249 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter