Summary
Aquí, presentamos los protocolos para investigar el deterioro de la unidad neurovascular durante la encefalomielitis autoinmune experimental en vivo. Específicamente abordamos cómo determinar permeabilidad de la barrera blood - brain y gelatinasa actividad involucrada en la migración de leucocitos a través de la glía INCURVATA4.
Abstract
La unidad neurovascular (NVU) se compone de células endoteliales microvasculares formando la barrera blood - brain (BBB), una membrana basal endotelial con pericitos encajado, y la glia INCURVATA4 compuesta por la membrana basal parenquimal y astrocíticos alimentación final abarca el aspecto abluminal de microvasos del sistema nervioso central (SNC). Además de mantener el CNS homeostasis el NVU controla tráfico de células inmunes en el SNC. Durante el ataque del SNC bajo número de linfocitos activados puede cruzar la barrera endotelial sin causar disfunción BBB o enfermedad clínica. En contraste, durante la neuroinflamación tales como esclerosis múltiple o su modelo animal encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) un gran número de células inmunes puede cruzar el BBB y posteriormente la glia INCURVATA4 eventualmente alcanzar el parénquima de la CNS hacia la enfermedad clínica. Migración de células inmunes en la parenquimia del CNS es así un proceso de dos etapas que implica una migración secuencial a través de la barrera endotelial y glial de NVU empleando distintos mecanismos moleculares. Si después de su paso a través de la barrera endotelial, células T encuentran su antígeno cognado en células presentadoras de antígenos perivasculares su reactivación local iniciará posterior mecanismos que conducen a la activación focal de matrilisina, que permitirá a las células T cruzar la barrera glial y entrar en el parénquima del CNS. Por lo tanto, evalúe la permeabilidad BBB y actividad MMP en correlación espacial con acumulación de células inmunitarias en el SNC durante la EAE permite para especificar la pérdida de la integridad de las barreras endoteliales y gliales del NVU. Aquí mostramos cómo inducir EAE en ratones C57BL/6 por inmunización activa y posteriormente analizar permeabilidad BBB en vivo usando una combinación de marcadores fluorescentes exógenos. Mostramos además, cómo visualizar y localizar la actividad gelatinasa en el cerebro de EAE por zymogaphy in situ junto a los stainings inmunofluorescentes de las membranas del sótano BBB y CD45 + invade las células inmunes.
Introduction
Sistema nervioso central (SNC) coordina todos los cuerpo y las funciones mentales en los vertebrados, y homeostasis del CNS es esencial para una adecuada comunicación de las neuronas. Homeostasis de la CNS está garantizada por la unidad neurovascular (NVU), que protege el SNC desde el ambiente cambiante de la corriente sanguínea. El NVU se compone de células endoteliales microvasculares de la CNS, bioquímicamente único y establecen la barrera blood - brain (BBB) en continua interferencia con pericitos, astrocitos, neuronas y componentes de la matriz extracelular (ECM), establecimiento de dos las distintas membranas del sótano1. La membrana basal endotelial que ensheathes el aspecto abluminal de las células endoteliales de BBB alberga un alto número del pericitos y se compone de laminina α4 y α5 del laminin, además de otras proteínas de ECM2. En contraste, la membrana basal parenquimal consta de laminina α1 y α2 de laminina y es abrazada por fin pies astrocíticos. La membrana basal parenquimal junto con los astrositos final-pies compone el INCURVATA4 de glia que segrega la red neuronal del CNS de la llena de líquido cerebroespinal perivascular o espacios subaracoideos3. Debido a la arquitectura única del NVU, células inmunitarias trata hacia el SNC es distinto que en los tejidos periféricos ya que requiere un proceso de dos pasos con las células inmunes, primero incumplimiento BBB endotelial y posteriormente la glia INCURVATA4 a fin de alcanzar el parénquima de la CNS.
Esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad común de la capensis del CNS, en la que un gran número de células inmunes circulantes entre el SNC y causar neuroinflamación, desmielinización y pérdida focal de BBB integridad4. Pérdida de la integridad BBB es un sello temprano de MS, como se indica por la presencia de contraste de gadolinio mejora las lesiones en el SNC como visualizado por la proyección de imagen de resonancia magnética (MRI)5. Extravasación del leucocito en el SNC se produce a nivel de vénulas postcapilares; sin embargo, los mecanismos precisos involucrados en la diapedesis celular inmune a través de la membrana del sótano BBB y posteriormente la barrera glial quedan por explorarse. Encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) sirve como un modelo animal para MS y ha contribuido significativamente a nuestro conocimiento actual sobre la patogenia de la EM. Por ejemplo, utilizando el modelo EAE se ha descubierto que la extravasación del leucocito ocurre en un proceso de varios pasos, incluyendo una captura inicial y balanceo paso mediado por selectinas y moléculas de mucina-como como ligando glicoproteína P-selectina (PSGL) -1, seguido por detención firme dependiente de integrinas y arrastre de células T en las células endoteliales de BBB a lados permisivas por diapedesis6.
Una vez que las células T han cruzado el BBB endotelial y la membrana basal endotelial, que necesitan encontrar su antígeno cognado en macrófagos o células dendríticas localizadas estratégicamente en los espacios de leptomeningeal o perivascular. Esta interacción induce producción focal de mediadores pro-inflamatorios disparo los mecanismos posteriores necesarios para la invasión del tejido del CNS de células inmunes por la glia INCURVATA47,8,9. Focal activación de metaloproteinasas de matriz (MMP) -2 y MMP-9 altera la activación de chemokine e induce la degradación de receptores de matriz extracelular en astrositos final-pies, que es un prerrequisito para inmune migración de la célula a través de la INCURVATA4 de glia en la Parénquima de CNS e inducir la aparición de síntomas clínicos de EAE10,11.
Combina la detección de CNS infiltración celular inmune con BBB actividad salida y gelatinasa en las secciones de tejido de CNS ofrece información valiosa sobre la integridad funcional de la barrera endotelial y glial en el contexto de la neuroinflamación. Por ejemplo, hemos investigado recientemente la pérdida constitutiva de la molécula de adherencia junctional de molécula endotelial ensambladura apretada (JAM)-B en el tráfico de células inmunes en el SNC en el contexto de la EAE. No comparado con saludables ratones C57BL/6 de tipo salvaje, sanas hermanos de camada de mermelada-B-deficiente mostraron ningún deterioro de la integridad BBB como se muestra en la evaluación de la permeabilidad in vivo utilizando marcadores endógenos como exógenos12. En el marco de la EAE, ratones C57BL/6 B-mermelada-deficiente mostraron síntomas de la enfermedad mejoró, que se asoció con captura de células inflamatorias en los espacios de leptomeningeal y perivascular12. Para examinar este fenómeno aplicamos zymography en situ , que permita la identificación de la actividad gelatinasa para probar si la falta de actividad gelatinasa en ratones deficientes en B-atasco puede ser responsable por el reducido número de células inmunes capaces de romper la glia INCURVATA412.
Dada la disponibilidad de diferentes genéticamente ratón modelos carece de, por ejemplo, diferentes moléculas de ensambladura apretada BBB que pueden provocar cambios en la función BBB, metodologías para investigar la integridad BBB son importantes. Además, fármacos recientemente desarrollados podrían impactar sobre las barreras NVU. Aquí mostramos cómo inducir EAE en ratones C57BL/6 por inmunización activa con la glicoproteína del oligodendrocyte del myelin (MOG)-péptido aa35-55 en adyuvantes de Freund completo. A continuación explicamos cómo localizar la infiltración de células inmunitarias a través de las barreras endoteliales y gliales del NVU y cómo estudiar la integridad de la barrera endotelial y glial en vivo por la detección in situ de marcadores exógenos y la actividad gelatinasa, respectivamente.
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Protocol
Todos los estudios se llevaron a cabo bajo las directrices de acuerdo con la legislación Suiza relativa a la protección de los animales y fueron aprobados por la Oficina veterinaria del cantón de Berna, Suiza (número de autorización: BE 31/17 y ser 77/18).
1. vivienda de ratones C57BL/6 en la condiciones libres de patógenos específicos (SPF)
- Ciclo de ratones en jaulas individuales ventilados con una 12/12 h luz / oscuridad de la casa. Proporcionar alimento y agua ad libidum. Para supervisar la calidad microbiológica de los ratones, la cohorte experimental experimentó la vigilancia de la salud trimestral por centinelas de la ropa sucia de cama siguiendo las recomendaciones de personal13.
- Uso oreja Punzones para marcar individualmente ratones C57BL/6 femeninos 8-12 semanas de edad.
2. inmunización de ratones C57BL/6
- Preparación de soluciones14:
- Para el coadyuvante completo de Freund (CFA), mezclar 30 mL de adyuvante de Freund incompleto con 120 mg de calor recién pestled inactiva Mycobacterium tuberculosis (H37RA) bajo una campana de humos. Almacenar la solución a 4 ° C.
- Para la solución MOGaa35-55-péptido, MOGaa35-55-péptido en PBS estéril (4 mg/mL) se disuelven y almacenar a-80 ° C.
- Preparar la emulsión MOG:
- Diluya 1:2 con solución MOG-péptido en un microtubo 2 mL el CFA.
- Sellar el microtubo con la película y se fijan en un mezclador Vortex cubriendo completamente el tubo con cinta adhesiva. Emulsión de Vortex durante 4 h a 4 ° C.
- Preparar las jeringuillas con emulsión estable:
- Toma microtubo y girar rápidamente por la emulsión utilizando una centrífuga de mesa. Recoger la emulsión en una jeringa con una aguja de inyección 18 x 1½'' (1,2 x 40 mm).
- Según el número de ratones ajustar el volumen de la emulsión en la jeringa (100 μl/ratón) y vuelva a colocar la aguja de 18 G con una aguja de inyección 27 x ¾'' (0,4 mm x 19 mm). Sello de la aguja a la jeringa con la película.
- Para la tos ferina toxina (PTx) solución, disolver 50 μg de PTx liofilizado en 500 μl de PBS estéril (100 ng/μL). Almacenar la solución a 4 ° C.
- Para la solución de trabajo de PTx mix 97 μl de PBS estéril con 3 μl de solución stock de PTx (300 ng/100 μL) por ratón (para uso de la inyección intraperitoneal una aguja 30 x ½'' (0,3 mm x 13 mm)).
- Inducción de EAE
- Anestesiar ratones C57BL/6 con un sistema vaporizador isofluorane. Para inducir anestesia en ratones, exponga el ratón para isofluorane 4.5% en oxígeno en una cámara de incubación pequeñas antes de transferir el ratón a una máscara con isofluorane 2,1%. Utilizar una unidad de anestesia equipada con cojín de calefacción para prevenir la hipotermia del ratón.
- Fijar el ratón anestesiado en una mano y primero inyectar por vía subcutánea 30 μl de MOG35-55/CFA-emulsión en pata trasera flancos (Figura 1:1 + 2; en total 60 μL; izquierda flanco 30 μl y flanco derecho 30 μL) en proximidad cercana a los ganglios linfáticos inguinales.
- Coloque el ratón sobre su vientre e inyectar 20 μl de MOGaa35-55/CFA-emulsión en el izquierda y derecha suave tejido graso en la raíz de la cola (Figura 1:3 + 4; en total 40 μl; derecha e izquierda cola raíz 20 μl raíz 20 μl de la cola) y una pequeña gota de int MOGaa35-55/CFA-emulsión o el cuello del ratón (figura 1: 5).
- Inyectar 100 μl de solución de PTx por vía intraperitoneal en el ratón. Sostenga la cabeza del ratón debajo del centro del cuerpo evitando la inyección en el intestino.
- Reemplazar la dieta de mantenimiento (extrusión principales nutrientes: 18.5% de proteína cruda, grasa cruda 4.5% 4.5% de fibra cruda; Cenizas brutas 6.5%; almidón 35%; energía metabólica: 13.1 MJ/kg) a la dieta de cría (extrusión principales nutrientes: proteína cruda 23.5%, grasa cruda 5.5%, fibra bruta 3%; ceniza bruta 5.7%; 36% de almidón; energía metabólica: 14.3 MJ/kg) para los ratones con el alimento de mayor contenido de energía antes y durante la enfermedad clínica esperada.
- Retire la mascarilla y transferir el ratón a su jaula casera con una almohadilla de calentamiento. Asegúrese de que el ratón esté totalmente despierto y móviles después de 10 minutos.
- Repetir la inyección PTx (2.2.4) 48 h después del primer tratamiento.
3. puntuación de ratones EAE
- Comprobar el estado de salud de los ratones EAE cada mañana echando un vistazo dentro de las jaulas.
- Cuenta ratones EAE cada tarde.
- Tomar cada ratón individual incluido en el experimento EAE de la jaula y comprobar si la cola tiene tono moviéndolo hacia arriba con un dedo. Un ratón sano seguir su cola (la cola tiene un tonus). Si clínica EAE ha comenzado, el tono de la cola será inferior, visible por la gradual caída de la cola. Finalmente el ratón no será capaz de levantar su cola en todo.
- Cada ratón individual incluido en el experimento de la EAE en el Banco limpio y observar y documentar el comportamiento de a pie. Ver tabla 115 de recuento de los criterios para la evaluación de severidad de la enfermedad (score de EAE).
- Evaluar y documentar el peso de cada ratón incluido en el experimento.
- Para asegurar una alimentación adecuada y la absorción de agua por los ratones mostrando una EAE clínica score 1 suministrar alimento húmedo en un plato de plástico en la parte inferior de la jaula y actualizar todos los días.
4. ensayo de permeabilidad In vivo
- Preparación de soluciones:
- Soluciones stock de dextrano, disolver 10 mg de 10 kDa dextrano Alexa Fluor 488, así como 3 kDa dextrano Texas Red en 500 μl de solución de cloruro de sodio 0,9% (20 mg/mL).
- Para la solución de trabajo de dextrano, justo antes de la inyección pipeta 55 μl de 10 kDa dextrano Alexa Fluor 488 stock solución (20 mg/mL) en un pedazo de película y añadir 55 μl de 3 kDa dextran solución madre de rojo de Texas (20 mg/mL). De la mezcla y recoger 100 μL en una jeringuilla fina (concentración final 2 mg/100 μL).
- Para la solución madre de formaldehído (MF) de 10%, se combinan 10 g de polvo extra puro PFA, 100 mL de PBS y 200 μL de NaOH 1N en un vaso de vidrio limpio y calor hasta precisamente de 56 ° C bajo agitación con un agitador magnético; mantener a 56 ° C por 30 min hasta que se haya disuelto completamente el PFA; enfriar a temperatura ambiente; ajustar el pH a 7.4; y filtrar con un filtro de papel. Almacenar a - 20 ° C. La solución puede diluirse más con PBS.
- Anestesiar poco saludables ratones C57BL/6 o ratones C57BL/6 sufren de EAE con isoflurano (el ratón será sedado durante aproximadamente 1 minuto). Utilizar un sistema automatizado como en el paso 2.2.1 (ratones serán expuestos a 4,5% de isoflurano en oxígeno en una cámara de inducción y entonces transferidos a una máscara con 2.1% isoflurano).
- Coloque el ratón anestesiado en posición lateral sobre la mesa, luego por vía intravenosa (por ejemplo retro-orbitally) inyectar 100 μl de marcadores fluorescentes en el ratón antes de que el ratón se despierta.
- Quitar la mascarilla inmediatamente y asegúrese de que el ratón esté totalmente despierto y móviles después de la anestesia corta. Que el trazador circule durante 15 minutos.
- Continúe con el paso 5.1.
5. perfusión de ratones
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Para la evaluación de la permeabilidad en vivo:
- Comenzar el procedimiento de 15 minutos después de la inyección del trazador fluorescente mediante la inducción de la anestesia isoflurano profundo. Para inducir la anestesia profunda en ratones usar 2.3% de isoflurano en oxígeno. Utilice el reflejo de retirada de la pata para juzgar la profundidad de la anestesia (pellizcar la piel entre los dedos del pie; la falta de flexión indica una profundidad suficiente) y probe los reflejos de la extremidad delantera y la trasera en ratones sometidos a EAE.
- Fijar el ratón en su parte posteriora y el vientre del aerosol con etanol. Abrir el tórax con una tijera y retire el diafragma. Abrir la aurícula derecha del corazón usando una tijera y perfusión el ratón a través del ventrículo izquierdo del corazón con 10 mL de PBS, seguido de 10 mL 4% PFA en PBS.
PRECAUCIÓN: Para evitar la inhalación de PFA, inundar el ratón en una campana de humos. - Proceder a la sección 6.
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Por zymography en situ :
- Inducen anestesia isoflurano profundo con 2.3% de isoflurano en oxígeno en un ratón sufriendo de EAE y verificar la profundidad de la anestesia como en el paso 5.1.1.
- A continuación, fijar el ratón en su parte posterior y el vientre del aerosol con etanol. Abrir el tórax con una tijera y retire el diafragma. Abrir la aurícula derecha del corazón usando una tijera y perfusión el ratón a través del ventrículo izquierdo del corazón con 20 mL de PBS.
- Proceder a la sección 6.
6. disección y congelamiento de cerebro
- Preparación del baño de enfriamiento:
- Llene un recipiente dewar plana con hielo seco triturado y añadir 2-Metilbutano (isopentano) hasta que el líquido llegue a 1 cm por encima del paquete de hielo seco. Cubrir con una tapa suelta – por ejemplo, una tapa de cubo de hielo.
- Clip de la cabeza del ratón perfundido con unas tijeras afiladas y quitar la piel y las orejas usando un conjunto más reducido de tijeras.
- Disecar cuidadosamente el skullcap cortando desde el foramen magnum hacia delante a la izquierda y la derecha que permite upfold el casquete sobre el cerebro. Luego, cuidadosamente levante el cerebro intacto desde la base del cráneo mientras cortar los nervios ópticos con una espátula de metal plana.
- Poner cerebro en papel de aluminio y cortar el cerebro en tres piezas (frontal del cerebro, cerebro medio y cerebelo + tronco encefálico) colocando dos cortes coronales.
- Llenar un cryomold (25 x 20 x 5 mm) para el primer trimestre con la matriz de corte (O.C.T.) temperatura óptima, coloque rebanadas de cerebro con la parte anterior de cada pieza del cerebro hacia abajo en el cryomold y cubrir el tejido completamente con matriz O.C.T..
- Coloque el cryomold con el tejido en una orientación horizontal en el baño 2-Metilbutano y asegúrese de que el tejido se congela en la parte inferior hasta la parte superior dentro de 1 minuto evitando sumergir el bloque de tejido entero en el baño.
- Transferencia de tejido congelado a-80 ° C para el almacenamiento y continuar con la sección 7.
7. preparación de secciones congeladas del tejido
- Alcancen la temperatura del tejido congelado de-80 ° C a-20 ° C en el criostato para 30 minutos.
- Eliminar bloque de tejido de la cryomold y montaje en el soporte de tejido de criostato (set a-15 ° C) usando O.C.T. matriz.
- Recortar los bordes del bloque de tejido en el soporte de criostato con un bisturí afilado y empezar a cortar en el bloque de tejido quitando 20 μm secciones con el cuchillo de criostato hasta que el tejido sea visible.
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Para el análisis de permeabilidad BBB en vivo:
- Cortar secciones de tejido de 6-10 μm, recoger en portaobjetos de adhesión y los tramos cubiertos con un cubreobjetos usando un microscopio de fluorescencia de imagen inmediatamente.
- Evaluar el aspecto de los vasos sanguíneos en el cerebro (atención a fuertes fronteras de vasos no agujereado comparados a difundir patrones de fluorescencia observados por vasos sanguíneos con fugas). Como control positivo, Compruebe la salida del trazador en el estroma de los órganos de Programmable o el plexo coroideo que carecen de una BBB.
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Por zymography en situ :
- Cortar 6 μm las secciones de tejido usando un criostato, recoger en portaobjetos de adhesión y congelar las secciones de tejido a-20 ° C en una caja de congelación que contengan gel de silicona en la tapa.
8. in situ zymography combinado con la tinción de inmunofluorescencia de laminina/CD45
- Preparación de soluciones:
- Preparar solución de empotrar:
- Mezclar 6 g de glicerol (grado analítico), 2,4 g de poli (alcohol vinílico), 6 mL de ddH2O y 12 mL de tampón de Tris de 0.2 M, pH 8 y remover (agitador magnético) la solución durante 4 horas a TA.
- Transferir la solución a un tubo de centrífuga de 50 mL y se deja reposar por 2 h a TA. Posteriormente incubar la solución durante 10 minutos a 50 ° C (baño María) y centrifugar durante 20 min a 2.700 x g a temperatura ambiente.
- Tomar el sobrenadante y congelar en alícuotas a-20 ° C.
- Preparar solución de gelatina fría:
- Disolver 0,1 g de gelatina fría de piel bovina en 10 mL de ddH2O.
- Dejarlo reposar al menos 1 día y almacenar alícuotas a 4 º C.
- Preparar helado metanol (-20 ° C):
- Ponga 100% metanol en una jarra de coplin y enfriar hasta-20 ° C.
- Preparar la solución madre de azida de sodio 10%:
- Añadir 1 g de azida de sodio en 10 mL de ddH2O y almacenar a temperatura ambiente.
- Preparar solución de trabajo de azida de sodio 0,1%:
- Mix 99 μl of ddH2O con 1 μl de la solución madre de azida de sodio 10%.
- Disolver 1 mg de fluoresceína conjugado colorante apagado (DQ) gelatina de piel de cerdo en 1 mL de azida de sodio solución y tienda 100 μl partes alícuotas protegidos de la luz a 4 ° C. de trabajo
- Disolver 30 mg de 1, 10-fenantrolina monohidrato en 76 μl de etanol y almacenar a-20 ° C.
- Preparar 25 x solución de inhibidor de la proteasa:
- Añadir 1 pastilla de inhibidor de la proteasa libre de EDTA 2 ml de ddH2O. Almacenar a-20 ° C.
- Justo antes del uso, preparar la solución de reacción (150 μL/sección):
- Centrifugue la solución de gelatina DQ de 1 mg/mL durante 5 minutos a 13.300 x g.
- Mezcla 127.2 μl de ddH2O, 15 μl de 10 x buffer de reacción (Kit de prueba de gelatinasa/colagenasa; véase Tabla de materiales), 0,3 μl de gelatina fría 20 mg/mL, 1,5 μl de gelatina DQ de 1 mg/mL y 6 μl de 25 x solución de inhibidor de la proteasa.
- Justo antes del uso, preparar la solución de reacción de control negativo phenantroline (150 μL/sección):
- Mezcla 125.2 μl de ddH2O, 15 μl de 10 x buffer de reacción, 0,3 μl de gelatina fría 20 mg/mL, 1,5 μl de gelatina DQ de 1 mg/mL, 6 μl de 25 x inhibidor de la proteasa libre de EDTA y 2 μl de 2 M 1, 10-phenantroline (inhibidor de MMP).
- Justo antes del uso, preparar la gelatina fría control negativo (no fluorescente) reacción solución (150 μL/sección):
- Mezcla 128.7 μl de ddH2O, 15 μl de 10 x buffer de reacción, 0,3 μl de gelatina fría 20 mg/mL y 6 μl de inhibidor de la proteasa libre de EDTA 25 x.
- Preparar coctel para contratinción, por ejemplo del anticuerpo primario, 0,95 μg/mL policlonal conejo anti-laminina y el anticuerpo 10 μg/mL rata policlonal anti-CD45 en 1% de BSA en PBS y preparar control de isotipo correspondiente cócteles de anticuerpo primario.
- Preparar solución de anticuerpo secundario, por ejemplo, 7.5 μg/mL Cy3 cabra anti-rata + 15 μg/mL de anti-conejo AMCA en el 1% de BSA en PBS (proteger de la luz).
- Preparar solución de empotrar:
- 6 μm cerebro no fija las secciones de tejido de los ratones EAE dentro de la caja plástica de congelación que contienen gel de silicona en la tapa en una campana de humos para evitar la retención de agua en el tejido y separar 2 secciones de tejido en un portaobjetos dibujando líneas con un rechazo pluma de agua de deshielo
- Preparar soluciones de reacción (medidas 8.1.9-8.1.11), centrifugar durante 5 min a 13.400 x g a temperatura ambiente y la caliente a 37 ° C utilizando un baño de agua.
- Rehidratar las secciones de tejido por 5 min a 37 ° C con 1 x buffer de reacción. Luego, vierta 1 x buffer de reacción, añadir solución de reacción en las secciones de tejido e incube durante 4 h a 37 ° C. Lavar los portaobjetos 5 veces en ddH2O.
- Fijar las secciones de 5 minutos con metanol helado a-20 ° C y luego Lávese las secciones una vez con PBS a temperatura ambiente.
- Añadir 1% de BSA en PBS a las secciones e incubar por 20 min a temperatura ambiente (proteger de la luz). Luego, deseche el 1% de BSA en PBS de las secciones poniendo las diapositivas sobre el tejido, añadir anticuerpo primario cóctel e incubar durante 1 h a temperatura ambiente (proteger de la luz).
- Lávese las secciones dos veces con PBS, añadir anticuerpo secundario cóctel e incube durante 1 h a temperatura ambiente (proteger de la luz).
- Lávese las secciones dos veces con PBS, montar las diapositivas con incrustación de solución, deje que se seque durante la noche a temperatura ambiente secciones montadas (proteger de la luz). Por último, analizar las secciones de tejido manchado usando un microscopio de fluorescencia.
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Representative Results
Evaluación del curso clínico de la EAE en ratones C57BL/6 debe resultar en una curva de la enfermedad como se muestra en la figura 2A y los cambios en el peso corporal de ratón tal como se presenta en la figura 2B. Ratones C57BL/6 inmunizados con MOGaa35-55 generalmente comienzan a desarrollar síntomas de la enfermedad alrededor de 10-12 días después de la inmunización activa (figura 1A). Por lo general, ratones vacunados muestran una caída transitoria de peso corporal el día después de la inyección de la emulsión y la primera dosis de la toxina de pertussis (figura 1B). Desde el día 2 después de la inducción de EAE, el peso corporal de ratones inmunizados luego aumenta gradualmente hasta el comienzo de la enfermedad, cuando el peso del cuerpo por lo general un día antes del desarrollo de síntomas clínicos y continúa disminuyendo la correlación para el aumento síntomas de la enfermedad (figura 1A,B). La severidad de la enfermedad EAE aumenta hasta el pico de la enfermedad, que se puede esperar entre los días 16 y 20 después de la inducción de EAE (figura 2A). En el pico de EAE clínica, ratones también muestran el peso corporal más bajo (figura 2B), que aumenta en correlación con la mejoría de las EAE en la fase de remisión de la enfermedad (figura 2A,B). La inducción de EAE en ratones C57BL/6 con resultados MOGaa35-55 en una patología de la enfermedad crónica y los ratones normalmente no se recuperan completamente (figura 1A).
Figura 3A muestra un cuadro representativo del plexo coroideo y el parénquima cerebral adyacente de un ratón C57BL/6 sufren de EAE que se inyectó por vía intravenosa con kDa 3 fluorescentes dextrano (rojo) y 10 kDa dextrano (verde) 15 min antes de sacrificar ; la escala de la barra 50 μm. Como hemos demostrado anteriormente, marcadores fácilmente difuso a través de los microvasos fenestrado en el estoma del plexo coroides (imagen izquierda y medio), mientras que el BBB no permite la difusión de trazadores que circulan en el parénquima cerebral, indica por la línea punteada (imagen derecha), que está desprovista de cualquier señal fluorescente. Figura 3B muestra representativos vasos sanguíneos con fugas en el cerebelo del ratón C57BL/6 sufren de EAE que se inyectó por vía intravenosa con kDa 3 fluorescentes dextrano (rojo) y 10 kDa dextrano (verde) 15 min antes de sacrificar. Cabezas de flecha indican marcadores difundidos a través de los microvasos cerebrales en el parénquima de la CNS (imagen izquierda y medio), lo que sugiere que la función BBB está deteriorada en estos vasos. En el parénquima de la CNS, señal fluorescente verde y roja es visible fuera de las paredes de los vasos sanguíneos, que están indicadas por líneas discontinuas. En EAE, en el cerebelo donde puños inflamatorios aparecen los trazadores pueden también encontrarse en el espacio perivascular entre la membrana basal endotelial y la glia INCURVATA4 indicando pérdida funcional de la integridad endotelial de BBB. Si el trazador se encuentra difuso en el parénquima cerebral, muestra más disfunción de la barrera glial12.
La figura 4 muestra cuadros representativos del análisis de la actividad gelatinasa (MMP) en un cerebro EAE de un ratón C57BL/6 visualizado por zymography in situ y localizada en compartimientos de la barrera de cerebro específicas anti-movimiento pan-laminina (azul) y a la presencia de células inflamatorias por tinción de inmunofluorescencia anti-CD45 (rojo). Clivaje proteolítico de la gelatina (DQ) apagado tinte unquenches una señal de la fluoresceína, que permite la localización de la actividad gelatinasa en la sección del tejido. Cuando se incuba la gelatina fría (no fluorescente control), no verde señal fluorescente puede ser detectada en las secciones de cerebro de los ratones EAE (fila superior), así como en las secciones que han sido incubadas con DQ-gelatina combinada con phenantroline, un potente Zn +- agente secuestrante e inhibidor de MMP (fila media). En la fila inferior, actividad gelatinasa/MMP focal es visible como señal de fluorescencia verde brillante granular típico, como se destacó por las puntas de flecha. En manguitos inflamatorios en el cerebelo de un ratón EAE, actividad específica de la MMP se produce más allá de la glia INCURVATA4 (azul) en los sitios de infiltración inflamatoria de la célula (rojo).
Figura 1 : Representación gráfica de los sitios de inyección para la inducción de EAE. 1) sitio de la inyección de 30 μL MOG-emulsión en el flanco derecho, 2) inyección de 30 μL MOG-emulsión en el flanco izquierdo, 3) inyección de 20 μl MOG-emulsión en la raíz de la cola izquierda, 4) inyección de 30 μL MOG-emulsión en la raíz de la cola derecha 5) inyección de una pequeña gota de MOG-emulsión en el cuello. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Curso de representante de EAE. (A) síntomas de la enfermedad de EAE en ratones C57BL/6 con el tiempo. Se muestra la media +/-SEM. (B) el cambio de peso corporal durante la EAE en el tiempo. Se muestra la media +/-SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Cuadro representativo de la permeabilidad en vivo. (A) imagen izquierda: verde fluorescente 10 kDa dextrano a nivel del plexo coroides. Cuadro medio: rojo fluorescente 3 kDa dextrano a nivel del plexo coroides. Imagen de la derecha: fusión de las imágenes izquierdas y medianas. Escala bar 50 μm. (B) cuadro izquierdo: verde fluorescente 10 kDa dextrano en el cerebelo de ratón. Cuadro medio: rojo fluorescente 3 kDa dextrano en el cerebelo de ratón. Imagen de la derecha: fusión de las imágenes izquierdas y medianas. Las líneas punteadas son indicativas para las paredes de los vasos sanguíneos; cabezas de flecha señalan a marcadores fluorescentes en el parénquima del CNS. Escala de la barra 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Cuadros representativos de en situ zymography. Primera columna: canal fluorescente verde (señal insaciable de gelatina (DQ) apagado de tinte). Segunda columna: canal fluorescente azul (laminina). Tercera columna: canal rojo fluorescente (CD45). Cuarta columna: fusión de canales fluorescentes. Fila superior: control negativo de gelatina fría (no fluorescente). Fila del medio: control negativo phenantroline (inhibidor de MMP). Fila inferior: gelatina DQ. Escala de la barra 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| puntuación de 0 a 3 puntos | criterios | cambio de peso |
| 0 | no hay signos | peso normal |
| ~ | débil cola (tonus del débil) - criterio de las instalaciones: no incluye puntuación documentada | pérdida de peso (indicativa de verificación 2 º) |
| 0.5 | cola de Limp (gotas de cola) | pérdida de peso |
| 1 | hindleg debilidad, marcha inestable (ratón camina en el Banco como un pato) | pérdida de peso |
| 2 | paraplejia hindleg (el ratón no mueve sus miembros posteriores) | pérdida de peso severa (indicativa de verificación 2 º) |
| 3 | hindleg paraplejia, incontinencia pérdida de control de cuerpo inferior (ratón cae a un lado pero puede moverse en la jaula con ist frontlegs + incontinencia; moribundo) | muy bajo peso (indicativo de verificación 2 º) |
Tabla 1: Calificación criterios de evaluación de severidad de la enfermedad EAE.
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Discussion
Aquí, presentamos un protocolo para inducir y controlar EAE en ratones C57BL/6 femeninos. Preferentemente se eligen las hembras, y hay una incidencia de las mujeres: los hombres de 3:1 en MS. Para evaluar la severidad de la EAE, hicimos uso de una hoja de puntuación de 3 puntos. Severidad de la EAE se anotó generalmente con respecto a la gravedad de los trastornos motores. Ratones con avanzadas fases de la EAE, es decir, exhibiendo una puntuación por encima de 2 debería ser sacrificado para evitar sufrimiento innecesario de los animales. Por lo tanto, se recomienda anotar los ratones a intervalos cercanos por ejemplo dos veces al día como se explica en el protocolo. Hay varias marcar rutinas empleadas, llegando de 0 a 3 puntos a 0-6 puntos de16,17,18,19 o incluso más subpoints20. Sin embargo, hemos demostrado previamente que supuestamente refinado EAE puntuación no conduce a ninguna mejora en la determinación de posibles diferencias estadísticamente significativas en las puntuaciones de la enfermedad entre los grupos, al considerar el total de severidad enfermedad15. Basado en esta observación que nos hizo uso de la escala de 3 puntos para evaluar la progresión de la enfermedad en EAE para reducir el tiempo de manipulación del ratón y por lo tanto, dificultades para la aplicación de las normas de 3R de ratones. Otro punto crítico con el modelo EAE para el estudio de diferencias entre el golpe de gracia y ratones de tipo salvaje o las diferencias entre grupos de tratamiento es establecer una precisa planificación experimental. Comparados con los ratones de tipo salvaje son ratones knockout, es esencial para comparar hermanos de camada procedentes de cruzamientos heterozigótico para asegurar fondos genéticos idénticos de los ratones de tipo salvaje y el golpe de gracia en comparación con en el experimento de la EAE. También es importante mantener las mismas condiciones para todos los ratones en un experimento, por ejemplo cambios de jaula, la administración de alimento húmedo y especialmente del ratón (estado de salud) las condiciones de vivienda. Con el fin de evitar fenómenos de jaula específica inducidos por el investigador, Cruz-inmunización debe ser realizada. Más precisamente, si es necesario más de una jeringa para vacunar a un cierto número de ratones, ellos deben ser asignados aleatoriamente a diversas jeringuillas utilizadas. Este último además debe aplicarse para la realización de estudios de tratamiento. Por último pero no menos importante, el estado de salud de los ratones alojados en diferentes instalaciones de animales pueda impactar en la severidad y la incidencia de la enfermedad y así más de21 o menos Mycobacterium tuberculosis22 podría ser requerida para inducir un correcto de clínica de la enfermedad. Además, el sitio de inyección puede afectar el desarrollo de la enfermedad. En este protocolo se propone inyectar volúmenes relativamente pequeños en cinco diferentes sitios subcutáneos: 30 μL en dos flancos, 20 μl en la raíz de la cola derecha e izquierda y una pequeña gota en el cuello. En otros protocolos, 50 depósitos μl se colocan por vía subcutánea en la raíz de cola sólo23 o en los cuatro costados21. Inyecciones de depósitos más pequeños, sin embargo, minimizan el riesgo de causar irritación de la piel, que ratones probar a cero.
Permeabilidad in vivo puede realizarse para evaluar salida BBB en EAE pero también para evaluar si la canceladura genética específica de una molécula o un tratamiento farmacológico los impactos sobre la integridad del BBB en vivo. Esto puede ser realizados ya sea por la detección de marcadores de plasma endógena como IgG depósitos12 o exógenos trances que se aplican a la circulación de un ratón vivo24. En este protocolo hemos hecho uso de dos diferentes exógenos trazadores (kDa 3 y 10 kDa Dextran) que se inyecta simultáneamente y permitido circular por un tiempo de 15 minutos con dos marcadores de diferentes tamaños permite determinar la severidad de la BBB disfunción y puede permitir definir un atajo para tamaños de trazador que difuso o no a través de la BBB. Fluorescentes dextranos son polisacáridos hidrófilos caracterizadas por buena solubilidad en agua, baja toxicidad y baja inmunogenicidad. Además, dextranos están compuestos de poli-(α-D-1, 6 glucosa), que son resistentes al escote por glicosidasas endógenas de celular. Aquí hemos utilizado variantes de dextrano que tienen residuos de lisina incorporados en el conjugado de dextrano. Lysinated dextranos son aldehino fijable, que permite para fijar el palpador en el tejido. Además de fluorescencia etiquetadas dextranos, otros productos químicos pueden utilizarse para evaluar permeabilidad en vivo, por ejemplo, Hoechst tinte en combinación con el azul de Evan, que se une a una gran parte a la albúmina sérica. Hoechst tiñe los núcleos de células endoteliales BBB microvessels del CNS de la guarnición, y azul de Evan puede detectarse en el espacio perivascular en disfunción BBB y difunde más la glia INCURVATA4 esté perturbado25,26. Cambio, evaluar permeabilidad in vivo mediante la tinción inmunofluorescente de marcadores endógenos proporciona visión de acumulación de, por ejemplo, las moléculas de IgG o fibrinógeno, una glicoproteína que circula en la sangre, con el tiempo. En condiciones saludables, es muy estrecho el espacio perivascular y la membrana basal endotelial y la glia INCURVATA4 está estrechamente conectados y, así, visualizar las dos barreras de ECM de la NVU requiere laminina isoform-anticuerpo específico de tinción27 .
Moléculas IgG endógenas son presentes en salud y enfermedad dentro de los vasos sanguíneos, así como en el tejido de los órganos de Programmable, donde no BBB es establecido12. En gen modificado ratones con defectos de la barrera del cerebro, durante el tratamiento, o durante las moléculas endógenas de neuroinflamación que normalmente circulan en la sangre puede depositarse en la parenquimia de la CNS, que puede ser visualizada por contratinción con anti-laminina anticuerpos o bien reconociendo todos laminina isoformas (pan-laminina anticuerpos) o laminina isoforma específicos anticuerpos permitiendo diferenciar Lamininas, laminina α4 y α5 de la membrana basal endotelial y laminina α1 y laminina α2 de la glia INCURVATA4. Durante condiciones de capensis puede ampliarse el espacio perivascular por infiltración de células inmunes, lo que permite para identificar la membrana basal endotelial y la glia INCURVATA4 usando un anticuerpo de pan-laminina. Contratinción de Lamininas presente en el NVU permite evaluar si endógenos pero también marcadores exógenos se depositan en el parénquima de la CNS y contratinción de CD45 permite evaluar si la pérdida focal de la BBB se asocia a células inmunitarias infiltración.
Migración de células inmunes en la parenquimia del CNS requiere el paso secuencial de dos barreras distintas el NVU, el BBB endotelial y posteriormente la glia INCURVATA428. Cruzando la glia INCURVATA4 y CNS entrada de células inmunes se correlaciona con la aparición de clínica EAE29, mientras CNS infiltración células atrapados en leptomeningeal y los espacios perivascularios desencadenar clínica EAE. Captura de células inmunitarias en leptomeningeal y perivascular espacios entre las membranas del sótano se ha observado en varios modelos de ratón modificados gen e.g. L-selectin knockout mice30, de ratones knockout TNF23, ratones knockout doble de MMP2/MMP910 y JAM-B de ratones knockout12. Estos subrayan resultados que falta de estas moléculas no afecta la migración de células inmunes a través de la BBB, sino más bien en el INCURVATA4 de glia, subrayando que los mecanismos moleculares que median la migración de células inmunes a través de la BBB y la glia INCURVATA4 son distintas. Cerebro en situ zymography es una metodología para investigar actividad gelatinasa focal en una sección de tejido en la correlación espacial precisa a patología del CNS. Detección de la permeabilidad BBB en vivo junto a realizar zymography in situ para detectar actividad de MMP2/MMP9 así permite para delinear endotelial versus alteración de barrera de glia en correlación a la infiltración de células inmunitarias. Combinado con pan-laminina y CD45 inmunofluorescencia que manchaba en secciones de cerebro EAE, permite la localización de la actividad gelatinasa gelatina de DQ unquenching y localización de las células inmunes de la infiltración al mismo tiempo. Unquenching de fluoresceína a partir de resultados de la gelatina de DQ en una señal de fluorescencia verde brillante granular típico, mientras que áreas fluorescentes tenue verdes desiguales en secciones de tejidos deben considerarse como señal inespecífica12. Así, la evaluación cuidadosa de las secciones de tejido y controles adecuados son indispensables cuando se realiza en situ zymography. En este protocolo, se realizó en situ zymography en combinación con CD45 y la coloración de la laminina. Anticuerpos primarios contra el CD45 y la laminina se incubaron como una mezcla al mismo tiempo. Del mismo modo, los anticuerpos secundarios se incubaron como una mezcla en un segundo paso de tinción. Una combinación de anticuerpos necesita pruebas para asegurar que el segundo anticuerpos de fase son absorbidos contra otros depósitos para evitar la reactividad cruzada.
Tomados en conjunto, los protocolos aquí presentados proporcionan herramientas para investigar en detalle qué elemento de la NVU se deteriora en condiciones de capensis de EAE. Evaluación de la permeabilidad in vivo por marcadores exógenos permite para identificar el actual deterioro de la integridad de la célula endotelial microvascular o deterioro actual de la NVU. Además, introducción de marcadores de diferentes tamaños permite estimar la severidad de la debilitación de la BBB. Adicional in situ zymography Descubre actividad gelatinasa focal en los astrocitos y las células inflamatorias potencialmente, que es necesario romper el INCURVATA4 de glia como una última barrera antes de acceder a la CNS parénquima10.
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Disclosures
No hay conflicto de interés declarado.
Acknowledgments
Agradecemos a Sorokin de Lydia, que compartió con nosotros su original en situ zymography de protocolo10 .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AMCA anti-rabbit antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-156-045 | Store at 4 °C; protect from light |
| Anti-CD45 Antibody (30F11) | Pharmingen | 07-1401 | Store at 4 °C |
| Anti-Laminin Antibody | DAKO | Z0097 | Store at 4 °C |
| Breeding food | e.g. PROVIMI KLIBA SA | 3336 | |
| Individually ventilated cages, Blue line Type II or III | e.g. Tecniplast | 1145T, 1285L | |
| BSA fraction V | Applichem | A1391 | Store at 4 °C |
| Cold gelatine | Sigma-Aldrich | G 9391 | |
| Coplin jar + rack | e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG | H554.1; H552.1 | |
| Cy3 anti-rat antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-156-144 | Store at 4 °C; protect from light |
| Cover slips 24 x 40 mm # 1 | e.g. Thermo Scientific | 85-0186-00 | |
| Dextran Alexa Fluor 488 (10,000 MW) | e.g. Molecular probes | D22910 | Store at -20 °C; protect from light |
| Dextran Texas Red (3000 MW) | Invitrogen | D3328 | Store at -20 °C; protect from light |
| EnzChek Gelatinase/Collagenase Assay Kit | Thermo Fisher Scientific; EnzCheck | E12055 | Store at -20 °C; protect form light |
| Female C57BL/6J mice (8-12 weeks) | e.g. Janvier Labs | Females, 8-12 weeks | |
| Freezing box for histology slides | e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG | 2285.1 | |
| 18G x 1½’’ (1.2mm x 40mm) injection needle | e.g. BD, BD Microlance 3 | 304622 | |
| 27G x ¾’’ – Nr. 20 (0.4mm x 19mm) injection needle | e.g. BD, BD Microlance 3 | 302200 | |
| 30G x ½’’ (0.3 mm x 13 mm) injection needle | e.g. BD, BD Microlance 3 | 304000 | |
| Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) | e.g. Santa Cruz Biotechnology | sc-24648 | Store at 4°C |
| Maintenance food | e.g. PROVIMI KLIBA SA | 3436 | |
| MOGaa35-55 peptide | e.g. GenScript | Store at -80 °C | |
| microscope slides (Superfrost Plus ) | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Mycobacterium tuberculosis H37RA | e.g. BD | 231141 | Store at 4 °C |
| NaCl 0.9 % | B. Braun | 3535789 | |
| O.C.T. compound (Tissue-Tek ) | Sakura | 4583 | |
| Omnican 50 30G x ½’’ | B. Braun | 9151125S | |
| Paraformaldehyde | Merck | 30525-89-4 | |
| Pertussis toxin | e.g. List biological laboratories, Inc. | 180 | Store at 4 °C |
| poly(vinyl alcohole) (Mowiol 4-88) | Sigma-Aldrich | 81381 | |
| Protease Inhibitor EDTA free (Roche) | Sigma-Aldrich | 4693132001 | Store at 4 °C |
| repelling pen e.g. DAKO Pen | e.g. DAKO | S2002 | |
| sealing film e.g. Parafilm M | e.g Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Silica gel | e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG | 9351.1 | |
| Stitch scissor | F.S.T | 15012-12 | |
| syringe 1 ml | e.g. PRIMO | 62.1002 | |
| syringe 10 ml | e.g. CODAN Medical ApS | 2022-05 | |
| vaporizer system Univentor 400 | UNO.BV |
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