Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Nörovasküler biriminin endotel ve gliyal engelleri bozulma Vivo deneysel otoimmun ensefalomiyelit sırasında görüntülenmesi

Published: March 26, 2019 doi: 10.3791/59249

Summary

Burada, nörovasküler birim bozulma deneysel otoimmun ensefalomiyelit içinde vivo sırasında araştırmak için protokolleri mevcut. Biz özellikle kan - beyin bariyerini geçirgenliği ve gelatinase etkinlik lökosit göç dahil glia limitans belirlemek nasıl adres.

Abstract

Nörovasküler birimi (NVU) mikrovasküler endotel hücrelerinin kan - beyin bariyerini (BBB), bir endotel membran ile katıştırılmış perisitlerden, şekillendirme oluşmaktadır ve glia limitans parenkima membran ve astrositik oluşur son-besleme merkezi sinir sistemi (MSS) yüzdeki abluminal yönünü kucaklayan. CNS sürdürmenin yanı sıra homeostazı NVU bağışıklık hücre MSS kaçakçılığı kontrol eder. MSS immunosurveillance sırasında aktive lenfositler az sayıda BBB disfonksiyon ya da klinik hastalığı neden olmadan endotel bariyer geçebilir. Buna ek olarak, multipl skleroz veya hayvan onun modeli gibi neuroinflammation sırasında deneysel otoimmun ensefalomiyelit (EAE) çok sayıda bağışıklık hücreleri BBB ve daha sonra sonunda CNS parankimi ulaşan glia limitans geçebilir Klinik hastalık için önde gelen. Bağışıklık hücre göç CNS parankimi içine böylece ayrı moleküler mekanizmaları istihdam NVU endotel ve gliyal bariyer arasında sıralı bir geçiş içeren bir işlemdir. Endotel bariyer arasında geçiş takip, T hücreleri kendi yerel etkinleştirme başlatmak sonraki mekanizmaları jelatinin, Fokal harekete geçirmek için önde gelen Perivasküler antijen sunan hücreler üzerinde onların soydaş antijen karşılaşmak hangi gliyal bariyer çapraz ve CNS parankimi girmek T hücreleri sağlayacaktır. Böylece, hem, BBB geçirgenliği ve MMP aktivite sırasında EAE MSS bağışıklık hücre birikimi için mekansal ilişki içinde değerlendirilmesi NVU endotel ve gliyal engelleri bütünlüğünü kaybı belirtmenizi sağlar. Biz burada EAE C57BL/6 fareler tarafından Aktif bağışıklama ikna etmek ve daha sonra analiz BBB geçirgenliği içinde vivo eksojen floresan tarayıcıları kullanarak gösterir. Biz daha fazla göstermek nasıl görselleştirmek ve yerinde zymogaphy BBB Bodrum membranlar ve CD45 + işgal bağışıklık hücreleri immünfloresan stainings birleştiğinde tarafından gelatinase aktivite EAE beynindeki yerelleştirilmesine.

Introduction

Tüm vücut ve zihinsel fonksiyonları omurgalılarda merkezi sinir sistemi (MSS) koordinatları ve CNS homeostazı nöronlar uygun bir iletişim için esastır. CNS homeostazı MSS kan akışı değişen çevre korur nörovasküler birimi (NVU), tarafından garanti kapsamındadır. NVU biyokimyasal olarak benzersiz ve kan - beyin bariyerini (BBB) perisitlerden, astrocytes, sinir hücreleri ve hücre dışı Matriks (ECM) bileşenleri ile sürekli crosstalk kurmak, CNS mikrovasküler endotel hücreleri, iki kurulması oluşur farklı Bodrum membranlar1. Endotel membran o ensheathes BBB endotel hücreleri ve abluminal yönü perisitlerden yüksek sayıda limanlar ve laminin α4 ve ek olarak diğer ECM proteinler2laminin α5 oluşmaktadır. Buna ek olarak, parenkimal membran laminin α1 ve laminin α2 oluşur ve astrositik sonu-ayak tarafından kucakladı. Astrocyte sonu-ayakları ile birlikte parenkima membran serebrospinal sıvı dolu Perivasküler veya subaraknoid boşluk3CNS nöronal ağdan segregates glia limitans oluşturur. NVU eşsiz mimarisi nedeniyle bağışıklık hücre MSS ticareti bir işlemdir bağışıklık hücreleri ile gerektirir gibi periferik dokulara ilk endotel BBB ve daha sonra glia limitans için ihlal olduğunu ayrıdır CNS parankimi ulaşmak.

Multipl skleroz (MS) bağışıklık hücreleri dolaşan çok sayıda MSS girin ve neuroinflammation, demiyelinizasyon ve BBB bütünlüğü4odak kaybına neden MSS, ortak bir neuroinflammatory hastalıktır. BBB bütünlüğü kaybı bir erken MS, gadolinyum kontrast olarak görüntülenmeyecektir manyetik rezonans görüntüleme (MRG)5MSS lezyonlarının artırılması varlığı tarafından belirtildiği şekilde özelliğidir. Lökosit ekstravazasyonu içine MSS postkapiller venüller düzeyinde gerçekleşir; Ancak, keşfedilmeyi kesin mekanizmaları bağışıklık hücre diapedesis BBB membran ve daha sonra gliyal bariyer arasında yer kalır. Deneysel otoimmun ensefalomiyelit (EAE) MS için hayvan bir model olarak hizmet vermektedir ve önemli ölçüde bizim mevcut bilgi hakkında MS patogenezinde katkıda bulunmuştur. Örneğin, EAE modelini kullanarak bu ilk bir yakalama dahil olmak üzere multistep bir işlemde lökosit ekstravazasyonu oluşur ve adım haddeleme tarafından selectins ve müsin benzeri moleküllerin glikoprotein ligand (PSGL) -1, P-selektin gibi aracılı keşfedilmiştir integrin bağımlı firma tutuklama ve T hücrelerinin diapedesis6için izin veren iki taraf için de BBB endotel hücreleri üzerinde tarama tarafından izlenen.

T hücreler endotel BBB ve endotel membran geçti sonra onların soydaş antijen makrofajlar veya stratejik leptomeningeal veya Perivasküler boşluklara lokalize dendritik hücreler karşılaşmaya ihtiyaçları var. Bu etkileşim pro-inflamatuar aracılar odak üretim sonraki mekanizmaları via glia limitans7,8,9bağışıklık hücreleri CNS doku işgali için gereken tetiği neden olmaktadır. Matriks metalloproteinazların (MMP) -2 ve MMP-9 odak harekete geçirmek Kemokin harekete geçirmek değiştirir ve bağışıklık için bir önkoşuldur bozulması astrocyte sonu-ayakları, hücre dışı matriks reseptörlerinin indükler glia limitans arasında geçiş hücre CNS parankimi ve klinik belirtiler EAE10,11başlangıcı ikna etmek için.

BBB ile bağışıklık hücre infiltre CNS tespiti birleştiren CNS doku bölümlerde kaçağı ve gelatinase etkinliği bağlamında neuroinflammation, endotel ve gliyal bariyer işlevsel bütünlüğü hakkında değerli bilgiler sağlar. Örneğin, biz son zamanlarda araştırdık endotelyal sıkı kavşak molekül bileske adezyon molekülü (reçel) kurucu kaybı-B bağışıklık hücre MSS EAE bağlamında kaçakçılığı. Sağlıklı vahşi tipli C57BL/6 fareler için karşılaştırıldığında, sağlıklı reçel B eksikliği littermates BBB bütünlüğü hiçbir bozulma endojen gibi eksojen izleyiciler12kullanarak içinde vivo geçirgenliği değerlendirme tarafından gösterildiği gibi gösterdi. EAE bağlamında, reçel-B-eksik C57BL/6 fareler iyileştirmiştir hastalık belirtileri, hangi inflamatuar hücre bindirme leptomeningeal ve Perivasküler alanlarda12ile ilişkili olduğunu gösterdi. Bu fenomen incelemek için biz in situ zymography, gelatinase faaliyetlerin tanımlaması reçel B eksikliği farelerde gelatinase aktivite eksikliği bağışıklık hücreleri aşmak mümkün sınırlı sayıda için sorumlu olabilir eğer test etmek için izin uygulanır glia limitans12.

Durumu göz önüne alındığında farklı genetik olarak eksik, örneğin, değişiklikleri BBB işlevinde neden olabilir farklı BBB sıkı kavşak molekül modelleri için BBB bütünlüğü araştırıyor metodolojileri önemlidir fare değiştirilmiş. Buna ek olarak, yeni geliştirilen ilaçlar NVU engelleri üzerinde etkisi olabilir. Burada biz EAE C57BL/6 farelerde miyelin oligodendrocyte glikoprotein (MOG) ile Aktif bağışıklama tarafından ikna etmek nasıl göstereceğim-peptid aa35-55 tam Freund'ın adjuvan olarak. Biz o zaman bağışıklık hücre infiltrasyonu NVU endotel ve gliyal engelleri arasında yerelleştirilmesine ve içinde vivo endotel ve gliyal bariyer bütünlüğünü eksojen izleyiciler ve gelatinase etkinlik, yerinde tespiti tarafından sırasıyla çalışma açıklanmaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm çalışmalar muhafaza-in hayvan İsviçre mevzuatına göre kurallar altında yapılmıştır ve Bern, İsviçre kantonu veteriner ofisi tarafından kabul edildi (izni numaraları: BE 31/17 ve olmak 77/18).

1. belirli patojen ücretsiz (SPF) koşullarında C57BL/6 farelerin konut

  1. 12/12 h koyu ile bireysel havalandırılmış kafeslerde House fareler döngüsü. Gıda sağlamak ve reklam libidum su. Farelerin Mikrobiyolojik kalite denetleyecek, deneysel kohort FELASA öneriler13takip kirli yatak nöbetçiler tarafından üç aylık sağlık kontrolü uygulandı.
  2. Kulak yumruk tek tek mark 8-12 hafta yaşlı kadın C57BL/6 fareler için kullanın.

2. C57BL/6 farelerin bağışıklama

  1. Çözümler14hazırlanması:
    1. Tam Freund'ın adjuvan (CFA için), Mycobacterium tüberküloz (H37RA) bir duman başlık altında mix eksik Freund'ın adjuvan 30 mL taze pestled ısı 120 mg ile inaktive olur. Hisse senedi çözüm 4 ° C'de depolayın
    2. MOGaa35-55-peptid hisse senedi çözüm için MOGaa35-55-peptid steril PBS (4 mg/mL) içinde dağıtılması ve-80 ° C'de depolayın
    3. MOG emülsiyon hazırlayın:
      1. CFA MOG-peptid hisse senedi çözümde 2 mL microtube ile 1:2 oranında seyreltin.
      2. Film mühürleme ile microtube mühür ve tüp yapıştırıcı bant ile tamamen kaplayan bir girdap karıştırıcı düzeltmek. Girdap emülsiyon 4 ° C'de 4 h için
    4. Bunlar arasında emülsiyon ile şırıngalar hazırlayın:
      1. Microtube al ve hızlı bir şekilde küçük masa santrifüj kullanarak emülsiyon spin. Emülsiyon 18G x 1½'' (1.2 mm x 40 mm) enjeksiyon iğne kullanarak bir şırınga toplamak.
      2. Fareler sayısına göre şırınga (100 µL/fare) emülsiyon sesi ayarlamak ve 18 G iğne 27G x ¾'' (0.4 mm x 19 mm) enjeksiyon iğnesiyle değiştirin. Film mühürleme ile şırınga bağlı enjeksiyon iğne kapatın.
    5. Boğmaca toksin (PTx) stok çözüm için liyofilize PTx steril PBS 500 µL içinde 50 µg dağıtılması (100 ng/µL). Hisse senedi çözüm 4 ° C'de depolayın
    6. PTx çalışma çözüm için PTx hisse senedi çözüm (300 ng/100 µL) fare (mayi enjeksiyon kullanımı için 30G x ½'' (0.3 mm x 13 mm) iğne) başına 3 µL steril PBS 97 µL karıştırın.
  2. EAE indüksiyon
    1. C57BL/6 fareler bir Buharlaştırıcı sistemi kullanarak isofluorane ile anestezi. Anestezi farelerde ikna etmek için % 4.5 isofluorane oksijen küçük kuluçka odasında fare sağlamlılık %2.1 isofluorane ile fare aktarmadan önce maruz. Yastık Isıtma ile donatılmış bir anestezi birimi fare hipotermi engellemek için kullanın.
    2. Bir elinde imzalat fare düzeltmek ve ilk MOG35-55/CFA-emülsiyon 30 µL subkutan arka bacak yanları enjekte (Şekil 1:1 + 2; 60 µL toplamda; sol kanattan 30 µL ve sağ kanatta 30 µL) olarak inguinal lenf düğümleri yakınlığı kapatın.
    3. Karnı fareyi getirin ve MOGaa35-55/CFA-emülsiyon 20 µL sol ve sağ fonksiyon yağ dokusu kuyruk kök içine enjekte (Şekil 1:3 + 4; 40 µL toplamda; kuyruk kök 20 µL sol tarafta kuyruk kök 20 µL ve sağ tarafta) ve MOGaa35-55/CFA-emülsiyon int küçük damlacık o fareyi boyun (şekil 1: 5).
    4. PTx çözümün 100 µL intraperitoneally fareyi enjekte. Fare başkanı bağırsak içine enjeksiyon kaçınarak vücut Merkezi aşağıda tutun.
    5. Bakım diyet değiştirin (extrudate önemli besin: ham protein % 18.5 ham yağ % 4.5 ham lif % 4.5; Ham kül % 6,5; nişasta % 35; metabolik enerji: 13.1 MJ/kg) diyet ıslahı için (extrudate önemli besin: ham protein %23,5; ham yağ % 5.5; ham lif % 3; Ham kül % 5.7; nişasta % 36; metabolik enerji: 14.3 MJ/kg) öncesi ve sırasında beklenen klinik hastalık fareler daha yüksek enerji içeriği yemekle sağlamak.
    6. Ve fare ile ısınma bir yastık ev onun kafes için transfer yüz maskesi çıkarın. Tam olarak uyanık ve hareketli fare 10 dakika sonra olduğundan emin olun.
    7. PTx enjeksiyon (2.2.4) 48 h ilk tedaviden sonra tekrar.

3. puanlama EAE farelerin

  1. Kafes içinde bir göz atarak her sabah EAE fareler sağlık durumunu denetleyin.
  2. EAE fareler her öğleden sonra puan.
  3. Kuyruk yukarı doğru bir parmak ile hareket ettirerek tonusunuz olup EAE deney dışarı kafes ve onay dahil her bireysel fare al. Sağlıklı bir fare kuyruğunu devam edecektir (kuyruğu bir tonusunuz var). Klinik EAE başlamışsa, kuyruk tonusunuz daha düşük, kademeli bir düşüş kuyruk tarafından görünür olacaktır. Sonunda fare kuyruğunu hiç kaldırmak mümkün olmayacaktır.
  4. EAE deneme temiz bankta dahil her bireysel fare yerleştirin ve gözlemlemek ve yürüyüş davranış belge. Hastalık şiddeti değerlendirilmesi için kriterleri puanlama için Tablo 115 bakın (EAE puan).
  5. Değerlendirmek ve denemeye dahil her farenin ağırlığını belge.
  6. Yeterli gıda ve su alımını bir klinik EAE görüntüleme fareler tarafından emin olmak için 1 skor bir plastik tabak üstünde belgili tanımlık dip-in belgili tanımlık kafes içinde nemli gıda tedarik ve günlük yenileyin.

4. In vivo geçirgenliği tahlil

  1. Hazırlıklar çözümleri:
    1. Dextran hisse senedi çözümleri için 10 mg 10 kDa Dextran Alexa Fluor 488 yanı sıra 3 kDa Dextran Texas kırmızı 500 µL % 0,9 Sodyum Klorür çözüm (20 mg/mL) geçiyoruz.
    2. Dextran çalışma çözüm için sadece 10 kDa Dextran Alexa Fluor 488 enjeksiyon damlalıklı 55 µL önce çözüm (20 mg/mL) film sızdırmazlık bir parça üzerine stok ve 3 kDa dextran Texas kırmızı hisse senedi çözüm (20 mg/mL) 55 µL ekleyin. Mix ve 100 µL tek kullanımlık iyi şırınga (son konsantrasyonu 2 mg/100 µL) toplamak.
    3. PFA ekstra saf toz, PBS 100 mL ve temiz cam kabı ve tam 56 ° bir manyetik karıştırıcı kullanarak karıştırma altında C kadar ısı 1N NaOH 200 µL 10 g % 10 formaldehit (PFA) hisse senedi çözüm için birleştirin; 30 dk 56 ° C'de ise tamamen eriyene kadar tutun; oda sıcaklığına kadar sakin olun; pH 7.4 için ayarla; ve bir kağıt filtre ile filtre. Mağaza - 20 ° c Hisse senedi çözüm daha da PBS kullanarak seyreltilmiş.
  2. Kısa bir süre sağlıklı C57BL/6 fare veya C57BL/6 fare ile (fare yaklaşık 1 dk sedatize) isoflurane EAE acı anestezi. Otomatik bir sistem olduğu gibi (fare-% 4.5 isoflurane oksijen bir indüksiyon odasında maruz ve sağlamlılık % 2.1 isoflurane ile transfer) adım 2.2.1 kullanın.
  3. İmzalat fare masada, lateral pozisyonda sonra intravenöz yer (örneğin retro-orbitally) fare uyanmadan önce floresan izleyiciler 100 µL fare enjekte.
  4. Hemen sağlamlılık kaldırmak ve fare sonra kısa anestezi tam olarak uyanık ve hareketli olduğundan emin olun. 15 dakikadır dolaşımda izleyici izin.
  5. Adım 5.1 ile devam edin.

5. farelerin perfüzyon

  1. İçinde vivo geçirgenliği değerlendirmesi için:
    1. Yordam 15dk derin isoflurane anestezi inducing tarafından floresan izleyici enjeksiyon sonra başlar. Farelerde derin anestezi ikna etmek için oksijen isoflurane %2.3 kullanın. Anestezi derinliği yargılamaya pençe çekilme refleks kullanın (ayak parmakları arasında cilt çimdik; fleksiyon eksikliği yeterli derinlik gösterir) ve refleksleri forelimb ve farelerde EAE için tabi hindlimb sonda.
    2. Sırtında fare düzeltmek ve etanol ile göbek sprey. Makas kullanarak Toraks açın ve diyafram çıkarın. Makas kullanarak kalbi Sağ atrium açın ve fare ile kalbin sol ventrikül tarafından 10 mL % 4'lük takip PBS 10 mL ile sıvı PFA PBS içinde.
      Dikkat: PFA teneffüs önlemek için fareyi bir duman başlıklı sıvı.
    3. 6 bölüme geçin.
  2. Situ zymography için:
    1. Derin isoflurane anestezi % 2,3 isoflurane oksijen EAE acı bir Mouse kullanarak teşvik ve olduğu gibi adım 5.1.1 anestezi derinliği kontrol edin.
    2. Ardından, fare sırtını düzeltin ve etanol ile göbek sprey. Makas kullanarak Toraks açın ve diyafram çıkarın. Makas kullanarak kalbi Sağ atrium açın ve kalbin sol ventrikül ile 20 mL PBS üzerinden fare sıvı.
    3. 6 bölüme geçin.

6. diseksiyon ve beyin dondurulması

  1. Soğutma banyo Hazırlanışı:
    1. Düz bir dewar kapsayıcı ezilmiş kuru buz ile doldurun ve sıvı yaklaşık 1 cm kuru buz torbası yukarıda ulaşıncaya kadar 2-methylbutane (Isopentane) ekleyin. Gevşek bir kapak ile-örneğin, bir buz kovası kapak kapak.
  2. Perfused fare kafasını keskin makas ile küçük ve cilt ve kulakları makas daha küçük bir kümesi kullanarak kaldırın.
  3. Dikkatle Scullcap deliği magnum sol ve sağ tarafındaki için upfold kafatası beyin üzerinde izin önüne doğru gelen keserek parçalara. O zaman, olduğu gibi beyin kafatası tabanından dışarı düz metal bir spatula kullanarak optik sinirler kesilmesinin çýkýntýdan.
  4. Beyin alüminyum folyo yerleştirin ve üç adet (ön beyin, orta beyin ve beyincik + beyin sapı) beyinde iki koronal kesim koyarak kesti.
  5. Bir cryomold (25 x 20 x 5 mm) ilk çeyrek için optimum sıcaklık kesme (O.C.T.) matris ile doldurun, her beyin parça aşağı doğru cryomold bakan ön tarafı ile beyin dilimleri yerleştirin ve doku tamamen O.C.T. matris ile kapak.
  6. 2-Methylbutane banyo içine yatay yönde doku ile cryomold yerleştirin ve doku aşağıdan yukarı 1 dakika içinde tüm doku blok banyo içine daldırma kaçınarak donuyor olduğunu emin olun.
  7. -80 ° C depolama için dondurulmuş doku aktarmak ve Bölüm 7 ile devam edin.

7. dondurulmuş doku bölümleri hazırlanması

  1. Sıcaklık donmuş dokusundan-80 ° c-20 ° C'de 30 dk için cryostat equilibrate.
  2. Cryomold ve monte cryostat doku tutucu (-15 ° C ile ayarla) doku blok kaldırmak O.C.T. matrisi kullanarak.
  3. Cryostat keskin bir neşter ile kutusunda doku bloğunu kenarlarını kesme ve doku görünene kadar cryostat bıçakla 20 µm bölümleri kaldırarak doku bloğu içine kesme başlatın.
  4. İçinde vivo BBB geçirgenliği analizi için:
    1. 6-10 µm doku bölümler kesip, onları yapışma cam slaytlarda toplamak ve hemen bir kapak bir floresan mikroskop kullanarak kayma ile kaplı bölümleri görüntü.
    2. Görünüm (floresan desenleri sızan kan damarları için gözlenen yaygın karşılaştırıldığında sigara sızan kan damarlarının sınırları keskin dikkat) beyindeki kan damarlarının değerlendirmek. Pozitif kontrol, izleyici kaçağı circumventricular organ veya bir BBB eksikliği choroid plexus stroma doğrulayın.
  5. Situ zymography için:
    1. Bir cryostat kullanma 6 µm doku bölümlerine kes, onları yapışma cam slaytlarda toplamak ve doku bölümleri kapağı silikon jel içeren bir dondurucu kutusunda-20 ° C'de dondurmak.

8. in situ zymography kombine laminin/CD45 ayirt boyama ile

  1. Çözümleri hazırlayın:
    1. Gömme çözüm hazırlayın:
      1. Gliserol (analitik grade) 6 g, Poli (vinil alkol) 2.4 g, ddH2O 6 mL ve 12 mL 0,2 M Tris arabelleği, pH 8, mix ve (manyetik karıştırıcı) 4 h için çözüm RT. heyecan.
      2. Çözüm için 50 mL santrifüj tüpü aktarmak ve RT. 2 h için rahat bırak Daha sonra 10 dk 50 ° c (su banyosu) için çözüm ve santrifüj 2700 x g oda sıcaklığında 20 dakika için kuluçkaya.
      3. Süpernatant al ve aliquots-20 ° C'de dondurmak
    2. Soğuk jelatin çözüm hazırlayın:
      1. 0.1 g ddH2O 10 ml sığır deriden soğuk jelatin geçiyoruz.
      2. En az 1 gün için emmek ve aliquots 4 ° C'de depolayın
    3. Buz gibi metanol (-20 ° C) hazırlayın:
      1. -20 ° c kadar serin ve % 100 metanol coplin kavanoza koy
    4. % 10 sodyum azid hisse senedi çözüm hazırlayın:
      1. DdH2O için 10 mL sodyum azid 1 g ekleyin ve oda sıcaklığında saklayın.
    5. % 0.1 sodyum azid çalışma çözüm hazırlayın:
      1. 1 µL % 10 sodyum azid hisse senedi çözüm ile Mix 99 µL of ddH2O.
    6. Birleşik floresein boya su (DQ) jelatin domuz deri ışık 4 ° C'de Korumalı çözüm ve mağaza 100 µL aliquots çalışma sodyum azid 1 ml 1 mg dağıtılması
    7. Etanol ve mağaza-20 ° C'de 76 µL 1,10-pH monohidrat 30 mg dağıtılması
    8. 25 x proteaz inhibitörü çözüm hazırlayın:
      1. EDTA ücretsiz proteaz inhibitörü 1 tablet ddH2O 2 mL için ekleyin. -20 ° C'de mağaza
    9. Sadece kullanmadan önce reaksiyon çözüm (150 µL/bölüm) hazırlayın:
      1. 1 mg/mL DQ jelatin çözüm 13,300 x gde 5 dk santrifüj kapasitesi.
      2. DdH2O, 15 µL tepki arabellek (Gelatinase/Collagenase tahlil kiti; bkz: Malzemeler tablo) x 10, 20 mg/mL soğuk jelatin 0.3 µL, 1 mg/mL DQ jelatin 1,5 µL ve proteaz inhibitörü çözüm x 25 6 µL Mix 127.2 µL.
    10. Sadece kullanmadan önce phenantroline negatif kontrol tepki çözümü (150 µL/bölüm) hazırlayın:
      1. DdH2O, 10 tepki tampon, 0.3 µL 20 mg/mL soğuk jelatin, 1 mg/mL DQ jelatin 1,5 µL, 6 µL proteaz inhibitörü EDTA ücretsiz x 25 x 15 µL ve 2 M 1,10-phenantroline (MMP inhibitörü) 2 µL Mix 125.2 µL.
    11. Sadece kullanmadan önce soğuk jelatin (floresan olmayan) negatif kontrol tepki çözümü (150 µL/bölüm) hazırlayın:
      1. DdH2O, 10 x reaksiyon arabellek 15 µL, 20 mg/mL soğuk jelatin 0.3 µL ve 25 x proteaz inhibitörü EDTA ücretsiz 6 µL Mix 128.7 µL.
    12. Birincil antikor, örneğin counterstaining için kokteyl, 0.95 µg/mL poliklonal tavşan anti-laminin antikor ve 10 µg/mL poliklonal fare anti-CD45 antikor PBS % 1 BSA içinde ve uygun izotip kontrol birincil antikor kokteyller hazırlayın.
    13. İkincil antikor çözüm, örneğin, 7.5 µg/mL Cy3 keçi Anti-sıçan + 15 µg/mL % 1 BSA PBS içinde AMCA Anti-tavşan hazırlamak (ışıktan korumak).
  2. 6 µm sabit olmayan beyin doku bölümlerden EAE fareler kapağı su doku saklama önlemek ve kalem kovucu bir su ile çizgiler çizerek 2 doku bölümlerde bir slayt üzerinde ayrı bir duman başlıklı silika jel içeren plastik dondurma kutusu içinde çözülme
  3. Reaksiyon Çözümleri (adımları 8.1.9-8.1.11) hazırlamak, 13.400 x g oda sıcaklığında ve öncesi sıcak su banyosu kullanarak 37 ° c de 5 dk santrifüj kapasitesi.
  4. 1 x reaksiyon arabellek kullanarak 37 ° C'de 5 min için doku bölümleri rehydrate. Sonra 1 x reaksiyon arabellek dökün, reaksiyon çözüm doku bölümleri ekleyin ve 37 ° C'de 4 h için kuluçkaya Slaytlar ddH2O içinde 5 kere yıkayın.
  5. -20 ° C'de buz gibi metanol ile 5 min için bölümleri düzeltmek ve daha sonra PBS oda sıcaklığında bir kez bölümlerle yıkayın.
  6. % 1 BSA içinde PBS için bölümler eklemek ve oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya (ışıktan korumak). Sonra doku slaytlarda lanetleme tarafından PBS bölümlerden %1 BSA atmak, birincil antikor kokteyl ekleyin ve oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya (ışıktan korumak).
  7. Bölümleri iki kez PBS ile yıkayın, ikincil antikor kokteyl ekleyin ve oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya (ışıktan korumak).
  8. Bölümleri iki kez PBS ile yıkayın, çözüm gömülmesi ile slaytlar mount, bağlı bölümler gece oda sıcaklığında kuru izin (ışıktan korumak). Son olarak, floresan mikroskop kullanma lekeli doku bölümlerine analiz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

EAE klinik seyir C57BL/6 farelerde değerlendirilmesi bir hastalık eğrisi şekil 2A ve şekil 2Bsunulan gibi fare vücut ağırlığı değişimler tasvir sonuçlanmalıdır. MOGaa35-55 ile genellikle aşı C57BL/6 fareler Aktif bağışıklama (şekil 1A) sonra gün 10-12 civarında hastalık belirtileri geliştirmeye başlayın. Genellikle, aşılı fareler emülsiyon enjeksiyon ve boğmaca toksin (şekil 1B) ilk doz ertesi gün vücut ağırlığının geçici bir düşüş gösterir. Vücut ağırlığı genellikle damla bir gün önce klinik belirtiler geliştirilmesi ve artırılması için bağıntı azaltmak devam ettiğinde 2 gün sonra EAE indüksiyon, vücut ağırlığı ile aşılı fareler daha sonra hastalığı başlar kadar yavaş yavaş artar. hastalık belirtileri (şekil 1A,B). 16-20 EAE indüksiyon (şekil 2A) sonra gün arasında beklenebilir hastalık zirvesine kadar EAE hastalık şiddeti artar. Klinik EAE zirvesinde, fareler de korelasyon (şekil 2A,B) hastalığının EAE iyileşme iyileşme aşamasında için artıran en düşük vücut ağırlığı (şekil 2B) gösterir. EAE indüksiyon MOGaa35-55 sonuçlarında bir kronik hastalık patoloji ve fareler genellikle kullanan C57BL/6 farelerde tam (şekil 1A) kurtarmak değil.

Şekil 3A ve intravenöz floresan 3 kDa Dextran (kırmızı) ve 10 kDa Dextran (yeşil) 15 dk ile ödün önce enjekte edildi EAE acı bir C57BL/6 fare bitişik beyin parankimi choroid plexus bir temsili resim gösterir ; bar 50 µm çap. Biz daha önce gösterdiği gibi BBB izleyicileri beyin parankimi dolaşan Difüzyon izin vermez iken izleyiciler kolayca Poşlu yüzdeki choroid plexus (resim) soldaki ve ortadaki, ağzının içine genelinde yaygın belirtilen Kesikli çizgi tarafından (doğru resmi), böylece yoksun floresan herhangi bir sinyal var. Şekil 3B temsilcisi sızan kan damarları intravenöz floresan 3 kDa Dextran (kırmızı) ve 10 kDa Dextran (yeşil) 15 dk ile ödün önce enjekte edildi EAE acı bir C57BL/6 fare beyincik gösterir. Ok uçları arasında beyin yüzdeki CNS parankimi (resim), sol ve orta yayılmış izleyiciler BBB işlevi bu gemiler engelliler düşündüren gösterir. CNS parankimi yeşil ve kırmızı floresan sinyal kesik çizgilerle gösterilir kan damarı duvarlarının dışından görülür. EAE, inflamatuar kelepçeleri izleyiciler görüntülendiği beyincik de endotel membran ve endotel BBB bütünlüğü işlev kaybı gösteren glia limitans arasında Perivasküler boşluk bulunabilir. İzleyici beyin parankimi yaygın bulunursa, gliyal bariyer12ek işlev bozukluğu gösterir.

Şekil 4 gelatinase (MMP) etkinlik analizi temsilcisi resimleri bir EAE beyin tarafından yerinde zymography görüntülenir ve anti-pan-laminin (mavi) ve varlığı için belirli beyin bariyeri bölmeleri için yerelleştirilmiş bir C57BL/6 fare gösterir anti-CD45 (kırmızı) ayirt boyama tarafından inflamatuar hücreler. Proteolitik bölünme (DQ) jelatin boya su doku bölümü faaliyete gelatinase lokalizasyonu sağlar floresein sinyal unquenches. Ne zaman soğuk jelatin (floresan sigara denetimi) inkübe, floresan sinyal EAE fareler (üst satır) beyin bölümlerden yanı sıra DQ-jelatin ile inkübe bölümler algılandı yok yeşil phenantroline ile bir güçlü Zn + kombine- Kompleks Ajan ve MMP inhibitörü (orta sıra). Alt satırda, Fokal gelatinase/MMP etkinlik olarak tipik taneli parlak yeşil Floresans sinyal, ok uçları tarafından vurgulanmış olarak görünür. EAE fare beyincik içinde inflamatuar kelepçe içinde belirli MMP etkinlik sitelerde iltihabi hücre infiltrasyonu (kırmızı) (mavi) glia limitans ötesinde oluşur.

Figure 1
Resim 1 : Enjeksiyon siteleri EAE indüksiyon için grafik olarak gösterilmesi. 1) enjeksiyon yeri için 30 µL MOG-emülsiyon içine sağ kanadı, 2) enjeksiyon sitesi için 30 µL MOG-emülsiyon sol kanat içine, 3) enjeksiyon sitesi için 20 µL MOG-emülsiyon sol kuyruk kök içine, 4) enjeksiyon sitesi için 30 µL MOG-emülsiyon içine doğru kuyruk kök 5) enjeksiyon yeri küçük damlacık MOG-emülsiyon boyun içine için. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : Temsilcisi tabii ki EAE. (A)zaman içinde C57BL/6 farelerde EAE hastalık belirtileri. Demek SEM +/-gösterilir. EAE zamanla sırasında vücut ağırlığının (B) Değiştir. Demek SEM +/-gösterilir.  Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : İçinde vivo geçirgenliği temsili resmi. (A)sol resim: choroid plexus düzeyde floresan 10 kDa dextran yeşil. Orta resim: kırmızı floresan 3 kDa dextran en choroid plexus düzeyde. Doğru resmi: soldaki ve ortadaki resimlerini birleştirme. Ölçek çubuğu 50 µm. (B) sol resim: floresan 10 kDa dextran fare beyincik içinde yeşil. Orta resim: kırmızı floresan 3 kDa dextran fare beyincik içinde. Doğru resmi: soldaki ve ortadaki Resim birleştirme. Kesik çizgiler damar duvarları için işaret etmektedir; Ok uçları CNS parankimi floresan izleyiciler üzerine gelin. Ölçek bar 100 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 : Situ zymography temsilcisi resimleri. İlk sütun: yeşil flüoresan kanal (boya-su (DQ) jelatin unquenched sinyal). İkinci sütun: mavi flüoresan kanal (laminin). Üçüncü sütun: kırmızı floresan kanal (CD45). Dördüncü sütun: floresan kanalları birleştirme. Üst satır: soğuk jelatin (floresan olmayan) negatif kontrol. Orta sıra: phenantroline (MMP-inhibitörü) negatif kontrol. En düşük satır: DQ jelatin. Ölçek bar 100 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

0-3 nokta puanı Ölçüt ağırlık değişiklik
0 hiçbir belirti normal kilolu
~ zayıf kuyruk (zayıf tonusunuz) - inhouse ölçüt: belgelenmiş puanlama dahil değildir kilo kaybı (2 kontrol için gösterge)
0,5 kuyruk limp (kuyruk damla) kilo kaybı
1 hindleg zayıflık, dengesiz yürüme (fare kürsüye bir ördek gibi yürür) kilo kaybı
2 hindleg parapleji (fare onun hindlimbs hareket etmez) şiddetli kilo kaybı (2 kontrol için gösterge)
3 hindleg parapleji, daha düşük vücut kontrol kaybı inkontinans (fare falls bir yan ama ist frontlegs + inkontinans; kullanarak kafeste taşıyabilirsiniz can çekişen) çok düşük vücut ağırlığı (2 kontrol için gösterge)

Tablo 1: EAE hastalık şiddeti değerlendirilmesi için kriterleri puanlama.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada, teşvik ve kadın C57BL/6 farelerde EAE izlemek için bir iletişim kuralı mevcut. Kadın tercihen seçilir ve orada kadınlar insidansı: Erkekler 3:1 MS. EAE şiddetini değerlendirmek için yaptığımız bir 3-nokta skor sayfası kullanın. EAE önem genellikle motor işlev bozuklukları önem derecesi ile ilgili olarak attı. EAE aşamalarında fare ile gelişmiş, yani 2 üzerinde bir skor sergilenmesi hayvanların gereksiz acı önlemek için feda. Böylece, bu fareler yakın aralıklarla örneğin puanı için önerilir günde iki kez iletişim kuralında açıkladı.  Birkaç istihdam rutinleri puanlama, 0-6 Puan 0-3 ulaşan16,17,18,19 veya daha fazla subpoints20puan. Ancak, biz daha önce sözde rafine EAE puanlama hastalığı puanları potansiyel istatistiksel olarak önemli farklılıkları dikkate alınarak genel hastalık şiddeti15gruplar arasında belirlemede herhangi bir iyileşme yol açmaz olduğunu göstermiştir. EAE hastalığın ilerlemesinde fare işlem süresini azaltmak için değerlendirmek için 3 noktalı ölçeğini kullanmak ve böylece, sıkıntı 3R kuralları uygulama fareler için yapılan bu gözlem dayalı. Başka bir kritik nokta EAE modelini kullanarak çalışma nakavt ve vahşi-tipi fare arasındaki farklar veya tedavi grupları arasındaki farklar konusunda bir kesin deneysel planlama kadar kuruyor. Vahşi tipi fareler nakavt fareler için karşılaştırıldığında, heterozigoz matings kaynaklanan littermates EAE deneyde karşılaştırıldığında vahşi tipi ve nakavt fareler aynı genetik arka sağlamak için karşılaştırmak için önemlidir. Bir deneyde, örneğin kafes değişiklikleri, ıslak yiyecek, yönetimi dahil tüm fareler için aynı koşullar tutmak ve özellikle (sistem durumu) koşulları konut fare önemlidir. Araştırmacı tarafından indüklenen kafes özel olayları önlemek için çapraz-aşılama yapılmalıdır. Daha doğrusu, birden fazla şırınga fareler belirli sayıda bağışıklık için gerekliyse, rastgele farklı şırıngalar kullanılan atanmalıdır. İkincisi aynı şekilde tedavi çalışmaları performans için uygulanmalıdır. Son olarak, fareler farklı hayvan tesislerinde housed sağlık durumunu hastalık görülme sıklığı ve şiddeti üzerinde etkisi olabilir ve böylece daha fazla21 veya daha az Mycobacterium tüberküloz22 uygun bir klinik ikna etmek için gerekli olabilir hastalık. Ayrıca, sitenin enjeksiyon hastalığı geliştirme üzerinde etkisi olabilir. Bu protokol için biz nispeten küçük birimleri beş farklı subkutan sitelerine enjekte için teklif: iki yanları, 20 µL sol ve sağ kuyruk kök içine ve boyun içine küçük bir damlacık içine 30 µL. Diğer protokoller 50 µL depoları subkutan kuyruk kök sadece23 veya dört yanları21içine yerleştirilir. Daha küçük depoları, enjeksiyonlari ancak, cilt tahrişi, hangi fare çizik için deneyebilirsiniz neden olan risk en aza indirmek.

İn vivo geçirgenliği BBB sızıntı sırasında EAE değerlendirmek için aynı zamanda bir molekül veya ilaç tedavisi belirli genetik silinmesine BBB bütünlüğü içinde vivo etkileri olup olmadığını değerlendirmek için yapılması. Bu bir canlı fare24dolaşıma uygulanır ya endojen plazma izleyiciler IgG mevduat12 gibi algılanması tarafından gerçekleştirilen veya eksojen transta olabilir. Bu protokol için yaptık aynı anda enjekte ve BBB şiddetini belirlemek için 15 dakika ile farklı boyutlarda iki tarayıcıları kullanarak tanımlanmış bir zaman sağlar dolaşmaya izin iki farklı eksojen tarayıcıları (3 kDa ve 10 kDa Dextran) kullanımı disfonksiyon ve izleyici boyutları bu diffüz ya da değil BBB karşısında bir kesim tanımlamak için izin verebilir. Floresan dextrans hidrofilik polisakkaritler tarafından iyi su çözünürlük, düşük toksisitesi ile karakterize olan ve nispeten düşük immünojenisite. Ayrıca, dextrans Poli-(α-D-1,6 glikoz), hangi bölünme endojen hücresel glycosidases tarafından karşı dayanıklıdır oluşur. Biz burada lizin artıkları dextran eşlenik dahil var dextran türevleri kullanılır. Lysinated dextrans aldehit tamir edilebilir, izleyici doku düzeltmek için izin veren vardır. Fluorescently etiketli dextrans yanı sıra diğer kimyasallar içinde vivo geçirgenliği, örneğin, Höchst boya serum albümin için büyük bir bölümü bağlar Evan'ın mavi ile birlikte değerlendirmek için kullanılabilir. Höchst CNS yüzdeki astar BBB endotel hücre çekirdeği lekeleri ve Evan'ın mavi BBB disfonksiyon üzerine Perivasküler uzayda tespit edilebilir ve daha fazla glia limitans rahatsız25,26olduğunda dağılır. Buna ek olarak, içinde vivo geçirgenliği immünfloresan endojen işaretleri boyama tarafından değerlerin birikimi, örneğin, IgG molekülleri veya fibrinojen, kan içinde zaman içinde dolaşır bir glikoprotein görmemizi sağlar. Sağlıklı koşullarda Perivasküler alanı çok dar ve endotel membran ve glia limitans yakından bağlantılıdır ve, böylece, NVU iki ECM engel görselleştirme laminin izoformu özgü antikor27 boyama gerektirir .

Endojen IgG yok BBB kurulan12nerede circumventricular organ, doku olduğu gibi sırasında sağlık ve hastalık kan damarları de içinde mevcut moleküllerdir. Gen fareler ile beyin engel kusurlar, uyuşturucu tedavisi sırasında değiştirilmiş veya normalde kanda dolaşan neuroinflammation endojen molekülleri sırasında anti-laminin ile counterstaining tarafından görüntülenmiştir CNS parankimi yatırılması ya bütün laminin izoformlarının (pan-laminin antikorlar) veya laminin izoformu özel antikorlar endotel membran ve laminin α1 ve laminin α2 glia üzerinden laminins, laminin α4 ve α5 ayırt etmek için izin tanıma antikorlar limitans. Neuroinflammatory koşullarında Perivasküler alanı bağışıklık hücreleri hem, endotel membran ve pan-laminin antikor kullanarak glia limitans tanımlamak için izin infiltre tarafından genişletilmiş. Laminins NVU mevcut, counterstaining endojen değerlendirmek için ama Ayrıca eksojen izleyiciler CNS parankimi yatırılır ve CD45 counterstaining BBB odak kaçağı bağışıklık hücreyle ilişkili olup olmadığını değerlendirmek için sağlar infiltrasyon.

Bağışıklık hücre göç CNS parankimi içine iki ayrı engel NVU, endotel BBB ve daha sonra glia limitans28içinde sıralı geçişi gerektirir. Glia limitans ve bağışıklık hücrelerinin CNS giriş kapısı klinik EAE29başlangıcı ile ilişkili olan, CNS hücrelerinin infiltre leptomeningeal içinde sıkışıp ve Perivasküler alanlarda klinik EAE tetiklemek değil. Bağışıklık hücre bindirme leptomeningeal ve Perivasküler alanlarda Bodrum membranlar arasında çeşitli gen-modified fare modellerinde örneğin L-selektin nakavt fareler30, TNF nakavt fareler23, MMP2/MMP9 Çift Kişilik nakavt fareler10 gözlenmiştir ve reçel-B nakavt fareler12. Bu moleküller eksikliği bağışıklık hücre göç BBB arasında ama oldukça glia limitans moleküler mekanizmaları bağışıklık hücre göç BBB ve glia limitans arasında arabuluculuk olduğunu vurgulamış, karşısında etkileyeceğini bu bulgular alt çizgi farklı. Beyin içinde in situ zymography CNS patoloji için kesin kayma korelasyon doku bölümünde Fokal gelatinase etkinlik için araştırmak için bir metodoloji var. MMP2/MMP9 bir etkinlik tespit için yerinde zymography performans ile birlikte içinde vivo BBB geçirgenliği tespiti böylece betimlemek için endotel glia bariyer rahatsızlık karşı bağışıklık hücre infiltrasyonu korelasyon sağlar. Pan-laminin ve CD45 ayirt EAE beyin bölümleri üzerinde boyama ile birlikte, aynı zamanda bağışıklık hücrelerinin infiltre, Yerelleştirme ve yerelleştirme unquenching DQ-jelatin gelatinase etkinliğinin sağlar. Fluoresein düzensiz loş yeşil flüoresan alanlar doku bölümlerinde belirsiz sinyal12olarak dikkate alınması gereken varken bir tipik taneli parlak yeşil Floresans sinyalinde DQ-jelatin sonuçlarından biri unquenching. Böylece, doku bölümler ve uygun denetimler dikkatli değerlendirilmesi vazgeçilmez in situ zymography işlemi sırasında. Bu protokol için in situ zymography CD45 ve laminin boyama ile birlikte seslendirdi. Birincil antikorlar CD45 ve laminin karşı bir karışımı aynı anda inkübe. Benzer şekilde, ikincil antikorlar ikinci bir boyama adım bir karışımı olarak inkübe. Böyle bir kombinasyon antikorların ikinci sahne antikorları olan önlemek için diğer IgGs karşı emilir emin olmak için test gerekir.

Birlikte ele alındığında, burada sunulan iletişim kuralları ayrıntılı olarak hangi unsuru NVU EAE neuroinflammatory koşullarda engelliler araştırmak için araçlar sağlar. İn vivo geçirgenliği değerlendirme eksojen izleyiciler tarafından geçerli mikrovasküler endotel hücre bütünlük bozulma veya geçerli NVU bozulma tanıtılmasına olanak sağlar. Buna ek olarak, BBB bozukluğu şiddetini tahmin etmek için farklı boyutları ile izleyicileri giriş sağlar. Ek yerinde zymography glia limitans bir son erişim CNS parankimi10almadan önce bariyeri için gereken odak gelatinase faaliyet astrocytes ve potansiyel olarak iltihabi hücreler, ortaya çıkarır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Hiçbir çıkar çatışmaları ilan etti.

Acknowledgments

Ona orijinal in situ zymography protokolü10 bizimle paylaştı Lydia Sorokin minnetle anıyoruz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AMCA anti-rabbit antibody Jackson ImmunoResearch 111-156-045 Store at 4 °C; protect from light
Anti-CD45 Antibody (30F11) Pharmingen 07-1401 Store at 4 °C
Anti-Laminin Antibody DAKO Z0097 Store at 4 °C
Breeding food e.g. PROVIMI KLIBA SA 3336
Individually ventilated cages, Blue line Type II or III e.g. Tecniplast 1145T, 1285L
BSA fraction V Applichem A1391 Store at 4 °C
Cold gelatine Sigma-Aldrich G 9391
Coplin jar + rack e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG H554.1; H552.1
Cy3 anti-rat antibody Jackson ImmunoResearch 111-156-144 Store at 4 °C; protect from light
Cover slips 24 x 40 mm # 1 e.g. Thermo Scientific 85-0186-00
Dextran Alexa Fluor 488 (10,000 MW) e.g. Molecular probes D22910 Store at -20 °C; protect from light
Dextran Texas Red (3000 MW) Invitrogen D3328 Store at -20 °C; protect from light
EnzChek Gelatinase/Collagenase Assay Kit  Thermo Fisher Scientific; EnzCheck E12055 Store at -20 °C; protect form light
Female C57BL/6J mice (8-12 weeks) e.g. Janvier Labs Females, 8-12 weeks
Freezing box for histology slides e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG 2285.1
18G x 1½’’ (1.2mm x 40mm) injection needle e.g. BD, BD Microlance 3 304622
27G x ¾’’ – Nr. 20 (0.4mm x 19mm) injection needle e.g. BD, BD Microlance 3 302200
30G x ½’’ (0.3 mm x 13 mm) injection needle e.g. BD, BD Microlance 3 304000
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) e.g. Santa Cruz Biotechnology sc-24648 Store at 4°C
Maintenance food e.g. PROVIMI KLIBA SA 3436
MOGaa35-55 peptide e.g. GenScript Store at -80 °C
microscope slides (Superfrost Plus ) Thermo Scientific J1800AMNZ
Mycobacterium tuberculosis H37RA e.g. BD 231141 Store at 4 °C 
NaCl 0.9 % B. Braun 3535789
O.C.T. compound (Tissue-Tek ) Sakura 4583
Omnican 50 30G x ½’’ B. Braun 9151125S
Paraformaldehyde Merck 30525-89-4
Pertussis toxin e.g. List biological laboratories, Inc. 180 Store at 4 °C
poly(vinyl alcohole) (Mowiol 4-88) Sigma-Aldrich 81381
Protease Inhibitor EDTA free (Roche) Sigma-Aldrich 4693132001 Store at 4 °C
repelling pen e.g. DAKO Pen e.g. DAKO S2002
sealing film e.g. Parafilm M e.g Sigma-Aldrich P7793
Silica gel e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG 9351.1
Stitch scissor F.S.T 15012-12
syringe 1 ml e.g. PRIMO 62.1002
syringe 10 ml e.g. CODAN Medical ApS 2022-05
vaporizer system Univentor 400 UNO.BV

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tietz, S., Engelhardt, B. Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions. Journal of Cell Biology. 209, 493-506 (2015).
  2. Wu, C., et al. Endothelial basement membrane laminin alpha5 selectively inhibits T lymphocyte extravasation into the brain. Nature Medicine. 15, 519-527 (2009).
  3. Hannocks, M. J., et al. Molecular characterization of perivascular drainage pathways in the murine brain. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 38, 669-686 (2018).
  4. Kermode, A. G., et al. Breakdown of the blood-brain barrier precedes symptoms and other MRI signs of new lesions in multiple sclerosis. Pathogenetic and clinical implications. Brain. 113 (Pt 5), 1477-1489 (1990).
  5. Tommasin, S., Gianni, C., De Giglio, L., Pantano, P. Neuroimaging techniques to assess inflammation in Multiple Sclerosis. Neuroscience. , (2017).
  6. Lopes Pinheiro, M. A., et al. Immune cell trafficking across the barriers of the central nervous system in multiple sclerosis and stroke. Biochimica Biophysica Acta. 1862, 461-471 (2016).
  7. Bartholomaus, I., et al. Effector T cell interactions with meningeal vascular structures in nascent autoimmune CNS lesions. Nature. 462, 94-98 (2009).
  8. Kyratsous, N. I., et al. Visualizing context-dependent calcium signaling in encephalitogenic T cells in vivo by two-photon microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, E6381-E6389 (2017).
  9. Lodygin, D., et al. A combination of fluorescent NFAT and H2B sensors uncovers dynamics of T cell activation in real time during CNS autoimmunity. Nature Medicine. 19, 784-790 (2013).
  10. Agrawal, S., et al. Dystroglycan is selectively cleaved at the parenchymal basement membrane at sites of leukocyte extravasation in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Experimental Medicine. 203, 1007-1019 (2006).
  11. Song, J., et al. Focal MMP-2 and MMP-9 activity at the blood-brain barrier promotes chemokine-induced leukocyte migration. Cell Reports. 10, 1040-1054 (2015).
  12. Tietz, S., et al. Lack of junctional adhesion molecule (JAM)-B ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis. Brain, Behavior, and Immunity. 73, 3-20 (2018).
  13. Mähler Convenor, M., Berard, M., Feinstein, R., Gallagher, A., Illgen-Wilcke, B., Pritchett-Corning, K., Raspa, M. FELASA working group on revision of guidelines for health monitoring of rodents and rabbits. FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units. Lab Anim. 48 (3), 178-192 (2014).
  14. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visual Experiments. , (2014).
  15. Tietz, S. M., et al. Refined clinical scoring in comparative EAE studies does not enhance the chance to observe statistically significant differences. European Journal of Immunology. 46, 2481-2483 (2016).
  16. Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).
  17. Miller, S. D., Karpus, W. J. Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse. Current Protocols in Immunology. 15, Chapter 15 Unit 14 (2007).
  18. Sobel, R. A., Tuohy, V. K., Lu, Z. J., Laursen, R. A., Lees, M. B. Acute experimental allergic encephalomyelitis in SJL/J mice induced by a synthetic peptide of myelin proteolipid protein. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 49, 468-479 (1990).
  19. Westarp, M. E., et al. T lymphocyte line-mediated experimental allergic encephalomyelitis--a pharmacologic model for testing of immunosuppressive agents for the treatment of autoimmune central nervous system disease. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 242, 614-620 (1987).
  20. Klotz, L., et al. B7-H1 shapes T-cell-mediated brain endothelial cell dysfunction and regional encephalitogenicity in spontaneous CNS autoimmunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, E6182-E6191 (2016).
  21. Tietz, S. M., et al. MK2 and Fas receptor contribute to the severity of CNS demyelination. PLoS One. 9, e100363 (2014).
  22. Coisne, C., Mao, W., Engelhardt, B. Cutting edge: Natalizumab blocks adhesion but not initial contact of human T cells to the blood-brain barrier in vivo in an animal model of multiple sclerosis. Journal of Immunology. 182, 5909-5913 (2009).
  23. Korner, H., et al. Critical points of tumor necrosis factor action in central nervous system autoimmune inflammation defined by gene targeting. Journal of Experimental Medicine. 186, 1585-1590 (1997).
  24. Krueger, M., et al. Blood-brain barrier breakdown involves four distinct stages of vascular damage in various models of experimental focal cerebral ischemia. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 35, 292-303 (2015).
  25. Hawkins, B. T., Egleton, R. D. Fluorescence imaging of blood-brain barrier disruption. Journal of Neuroscience Methods. 151, 262-267 (2006).
  26. Graesser, D., et al. Altered vascular permeability and early onset of experimental autoimmune encephalomyelitis in PECAM-1-deficient mice. Journal of Clinical Investigation. 109, 383-392 (2002).
  27. Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Seminars in Immunopathology. 31, 497-511 (2009).
  28. Owens, T., Bechmann, I., Engelhardt, B. Perivascular spaces and the two steps to neuroinflammation. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 67, 1113-1121 (2008).
  29. Sixt, M., et al. Endothelial cell laminin isoforms, laminins 8 and 10, play decisive roles in T cell recruitment across the blood-brain barrier in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Cell Biology. 153, 933-946 (2001).
  30. Grewal, I. S., et al. CD62L is required on effector cells for local interactions in the CNS to cause myelin damage in experimental allergic encephalomyelitis. Immunity. 14, 291-302 (2001).

Tags

İmmünoloji ve enfeksiyon sayı: 145 bağışıklık sistemi anatomi Hemic ve bağışıklık sistemi kalp-damar sistemi sinir sistemi hastalıklar sinir sistemi hastalıkları deneysel otoimmun ensefalomiyelit vivo geçirgenliği in situ zymography kan-beyin içinde bariyer glia limitans nörovasküler birimi
Nörovasküler biriminin endotel ve gliyal engelleri bozulma Vivo deneysel otoimmun ensefalomiyelit sırasında görüntülenmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tietz, S. M., Engelhardt, B.More

Tietz, S. M., Engelhardt, B. Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo. J. Vis. Exp. (145), e59249, doi:10.3791/59249 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter