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Immunology and Infection

体内自身免疫性脑髓炎实验性神经血管内障碍和胶质屏障的可视化

Published: March 26, 2019 doi: 10.3791/59249

Summary

在这里, 我们提出的方案, 以调查损伤的神经血管单位在实验性自身免疫性脑髓炎在体内。我们专门讨论了如何确定血液脑屏障通透性和明胶酶活性与白细胞迁移跨越胶质细胞限制。

Abstract

神经血管单元 (NVU) 由微血管内皮细胞组成, 形成血脑屏障 (BBB)、内皮基底膜 (嵌入过周) 和胶质细胞限制细胞, 由实质基底膜和星形胶质细胞组成端部饲料包括中枢神经系统 (CNS) 微血管的烧蚀面。除了维持中枢神经系统的稳态外, NVU 还控制着免疫细胞贩运进入中枢神经系统。在对中枢神经系统进行免疫监测期间, 低活性淋巴细胞的数量可以穿过内皮屏障, 而不会导致 BBB 功能障碍或临床疾病。相反, 在多发性硬化症或其动物模型实验性自身免疫性脑炎 (EAE) 等神经炎症期间, 大量的免疫细胞可以穿过 BBB, 随后胶质细胞最终到达中枢神经系统实质导致临床疾病。 因此, 免疫细胞迁移到中枢神经系统实质是一个两步的过程, 涉及连续迁移整个内皮和胶质屏障的 NVU 采用不同的分子机制。如果在通过内皮屏障后, T 细胞在血管周围抗原表达细胞上遇到认知抗原, 它们的局部激活将启动随后的机制, 导致明胶酶的局灶性激活,将使 T 细胞越过胶质屏障, 进入中枢神经系统实质。因此, 在 EAE 期间, 评估 BBB 通透性和 MMP 活性与中枢神经系统免疫细胞积累的空间相关性, 可以指定 NVU 内皮屏障和胶质屏障完整性的丧失。 本文介绍了如何通过主动免疫诱导 c57bl6 小鼠的 EAE, 以及如何利用外源荧光示踪剂联合分析 BBB 在体内的通透性。我们进一步展示了如何可视化和定位明胶酶活性在 EAE 大脑中的原位酶结合到免疫荧光污渍的 bbb 基底膜和 CD45 + 入侵免疫细胞。

Introduction

中枢神经系统 (CNS) 协调脊椎动物的所有身体和精神功能, 中枢神经系统的稳态对于神经元的适当沟通至关重要。中枢神经系统的稳态是由神经血管单位 (NVU) 保证的, 它保护中枢神经系统免受血液变化环境的影响。NVU 由中枢神经系统微血管内皮细胞组成, 具有生物化学性质的独特性, 并在具有周细胞、星形胶质细胞、神经元和细胞外基质 (ECM) 成分的连续串扰中建立血脑屏障 (BBB), 建立两个独特的基底膜1。内皮基底膜, 使 BBB 内皮细胞的腔侧含有大量的周周细胞, 并由层压蛋白α4和层压蛋白α5组成, 以及其他 ECM 蛋白 2.相反, 实质基底膜由层蛋白α1和层蛋白α2组成, 并被星形胶质细胞终脚所接受。实质基底膜与星形胶质细胞终脚共同构成胶质细胞限制, 将中枢神经系统神经元网络与充满血管周围或蛛网膜下腔的脑脊液分离3。由于 NVU 的独特结构, 免疫细胞贩运到中枢神经系统是不同于, 进入外周组织, 因为它需要一个两步的过程与免疫细胞, 首先违反内皮 BBB, 然后胶质限制, 以到达中枢神经系统。

多发性硬化症 (MS) 是中枢神经系统常见的神经炎症性疾病, 其中大量循环免疫细胞进入中枢神经系统, 引起神经炎症、脱髓鞘和 BBB 完整性局灶性丧失4。BBB 完整性的丧失是 MS 的一个早期特征, 磁共振成像 (MRI) 5 显示中枢神经系统中存在的增强铝对比度病变就表明了这一点.白细胞向中枢神经系统的外渗发生在毛细血管后静脉水平;然而, BBB 基底膜上的免疫细胞直径所涉及的精确机制以及随后的胶质屏障仍有待探索。实验性自身免疫性脑炎 (EAE) 是 MS 的动物模型, 对我们目前对 MS 发病机制的了解做出了显著贡献。例如, 使用 EAE 模型, 已经发现白细胞外渗发生在一个多步骤的过程中, 包括由选择和粘液样分子 (p-选择蛋白糖蛋白配体 (PSGL)-1 介导的初始捕获和滚动步骤,其次是整合依赖的牢固的逮捕和在 BBB 内皮细胞上的 T 细胞爬行到允许的边的 diapdesis6

一旦 T 细胞穿过内皮 BBB 和内皮基底膜, 它们就需要在巨噬细胞或树突状细胞上遇到它们的同源抗原, 这些细胞战略性地定位在平生细胞或血管周围的空间。这种相互作用诱导促进炎症介质的聚焦产生, 从而触发中枢神经系统组织通过胶质细胞7,8,9侵入免疫细胞所需的后续机制。基质-金属蛋白酶 (MMP)-2 和 MMP-9 的焦点活化改变趋化因子活化并诱导星形胶质细胞末端脚部细胞外基质受体的降解, 这是免疫细胞在胶质细胞中迁移到胶质细胞中的先决条件。中枢神经系统实质和诱导的临床症状的 OAE10,11

结合中枢神经系统浸润免疫细胞的检测与 BBB 泄漏和中枢神经系统组织切片中的明胶酶活性相结合, 为神经炎症背景下内皮屏障和胶质屏障的功能完整性提供了有价值的信息。例如, 我们最近研究了内皮紧密结合分子连接粘附分子 (JAM)-b 在 EAE 环境下向中枢神经系统的导入中的本构损失。与健康的野生型 c57bl6 小鼠相比, 健康的 Jam-b 缺乏的同学没有显示出 BBB 完整性的损伤, 这表明在体内的通量评估使用内源性和外源示踪剂12。在 EAE 方面, 缺乏 Jam-b 的 c57bl6 小鼠表现出改善的疾病症状, 这与炎症细胞捕获在小孔和血管周围空间12有关.为了研究这种现象, 我们在原位酶学, 允许识别明胶酶活性, 以测试缺乏正义酶酶活性的族洗钱蛋白酶活性是否可能导致能够突破胶质限制12

鉴于缺乏不同的转基因小鼠模型, 例如, 可能导致 BBB 功能变化的不同 BBB 紧密连接分子的可用性, 研究 BBB 完整性的方法非常重要。此外, 新开发的药物可能会对 NVU 的壁垒产生影响。在这里, 我们展示了如何诱导 eae c57bl6 小鼠积极免疫髓鞘少突胶质细胞糖蛋白 (MOG)-肽 aaaa35-55 在完整的 Freund 的佐剂。然后, 我们解释了如何定位免疫细胞浸润的内皮和胶质屏障的 NVU, 以及如何研究在体内内皮和胶质屏障完整性的原位检测外源示踪剂和明胶酶活性, 分别。

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Protocol

所有研究都是根据这些准则根据瑞士关于保护动物的立法进行的, 并得到了瑞士伯尔尼州兽医办公室的批准 (许可号: be31/和 BE 77/18)。

1. 在特定无病原体 (SPF) 条件下的 c57bl6 小鼠的外壳

  1. 在每一个通风笼子里, 以 12/半小时的光暗周期的家庭老鼠。提供食物和水的。为了监督小鼠的微生物质量, 实验组根据 FELASA 建议13, 采用肮脏床上用品的哨兵进行季度健康监测。
  2. 使用耳拳单独标记8-12 大的雌性 c57bl·6只小鼠。

2. c57bl6 小鼠免疫接种

  1. 解决方案的准备 14:
    1. 对于完全弗罗因德的佐剂 (CFA), 将30毫升的不完全弗罗因德的佐剂与120毫克的新鲜湿热灭活结核分枝杆菌 (H37RA) 混合在烟云罩下。将库存解决方案存放在4°c。
    2. 对于 MOGaa35-55 肽活性物质溶液, 在无菌 PBS (4 Mg/ml) 中溶解 Mogaa13-55 肽, 并在-80°c 下储存。
    3. 准备 mog 乳液:
      1. 稀释 CFA 1:2 与 mL 肽股票溶液在一个2毫升微管。
      2. 用密封膜密封微管, 用胶带完全覆盖微管, 固定在涡流搅拌机上。在4°C 下为4小时的涡流乳液。
    4. 用稳定的乳液准备注射器:
      1. 取微管, 用一个小的离心机快速旋转下乳状液。使用 18G x 11"" (1.2 mm x 40 mm) 注射针将乳剂收集到注射器中。
      2. 根据小鼠的数量调整注射器 (100μl/m鼠) 中的乳状液体积, 并将18G 针替换为 27G x ' (0.4 mm x 19 毫米) 注射针。用密封膜密封连接到注射器上的注射针。
    5. 对于百日咳毒素 (PTx) 库存溶液, 在500μl 无菌 PBS (100 ngμl) 中溶解50微克的冻干 PTx。将库存解决方案存放在4°c。
    6. 对于 PTx 工作溶液, 每只小鼠将97μl 无菌 PBS 与 3μl PTx 库存溶液 (300 ng1μl) 混合 (对于腹腔注射, 使用 30G x 半 ' (0.3 mm x 13 mm) 针)。
  2. EAE 诱导
    1. 用蒸发器系统将 c57bl6 小鼠与异氟烷进行麻醉。为了诱导小鼠麻醉, 将小鼠暴露在小孵化器的氧气中, 然后将小鼠转移到具有2.1% 异氟烷的面罩中。使用配备加热垫的麻醉装置, 以防止小鼠体温过低。
    2. 将麻醉小鼠用一只手固定, 首先将 30Μ5-55/cfa 乳剂皮下注射到后腿侧翼 (图 1:1 + 2; 共 60μl; 左侧30μl 和右侧翼 30Μl), 靠近腹股沟淋巴结。
    3. 将小鼠放在腹部, 并将20μh 的 Mogaa35-55/Cfa-co-col 乳剂注入尾根的左右软组织 (图 1:3 + 4); 总 40μl; 左侧尾根20Μl 和右侧尾根 20Μl) 和 Mogaa35-55/Cfa-co-co-coh 乳液的小液滴o 鼠标颈部 (1:5)。
    4. 在小鼠体内腹腔注射100Μl 的 PTx 溶液。将鼠标的头部保持在身体中心下方, 避免注射到肠道。
    5. 取代维持饮食 (挤出物主要营养素: 粗蛋白 18.5%; 粗脂肪 4.5%; 粗纤维 4.5%; 粗灰分 6.5%; 淀粉 35%; 代谢能量: 13.1 mjkg) 以养殖饮食 (挤出物主要营养素: 粗蛋白 23.5%; 粗脂肪 5.5%; 粗纤维 3%;粗灰分 5.7%;淀粉 36%;代谢能量: 14.3 mj kg), 以便在预期的临床疾病之前和期间为小鼠提供能量含量较高的食物。
    6. 摘下面罩, 用暖垫将鼠标转移到主笼子。确保鼠标在10分钟后完全清醒和运动。
    7. 第一次治疗后, 重复 PTx 注射 (2.2.4) 48小时。

3. EAE 小鼠的评分

  1. 每天早上, 通过查看笼子内的情况, 检查 EAE 老鼠的健康状况。
  2. 每天下午给 EAE 老鼠打分。
  3. 将 EAE 实验中包含的每只鼠标从笼子中取出, 并通过用手指向上移动, 检查尾巴是否有扁桃体。一只健康的老鼠会保持它的尾巴 (尾巴有一个扁桃体)。如果临床 EAE 已经开始, 尾巴扁桃体会更低, 可以看到尾巴的逐渐下降。最终, 老鼠将无法抬起它的尾巴。
  4. 将 EAE 实验中包含的每一个鼠标放在干净的长凳上, 观察和记录行走行为。关于疾病严重程度评估的评分标准 (EAE 评分), 请参见表 115.
  5. 评估和记录实验中包含的每个鼠标的重量。
  6. 确保显示临床 EAE 分数为1的小鼠摄入足够的食物和水分, 并每天刷新笼子底部的塑料盘子中的湿食物。

4. 体内渗透率测定

  1. 解决方案的准备工作:
    1. 对于糊精库存溶液, 溶解10毫克的 10 kda Dextran 亚历克莎 flor 488, 以及 3 kDa Dextran 得克萨斯红在 500μl 0.9% 氯化钠溶液 (20 mg/mL)。
    2. 对于糊精工作解决方案, 就在将管道55μl 的10Kda 右旋拉亚历克莎 Flor 488 库存解决方案 (20 mg/mL) 注入一块密封膜上, 并添加55μl 的 3 kDa 右旋糖酐德克萨斯州红色库存解决方案 (20 mg/mL)。将100μl 混合并收集到一次性精细注射器中 (最终浓度为 2 mgs100μl)。
    3. 对于10% 甲醛 (PFA) 库存溶液, 将10克 PFA 额外纯粉、100毫升 PBS 和 200Μl 1N NaOH 混合在一个干净的玻璃烧杯中, 然后在搅拌时使用磁力搅拌器加热到精确 56°C;在56°c 下保持 30分钟, 直到 PFA 完全溶解;冷却至室温;将 pH 值调整为 7.4;并通过纸张过滤器进行筛选。储存在-20°c。股票溶液可以进一步稀释使用 PBS。
  2. 不久麻醉健康的 c57bl6 小鼠或 c57bl6 小鼠患有异氟醚的 EAE (小鼠将被镇静剂镇静剂约 1分钟)。使用步骤2.2.1 的自动化系统 (小鼠将在诱导室的氧气中暴露在4.5% 的异氟醚中, 然后转移到含有2.1% 异氟醚的面罩中)。
  3. 将麻醉后的小鼠放置在桌子上的侧向位置, 然后在小鼠醒来之前将100μl 荧光示踪剂注入小鼠体内 (例如后轨道)。
  4. 立即取出面罩, 并确保小鼠在短暂的麻醉后完全清醒和运动。让示踪剂循环15分钟。
  5. 继续执行步骤5.1。

5. 小鼠灌注

  1. 对于体内渗透率评估:
    1. 在荧光示踪剂注射15分钟后, 通过诱导深异氟烷麻醉开始手术。为诱导小鼠深部麻醉, 在氧中使用了2.3% 的异氟醚。使用爪子撤退反射来判断麻醉的深度 (捏脚趾之间的皮肤; 缺乏屈曲表示足够的深度), 并探测受 EAE 影响的小鼠前肢和后肢的反射。
    2. 将鼠标固定在背部, 然后用乙醇喷洒腹部。用剪刀打开胸部, 取出隔膜。使用剪刀打开跳动的心脏的右心房, 用10毫升的 PBS 将鼠标通过心脏的左心室灌注, 然后在 PBS 中使用10毫升的 4% PFA。
      注意: 为了避免吸入 PFA, 将鼠标注入通风罩。
    3. 继续执行第6条。
  2. 对于原位酶学:
    1. 在患有 EAE 的小鼠的氧气中使用2.3% 的异氟醚麻醉, 并检查麻醉深度5.1.1。
    2. 接下来, 将鼠标固定在背部, 然后用乙醇喷洒腹部。用剪刀打开胸部, 取出隔膜。用剪刀打开跳动的心脏的右心房, 用20毫升的 PBS 将鼠标通过心脏的左心室灌注。
    3. 继续执行第6条。

6. 大脑的解剖和冻结

  1. 冷却浴的准备:
    1. 用碎冰填充一个扁平的除瓦容器, 加入 2-甲基丁烷 (异戊烷), 直到液体达到干冰包上方约1厘米处。盖上一个松散的盖子--例如, 一个冰桶盖。
  2. 用锋利的剪刀将灌注鼠标的头部剪下来, 用较小的剪刀去除皮肤和耳朵。
  3. 仔细解剖头盖骨, 从孔状的大孔切入前部的左侧和右侧, 允许将头盖骨顶在大脑上。然后, 小心地将完整的大脑从颅底抬出来, 同时用扁平的金属铲子切断视神经。
  4. 将大脑放在铝箔上, 通过放置两个冠状切口将大脑切成三块 (额叶大脑、中脑和小脑 + 脑干)。
  5. 用最佳的温度切割 (o. c. t.) 矩阵将冷冻器 (25 毫米 x 20 毫米 x 5 毫米) 填充到第一季度, 将每个脑片的前侧朝下进入冷冻机, 并用 o. c. t. 矩阵完全覆盖组织。
  6. 将与组织的冷冻体水平定向放入 2-甲基丁烷浴中, 并通过避免将整个组织块浸入浴缸中, 确保组织在1分钟内从底部冻结到顶部。
  7. 将冷冻组织转移到-80°c 进行储存, 然后继续进行第7节。

7. 冷冻组织切片的制备

  1. 在低温恒温器中, 从-80°c 到-20°C 的冷冻组织中平衡温度30分钟。
  2. 从冷冻机上取出组织块, 并使用 o. c. t. 矩阵将其安装在低温恒温器组织支架 (设置为-15°c) 上。
  3. 用锋利的手术刀将组织块的边缘修剪在低温支架上, 并通过使用低温刀取出20μm 的部分, 开始切割到组织块中, 直到组织可见为止。
  4. 用于体内 BBB 渗透率的分析:
    1. 切割6-10μm 的组织切片, 将其收集在粘附玻璃幻灯片上, 并使用荧光显微镜立即用盖板成像。
    2. 评估大脑中血管的外观 (注意与观察到的血管漏水的弥漫性荧光模式相比, 血管的尖锐边界)。作为阳性对照, 验证示踪剂泄漏到缺乏 BBB 的环心室器官或脉络丛的基质中。
  5. 对于原位酶学:
    1. 使用低温恒温器切割6μm 的组织部分, 将其收集在粘附玻璃幻灯片上, 并在-20°c 的冷冻箱中将组织切片冻结在盖子中含有硅胶的冷冻箱中。

8.原位酶学结合拉米宁/cd45 免疫荧光染色

  1. 准备解决方案:
    1. 准备嵌入解决方案:
      1. 混合6克甘油 (分析级), 2.4 克的聚 (乙烯醇), 6 毫升的 ddH2O, 12 毫升 0.2 M Tris 缓冲液, pH 8, 搅拌 (磁力搅拌器) 溶液4小时在 RT。
      2. 将溶液转移到50毫升的离心管上, 让它在 RT 休息2小时。随后在 50°c (水浴) 下孵育溶液 10分钟, 在室温下 2, 700 x 克孵育20分钟。
      3. 服用上清液, 在-20°c 时冷冻。
    2. 准备冷明胶溶液:
      1. 在10毫升的 ddH2O 中溶解牛皮肤0.1 克的冷明胶。
      2. 让它浸泡至少 1天, 并在4°c 下储存脂肪。
    3. 准备冰凉甲醇 (-20°c):
      1. 将100% 甲醇放入可待因罐中, 冷却至-20°c。
    4. 准备10% 的氮化钠库存解决方案:
      1. 在 ddH2O 的10毫升中加入1克氮化钠, 并在室温下储存。
    5. 准备0.1% 氮化钠的工作解决方案:
      1. 将99Μl 的 ddH2O 与10% 氮化钠的库存溶液中混合。
    6. 在1毫升氮化钠的工作溶液中, 从猪皮肤中溶解1毫克荧光素共轭染料淬火 (DQ) 明胶, 并在4°c 时储存100Μl 脂肪, 不受光保护。
    7. 在76μl 乙醇中溶解30毫克的 1, 10 苯基林一水, 并储存在-20°c。
    8. 准备25x 蛋白酶抑制剂溶液:
      1. 在 ddH2O 中加入1片游离 edta 蛋白酶抑制剂。储存在-20°c。
    9. 使用前, 准备反应溶液 (150μl 部分):
      1. 在 13, 300 x g 处离心 1 mgml DQ 明胶溶液 5分钟.
      2. 混合127.2Μl 的 ddH2O, 15μl 10倍反应缓冲液 (Gelatinasea/colagenase 检测试剂盒;见材料表)、0.3μl 的 20 mgml 冷明胶、1.5 μl 的 1 mgml DQ 明胶和25x 蛋白酶抑制剂溶液的6Μl。
    10. 使用前, 制备酚3林负控制反应溶液 (150μl/):
      1. 混合125微米的 ddH2O, 10x 反应缓冲液 15μl, 20mg/l 冷明胶 0.3μl, 1mgl DQ 明胶 1.5μl, 25x25f 蛋白酶抑制剂 EDTA 不含 6Μl, 2μl 2 m 1, 10-芬多林线 (MMP 抑制剂)。
    11. 使用前, 制备冷明胶 (非荧光) 负控制反应溶液 (150μl):
      1. 混合128.7μl 的 ddH2O, 15μl 的10倍反应缓冲液, 0.3μl 的 20 mgml 冷明胶, 和6μl 的无 edta 25X 蛋白酶抑制剂。
    12. 准备用于反染色的原代抗体鸡尾酒, 例如 PBS 中 1% bsa 中的0.95μgl 多克隆兔抗层压蛋白抗体和10μgml 多克隆大鼠抗 CD45 抗体, 并制备适当的同型对照原代抗体鸡尾酒。
    13. 制备二级抗体溶液, 例如, 7.5Μgml Cy3 山羊抗大鼠 + 15μgml AMCA 抗兔在 1% BSA 中的 PBS (防止光线)。
  2. 从烟盖内装有硅胶的塑料冷冻箱内的 EAE 小鼠身上解冻6μm 的非固定脑组织部分, 以避免将水保留在组织中, 并通过用防水笔在一张幻灯片上分离2个组织部分
  3. 准备反应溶液 (步骤 8.1.9-8.1.11), 在室温 13 400 x的温度下离心 5分钟, 使用水浴预热至37°c。
  4. 在37°c 下, 使用1x 反应缓冲液补充组织切片5分钟。然后, 倒出1x 反应缓冲液, 在组织切片上加入反应溶液, 在37°c 孵育4小时。在 ddH2O 中清洗幻灯片5次。
  5. 在-20°c 时使用冰凉甲醇固定部分 5分钟, 然后在室温下使用 PBS 清洗一段。
  6. 在 PBS 中添加1% 的 BSA 到切片中, 并在室温下孵育 20分钟 (防止光线照射)。然后, 通过翻转组织上的幻灯片, 添加初级抗体鸡尾酒, 并在室温下孵育 1小时 (防止光线), 从部分中丢弃 pbs 中的 1% BSA。
  7. 用 PBS 清洗切片两次, 添加二级抗体鸡尾酒, 并在室温下孵育 1小时 (防止光线照射)。
  8. 用 PBS 清洗切片两次, 用嵌入溶液安装幻灯片, 让安装的部分在室温下夜间干燥 (防止光线照射)。最后, 用荧光显微镜分析染色组织切片。

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Representative Results

评估 c57bl6 小鼠 EAE 的临床过程应导致如图 2 a 所示的疾病曲线和图 2A所示的小鼠体重变化。接受 MOGaa35-55 免疫的 c57bl6 小鼠通常在主动免疫后10-12 天左右开始出现疾病症状 (图 1 a)。通常情况下, 免疫小鼠在注射乳剂和第一剂百日咳毒素的第二天显示出短暂的体重下降 (图 1 b)。从 EAE 诱导后的第2天开始, 免疫小鼠的体重逐渐增加, 直到疾病开始, 当体重通常在临床症状发展前一天下降, 并继续减少与增加相关的情况疾病症状 (图 1a、b)。EAE 疾病的严重程度增加, 直到疾病的高峰, 这可以预期在第16天和第20天之间 EAE 诱导后 (图 2 a)。在临床 EAE 的高峰期, 小鼠的体重也最低 (图 2A), 这与疾病缓解期 eae 的改善有关 (图 2a,b)。使用 Mogaa5-55 对 c57bl6 小鼠的 EAE 诱导导致慢性疾病病理, 小鼠通常不能完全恢复 (图 1 a)。

图 3A显示了一只 c57bl6 小鼠的脉络丛和邻近的脑实质的典型图片, 这只小鼠在牺牲前15分钟被静脉注射了荧光 3 kda dextran (红色) 和 10 Kda dextran (绿色);刻度杆50μm。正如我们之前所证明的, 示踪剂很容易通过被吸收的微血管扩散到脉络丛的气孔 (左图和中图), 而 BBB 不允许循环示踪剂扩散到大脑实质, 表明由虚线 (右图), 从而没有任何荧光信号。图 3B显示了一只患有 eae 的 c57bl6 小鼠小脑中具有代表性的漏血管, 该小鼠在牺牲前15分钟被静脉注射荧光 3 kda dextran (红色) 和 10 Kda dextran (绿色)。箭头头表明, 追踪物在大脑微血管中扩散到中枢神经系统实质 (左、中图), 这表明 BBB 功能在这些血管中受到损害。在中枢神经系统实质中, 在血管壁外可以看到绿色和红色的荧光信号, 这些信号是用虚线表示的。在 EAE 中, 在小脑中, 炎症袖口出现的追踪器也可以在内皮基底膜和胶质细胞之间的血管周围空间中找到, 表明内皮 BBB 完整性的功能丧失。如果发现示踪剂扩散到大脑实质, 它显示额外的功能障碍的胶质屏障12

图 4显示了 c57bl6 小鼠 eae 大脑中明胶酶 (mmp) 活性分析的代表性图片, 这些图像通过原位酶学观察, 并通过抗泛层压蛋白 (蓝色) 定位到特定的脑屏障隔间, 并显示出通过抗 CD45 (红色) 免疫荧光染色的炎症细胞。染料淬火 (DQ) 明胶的蛋白溶解裂解不淬火荧光素信号, 从而使明胶酶活性在组织切片上定位。当冷明胶 (非荧光控制) 孵育时, 在 EAE 小鼠 (上排) 的大脑切片中, 以及在与酚类营养素 (强效 zn +) 结合孵育的部分中, 都无法检测到绿色荧光信号-络合剂和 MMP 抑制剂 (中排)。在下一行中, 焦点明胶/mmp 活性是典型的颗粒明亮的绿色荧光信号, 箭头突出显示。在 EAE 小鼠小脑的炎性袖口中, 炎症细胞浸润 (红色) 部位的胶质细胞限度 (蓝色) 以外发生特定的 MMP 活动。

Figure 1
图 1: 用于 EAE 诱导的注射部位的图形化表示.1) 注射部位为 30Μl mog 乳液进入右侧, 2) 注射部位为 30Μl mog 乳液进入左侧, 3) 注射部位为 20Μl mog 乳液进入左尾根, 4) 注射部位为 30Μl mog 乳液进入右尾根, 5) 注射部位, 将少量的 mog 乳状液滴插入颈部。请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: EAE 的代表性课程.(a) c57bl6 小鼠 eae 的疾病症状。显示均值 +/-SEM。(b) 随着时间的推移, eae 期间体重的变化。显示均值 +/-SEM。 请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 体内通透性的代表性图片.(a) 左图: 绿色荧光 10 kda 右旋糖酐水平的脉络丛。中间图片: 红色荧光 3 kDa 右旋糖酐水平的脉络丛。右图: 左、中图片合并。刻度条 50μm. (b) 左图: 绿色荧光 10 kda 右旋糖酐在小鼠小脑。中间图片: 红色荧光 3 kDa 右旋糖酐在小鼠小脑。右图: 左、中图片合并。虚线是指示血管壁;箭头指向中枢神经系统实质中的荧光示踪剂。刻度栏 100μm. 请点击这里查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4:有代表性的原位酶学照片.第一列: 绿色荧光通道 (染料淬火 (DQ) 明胶的未淬火信号)。第二列: 蓝色荧光通道 (层压)。第三列: 红色荧光通道 (CD45)。第四列: 荧光通道合并。上一排: 冷明胶 (非荧光) 负对照。中排: 芬3琳 (mmp 抑制剂) 阴性对照。最低行: DQ 明胶。刻度栏 100μm. 请点击这里查看此图的较大版本.

0至3分得分 标准 体重变化
0 没有迹象 正常重量
~ 弱尾巴 (弱扁桃体)-内部标准: 不包括在有据可查的评分 减肥 (第二次检查指示)
0。5 一瘸一拐的尾巴(尾滴) 减肥
1 后腿无力, 步态不稳(老鼠像鸭子一样走在长凳上) 减肥
2 后腿截瘫(鼠标不移动它的后肢) 严重减肥 (第二次检查指示)
3个 后腿截瘫, 尿失禁失去下半身控制 (老鼠倒在一边, 但可以在笼子里移动使用的前腿 + 尿失禁; 垂死) 非常低的体重 (指示第二次检查)

表 1: EAE 疾病严重程度评估的评分标准。

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Discussion

在这里, 我们提出了一个方案诱导和监测 EAE 在雌性 c57bl6 小鼠。女性优先被选择, 并且有妇女的发生率: 男性在 m s 中 3: 1。为了评估 EAE 的严重程度, 我们使用了3分评分表。EAE 的严重程度通常是根据运动功能障碍的严重程度来评分的。应牺牲 EAE 晚期的小鼠, 即表现出2分以上的小鼠, 以避免动物遭受不必要的痛苦。因此, 建议对老鼠进行近距离的评分, 例如, 如协议中所解释的那样, 每天两次。 有几个得分套路, 从0-3 分达到0-3 分16 分、17分、18分、19 分甚至更多的分20分。然而, 我们以前已经表明, 所谓的精细 EAE 评分并没有导致任何改善, 以确定潜在的统计显著差异的疾病评分之间的, 当考虑到整体疾病严重程度15。基于这一观察, 我们利用3点尺度来评估 EAE 中的疾病进展, 以减少老鼠的处理时间, 从而减少小鼠执行3R 规则的痛苦。另一个关键点是使用 EAE 模型来研究淘汰赛小鼠和野生小鼠之间的差异或治疗组之间的差异, 即建立一个精确的实验规划。在将野生小鼠与敲除小鼠进行比较时, 必须比较来自杂合交配的同学, 以确保野生小鼠和淘汰赛小鼠的遗传背景相同。同样重要的是, 对实验中包括的所有老鼠保持相同的条件, 例如笼子的变化、湿食物的管理, 特别是老鼠的住房 (健康状况) 条件。为了避免调查人员诱发的特定笼子现象, 应进行交叉免疫接种。更准确地说, 如果需要多个注射器来免疫一定数量的小鼠, 则应将它们随机分配到使用的不同注射器中。后者也应适用于治疗研究的进行。最后但并非最不重要的是, 放置在不同动物设施中的小鼠的健康状况可能会对疾病的发生率和严重程度产生影响, 因此可能需要更多的21个或更少的结核分枝杆菌22才能诱发适当的临床疾病。此外, 注射部位可能会对疾病的发展产生影响。在这个协议中, 我们建议注入相对较小的体积到五个不同的皮下部位: 30μl 到两个侧面, 20Μl 到左、右尾根, 并在脖子上有一个小液滴。在其他协议中, 50μl 仓库仅在皮下放置到尾根23或四个侧翼 21.然而, 注射较小的仓库会最大限度地降低引起皮肤刺激的风险, 而老鼠可能会试图划伤皮肤。

在体内可进行渗透率评估在 EAE 期间 BBB 泄漏, 但也评估分子的特定遗传缺失或药物治疗是否影响 BBB 在体内的完整性。这可以通过检测内源性等离子体示踪剂 (如 IgG 沉积 12)或外源性过渡来实现, 这些牵引力在活鼠24 的循环中应用。在这个协议中, 我们使用了两个不同的外源示踪剂 (3 kDa 和 10 kDa Dextran), 它们被同时注入并允许在规定的15分钟内循环. 使用两个不同大小的示踪剂可以确定 BBB 的严重程度功能障碍, 并可能允许定义一个截止点的示踪剂大小扩散或不跨越 BBB。荧光糊精是亲水多糖, 具有水溶性好、毒性低、免疫原性相对较低的特点。此外, 右旋糖体由多 (Α-D-1, 6 葡萄糖) 组成, 后者通过内源性细胞糖苷酶抵抗裂解。我们在这里使用的糊精变种, 有赖氨酸残留纳入糊精共轭。有清述的糊精是可固定的醛, 它可以固定在组织中的示踪剂。除了荧光标记的糊精外, 其他化学物质还可用于评估体内的渗透性, 例如, Hoechst 染料与 Evan 的蓝色结合, 它与血清白蛋白结合在很大程度上。hoechst 染色 bbb 内皮细胞核内衬中枢神经系统微血管, 在 bbb 功能障碍时, evan 的蓝色可以在血管周围空间被检测到, 当胶质细胞受到 25,26微血管干扰, 其叶片会进一步扩散。相反, 通过内源性标记的免疫荧光染色来评估体内通透性, 可以洞察 IgG 分子或纤维蛋白原 (一种在血液中循环的糖蛋白) 随着时间的推移而积累的情况。在健康条件下, 血管周围的空间非常狭窄, 内皮基底膜和胶质细胞是紧密相连的, 因此, 可视化 NVU 的两个 ECM 屏障需要层压等态抗体染色27.

内源性 IgG 分子存在于健康和疾病期间, 血管内以及周围器官的组织, 其中没有 BBB 建立 12.在有脑屏障缺陷的基因修饰小鼠中, 在药物治疗期间, 或在正常血液中循环的神经炎症内源性分子中, 可能会沉积在中枢神经系统实质中, 通过反染色抗拉米宁可以观察到抗体识别所有层压蛋白等形 (泛层压蛋白抗体) 或层压蛋白等形特异性抗体, 使其能够从内皮基底膜和层压蛋白α1和层压蛋白α2与胶质细胞中分化限制。在神经炎症条件下, 血管周围的空间可能会扩大通过浸润免疫细胞, 允许识别, 内皮基底膜和胶质限制使用泛层压抗体。NVU 上的层压蛋白的反染色可以评估内源性和外源示踪剂是否沉积在中枢神经系统实质中, CD45 的反染色可以评估 BBB 的焦点泄漏是否与免疫细胞有关渗透。

免疫细胞迁移到中枢神经系统实质需要连续交叉两个不同的屏障内的 NVU, 内皮 BBB, 随后胶质限制 28.交叉免疫细胞胶质细胞和中枢神经系统进入与临床 EAE29的发病有关, 而中枢神经系统浸润细胞被困在小孔和血管周围的细胞不会触发临床 eae。在几个基因修饰的小鼠模型中观察到免疫细胞捕获在基底膜之间的左旋和血管周围空间, 例如 l-选择素敲除小鼠30、tnf 敲除小鼠 23只、Mmp2/mmp9 双敲除小鼠10和 SAM-B 淘汰赛老鼠12。这些发现强调, 缺乏这些分子并不影响免疫细胞在 BBB 的迁移, 而是影响整个胶质细胞的迁移, 这突出表明介导免疫细胞在 BBB 和胶质细胞内的迁移的分子机制是不同。脑原位酶学是一种研究组织切片中焦点明胶酶活性的方法, 与中枢神经系统病理学有精确的空间相关性。检测体内 BBB 通透性, 同时进行原位酶学检查, 以检测 MMP2/MMP9 活性, 从而可以描述与免疫细胞浸润相关的内皮和胶质屏障障碍。结合 EAE 脑切片上的泛层压素和 CD45 免疫荧光染色, 既可以通过不淬火 dq-明胶来定位明胶酶活性, 同时也能定位浸润免疫细胞。从 dq-明胶中解光荧光素会产生典型的粒状明亮的绿色荧光信号, 而组织切片上的斑驳的淡绿色荧光区域必须被视为非特异性信号12。因此, 在进行原位酶学检查时, 仔细评估组织切片和适当的控制是必不可少的。在该协议中, 我们结合 CD45 和层压蛋白染色进行了原位酶学检查。同时将 CD45 和层压蛋白的原发抗体作为混合物孵育。同样, 二级抗体在第二个染色步骤中作为混合物孵育。这种抗体的组合需要检测, 以确保第二阶段的抗体被吸收到其他 Igg 上, 以避免交叉反应。

总之, 这里介绍的协议提供了工具, 详细调查哪些元素的 NVU 是受损的神经炎症条件的 EAE。在体内渗透率评估外源示踪剂可以确定目前的损伤微血管内皮细胞的完整性或当前损害的 NVU。此外, 引入不同尺寸的示踪剂可以估计 BBB 损伤的严重程度。在进入中枢神经系统实质10之前, 需要在星形胶质细胞和潜在的炎症细胞中发现焦点明胶酶活性, 这是突破胶质限制作为最后一道屏障所必需的.

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Disclosures

未申报利益冲突。

Acknowledgments

我们感谢莉迪亚·索罗金, 她与我们分享了她最初的现场酶学协议10.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AMCA anti-rabbit antibody Jackson ImmunoResearch 111-156-045 Store at 4 °C; protect from light
Anti-CD45 Antibody (30F11) Pharmingen 07-1401 Store at 4 °C
Anti-Laminin Antibody DAKO Z0097 Store at 4 °C
Breeding food e.g. PROVIMI KLIBA SA 3336
Individually ventilated cages, Blue line Type II or III e.g. Tecniplast 1145T, 1285L
BSA fraction V Applichem A1391 Store at 4 °C
Cold gelatine Sigma-Aldrich G 9391
Coplin jar + rack e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG H554.1; H552.1
Cy3 anti-rat antibody Jackson ImmunoResearch 111-156-144 Store at 4 °C; protect from light
Cover slips 24 x 40 mm # 1 e.g. Thermo Scientific 85-0186-00
Dextran Alexa Fluor 488 (10,000 MW) e.g. Molecular probes D22910 Store at -20 °C; protect from light
Dextran Texas Red (3000 MW) Invitrogen D3328 Store at -20 °C; protect from light
EnzChek Gelatinase/Collagenase Assay Kit  Thermo Fisher Scientific; EnzCheck E12055 Store at -20 °C; protect form light
Female C57BL/6J mice (8-12 weeks) e.g. Janvier Labs Females, 8-12 weeks
Freezing box for histology slides e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG 2285.1
18G x 1½’’ (1.2mm x 40mm) injection needle e.g. BD, BD Microlance 3 304622
27G x ¾’’ – Nr. 20 (0.4mm x 19mm) injection needle e.g. BD, BD Microlance 3 302200
30G x ½’’ (0.3 mm x 13 mm) injection needle e.g. BD, BD Microlance 3 304000
Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) e.g. Santa Cruz Biotechnology sc-24648 Store at 4°C
Maintenance food e.g. PROVIMI KLIBA SA 3436
MOGaa35-55 peptide e.g. GenScript Store at -80 °C
microscope slides (Superfrost Plus ) Thermo Scientific J1800AMNZ
Mycobacterium tuberculosis H37RA e.g. BD 231141 Store at 4 °C 
NaCl 0.9 % B. Braun 3535789
O.C.T. compound (Tissue-Tek ) Sakura 4583
Omnican 50 30G x ½’’ B. Braun 9151125S
Paraformaldehyde Merck 30525-89-4
Pertussis toxin e.g. List biological laboratories, Inc. 180 Store at 4 °C
poly(vinyl alcohole) (Mowiol 4-88) Sigma-Aldrich 81381
Protease Inhibitor EDTA free (Roche) Sigma-Aldrich 4693132001 Store at 4 °C
repelling pen e.g. DAKO Pen e.g. DAKO S2002
sealing film e.g. Parafilm M e.g Sigma-Aldrich P7793
Silica gel e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG 9351.1
Stitch scissor F.S.T 15012-12
syringe 1 ml e.g. PRIMO 62.1002
syringe 10 ml e.g. CODAN Medical ApS 2022-05
vaporizer system Univentor 400 UNO.BV

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References

  1. Tietz, S., Engelhardt, B. Brain barriers: Crosstalk between complex tight junctions and adherens junctions. Journal of Cell Biology. 209, 493-506 (2015).
  2. Wu, C., et al. Endothelial basement membrane laminin alpha5 selectively inhibits T lymphocyte extravasation into the brain. Nature Medicine. 15, 519-527 (2009).
  3. Hannocks, M. J., et al. Molecular characterization of perivascular drainage pathways in the murine brain. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 38, 669-686 (2018).
  4. Kermode, A. G., et al. Breakdown of the blood-brain barrier precedes symptoms and other MRI signs of new lesions in multiple sclerosis. Pathogenetic and clinical implications. Brain. 113 (Pt 5), 1477-1489 (1990).
  5. Tommasin, S., Gianni, C., De Giglio, L., Pantano, P. Neuroimaging techniques to assess inflammation in Multiple Sclerosis. Neuroscience. , (2017).
  6. Lopes Pinheiro, M. A., et al. Immune cell trafficking across the barriers of the central nervous system in multiple sclerosis and stroke. Biochimica Biophysica Acta. 1862, 461-471 (2016).
  7. Bartholomaus, I., et al. Effector T cell interactions with meningeal vascular structures in nascent autoimmune CNS lesions. Nature. 462, 94-98 (2009).
  8. Kyratsous, N. I., et al. Visualizing context-dependent calcium signaling in encephalitogenic T cells in vivo by two-photon microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, E6381-E6389 (2017).
  9. Lodygin, D., et al. A combination of fluorescent NFAT and H2B sensors uncovers dynamics of T cell activation in real time during CNS autoimmunity. Nature Medicine. 19, 784-790 (2013).
  10. Agrawal, S., et al. Dystroglycan is selectively cleaved at the parenchymal basement membrane at sites of leukocyte extravasation in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Experimental Medicine. 203, 1007-1019 (2006).
  11. Song, J., et al. Focal MMP-2 and MMP-9 activity at the blood-brain barrier promotes chemokine-induced leukocyte migration. Cell Reports. 10, 1040-1054 (2015).
  12. Tietz, S., et al. Lack of junctional adhesion molecule (JAM)-B ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis. Brain, Behavior, and Immunity. 73, 3-20 (2018).
  13. Mähler Convenor, M., Berard, M., Feinstein, R., Gallagher, A., Illgen-Wilcke, B., Pritchett-Corning, K., Raspa, M. FELASA working group on revision of guidelines for health monitoring of rodents and rabbits. FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units. Lab Anim. 48 (3), 178-192 (2014).
  14. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. Journal of Visual Experiments. , (2014).
  15. Tietz, S. M., et al. Refined clinical scoring in comparative EAE studies does not enhance the chance to observe statistically significant differences. European Journal of Immunology. 46, 2481-2483 (2016).
  16. Mendel, I., Kerlero de Rosbo, N., Ben-Nun, A. A myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T cells. European Journal of Immunology. 25, 1951-1959 (1995).
  17. Miller, S. D., Karpus, W. J. Experimental autoimmune encephalomyelitis in the mouse. Current Protocols in Immunology. 15, Chapter 15 Unit 14 (2007).
  18. Sobel, R. A., Tuohy, V. K., Lu, Z. J., Laursen, R. A., Lees, M. B. Acute experimental allergic encephalomyelitis in SJL/J mice induced by a synthetic peptide of myelin proteolipid protein. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 49, 468-479 (1990).
  19. Westarp, M. E., et al. T lymphocyte line-mediated experimental allergic encephalomyelitis--a pharmacologic model for testing of immunosuppressive agents for the treatment of autoimmune central nervous system disease. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 242, 614-620 (1987).
  20. Klotz, L., et al. B7-H1 shapes T-cell-mediated brain endothelial cell dysfunction and regional encephalitogenicity in spontaneous CNS autoimmunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, E6182-E6191 (2016).
  21. Tietz, S. M., et al. MK2 and Fas receptor contribute to the severity of CNS demyelination. PLoS One. 9, e100363 (2014).
  22. Coisne, C., Mao, W., Engelhardt, B. Cutting edge: Natalizumab blocks adhesion but not initial contact of human T cells to the blood-brain barrier in vivo in an animal model of multiple sclerosis. Journal of Immunology. 182, 5909-5913 (2009).
  23. Korner, H., et al. Critical points of tumor necrosis factor action in central nervous system autoimmune inflammation defined by gene targeting. Journal of Experimental Medicine. 186, 1585-1590 (1997).
  24. Krueger, M., et al. Blood-brain barrier breakdown involves four distinct stages of vascular damage in various models of experimental focal cerebral ischemia. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 35, 292-303 (2015).
  25. Hawkins, B. T., Egleton, R. D. Fluorescence imaging of blood-brain barrier disruption. Journal of Neuroscience Methods. 151, 262-267 (2006).
  26. Graesser, D., et al. Altered vascular permeability and early onset of experimental autoimmune encephalomyelitis in PECAM-1-deficient mice. Journal of Clinical Investigation. 109, 383-392 (2002).
  27. Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Seminars in Immunopathology. 31, 497-511 (2009).
  28. Owens, T., Bechmann, I., Engelhardt, B. Perivascular spaces and the two steps to neuroinflammation. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 67, 1113-1121 (2008).
  29. Sixt, M., et al. Endothelial cell laminin isoforms, laminins 8 and 10, play decisive roles in T cell recruitment across the blood-brain barrier in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Cell Biology. 153, 933-946 (2001).
  30. Grewal, I. S., et al. CD62L is required on effector cells for local interactions in the CNS to cause myelin damage in experimental allergic encephalomyelitis. Immunity. 14, 291-302 (2001).

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Tietz, S. M., Engelhardt, B. Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo. J. Vis. Exp. (145), e59249, doi:10.3791/59249 (2019).

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