Summary
Nous présentons ici les protocoles pour enquêter sur la dépréciation de l’unité neurovasculaire au cours de l’encéphalomyélite allergique expérimentale in vivo. Nous abordons plus précisément comment déterminer la perméabilité de la barrière hémato - encéphalique et activité de gélatinase impliquée dans la migration des leucocytes à travers la glia limitans.
Abstract
L’unité neurovasculaire (UNV) est composée de cellules endothéliales microvasculaires formant la barrière sang - encéphalique (BHE), une membrane basale endothéliale avec péricytes embarqués, et le glia limitans composé par la membrane basale parenchymateuse et astrocytes fin-feed embrassant l’aspect abluminal des microvaisseaux de système nerveux central (SNC). En plus de maintenir les CNS homéostasie l’UNV contrôle traite des cellules immunitaires dans le SNC. Au cours de l’immunosurveillance du SNC des lymphocytes activés en faibles effectifs peuvent traverser la barrière endothéliale sans causer le dysfonctionnement BBB ou cliniques de la maladie. En revanche, au cours de la neuro-inflammation comme dans la sclérose en plaques ou son modèle animal encéphalomyélite allergique expérimentale (EAE) un grand nombre de cellules immunitaires peut croiser le BBB et par la suite la glia limitans atteignant le parenchyme de la CNS conduisant à la maladie clinique. Migration de cellules immunitaires dans le parenchyme de la CNS est donc un processus en deux étapes qui implique une migration séquentielle à travers la barrière endothéliale et gliale de l’UNV employant les mécanismes moléculaires distincts. Si après leur passage à travers la barrière endothéliale, lymphocytes T rencontrent leur apparenté antigène sur les cellules présentatrices d’antigène périvasculaires, leur réactivation locale va initier les mécanismes conduisant à l’activation de focale des gélatinases, qui permettra aux lymphocytes T à traverser la barrière gliale et entrer dans le parenchyme de la CNS. Ainsi, évaluer tous les deux, perméabilité BBB et activité du MMP en corrélation spatiale à l’accumulation de cellules immunitaires dans le SNC au cours de l’EAE permet de spécifier la perte d’intégrité des barrières endothéliales et gliales de l’UNV. Ici, nous montrons comment induire EAE chez les souris C57BL/6 par immunisation active et analyser par la suite la perméabilité BBB in vivo à l’aide d’une combinaison des traceurs fluorescents exogènes. Nous montrons également, comment visualiser et localiser l’activité gélatinase dans les cerveaux de l’EAE en zymogaphy in situ, couplé à des salissures par immunofluorescence des membranes basales BBB et CD45 + invasion des cellules immunitaires.
Introduction
Le système nerveux central (CNS) coordonne tous les corps et les fonctions mentales chez les vertébrés, et homéostasie CNS est essentiel pour une bonne communication des neurones. L’homéostasie du CNS est justifié par l’unité neurovasculaire (UNV), qui protège le système nerveux central du milieu changeant de la circulation sanguine. Le NVU est composé de cellules endothéliales microvasculaires CNS, qui sont biochimiquement unique et mettre en place la barrière sang - encéphalique (BHE) en continu diaphonie avec les péricytes et astrocytes, neurones, constituants de la matrice extracellulaire (ECM), instituant deux distinctes des membranes basales1. La membrane basale endothéliale que cellules l’aspect abluminal des cellules endothéliales BBB recèle un nombre élevé de péricytes et se compose de la laminine α4 et laminine α5, en plus d’autres protéines de ECM2. En revanche, la membrane basale parenchymateuse se compose de la laminine α1 et α2 de laminine et est adoptée par fin-pieds astrocytaires. La membrane basale parenchymateuse ainsi que les astrocytes fin-pieds compose la glia limitans qui sépare le réseau neuronal CNS du périvasculaires rempli de liquide céphalo-rachidien ou espaces sous-arachnoïdienne3. En raison de l’architecture unique de l’UNV, des cellules immunitaires dans le SNC le trafic sont distinct que dans les tissus périphériques car il nécessite un processus en deux étapes avec les cellules immunitaires, tout d’abord viole la BHE endothéliale et par la suite le limitans glia afin de atteindre le parenchyme de la CNS.
Sclérose en plaques (MS) est une maladie fréquente des thérapeutiques de la CNS, dans lequel un grand nombre de cellules immunitaires circulantes entrer dans le SNC et provoquer la neuroinflammation et démyélinisation focale perte d' intégrité BBB4. Perte d’intégrité BBB est un début de MS, comme en témoigne la présence de contraste gadolinium amélioration des lésions dans le système nerveux central comme visualisées par l’imagerie par résonance magnétique (IRM)5. Extravasation de leucocyte dans le SNC se produit au niveau des veinules postcapillaires ; Cependant, les mécanismes précis diapédèse des cellules immunitaires à travers la membrane basale BBB et par la suite la barrière gliale restent à explorer. Encéphalomyélite allergique expérimentale (EAE) sert un modèle animal de la SP et a largement contribué à nos connaissances actuelles sur la pathogénie de MS. Par exemple, en utilisant le modèle de l’EAE on a découvert qu’extravasation de leucocyte se produit dans un processus multipas, y compris une capture initiale et laminage étape par l’intermédiaire de sélectines et les molécules de type mucine comme ligand de glycoprotéine P-sélectine (se) -1, suivie de l’arrestation ferme intégrine-dépendante et rampant des lymphocytes T sur les cellules endothéliales de BBB à côtés permissives pour diapédèse6.
Une fois que les cellules T ont traversé le BBB endothélial et la membrane basale endothéliale, ils doivent rencontrer leur antigène analogue sur les macrophages ou cellules dendritiques stratégiquement localisés dans les espaces méningées ou périvasculaires. Cette interaction induit focale production de médiateurs pro-inflammatoires que déclencher les mécanismes suivants requis pour invasion tissulaire CNS des cellules immunitaires par l’intermédiaire de la glia limitans7,8,9. Activation de focale-métalloprotéinases matricielles (MMP) -2, MMP-9 modifie chemokine activation et provoque la dégradation des récepteurs de la matrice extracellulaire sur astrocyte-embouts, qui est une condition sine qua non pour immunitaire cell migration à travers la limitans de cellules gliales dans le Parenchyme CNS et d’induire l’apparition des symptômes cliniques de l’EAE10,11.
La combinaison de détection des CNS s’infiltrer dans les cellules immunitaires avec BBB activité fuite et gélatinase dans des sections de tissu CNS fournit des informations précieuses sur l’intégrité fonctionnelle de la barrière endothéliale et gliale dans le contexte de la neuroinflammation. Par exemple, nous avons étudié récemment la perte constitutive de la molécule d’adhérence jonctionnelles molécule endothéliales jonction serrée (JAM)-B dans le trafic de cellules immunitaires dans le SNC dans le contexte de l’EAE. Chez la souris C57BL/6 type sauvage, sains littermates JAM-B-deficient montrent à sans altération de l’intégrité de la BBB comme indiqué par l’évaluation de la perméabilité in vivo à l’aide de traceurs tant endogène qu’exogène,12. Dans le contexte de l’EAE, JAM-B-deficient C57BL/6 souris ont montré des symptômes de maladie flexibilit, qui a été associée par piégeage de cellules inflammatoires dans les espaces méningées et périvasculaires à12. Pour étudier ce phénomène, nous avons appliqué in situ zymographie, permettant d’identifier l’activité gélatinase afin de tester si le manque d’activité de gélatinase dans les souris déficientes en B-confiture peut être responsable de la réduction du nombre de cellules immunitaires capables de rompre le glia limitans12.
Compte tenu de la disponibilité des différents génétiquement souris modèles n’ayant pas, par exemple, différentes molécules de jonction serrée BBB qui peuvent entraîner des modifications en fonction de la BBB, méthodologies d’enquête sur l’intégrité BBB sont importants. En outre, nouveaux médicaments pourraient avoir une incidence sur les obstacles NVU. Ici, nous montrons comment induire EAE chez les souris C57BL/6 par immunisation active avec la glycoprotéine oligodendrocyte de myéline (MOG)-peptide AA 35-55 en adjuvants de Freund complet. Puis, nous expliquons comment localiser l’infiltration de cellules immunitaires à travers les barrières endothéliales et gliales de l’UNV et étudier l’intégrité des barrière endothéliale et gliales in vivo par détection in situe des traceurs exogènes et activité de gélatinase, respectivement.
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Protocol
Toutes les études ont été menées au titre des directives conformément à la législation suisse sur la protection des animaux et ont été approuvés par l’Office vétérinaire Suisse du Canton de Berne, (numéro d’autorisation : BE 31/17 et être 77/18).
1. logement de souris C57BL/6 dans les conditions (SPF) gratuites agent pathogène spécifique
- Cycle de souris communes dans des cages individuelles ventilés avec un 12/12 h lumière-obscurité. Fournir de la nourriture et l’eau ad libitum. Pour superviser la qualité microbiologique des souris, la cohorte expérimentale a subi une surveillance de la santé trimestrielle par literie sale sentinelles suit FELASA recommandations13.
- Utilisation les poinçons d’oreille pour marquer individuellement les souris C57BL/6 femelles de 8-12 semaines vieux.
2. l’immunisation de souris C57BL/6
- Préparation de solutions14:
- Pour l’Adjuvant de Freund complet (FCA), mix 30 mL d’Adjuvant de Freund incomplet avec 120 mg de chaleur fraîchement pestled inactivé Mycobacterium tuberculosis (H37RA) sous une hotte aspirante. Stocker la solution-mère à 4 ° C.
- Pour la solution MOGaa35-55-peptide, dissoudre MOGaa35-55-peptide dans du PBS stérile (4 mg/mL) et conserver à-80 ° C.
- Préparer l’émulsion-MOG :
- Diluer le CFA 1 / 2 avec solution MOG-peptide dans un microtube 2 mL.
- Sceller le microtube avec film d’étanchéité et le fixer sur un vortex en couvrant complètement le tube avec du ruban adhésif. Émulsion de vortex pendant 4 h à 4 ° C.
- Préparer les seringues avec émulsion stable :
- Prenez le microtube et tourner rapidement vers le bas de l’émulsion à l’aide d’une centrifugeuse de petite table. Recueillir émulsion dans une seringue à l’aide d’une aiguille d’injection 18 x 1½'' (1,2 x 40 mm).
- Selon le nombre de souris régler le volume de l’émulsion dans la seringue (100 µL/souris) et remplacer l’aiguille 18 G avec une aiguille d’injection 27 x ¾'' (0,4 mm x 19 mm). Sceller l’aiguille d’injection fixé la seringue avec film d’étanchéité.
- Pour la solution étalon de la toxine (PTx) coqueluche, dissoudre 50 µg de PTx lyophilisée dans 500 µL de PBS stérile (100 ng/µL). Stocker la solution-mère à 4 ° C.
- Pour la solution de travail PTx, mélanger 97 µL de PBS stérile 3 µl de la solution mère de PTx (300 ng/100 µL) par souris (à utiliser une aiguille 30 x ½'' (0,3 mm x 13 mm) d’injection intrapéritonéale).
- Induction de l’EAE
- Anesthésier souris C57BL/6 avec isofluorane à l’aide d’un système de vaporisateur. Pour induire l’anesthésie chez les souris, exposer la souris à 4,5 % isofluorane en oxygène dans une chambre de petit d’incubation avant de transférer la souris à un masque facial avec 2,1 % isofluorane. Utiliser une unité d’anesthésie équipée de coussin chauffant pour éviter l’hypothermie, de la souris.
- Fixer la souris anesthésiée dans une main et tout d’abord injecter 30 µL de MOG35-55/CFA-émulsion par voie sous-cutanée dans les flancs de la patte arrière (Figure 1:1 + 2 ; au total 60 µL ; 30 µL et flanc droit 30 µL de flanc gauche) en étroite proximité avec les ganglions inguinaux.
- Placez votre souris sur le ventre et injecter 20 µL de MOGaa35-55/CFA-émulsion dans le tissu adipeux programmable droite et gauche à la racine de la queue (Figure 1:3 + 4 ; au total 40 µL ; racine 20 µL de queue de droite et gauche queue racine 20 µL) et une petite gouttelette de MOGaa35-55/CFA-émulsion int o le cou de la souris (Figure 1: 5).
- Injecter 100 µL de solution de PTx par voie intrapéritonéale chez la souris. Maintenez la tête de la souris sous le centre du corps en évitant l’injection dans l’intestin.
- Remplacer le maintien (extrudat nutriments majeurs : matière grasse brute 4,5 % ; fibre brute 4,5 %, cendres brutes 6,5 % ; amidon 35 %, 18,5 % de protéines brutes ; énergie métabolique : 13,1 MJ/kg) à la diète de reproduction (extrudat fertilisants majeurs : 23,5 % de protéines brutes, matières grasses brutes 5,5 % ; fibres brutes 3 % ; cendres brutes 5,7 % ; amidon 36 % ; l’énergie métabolique : 14,3 MJ/kg) afin de fournir les souris avec de la nourriture de la teneur énergétique plus élevée avant et pendant la maladie clinique attendue.
- Retirer le masque facial et transférer la souris dans sa cage maison avec un coussin chauffant. Assurez-vous que la souris est pleinement éveillé et mobiles au bout de 10 minutes.
- Renouveler l’injection de PTx (2.2.4) 48 h après le premier traitement.
3. cotation des souris EAE
- Vérifier l’état de santé des souris EAE chaque matin en prenant un coup d’oeil à l’intérieur des cages.
- Score de souris EAE tous les après-midi.
- Prendre chaque souris individuelle incluse dans l’expérience de l’EAE hors de la cage et vérifiez si la queue a un tonus en le déplaçant vers le haut avec un doigt. Une souris en bonne santé maintiendra sa queue (la queue a un tonus). Si EAE clinique a commencé, le tonus de la queue sera basse, visible par une baisse progressive de la queue. Finalement, la souris ne sera pas capable de soulever sa queue du tout.
- Placez chaque souris individuelle incluse dans l’expérience de l’EAE sur le banc propre et observer et documenter le comportement de marche. Voir le tableau 115 pour les critères de notation pour l’évaluation de la gravité de la maladie (la partition de l’EAE).
- Évaluer et documenter le poids de chaque souris comprise dans le test.
- Pour assurer une alimentation adéquate et l’absorption d’eau par souris affichant un EAE clinique score de 1 alimentation humide aliments dans un récipient en plastique sur le fond de la cage et actualise tous les jours.
4. essai de perméabilité In vivo
- Préparations de solutions :
- Pour les solutions mères de dextran, dissoudre 10 mg de 10 kDa 488 de Dextran Alexa Fluor ainsi que 3 kDa Dextran Texas Red dans 500 µL de solution de chlorure de sodium 0,9 % (20 mg/mL).
- Pour la solution de travail dextran, juste avant l’injection ajouter 55 µL de 10 kDa 488 de Dextran Alexa Fluor solution (20 mg/mL) sur un morceau de film d’étanchéité de mère et ajouter 55 µL de 3 kDa dextran solution mère de Texas Red (20 mg/mL). Mélanger et prélever 100 µL dans une seringue jetable et fine (concentration finale 2 mg/100 µL).
- Pour la solution mère de formaldéhyde (PFA) de 10 %, mélanger 10 g de poudre extra pure PFA, 100 mL de PBS et 200 µL de solution de NaOH 1N dans un bécher de verre propre et de la chaleur jusqu'à précisément de 56 ° C sous agitation à l’aide d’un agitateur magnétique ; garder à 56 ° C pendant 30 min jusqu'à dissolution complète de la PFA ; refroidir à température ambiante ; ajuster le pH à 7,4 ; et filtrer sur un filtre en papier. Conserver à - 20 ° C. La solution peut être diluée plus loin à l’aide de PBS.
- Peu de temps anesthésier chez la souris C57BL/6 ou souris C57BL/6 souffrant d’EAE à l’isoflurane (la souris va être sous sédation pendant environ 1 min). Utiliser un système automatisé comme au point 2.2.1 (souris seront exposés à 4,5 % isoflurane en oxygène dans une chambre à induction et ensuite transférées dans un masque facial avec 2,1 % isoflurane).
- Placez votre souris anesthésiée en position latérale sur la table, puis par voie intraveineuse (p. ex. rétro-orbitalement) injecter 100 µL de traceurs fluorescents à la souris avant de la souris se réveille.
- Retirer le masque facial immédiatement et assurez-vous que la souris est pleinement éveillé et motiles après l’anesthésie courte. Laisser le traceur à circuler pendant 15 min.
- Passez à l’étape 5.1.
5. la perfusion de souris
-
Pour l’évaluation de la perméabilité in vivo :
- Commencer la procédure 15 min après l’injection du traceur fluorescent en induisant l’anesthésie isoflurane profonde. Pour induire une anesthésie profonde chez la souris utiliser 2,3 % d’isoflurane en oxygène. Le réflexe de retrait patte permet de juger de la profondeur de l’anesthésie (pincer la peau entre les orteils, un manque de flexion indique une profondeur suffisante) et sonder les réflexes de la patte antérieure et le membre postérieur chez les souris soumises à l’EAE.
- Difficulté de la souris sur le dos et le ventre de pulvérisation avec de l’éthanol. Ouvrir la cage thoracique à l’aide de ciseaux et retirer la membrane. Ouvrez l’oreillette droite du cœur battant à l’aide de ciseaux et perfuse la souris à travers le ventricule gauche du coeur avec 10 mL de PBS puis 10 mL de 4 % PFA dans du PBS.
Attention : Pour éviter d’inhaler des PFA, perfuse la souris sous une hotte. - Passez à la section 6.
-
Pour in situ zymographie :
- Induire l’anesthésie isoflurane profonde l’isoflurane de 2,3 % en oxygène dans une souris souffrant d’EAE et vérifier la profondeur de l’anesthésie comme au point 5.1.1.
- Ensuite, fixer la souris sur le dos et le ventre de pulvérisation avec de l’éthanol. Ouvrir la cage thoracique à l’aide de ciseaux et retirer la membrane. Ouvrez l’oreillette droite du cœur battant à l’aide de ciseaux et perfuse la souris à travers le ventricule gauche du coeur avec 20 mL de PBS.
- Passez à la section 6.
6. dissection et gel des cerveaux
- Préparation du bain de refroidissement :
- Remplir un récipient de dewar plat avec glace pilée et ajoutez 2-méthylbutane (Isopentane) jusqu'à ce que le liquide atteigne environ 1 cm au-dessus du pack de glace carbonique. Couvrir avec un couvercle lâche – par exemple, un couvercle de seau à glace.
- Couper la tête de la souris perfusée avec des ciseaux pointus et enlever la peau et des oreilles à l’aide d’un ensemble plus restreint de ciseaux.
- Disséquer attentivement la Scutellaire en coupant depuis le trou occipital vers l’avant à gauche et à droite permettant d’upfold la calotte sur le cerveau. Ensuite, soulevez lentement sur le cerveau intact de la base du crâne tout en coupant les nerfs optiques à l’aide d’une spatule plate en métal.
- Placez le cerveau sur feuille d’aluminium et couper le cerveau en trois morceaux (frontale cerveau, cerveau moyen et cervelet + tronc cérébral) en plaçant deux coupes coronales.
- Remplir un cryomold (25 x 20 x 5 mm) pour le premier trimestre avec matrice de découpage (PTOM) de température optimale, placer des tranches de cerveau avec la face antérieure de chaque morceau de cerveau vers le bas dans le cryomold et couvrir le tissu complètement avec la matrice des PTOM.
- Placer le cryomold avec le tissu dans une orientation horizontale dans le bain 2-Méthylbutane et s’assurer que le tissu se fige, du bas vers le haut dans la minute en évitant de plonger le bloc de tissu ensemble dans le bain.
- Transfert de tissus congelés à-80 ° C pour le stockage et passez à la section 7.
7. préparation des coupes de tissus congelés
- Equilibrer la température des tissus congelés de-80 ° C à-20 ° C dans le cryostat pendant 30 min.
- Retirer le bloc de tissu du cryomold et monter sur le support de papier cryostat (réglé à-15 ° C) à l’aide de la matrice des PTOM.
- Découpez les bords du bloc de tissu sur le support du cryostat avec un scalpel tranchant et commencer à couper dans le bloc de tissu en enlevant 20 µm sections avec le couteau du cryostat, jusqu'à ce que le tissu soit visible.
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Pour l’analyse de la perméabilité BBB in vivo :
- Couper des sections de tissu de 6 à 10 µm, collectionnez-les sur lames de verre d’adhérence et d’image immédiatement les sections recouvertes d’une lamelle couvre-objet à l’aide d’un microscope à fluorescence.
- Évaluer l’apparence des vaisseaux sanguins dans le cerveau (faire attention aux aiguës les frontières des vaisseaux non perméable par rapport à la diffusion des profils de fluorescence observés pour les vaisseaux sanguins qui fuites). Comme contrôle positif, vérifier les fuites du traceur dans le stroma des organes circumventriculaires ou les plexus choroïdes qui n’ont pas un BBB.
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Pour in situ zymographie :
- Couper 6 µm des sections de tissu à l’aide d’un cryostat, collectionnez-les sur lames de verre d’adhérence et congeler à-20 ° C dans une boîte de gel contenant du gel de silice dans le couvercle des sections de tissu.
8. in situ zymographie combiné avec laminin/CD45 immunofluorescence souillant
- Préparer des solutions :
- Préparer la solution de l’encastrement :
- Mélanger les 6 g de glycérol (pureté analytique), 2,4 g de poly (alcool vinylique), 6 mL de ddH2O et 12 mL de tampon Tris de 0,2 M, pH 8 et remuer (agitateur magnétique) la solution pendant 4 h à température ambiante.
- Transvaser la solution dans un tube à centrifuger 50 mL et laissez-la reposer pendant 2 h à température ambiante. Par la suite incuber la solution pendant 10 min à 50 ° C (bain-marie) et centrifuger pendant 20 min à 2 700 x g à la température ambiante.
- Prenez le surnageant et congeler en portions à-20 ° C.
- Préparer la solution de gélatine froide :
- Dissoudre 0,1 g de gélatine froide de peau bovine dans 10 mL de ddH2O.
- Laisser tremper pendant au moins 1 jour et stocker les aliquotes à 4 ° C.
- Préparer le méthanol glacée (-20 ° C) :
- Mettre 100 % de méthanol dans une coloration et refroidir à-20 ° C.
- Préparer 10 % solution mère de l’azoture de sodium :
- Ajouter 1 g d’azide de sodium à 10 mL de ddH2O et conserver à température ambiante.
- Préparer la solution de travail d’azoture de sodium 0,1 % :
- Mix 99 µL du ddH2O 1 µl de la solution mère 10 % sodium azide.
- Dissoudre 1 mg de fluorescéine conjuguée ajouté un colorant (DQ) gélatine de peau de porc dans 1 mL de l’azide de sodium travail solution et magasin 100 µL d’extraits abri de la lumière à 4 ° C.
- Dissoudre 30 mg de 1, 10-phénanthroline monohydraté dans 76 µL d’éthanol et de conserver à-20 ° C.
- Préparer 25 x solution d’inhibiteur de protéase :
- Ajouter 1 comprimé d’inhibiteur de protéase libre d’EDTA à 2 mL de ddH2O. Conserver à-20 ° C.
- Juste avant utilisation, préparer la solution de réaction (150 µL/section) :
- Centrifuger le 1 mg/mL de solution de gélatine DQ pendant 5 min à 13 300 x g.
- Mix 127,2 µL de ddH2O, 15 µL de 10 x tampon de réaction (trousse Gélatinase/collagénase ; voir Table des matières), 0,3 µL de gélatine froide 20 mg/mL, 1,5 µL de gélatine DQ 1 mg/mL et 6 µL de 25 x solution d’inhibiteur de protéase.
- Juste avant utilisation, préparer phenantroline solution de réaction de contrôle négatif (150 µL/section) :
- Mix 125.2 µL de ddH2O et 15 µL de 10 x tampon de réaction, 0,3 µL de gélatine froide 20 mg/mL, 1,5 µL de gélatine DQ 1 mg/mL, 6 µL de 25 x inhibiteur de la protéase EDTA libre 2 µL de 1,10 M 2-phenantroline (inhibiteur de la MMP).
- Juste avant utilisation, préparer la solution de réaction de contrôle négatif (non fluorescent) gélatine froide (150 µL/section) :
- Mix 128,7 µL de 6 µL d’inhibiteur de protéase x 25 sans EDTA, 0,3 µL de gélatine froide 20 mg/mL, ddH2O et 15 µL de 10 x tampon de réaction.
- Préparer des anticorps primaire cocktail pour contre-coloration, par exemple, 0,95 µg/mL d’anticorps anti-laminin anticorps polyclonal de lapin et 10 µg/mL rat polyclonaux anti-CD45 anticorps BSA 1 % dans du PBS et préparer isotype appropriées de contrôle des cocktails de l’anticorps primaire.
- Préparer des solution d’anticorps secondaire, par exemple, 7,5 µg/mL Cy3 chèvre anti-rat + 15 µg/mL anti-lapin AMCA BSA 1 % dans du PBS (protéger de la lumière).
- Préparer la solution de l’encastrement :
- Décongeler 6 sections de tissu de cerveau non fixée µm de souris EAE à l’intérieur de la boîte de congélation en plastique contenant du gel de silice dans le couvercle dans une hotte aspirante pour éviter la rétention d’eau dans les tissus et séparer les 2 sections de tissu sur une diapositive en dessinant des lignes avec une plume hydrofuge
- Préparer des solutions (pas 8.1.9-8.1.11) de la réaction, centrifuger pendant 5 min à 13 400 g à température ambiante et pré chaud à 37 ° C à l’aide d’un bain d’eau.
- Réhydrater les coupes de tissus pendant 5 min à 37 ° C à l’aide de 1 x tampon de réaction. Ensuite, videz la 1 x tampon de réaction, ajouter la solution de réaction sur les sections de tissu et incuber pendant 4 h à 37 ° C. Les lames 5 fois en ddH2O.
- Difficulté des sections pendant 5 min avec du méthanol glacée à-20 ° C et ensuite laver les sections une fois avec du PBS à température ambiante.
- Ajouter 1 % de BSA dans du PBS dans les sections et incuber pendant 20 min à température ambiante (protéger de la lumière). Ensuite, jeter 1 % BSA dans du PBS des sections par retournement de la glisse sur le tissu, ajouter le cocktail de l’anticorps primaire et incuber pendant 1 heure à température ambiante (protéger de la lumière).
- Laver les sections deux fois avec du PBS, ajouter le cocktail d’anticorps secondaire et incuber pendant 1 heure à température ambiante (protéger de la lumière).
- Laver les sections deux fois avec du PBS, monter les lames avec intégration de solution, laisser sécher toute la nuit à température ambiante les sections montées (protéger de la lumière). Enfin, analyser des sections de tissu teinté à l’aide d’un microscope à fluorescence.
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Representative Results
Évaluation de l’évolution clinique de l’EAE chez les souris C57BL/6 devrait se traduire par une courbe de la maladie comme illustré à la Figure 2 a et variations dans le poids de corps de souris tels que présentés dans la Figure 2 b. C57BL/6 souris immunisées avec MOGaa35-55 habituellement commencent à développer des symptômes de la maladie autour de jour 10-12 après immunisation active (Figure 1 a). En général, souris immunisées montrent une baisse transitoire de poids le lendemain de l’injection de l’émulsion et la première dose de toxine de la coqueluche (Figure 1 b). Partir du jour 2 après l’induction de l’EAE, le poids corporel des souris immunisées puis augmente progressivement jusqu’au début de la maladie lorsque le poids du corps en général tombe un jour avant l’apparition des symptômes cliniques et ne cesse de diminuer corrélées à l’augmentation symptômes de la maladie (Figure 1 a,B). La gravité de la maladie EAE augmente jusqu'à ce que le pic de la maladie, dont on peut s’attendre entre les jours 16 et 20 après l’induction de EAE (Figure 2 a). À l’apogée de l’EAE clinique, souris montrent aussi le poids du corps le plus bas (Figure 2 b), qui augmente en corrélation avec l’amélioration de l’EAE dans la phase de rémission de la maladie (Figure 2 a,B). Induction de l’EAE chez les souris C57BL/6 en utilisant les résultats de MOGaa35-55 dans une pathologie de la maladie chronique et les souris en général ne récupèrent pas complètement (Figure 1 a).
Figure 3 a montre une image représentative du plexus choroïde et le parenchyme adjacent de cerveau de souris C57BL/6 souffrant d’EAE qui a été injecté par voie intraveineuse avec fluorescent 3 kDa Dextran (rouge) et 10 kDa Dextran (vert) 15 min avant de sacrifier ; l’échelle bar 50 µm. Comme nous l’avons démontré précédemment, traceurs diffuse facilement à travers les microvaisseaux fenêtrées dans la stomie du plexus choroïde (photo de gauche et du milieu), tandis que le BBB n’autorise pas la diffusion des traceurs en circulation dans le parenchyme du cerveau, a indiqué par la ligne pointillée (photo de droite), qui est donc dépourvu de tout signal fluorescent. Figure 3 b montre représentant les vaisseaux sanguins qui fuites dans le cervelet de souris C57BL/6 souffrant d’EAE qui a été injecté par voie intraveineuse avec fluorescent 3 kDa Dextran (rouge) et 10 kDa Dextran (vert) 15 min avant de sacrifier. Têtes de flèche indiquent à traceurs diffusées à travers les microvaisseaux dans le parenchyme de la CNS (photo de gauche et du milieu), ce qui suggère que la fonction BBB est altérée dans ces vaisseaux. Dans le parenchyme de la CNS, vert et rouge signal fluorescent est visible à l’extérieur des parois des vaisseaux sanguins, qui sont indiqués par des lignes pointillées. Dans l’EAE, dans le cervelet où poignets inflammatoires apparaissent à traceurs peuvent se retrouve dans l’espace périvasculaire entre la membrane basale endothéliale et la glia limitans indiquant une perte fonctionnelle d’intégrité endothéliale de BBB. Si le traceur se trouve à diffuser dans le parenchyme du cerveau, il montre supplémentaire dysfonctionnement de la barrière gliale12.
La figure 4 montre des images représentatives de l’analyse de l’activité de gélatinase (MMP) dans un cerveau EAE de souris C57BL/6 visualisée par zymographie in situ et localisée aux compartiments spécifiques du cerveau-barrière anti-casserole-laminine (bleu) et à la présence de cellules inflammatoires par anti-CD45 (rouge) immunofluorescence souillant. Le clivage protéolytique de la gélatine de (DQ) ajouté un colorant unquenches un signal de la fluorescéine, qui permet la localisation de l’activité de gélatinase sur la section de tissu. Lorsque la gélatine froide (contrôle non fluorescent) est incubée, aucun vert signal fluorescent peut être détectée dans les sections du cerveau des souris EAE (ligne supérieure), ainsi que dans les sections qui ont été incubées avec DQ-gélatine ne combiné avec phenantroline, un puissant Zn +- agent complexant et inhibiteur de la MMP (rangée du milieu). Dans la rangée inférieure, activité de gélatinase/MMP focale est visible comme signal de fluorescence granulaire typique de vert vif, mise en évidence par les flèches. Dans les poignets inflammatoires dans le cervelet d’une souris EAE, activité MMP spécifique se produit au-delà de la glia limitans (bleu) sur les sites de l’infiltration de cellules inflammatoires (rouge).
Figure 1 : Représentation graphique des sites d’injection pour l’induction de l’EAE. 1) point d’injection pour 30 µL MOG-émulsion dans le flanc droit, site d’injection 2) pour 30 µL MOG-émulsion dans le flanc gauche, site d’injection 3) pour 20 µL MOG-émulsion dans la racine de l’arrière gauche, 4) point d’injection pour 30 µL MOG-émulsion dans la racine de la queue droite site d’injection 5) pour une goutte de peu de MOG-émulsion dans le goulot. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Cours représentatifs de l’EAE. (A) symptômes de la maladie de l’EAE chez les souris C57BL/6 au fil du temps. Moyenne +/-SEM est montré. (B) modification du poids corporel au cours de l’EAE au fil du temps. Moyenne +/-SEM est montré. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : L’image représentative de la perméabilité in vivo. Photo de gauche (A) : vert fluorescent 10 kDa dextran au niveau du plexus choroïde. Image du milieu : rouge fluorescent 3 kDa dextran au niveau du plexus choroïde. Photo de droite : fusionner les images de gauche et du milieu. Balance bar 50 µm. (B) photo de gauche : vert fluorescent 10 kDa dextran dans le cervelet de souris. Image du milieu : rouge fluorescent 3 kDa dextran dans le cervelet de souris. Photo de droite : fusionner les images de gauche et du milieu. Les lignes pointillées sont indicatifs pour les parois des vaisseaux sanguins ; têtes de flèche pointent vers des traceurs fluorescents dans le parenchyme de la CNS. Balance bar 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Des photos représentatives de in situ zymographie. Première colonne : canal fluorescent vert (signal inassouvie de gélatine de (DQ) ajouté un colorant). Deuxième colonne : couche fluorescente bleue (laminine). Troisième colonne : couche fluorescente rouge (CD45). Quatrième colonne : fusion des canaux fluorescent. Rangée supérieure : contrôle négatif de gélatine froide (non fluorescent). Rangée du milieu : phenantroline (inhibiteur de MMP) contrôle négatif. Rang le plus bas : gélatine DQ. Balance bar 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| nombre de 0 à 3 points | critères de | changement de poids |
| 0 | aucun signe | poids normal |
| ~ | faible queue (faible tonus) - critères internes : non inclus dans la notation documentée | perte de poids (indicative 2ème vérification) |
| 0,5 | queue de limp (gouttes de queue) | perte de poids |
| 1 | hindleg faiblesse, démarche instable (souris se promène sur le banc comme un canard) | perte de poids |
| 2 | hindleg paraplégie (la souris ne bouge pas ses membres postérieurs) | perte de poids sévère (indicative 2ème vérification) |
| 3 | hindleg paraplégie, perte de l’incontinence de commande du corps inférieur (souris tombe sur un côté mais peut se déplacer dans la cage à l’aide de ist antérieurs + incontinence ; moribonde) | très faible poids (indicatif 2ème vérification) |
Tableau 1 : Critères de notation pour l’évaluation de la gravité de la maladie EAE.
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Discussion
Nous présentons ici un protocole pour induire et contrôler l’EAE chez les souris C57BL/6 femelles. Les femelles sont préférentiellement choisies, et on observe une incidence des femmes : hommes de 3:1 dans la SP. Pour évaluer la gravité de l’EAE, nous avons fait utiliser une feuille de notation de 3 points. Gravité de l’EAE est généralement marquée par rapport à la gravité des dysfonctionnements moteurs. Souris avec pointe de stades de l’EAE, c'est-à-dire présentant un score supérieur à 2 devrait être sacrifié pour éviter la souffrance inutile des animaux. Ainsi, il est recommandé de marquer les souris à des intervalles rapprochés par exemple deux fois par jour comme il est expliqué dans le protocole. Il y a plusieurs notation routines utilisées, allant de 0 à 3 points à 0-6 points de16,17,18,19 , ou même plus subpoints20. Cependant, nous avons montré précédemment que supposément raffiné EAE marquant ne conduise pas à toute amélioration dans la détermination des différences statistiquement significatives potentielles dans les scores de la maladie entre groupes, si l'on considère l’ensemble de gravité maladie15. Basé sur cette observation, que nous avons fait usage de l’échelle de 3 points pour évaluer la progression de la maladie dans l’EAE afin de réduire le temps de manipulation de la souris et ainsi, de détresse chez les souris, les modalités d’application 3R. Un autre point critique en utilisant le modèle de l’EAE pour étudier les différences entre knockout et souris de type sauvage ou les différences entre les groupes de traitement met en place un planning précis de l’expérimental. Lorsque les souris de type sauvage sont comparées aux souris knock-out, il est essentiel de comparer la même portée provenant de croisements hétérozygotes pour assurer des fonds génétiques identiques des souris sauvage et knock-out par rapport à l’expérience de l’EAE. Il est également important de garder les mêmes conditions pour toutes les souris inclus dans un essai, par exemple changement de cage, administration de la nourriture humide et en particulier de la souris (état de santé) conditions de logement. Afin d’éviter des phénomènes de cage spécifique induites par l’enquêteur, croix-la vaccination doit être effectuée. Plus précisément, si plus d’une seringue est nécessaire pour immuniser un certain nombre de souris, ils devraient être aléatoirement des seringues différentes utilisées. Ce dernier de même devrait s’appliquer à l’exécution d’études sur les traitements. Enfin et surtout, l’état de santé des souris logés dans les animaleries différentes peut-être influer sur la gravité et l’incidence de la maladie et donc plus de21 ou moins Mycobacterium tuberculosis22 pourrait être nécessaire pour induire une bonne clinique maladie. En outre, le site d’injection peut-être avoir une incidence sur le développement de la maladie. Dans ce protocole, nous vous proposons d’injecter des volumes relativement faibles dans cinq différents sites sous-cutanée : 30 µL dans deux flancs, 20 µL dans la racine de la queue droite et gauche et une petite gouttelette dans le goulot. Dans les autres protocoles, 50 dépôts µL sont placés par voie sous-cutanée dans la racine de la queue seulement23 ou dans les quatre flancs21. Injections de petits dépôts, cependant, minimisent le risque de provoquer des irritations de la peau, laquelle des souris peuvent essayer de rayures.
Perméabilité in vivo peut être effectuée afin d’évaluer les fuites BBB au cours de l’EAE, mais également d’évaluer si la délétion génétique spécifique d’une molécule ou un traitement médicamenteux a une incidence sur l’intégrité BBB in vivo. Ceci peut être effectués soit par la détection des traceurs de plasma endogènes comme les IgG dépôts12 ou exogènes des transes qui sont appliqués dans la circulation d’une souris vivante24. Dans ce protocole, nous avons fait usage de deux traceurs exogènes différents (3 kDa et 10 kDa Dextran) qui étaient en même temps injecté et admis à circuler pour un temps défini de 15 min. à l’aide de deux traceurs avec différentes tailles permet de déterminer la gravité de la BHE dysfonctionnement et peut permettre de définir un seuil pour les tailles de traceur qui diffuses ou pas à travers la BHE. Fluorescents dextranes sont des polysaccharides hydrophiles caractérisées par la solubilité dans l’eau de bonne qualité, faible toxicité et sa relativement faible immunogénicité. En outre, dextranes sont composées de poly-(α-D-1,6 glucose), qui résistent au clivage par les glycosidases cellulaires endogènes. Nous avons utilisé ici des variantes de dextran disposant de résidus de lysine incorporés dans le conjugué de dextran. Lysinated dextranes sont aldéhyde réparable, qui permet de fixer le traceur dans le tissu. Outre les dextranes fluorescent étiquetés, autres produits chimiques peuvent être utilisés pour évaluer la perméabilité in vivo, par exemple, Hoechst colorant en combinaison avec le fil bleu d’Evan, qui se lie à une grande partie à l’albumine sérique. Hoechst les noyaux de cellules endothéliales BBB doublure microvaisseaux de CNS, et taches bleu d’Evan peut être détecté dans l’espace périvasculaire lors de dysfonction BBB et diffuse plus loin quand la glia limitans est perturbé25,26. En revanche, évaluer la perméabilité in vivo par immunofluorescence des marqueurs endogènes donne un aperçu de l’accumulation de, par exemple, des molécules IgG ou fibrinogène, une glycoprotéine qui circule dans le sang, au fil du temps. Dans des conditions saines, l’espace périvasculaire est très étroit et la membrane basale endothéliale et la glia limitans sont étroitement liés et, visualiser les deux barrières de ECM de l’UNV requiert donc la laminine isoforme spécifique d’anticorps coloration27 .
Des molécules IgG endogènes sont présents au cours de la santé et la maladie à l’intérieur des vaisseaux sanguins ainsi que dans les tissus des organes circumventriculaires, où aucun BBB n’est établi12. Gène de souris présentant des défauts de barrière de cerveau, modifiées au cours du traitement de la toxicomanie, ou au cours de la neuro-inflammation des molécules endogènes qui circulent normalement dans le sang pourraient être déposés dans le parenchyme de la CNS, qui peut être visualisé par contre-coloration avec anti-laminine anticorps reconnaissant non plus toutes les isoformes de la laminine (anticorps pan-laminine) ou laminin anticorps de l’isoforme spécifique permettant de différencier les laminines, laminine α4 et α5 endothélial membrane basale et laminine α1 et α2 laminin de la glie limitans. Dans les conditions thérapeutiques l’espace périvasculaire pourrait être élargie en infiltrant des cellules immunitaires permettant l’identification, la membrane basale endothéliale tant la glia limitans utilisant un anticorps pan-laminine. Contre-coloration de laminines présents à l’UNV permet d’évaluer si endogène mais aussi traceurs exogènes sont déposés dans le parenchyme de la CNS et contre-coloration de CD45 permet de déterminer si les fuites focal de la BHE est associé à des cellules immunitaires infiltration.
Migration de cellules immunitaires dans le parenchyme de la CNS exige le passage séquentiel des deux obstacles distincts au sein de l’UNV, le BBB endothélial et par la suite la glia limitans28. Traversant la glia limitans et l’entrée de la CNS de cellules immunitaires est corrélée avec l’apparition de l’EAE clinique29, tandis que CNS infiltration de cellules piégés dans méningées et espaces périvasculaires ne déclenchent pas d’EAE clinique. Piégeage de cellules immunitaires dans les espaces entre les membranes basales méningées et périvasculaires a été observée dans plusieurs modèles de souris modifiées par exemple L-sélectine knockout souris30, TNF knockout souris23, MMP2/MMP9 souris double10 et de souris knock-out JAM-B12. Ces trait de soulignement de constatations que manque de ces molécules n’affecte pas de migration des cellules immunitaires à travers la BHE, mais plutôt dans l’ensemble de la glia limitans, soulignant qu’il existe des mécanismes moléculaires médiant la migration des cellules immunitaires à travers la BHE et la glia limitans distincts. Cerveau en situ zymographie est une méthodologie pour étudier pour l’activité de gélatinase focal dans une section de tissu en corrélation spatiale précise à la pathologie de la CNS. Détection in vivo perméabilité BBB avec exécution zymographie sur place afin de détecter l’activité MMP2/MMP9 ainsi permet de délimiter endothéliale par rapport aux perturbations de barrière de cellules gliales en corrélation avec l’infiltration de cellules immunitaires. Combiné avec pan-laminine et CD45 immunofluorescence souillant sur des coupes de cerveau EAE, il permet la localisation de l’activité de gélatinase par unquenching DQ-gélatine et localisation d’infiltration de cellules immunitaires dans le même temps. Unquenching de fluorescéine provoque un signal de fluorescence granulaire typique de vert brillant, tandis qu’inégales zones fluorescentes faiblement vertes sur coupes tissulaires sont à considérer comme signal imprécis12DQ-gélatine. Ainsi, une évaluation soigneuse des sections de tissu et des contrôles appropriés sont indispensables lors de l’exécution en situ zymographie. Dans ce protocole, nous avons effectué in situ zymographie en combinaison CD45 et des taches de la laminine. Anticorps primaires contre CD45 et laminine ont été incubées dans un mélange en même temps. De même, anticorps secondaires ont été incubées dans un mélange dans une deuxième étape de coloration. Une telle combinaison d’anticorps a besoin de tests pour s’assurer que les anticorps deuxième étape sont absorbées contre autre IgG afin d’éviter des réactions croisées.
Pris ensemble, les protocoles présentés ici fournissent des outils pour étudier en détail quel élément de l’UNV est altérée chez les conditions thérapeutiques de l’EAE. Évaluation in vivo de la perméabilité de traceurs exogènes permet d’identifier la dépréciation actuelle de l’intégrité des cellules endothéliales microvasculaires ou dépréciation actuelle de l’UNV. En outre, introduction de traceurs avec différentes tailles permet d’estimer la gravité de la déficience de BBB. Supplémentaires sur place zymographie dévoile les activité de gélatinase focal dans les astrocytes et les cellules potentiellement inflammatoires, qui sont nécessaire pour violer la glia limitans comme un dernier obstacle avant d’obtenir l’accès à la CNS parenchyme10.
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Disclosures
Aucun conflit d’intérêts ne déclarés.
Acknowledgments
Nous reconnaissons avec Lydia Sorokine, qui a partagé son original in situ zymographie protocole10 avec nous.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AMCA anti-rabbit antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-156-045 | Store at 4 °C; protect from light |
| Anti-CD45 Antibody (30F11) | Pharmingen | 07-1401 | Store at 4 °C |
| Anti-Laminin Antibody | DAKO | Z0097 | Store at 4 °C |
| Breeding food | e.g. PROVIMI KLIBA SA | 3336 | |
| Individually ventilated cages, Blue line Type II or III | e.g. Tecniplast | 1145T, 1285L | |
| BSA fraction V | Applichem | A1391 | Store at 4 °C |
| Cold gelatine | Sigma-Aldrich | G 9391 | |
| Coplin jar + rack | e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG | H554.1; H552.1 | |
| Cy3 anti-rat antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-156-144 | Store at 4 °C; protect from light |
| Cover slips 24 x 40 mm # 1 | e.g. Thermo Scientific | 85-0186-00 | |
| Dextran Alexa Fluor 488 (10,000 MW) | e.g. Molecular probes | D22910 | Store at -20 °C; protect from light |
| Dextran Texas Red (3000 MW) | Invitrogen | D3328 | Store at -20 °C; protect from light |
| EnzChek Gelatinase/Collagenase Assay Kit | Thermo Fisher Scientific; EnzCheck | E12055 | Store at -20 °C; protect form light |
| Female C57BL/6J mice (8-12 weeks) | e.g. Janvier Labs | Females, 8-12 weeks | |
| Freezing box for histology slides | e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG | 2285.1 | |
| 18G x 1½’’ (1.2mm x 40mm) injection needle | e.g. BD, BD Microlance 3 | 304622 | |
| 27G x ¾’’ – Nr. 20 (0.4mm x 19mm) injection needle | e.g. BD, BD Microlance 3 | 302200 | |
| 30G x ½’’ (0.3 mm x 13 mm) injection needle | e.g. BD, BD Microlance 3 | 304000 | |
| Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) | e.g. Santa Cruz Biotechnology | sc-24648 | Store at 4°C |
| Maintenance food | e.g. PROVIMI KLIBA SA | 3436 | |
| MOGaa35-55 peptide | e.g. GenScript | Store at -80 °C | |
| microscope slides (Superfrost Plus ) | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Mycobacterium tuberculosis H37RA | e.g. BD | 231141 | Store at 4 °C |
| NaCl 0.9 % | B. Braun | 3535789 | |
| O.C.T. compound (Tissue-Tek ) | Sakura | 4583 | |
| Omnican 50 30G x ½’’ | B. Braun | 9151125S | |
| Paraformaldehyde | Merck | 30525-89-4 | |
| Pertussis toxin | e.g. List biological laboratories, Inc. | 180 | Store at 4 °C |
| poly(vinyl alcohole) (Mowiol 4-88) | Sigma-Aldrich | 81381 | |
| Protease Inhibitor EDTA free (Roche) | Sigma-Aldrich | 4693132001 | Store at 4 °C |
| repelling pen e.g. DAKO Pen | e.g. DAKO | S2002 | |
| sealing film e.g. Parafilm M | e.g Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Silica gel | e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG | 9351.1 | |
| Stitch scissor | F.S.T | 15012-12 | |
| syringe 1 ml | e.g. PRIMO | 62.1002 | |
| syringe 10 ml | e.g. CODAN Medical ApS | 2022-05 | |
| vaporizer system Univentor 400 | UNO.BV |
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