Summary
Aqui, apresentamos os protocolos para investigar o comprometimento da unidade neurovascular durante encefalomielite auto-imune experimental in vivo. Abordamos especificamente como determinar a permeabilidade da barreira hemato - encefálica e gelatinase atividade envolvida na migração de leucócitos através da limitans da glia.
Abstract
A unidade neurovascular (NVU) é composta por células endoteliais microvasculares, formando a barreira hemato - encefálica (BBB), uma membrana basal endotelial com pericitos incorporados, e o limitans glia composta pela membrana basal parenquimatosa e hamartomas final-feed abraçando o aspecto abluminal do microvessels do sistema nervoso central (SNC). Além de manter o CNS homeostase o NVU controla tráfico de células imunes para o CNS. Durante immunosurveillance do SNC baixos números de linfócitos ativados podem atravessar a barreira endotelial sem causar disfunção BBB ou doença clínica. Em contraste, durante neuroinflammation tais como esclerose múltipla ou seu modelo animal encefalomielite auto-imune experimental (EAE) um grande número de células do sistema imunológico pode atravessar o BBB e, posteriormente, o limitans de glia eventualmente alcançando o parênquima do CNS levando a doença clínica. Migração de células imunes para o parênquima do CNS é, portanto, um processo de duas etapas que envolve uma migração sequencial através da barreira endotelial e glia do NVU empregando mecanismos moleculares distintos. Se após a sua passagem através da barreira endotelial, células T encontram seu antígeno cognato em células apresentadoras de perivascular sua reativação local irá iniciar mecanismos subsequentes, levando à ativação focal de gelatinases, que permitirá que as células T para atravessar a barreira glia e insira o parênquima do CNS. Assim, avaliar tanto, permeabilidade BBB e atividade da MMP na correlação espacial ao acúmulo de células imunes no SNC durante EAE permite especificar a perda da integridade das barreiras endoteliais e gliais do NVU. Aqui mostramos como induzir EAE em camundongos C57BL/6 por imunização ativa e como analisar posteriormente permeabilidade BBB in vivo usando uma combinação de marcadores fluorescentes exógenos. Mostramos ainda mais, como Visualizar e localizar gelatinase atividade no cérebro de EAE por zymogaphy in situ, acoplada à imunofluorescência citológicas de membranas de porão do BBB e CD45 + invadindo as células imunes.
Introduction
Sistema nervoso central (SNC) coordena todas as funções mentais em vertebrados e corpo, e homeostase do CNS é essencial para uma comunicação adequada dos neurônios. Homeostase do CNS é garantido pela unidade neurovascular (NVU), que protege o CNS de meio de mudança do fluxo de sangue. O NVU é composto de CNS microvascular em células endoteliais, que são bioquimicamente únicos e estabelecer a barreira hemato - encefálica (BBB) em interferência contínua com pericitos, astrócitos, neurônios e componentes da matriz extracelular (ECM), que estabelece dois membranas de porão distintas1. A membrana basal endotelial que ensheathes o aspecto abluminal das células endoteliais BBB abriga um número elevado de pericitos e é composto de laminina α4 e α5 laminina, além de outras proteínas de ECM2. Em contraste, a membrana basal parenquimatosa consiste de laminina α1 e α2 laminina e é abraçada por hamartomas ponta-pés. A membrana basal parenquimatosa juntamente com os fim de astrocyte-pés compõe o limitans glia que segrega a rede neuronal CNS do líquido cefalorraquidiano preenchido perivascular ou espaços subaracnoideo3. Devido a arquitetura original do NVU, célula imune ao tráfico para o CNS é distinta do que em tecidos periféricos como requer um processo de duas etapas com as células do sistema imunológico, primeiro violar o BBB endotelial e, posteriormente, o limitans glia a fim de alcançar o parênquima do CNS.
Esclerose múltipla (em) é uma doença comum do MPTP do SNC, em que um grande número de células do sistema imunológico em circulação Insira o CNS e causar neuroinflammation, desmielinização e perda focal de integridade BBB4. Perda de integridade BBB é uma marca início do MS, conforme indicado pela presença de contraste gadolínio realçando lesões no SNC como visualizado por ressonância magnética (MRI)5. Extravasamento de leucócitos para o CNS ocorre ao nível da postcapillary vênulas; no entanto, os precisos mecanismos envolvidos na diapedese de células imunes através da membrana basal do BBB e, posteriormente, a barreira glia permanecem para ser explorado. Encefalomielite auto-imune experimental (EAE) serve como um modelo animal para MS e tem contribuído significativamente para o nosso conhecimento atual sobre a patogênese da MS. Por exemplo, usando o modelo de EAE foi descoberto que o extravasamento de leucócitos ocorre em um processo de várias etapas, incluindo uma captura inicial e rolamento passo mediada por selectinas e mucina-como moléculas como ligante de glicoproteína P-selectina (PSGL) -1, seguido de prisão firme integrina-dependente e um rastreamento de células T em células endoteliais BBB aos lados permissivos para diapedese6.
Uma vez que as células T cruzaram o BBB endotelial e a membrana basal endotelial, eles precisam encontrar seu cognato antígeno macrófagos ou células dendríticas estrategicamente localizadas nos espaços leptomeníngeo ou perivascular. Essa interação induz a produção focal de mediadores pró-inflamatórios esse gatilho os subsequentes mecanismos necessários para invasão de tecido do CNS de células do sistema imunológico através da glia limitans7,8,9. Ativação focal de matrix-metaloproteinases (MMP) -2 e MMP-9 altera chemokine ativação e induz a degradação dos receptores de matriz extracelular em astrocyte ponta-pés, que é um pré-requisito para imunológico migração de células através da glia limitans para o Parênquima do CNS e induzir o aparecimento de sintomas clínicos de EAE10,11.
Combinando a deteção do CNS, infiltrando-se imune celular com BBB escapamento e gelatinase atividade em cortes de tecido do CNS fornece informações valiosas sobre a integridade funcional da barreira endotelial e glia no contexto de neuroinflammation. Por exemplo, recentemente investigamos a perda constitutiva da molécula de adesão endotelial junção apertada molécula (JAM)-B em células imunes ao tráfico para o CNS no contexto da EAE. Comparado ao saudáveis camundongos C57BL/6 de tipo selvagem, saudáveis littermates JAM-B-deficiente mostraram sem comprometimento da integridade do BBB, como demonstrado pela avaliação de permeabilidade in vivo usando marcadores endógenos como exógenos12. No contexto da EAE, JAM-B-deficientes C57BL/6 ratos mostraram sintomas de doença melhorou, que foi associado com interceptação de células inflamatórias na leptomeníngeo e perivascular espaços12. Para examinar este fenômeno aplicamos em situ zimografia, permitindo a identificação de gelatinase atividade para testar se a falta de atividade de gelatinase em camundongos JAM-B-deficiente pode ser responsável para o número reduzido de células do sistema imunológico capazes de romper a glia limitans12.
Dada a disponibilidade de diferentes geneticamente modificada do mouse modelos faltando, por exemplo, moléculas de junção apertada BBB diferentes que podem causar alterações na função do BBB, metodologias para investigar a integridade do BBB são importantes. Além disso, recentemente desenvolvidas drogas poderiam impactar sobre os obstáculos do NVU. Aqui nós mostramos como induzir EAE em camundongos C57BL/6 por imunização ativa com a glicoproteína do oligodendrocyte mielina (MOG)-peptídeo aa35-55 em adjuvantes de Freund completo. Explicamos como localizar infiltração de células imunes em toda as barreiras endoteliais e gliais o NVU e como estudar a integridade da barreira endotelial e gliais in vivo por detecção in situ de marcadores exógenos e atividade de gelatinase, respectivamente.
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Protocol
Todos os estudos foram conduzidos sob as diretrizes de acordo com a legislação Suíça relativa à protecção dos animais e foram aprovados pelo Instituto veterinário no Cantão de Berna, Suíça (números de permissão: BE 31/17 e ser 77/18).
1. habitação de camundongos C57BL/6 em condições (SPF) livre de patógeno específico
- Ciclo de casa os ratos em gaiolas ventiladas individuais com 12/12 h claro-escuro. Providenciar comida e água ad libidum. Para supervisionar a qualidade microbiológica dos ratos, a coorte experimental foi submetido a monitoramento de integridade trimestral por roupa de cama suja sentinelas FELASA recomendações13a seguir.
- Socos de orelha de uso para marcar individualmente camundongos C57BL/6 fêmeas de 8 a 12 semanas.
2. imunização de camundongos C57BL/6
- Preparação de soluções14:
- Por adjuvante de Freund completo (CFA), mistura de 30 mL de adjuvante de Freund incompleto com 120 mg de calor recém pestled inativado Mycobacterium tuberculosis (H37RA) sob uma coifa. Solução estoque de loja a 4 ° C.
- Para a solução de peptídeo-MOGaa35-55, dissolver MOGaa35-55-peptide em PBS estéril (4 mg/mL) e armazenar a-80 ° C.
- Prepare o MOG-emulsão:
- Dilua o CFA 1:2 com solução-mãe de MOG-peptídeo em um microtubo de 2 mL.
- Selar o microtubo com filme de selagem e corrigir no vortex, cobrindo completamente o tubo com fita adesiva. Emulsão de vórtice para 4 h a 4 ° C.
- Prepare as seringas com emulsão estável:
- Pegue o microtubo e rapidamente spin para baixo a emulsão utilizando uma centrífuga de mesa pequena. Colete a emulsão em uma seringa com uma agulha de injeção 18 x 1½'' (1,2 x 40 mm).
- De acordo com o número de ratos, ajustar o volume de emulsão na seringa (100 µ l/mouse) e substituir a agulha de 18 G com uma agulha de injeção 27 x ¾'' (0,4 x 19 mm). Sele a agulha de injeção, anexada à seringa com película de vedação.
- Para a solução de reserva de toxina (PTx) coqueluche, dissolver 50 µ g de PTx liofilizado em 500 µ l de PBS estéril (100 ng / µ l). Solução estoque de loja a 4 ° C.
- Para a solução de trabalho de PTx, misture 97 µ l de PBS estéril com 3 µ l de solução-mãe de PTx (300 ng/100 µ l) por mouse (para uso de injeção intraperitoneal uma agulha 30 x ½'' (0,3 x 13 mm)).
- Indução de EAE
- ANESTHETIZE camundongos C57BL/6 com isofluorano, usando um sistema de evaporação. Para induzir anestesia em camundongos, expor o mouse para isofluorano 4,5% de oxigênio em uma câmara de incubação pequeno antes de transferir o mouse para uma máscara com 2,1% isofluorano. Use uma unidade de anestesia equipada com almofada de aquecimento para evitar a hipotermia do mouse.
- Corrigir o mouse anestesiado em uma mão e primeiro injetar 30 µ l de MOG35-55/CFA-emulsão por via subcutânea em flancos pata traseira (Figura 1:1 + 2; no total 60 µ l; esquerda flanco 30 µ l e flanco direito 30 µ l) em estreita proximidade com os linfonodos inguinais.
- Posicione o mouse na sua barriga e injetar 20 µ l de MOGaa35-55/CFA-emulsão para o esquerda e bem macio tecido adiposo na raiz da cauda (Figura 1:3 + 4; no total 40 µ l; lado direito e lado esquerdo cauda raiz 20 µ l de cauda raiz 20 µ l) e uma pequena gota de int MOGaa35-55/CFA-emulsão o pescoço do mouse (Figura 1: 5).
- 100 µ l de solução de PTx intraperitonealmente injete o mouse. Segure a cabeça do rato abaixo do centro do corpo evitando a injeção para o intestino.
- Substituir a dieta de manutenção (extrudate principais nutrientes: 18,5% de proteína bruta; gordo cru 4,5% 4,5% de fibra bruta; cinzas brutas 6,5%; 35% de amido; energia metabólica: 13.1 MJ/kg) para reprodução de dieta (extrudate principais nutrientes: 23,5% de proteína bruta, gordura bruta 5,5%; 3% de fibra bruta; cinza total 5,7%; 36% de amido; energia metabólica: 14.3 MJ/kg) a fim de fornecer os ratos com alimentos de maior teor de energia antes e durante a doença clínica esperada.
- Remover a máscara facial e transferir o mouse para sua gaiola em casa com uma almofada de aquecimento. Certifique-se que o mouse está totalmente acordado e motile após 10 minutos.
- Repeti a PTx injecção (2.2.4) 48 h após o primeiro tratamento.
3. Pontuação de ratos EAE
- Verificar o status de saúde dos ratos EAE todas as manhãs, dando uma olhada dentro de jaulas.
- Marca os ratos EAE todas as tardes.
- Leve todos os ratos individuais incluídos no experimento EAE fora da gaiola e verificar se a cauda tem tônus movendo-a para cima com um dedo. Um rato saudável prosseguirá sua cauda (cauda tem um tônus). EAE clínico foi iniciado, o tônus da cauda se inferior, visível por uma diminuição gradual da cauda. Eventualmente o mouse não será capaz de levantar a cauda em tudo.
- Coloque cada rato individual incluído no experimento EAE no banco limpo e observar e documentar o comportamento ambulante. Consulte a tabela 115 por critérios de Pontuação para a avaliação da severidade da doença (o placar EAE).
- Avaliar e documentar o peso de cada rato incluído no experimento.
- Para garantir uma alimentação adequada e absorção de água pelos ratos, exibindo uma clínica EAE Pontuação de 1 fornecer alimento umedecido em um prato de plástico na parte inferior da gaiola e atualizar diariamente.
4. ensaio de permeabilidade In vivo
- Preparações de soluções:
- Para soluções estoque de dextrano, dissolvem-se 10 mg de 10 kDa dextrano Alexa Fluor 488, bem como 3 kDa dextrano Texas Red em 500 µ l de solução de cloreto de sódio 0,9% (20 mg/mL).
- Para a solução de trabalho de dextrano, apenas antes da injeção Pipetar 55 µ l de 10 kDa dextrano Alexa Fluor 488 estoque (20 mg/mL) de solução em um pedaço de filme de selagem e adicionar 55 µ l de 3 kDa dextrano solução Vermelho Texas (20 mg/mL). Misture e coletar 100 µ l em uma seringa descartável fina (concentração final de 2 mg/100 µ l).
- Para a solução de estoque de formaldeído (PFA) 10%, combinar 10g de PFA extra pura em pó, 100 mL de PBS e 200 µ l de NaOH 1N num copo de vidro limpo e calor até precisamente de 56 ° C sob agitação utilizando um agitador magnético; manter a 56 ° C por 30 min até que o PFA é completamente dissolvido; arrefecer à temperatura ambiente; ajustar o pH para 7,4; e filtrar através de um filtro de papel. Loja a - 20 ° C. A solução pode ser diluída ainda mais usando a PBS.
- Em breve anestesia saudável C57BL/6 ratos ou camundongos C57BL/6, sofrendo de EAE com isoflurano (o mouse será sedado por aproximadamente 1 min). Use um sistema automatizado como na etapa 2.2.1 (ratos serão expostos a 4,5% de isoflurano em oxigênio em uma câmara de indução e depois transferidos para uma máscara com 2,1% de isoflurano).
- Coloque o mouse anestesiado em posição lateral, em cima da mesa, então por via intravenosa (por exemplo, retrô-orbitally) 100 µ l de traçadores fluorescentes injetar o rato antes que o mouse acorde.
- Imediatamente remover a máscara e certifique-se de que o mouse está totalmente acordado e motile após a anestesia curta. Deixe o marcador circular por 15 min.
- Prossiga com a etapa 5.1.
5. perfusão de ratos
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Para avaliação da permeabilidade in vivo:
- Iniciar o procedimento de 15 min após a injeção do traçador fluorescente através da indução de anestesia profunda isoflurano. Para induzir anestesia profunda em camundongos usar 2,3% de isoflurano em oxigênio. Use o reflexo de retirada de pata para julgar a profundidade da anestesia (beliscar a pele entre os dedos; falta de flexão indica uma profundidade suficiente) e sonda os reflexos de tanto o membro anterior e o membro posterior de ratos submetidos a EAE.
- Corrigir o mouse em suas costas e pulverizar a barriga com etanol. Abra o tórax usando uma tesoura e retirar o diafragma. Abra o átrio direito do coração batendo usando uma tesoura e perfundir o mouse através do ventrículo esquerdo do coração, com 10 mL de PBS, seguido por 10 mL de 4% PFA em PBS.
Cuidado: Para evitar a inalação de PFA, perfundir o mouse em uma coifa. - Prossiga para a seção 6.
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Para em situ zimografia:
- Induzir a anestesia profunda isoflurano utilizando isoflurano 2,3% de oxigênio em um rato sofrendo de EAE e verifique a profundidade da anestesia como na etapa 5.1.1.
- Em seguida, corrigir o mouse em suas costas e pulverizar a barriga com etanol. Abra o tórax usando uma tesoura e retirar o diafragma. Abra o átrio direito do coração batendo usando uma tesoura e perfundir o mouse através do ventrículo esquerdo do coração com 20 mL de PBS.
- Prossiga para a seção 6.
6. dissecção e congelamento do cérebro
- Preparação do banho de arrefecimento:
- Encher um recipiente de dewar plana com gelo seco picado e adicionar 2-methylbutane (isopentano) até que o líquido atinge cerca de 1 cm acima do bloco de gelo seco. Cubra com uma tampa solta – por exemplo, uma capa de um balde de gelo.
- Cortar a cabeça do rato perfundido com tesoura afiada e retire a pele e as orelhas usando um conjunto menor de tesoura.
- Disse cuidadosamente o solidéu por corte a partir do foramen magnum na frente à esquerda e à direita, permitindo o solidéu upfold sobre o cérebro. Em seguida, levante com cuidado para fora o cérebro intacto da base do crânio enquanto separando os nervos ópticos, usando uma espátula metálica plana.
- Coloque o cérebro em papel alumínio e corte do cérebro em três pedaços (cérebro frontal, meio cérebro e cerebelo + tronco cerebral), colocando dois cortes coronais.
- Preencher um cryomold (25 x 20 x 5 mm) para o primeiro trimestre com matriz de corte (O.C.T.) de temperatura ideal, coloque fatias do cérebro com o lado anterior de cada pedaço de cérebro virado para baixo para a cryomold e cobrir o tecido completamente com matriz O.C.T..
- Coloque o cryomold com o tecido em uma orientação horizontal para o banho de 2-Methylbutane e certifique-se de que o tecido congela do fundo ao topo dentro de 1 minuto, evitando mergulhando o bloco de tecido todo o banho.
- Transferência de tecido congelado a-80 ° C para armazenamento e proceda à seção 7.
7. preparação de seções do tecido congelado
- Equilibrar a temperatura do tecido congelado de-80 ° C a-20 ° C em criostato por 30 min.
- Remover o bloco do tecido do cryomold e monte sobre o suporte do tecido do criostato (conjunto de-15 ° C) usando a matriz O.C.T..
- Aparar as arestas do bloco de tecido sobre o titular do criostato com um bisturi afiado e começar a cortar o bloco de tecido, removendo a 20 µm de seções com a faca do criostato até que o tecido é visível.
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Para a análise de permeabilidade in vivo do BBB:
- 6-10 µm tecido seções de corte, recolhê-los em lâminas de vidro de adesão e imagem imediatamente as seções cobertas com cobertura usando um microscópio de fluorescência.
- Avalie o aparecimento de vasos sanguíneos no cérebro (preste atenção ao acentuado bordas de não-vazamento vasos sanguíneos comparados para difundir os padrões de fluorescência observados para as embarcações de sangue pingando). Como controle positivo, verifique se o escapamento do traçador no estroma dos órgãos circunventriculares ou plexo coroide, que falta um BBB.
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Para em situ zimografia:
- Corte 6 µm histologicos usando um criostato, recolhê-los em lâminas de vidro de adesão e congelar os cortes histologicos a-20 ° C em uma caixa de congela contendo gel de silicone na tampa.
8. em situ zimografia combinado com mancha da imunofluorescência laminina/CD45
- Preparo de soluções:
- Prepare a solução de incorporação:
- Misture 6 g de glicerol (qualidade analítica), 2,4 g de poli (álcool vinílico), 6 mL de ddH2O e 12 mL de tampão Tris de 0,2 M, pH 8 e agitar (agitador magnético) a solução para 4h no RT
- Transferir a solução para um tubo de centrífuga de 50 mL e deixá-lo descansar por 2 h no RT Posteriormente, incube a solução por 10 min a 50 ° C (banho-maria) e centrifugar por 20 min a 2.700 x g, à temperatura ambiente.
- Pegue o sobrenadante e congelar em alíquotas a-20 ° C.
- Prepare a solução de gelatina fria:
- Dissolva 0,1 g de gelatina fria de pele bovina em 10 mL de ddH2O.
- Deixá-lo de molho pelo menos 1 dia e armazenar alíquotas a 4 ° C.
- Prepare o gelado metanol (-20 ° C):
- Colocar 100% de metanol em uma jarra de coplin e esfriar até-20 ° C.
- Prepare a solução-mãe de azida de sódio 10%:
- Adicionar 1 g de azida de sódio a 10 mL de ddH2O e armazenar à temperatura ambiente.
- Prepare a solução de trabalho de azida de sódio 0,1%:
- Mix 99 µ l dos ddH2O com 1 µ l de solução-mãe de azida de sódio 10%.
- Dissolver 1 mg de fluoresceína conjugada tintura-extinto (DQ) gelatina de pele de porco em 1 mL de azida de sódio trabalhando solução e loja 100 alíquotas µ l protegidas da luz a 4 ° C.
- Dissolver 30 mg de 1,10-fenantrolina monohidratada em 76 µ l de etanol e loja a-20 ° C.
- Prepare 25 x solução de inibidor de protease:
- Adicione 1 comprimido de inibidor de protease livre de EDTA a 2 mL de ddH2O. Loja a-20 ° C.
- Imediatamente antes da utilização, prepare a solução de reação (150 µ l/seção):
- Centrifugue a 1 mg/mL solução de gelatina DQ por 5 min a 13.300 x g.
- 127.2 Mix µ l de ddH2O 15 µ l de 10 x amortecedor da reação (Kit de ensaio Gelatinase/colagenase; ver Tabela de materiais), 0,3 µ l de gelatina fria de 20 mg/mL, 1,5 µ l de gelatina DQ 1 mg/mL e 6 µ l de 25 x solução de inibidor de protease.
- Imediatamente antes da utilização, prepare a solução de reação de controlo negativo phenantroline (150 µ l/seção):
- 125.2 Mix µ l de ddH2O 15 µ l de 10 x amortecedor da reação, 0,3 µ l de gelatina fria de 20 mg/mL, 1,5 µ l de gelatina DQ 1 mg/mL, 6 µ l de 25 x inibidor de protease EDTA livre e 2 µ l de 2m 1,10-phenantroline (inibidor MMP).
- Imediatamente antes da utilização, prepare solução de reação de controlo negativo (não-fluorescente) gelatina fria (150 µ l/seção):
- Mix 128,7 µ l de ddH2O, 15 µ l de buffer de reação de 10x, 0,3 µ l de gelatina fria de 20 mg/mL e 6 µ l de inibidor de protease de 25 x livre de EDTA.
- Preparar o anticorpo primário cocktail para counterstaining, por exemplo, 0,95 anticorpo antilaminina polyclonal µ g/mL e anticorpo de anti-CD45 polyclonal rato 10 µ g/mL em 1% de BSA em PBS e preparem-se apropriado do isotipo controle coquetéis de anticorpo primário.
- Preparar a solução de anticorpo secundário, por exemplo, 7,5 µ g/mL Cy3 cabra anti-rato + 15 µ g/mL anticoelho AMCA em BSA 1% em PBS (proteger da luz).
- Prepare a solução de incorporação:
- Descongelar a 6 seções do tecido cerebral não fixa µm de ratos EAE dentro da caixa de congelação plástico contendo gel de silicone na tampa em uma coifa para evitar a retenção de água no tecido e 2 secções de tecido em uma corrediça, separadas por linhas de desenho com uma água repelindo a caneta
- Preparar soluções de reação (8.1.9-8.1.11 de passos), centrifugue por 5 min a 13.400 x g em temperatura ambiente e pre-quente a 37 ° C, utilizando um banho de água.
- Hidratar as seções de tecido por 5 min a 37 ° C, utilizando o tampão de reação 1x. Em seguida, despeje o tampão de reação 1x, adicionar solução de reação sobre as secções de tecido e incubar durante 4 h a 37 ° C. Lave slides 5 vezes em ddH2O.
- Corrigir as seções por 5 min com metanol gelada a-20 ° C e depois lavar seções uma vez com PBS em temperatura ambiente.
- Adicionar 1% de BSA em PBS para as seções e incubar durante 20 min em temperatura ambiente (proteger da luz). Em seguida, descartar BSA 1% em PBS das seções lançando os slides sobre o tecido, adicione o cocktail de anticorpo primário e incubar por 1h à temperatura ambiente (proteger da luz).
- Lavar as seções duas vezes com PBS, adicione o cocktail de anticorpo secundário e incubar por 1h à temperatura ambiente (proteger da luz).
- Lave as seções duas vezes com PBS, montar as lâminas com solução de incorporação, deixe seções montadas secar durante a noite em temperatura ambiente (proteger da luz). Finalmente, analise o tecido manchado seções usando um microscópio fluorescente.
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Representative Results
Avaliação do curso clínico da EAE em camundongos C57BL/6 deve resultar em uma curva de doença, conforme representado na Figura 2A e mudanças no peso do corpo do mouse conforme apresentado na Figura 2B. C57Bl/6 ratos imunizados com MOGaa35-55 geralmente começam a desenvolver sintomas da doença em torno de 10 a 12 dias após a imunização ativa (figura 1A). Normalmente, ratos imunizados mostram uma queda transitória de peso corporal no dia após a injeção da emulsão e a primeira dose de toxina pertussis (figura 1B). Desde o dia 2 após a indução da EAE, o peso corporal de ratos imunizados depois aumenta gradualmente até o começa a doença, quando o peso do corpo, normalmente cai um dia antes do desenvolvimento dos sintomas clínicos e continua a diminuir, correlacionando o aumento sintomas da doença (figura 1A,B). A severidade da doença EAE aumenta até o pico da doença, que pode ser esperado entre os dias 16 e 20 após a indução da EAE (Figura 2A). No auge da EAE clínico, os ratos também mostram o peso de corpo mais baixo (Figura 2B), que aumenta em correlação com a melhora da EAE na fase de remissão da doença (Figura 2A,B). Indução de EAE em camundongos C57BL/6 usando MOGaa35-55 resultados em uma patologia crônica e os ratos normalmente não se recuperar totalmente (figura 1A).
A figura 3A mostra uma imagem representativa do plexo coroide e o parênquima cerebral adjacente de um rato C57BL/6, sofrendo de EAE que foi injetado por via intravenosa com fluorescente 3 kDa Dextran (vermelho) e 10 kDa Dextran (verde) 15 min antes de sacrificar ; escala da barra 50 µm. Como demonstramos anteriormente, traçadores prontamente difusa em toda a microvessels fenestrado em estoma do plexo coroide (foto à esquerda e meio), enquanto o BBB não permite a difusão de traçadores em circulação para o parênquima cerebral, indicado pela linha tracejada (foto direita), que é, portanto, desprovido de qualquer sinal fluorescente. Figura 3B mostra representativos gotejante dos vasos sanguíneos no cerebelo de um rato C57BL/6, sofrendo de EAE que foi injetado por via intravenosa com fluorescente 3 kDa Dextran (vermelho) e 10 kDa Dextran (verde) 15 min antes de sacrificar. Cabeças de seta indicam traçadores difundidas em toda a microvessels do cérebro para o parênquima do CNS (foto à esquerda e meio), sugerindo que a função BBB é diminuída destes vasos. No parênquima do CNS, sinal fluorescente verde e vermelho é visível fora as paredes dos vasos sanguíneos, que são indicadas por linhas tracejadas. Em EAE, no cerebelo onde inflamatórias algemas aparecem os marcadores também podem ser encontradas no espaço perivascular entre a membrana basal endotelial e o limitans de glia indicando perda funcional da integridade endotelial do BBB. Se rastreamento encontra-se para o parênquima cerebral se espalham, mostra adicional disfunção da barreira gliais12.
A Figura 4 mostra fotos representativas da análise da atividade de gelatinase (MMP) em um cérebro EAE do mouse C57BL/6 visualizado por zimografia in-situ e localizadas para compartimentos de barreira cérebro específico por anti-panlaminina (azul) e à presença de células inflamatórias pela coloração de imunofluorescência anti-CD45 (vermelho). Clivagem proteolítica de gelatina de (DQ) tintura-extinto unquenches um sinal de fluoresceína, que permite a localização da atividade de gelatinase na seção de tecido. Quando a gelatina fria (controle de não-fluorescente) é incubada, sem verde sinal fluorescente pode ser detectado nas seções de cérebro de ratos a EAE (linha superior), bem como nas seções que têm sido incubadas com DQ-gelatina combinada com phenantroline, um potente Zn +- agente complexante e inibidor MMP (linha média). Na linha inferior, atividade de gelatinase/MMP focal é visível como sinal típico granular fluorescência verde brilhante, como destacado pelas pontas de flechas. Inflamatória algemado no cerebelo de um rato EAE, atividade específica de MMP ocorre além da glia limitans (azul) nos locais de infiltração de células inflamatórias (vermelha).
Figura 1 : Representação gráfica dos locais de injeção para indução de EAE. 1) injecção para 30 µ l MOG-emulsão para o flanco direito, 2) injeção local para 30 µ l MOG-emulsão no flanco esquerdo, local 3) injeção de 20 µ l MOG-emulsão para a raiz da cauda esquerda, 4) injeção local para 30 µ l MOG-emulsão para a raiz da cauda direita 5) a injecção de uma pequena gota de MOG-emulsão para o pescoço. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Curso representante da EAE. (A) sintomas de doença da EAE em camundongos C57BL/6 ao longo do tempo. Média + /-SEM é mostrada. (B) mudança de peso corporal durante EAE ao longo do tempo. Média + /-SEM é mostrada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Imagem representativa da permeabilidade em vivo. (A) imagem esquerda: verde fluorescente 10 kDa dextrano a nível do plexo coroide. Imagens do meio: vermelho fluorescente 3 kDa dextrano a nível do plexo coroide. A fotografia certa: fusão das imagens esquerdas e meio. Escala barra 50 µm. (B) imagem esquerda: verde fluorescente 10 kDa dextrano no cerebelo do mouse. Imagens do meio: vermelho fluorescente 3 kDa dextrano no cerebelo do mouse. A fotografia certa: fusão das imagens esquerdas e meio. Linhas tracejadas são indicativas para paredes dos vasos sanguíneos; cabeças de seta apontam para marcadores fluorescentes no parênquima do CNS. Escala da barra 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Fotos representativas em situ zimografia. Primeira coluna: canal verde fluorescente (unquenched sinal de gelatina de (DQ) tintura-extinto). Segunda coluna: canal azul fluorescente (laminina). Terceira coluna: canal vermelho fluorescente (CD45). Quarta coluna: mesclagem de canais fluorescentes. Linha superior: controle negativo de gelatina fria (não fluorescente). Fila do meio: phenantroline (MMP-inibidor) controlo negativo. Linha inferior: gelatina DQ. Escala da barra 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Pontuação de 0 a 3 pontos | critérios | mudança de peso |
| 0 | sem sinais | peso normal |
| ~ | fraco cauda (fraco tônus) - critérios inhouse: não incluído na pontuação documentado | perda de peso (indicativa para verificação de 2) |
| 0,5 | manque de cauda (gotas de cauda) | perda de peso |
| 1 | hindleg fraqueza, marcha instável (o rato anda no banco como um pato) | perda de peso |
| 2 | hindleg paraplegia (mouse não se move seus membros traseiros) | perda de peso grave (indicativa para verificação de 2) |
| 3 | hindleg paraplegia, incontinência perda de controle do corpo mais baixa (rato cai para um lado, mas pode mover na gaiola usando ist frontlegs + incontinência; moribundo) | muito baixo peso (indicativo para verificação de 2) |
Tabela 1: Critérios de Pontuação para a avaliação da severidade da doença EAE.
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Discussion
Aqui, apresentamos um protocolo para induzir e monitorar EAE em camundongos C57BL/6 fêmeas. As fêmeas são preferencialmente escolhidas, e há uma incidência de mulheres: os homens de 3:1 em MS. Para avaliar a gravidade da EAE, fizemos uso de uma folha de Pontuação de 3 pontos. Severidade da EAE geralmente é marcada em relação a gravidade das disfunções motor. Ratos com avançados estágios da EAE, ou seja, exibir uma pontuação acima de 2 deve ser sacrificado para evitar o sofrimento desnecessário dos animais. Assim, recomenda-se marcar os ratos em intervalos próximos, por exemplo, duas vezes ao dia, conforme explicado no protocolo. Existem várias rotinas empregadas de pontuação, atingindo de 0-3 aponta para 0-6 pontos16,17,18,19 , ou até mais subpoints20. No entanto, mostramos anteriormente que supostamente refinada EAE marcando não implica que qualquer melhoria na determinação de potenciais diferenças estatisticamente significativas na pontuação da doença entre grupos, quando se considera o total de severidade doença15. Baseia-se esta observação que fizemos uso da escala 3 pontos para avaliar a progressão da doença em EAE a fim de reduzir o tempo de manuseio do mouse e afligir-se assim, para implementar as regras 3R de ratos. Outro ponto crítico, usando o modelo EAE para estudar as diferenças entre o nocaute e selvagem-tipo ratos ou diferenças entre os grupos de tratamento está montando um planejamento experimental precisos. Quando o selvagem-tipo ratos são comparados aos ratos nocaute, é essencial comparar littermates provenientes de acasalamentos heterozigotos para garantir fundos genéticos idênticos dos ratos selvagem-tipo e nocaute comparados no experimento EAE. Também é importante manter as mesmas condições para todos os mouses incluídos em um experimento, por exemplo, alterações de gaiola, administração de alimentos molhados e especialmente do rato (estado de saúde) as condições de alojamento. Para evitar fenômenos de gaiola específicas induzidos pelo investigador, Cruz-imunização deve ser realizada. Mais precisamente, se mais de uma seringa é necessária para imunizar um certo número de ratos, eles devem ser aleatoriamente para diferentes seringas usadas. O último da mesma forma deve ser aplicado para a realização de estudos de tratamento. Último mas não menos importante, o estado de saúde dos ratos alojados em instalações animais diferentes pode impactar na gravidade e incidência de doenças e, portanto, mais21 ou menos de Mycobacterium tuberculosis22 pode ser necessárias para induzir uma boa clínica doença. Além disso, o local da injeção pode influenciar no desenvolvimento da doença. Neste protocolo, propomos injetar volumes relativamente pequenos em cinco locais diferente de subcutâneo: 30 µ l em dois flancos, 20 µ l para a raiz da cauda direita e esquerda e uma pequena gota no pescoço. Em outros protocolos, depósitos de 50 µ l são colocados por via intramuscular para a cauda raiz apenas23 ou para os quatro flancos21. Injeções de depósitos menores, no entanto, minimizam o risco de causar irritação na pele, que os ratos podem tentar zero.
Permeabilidade in vivo pode ser realizada para avaliar o escapamento do BBB durante a EAE, mas também para avaliar se a exclusão genética específica de uma molécula ou um tratamento medicamentoso tem impacto na integridade do BBB em vivo. Isso pode ser realizadas também pela detecção de traçadores de plasma endógenos, tais como depósitos de IgG12 ou exógenos transes que são aplicadas na circulação de um rato vivo24. Neste protocolo, fizemos uso de duas diferentes exógenas traçadores (kDa 3 e 10 kDa Dextran) que foram injetados simultaneamente e permitiu a circulação por um tempo definido de 15 min. usando dois marcadores com tamanhos diferentes permite determinar a severidade do BBB disfunção e pode permitir definir um limite para tamanhos de traçador ou difusos ou não através do BBB. Fluorescentes dextranos são polissacarídeos hidrofílicos, caracterizados por baixa toxicidade, solubilidade em água boa e relativamente baixa imunogenicidade. Além disso, dextranos são compostos de poli-(α-D-1,6 glicose), que são resistentes a clivagem por glicosidases endógenas de celular. Aqui usamos variantes dextran com resíduos de lisina incorporados o conjugado de dextrano. Lysinated dextranos são aldeído fixável, que permite fixar o marcador no tecido. Dextranos fluorescente etiquetados, além de outros produtos químicos podem ser usados para avaliar a permeabilidade in vivo, por exemplo, a Hoechst tintura em combinação com o azul do Evan, que se liga a uma grande parte de albumina de soro. Hoechst manchas os núcleos de células endoteliais BBB CNS microvessels do forro, e azul do Evan pode ser detectado no espaço perivascular com disfunção BBB e difunde-se ainda mais quando o limitans glia é perturbado25,26. Em contraste, avaliar permeabilidade in vivo pela coloração imunofluorescente de marcadores endógenos fornece insights sobre a acumulação de, por exemplo, moléculas de IgG ou fibrinogênio, uma glicoproteína que circula no sangue, ao longo do tempo. Em condições saudáveis, o espaço perivascular é muito estreito e a membrana basal endotelial e o limitans da glia estão estreitamente ligados e, portanto, Visualizar as duas barreiras de ECM do NVU requer laminina isoform específico do anticorpo coloração27 .
Moléculas de IgG endógenas estão presentes durante a saúde e a doença dentro dos vasos sanguíneos, bem como o tecido dos órgãos circunventriculares, onde nenhum BBB é estabelecido12. No gene modificado ratos com defeitos de barreira do cérebro, durante o tratamento medicamentoso, ou durante neuroinflammation moléculas endógenas que circulam normalmente no sangue pode ser depositado no parênquima do CNS, que pode ser visualizado por counterstaining com antilaminina anticorpos também reconhecer todas as isoformas laminina (panlaminina anticorpos) ou laminina anticorpos de isoforma específica que permite diferenciar laminins, α4 laminina e α5 do endotelial da membrana basal e laminina α1 e laminina α2 partir da glia limitans. Durante condições de MPTP o espaço perivascular pode ser alargado por infiltração de células imunes, permitindo identificar tanto, a membrana basal endotelial e o limitans de glia usando um anticorpo de panlaminina. Counterstaining de laminins presente no NVU permite avaliar se endógena mas também marcadores exógenos são depositados no parênquima do CNS e counterstaining de CD45 permite avaliar se o escapamento focal do BBB está associado a célula imune infiltração.
Migração de células imunes para o parênquima CNS requer a passagem sequencial de duas barreiras distintas dentro do NVU, o BBB endotelial e posteriormente a glia limitans28. Cruzar o limitans glia e entrada de CNS de células do sistema imunológico se correlaciona com o início da clínica EAE29, enquanto CNS infiltração de células preso leptomeníngeo e espaços perivasculares não acionam EAE clínico. Interceptação de células imunes em espaços leptomeníngeo e perivascular entre membranas de porão tem sido observada em vários modelos de rato gene modificado, por exemplo, L-selectina nocaute ratos30, TNF nocaute ratos23, ratos de duplo nocaute MMP2/MMP910 e de camundongos nocaute JAM-B12. Estes sublinhado de descobertas que falta destas moléculas não afeta a migração de células imunes em BBB mas prefiro entre o limitans glia, ressaltando que os mecanismos moleculares, mediando a migração de células imunes através do BBB e o limitans glia são distintos. Cérebro em situ zimografia é uma metodologia para investigar a atividade focal gelatinase em uma seção de tecido em correlação espacial precisa para a patologia de CNS. Deteção de permeabilidade BBB em vivo juntamente com realizando zimografia in situ para detectar atividade de MMP2/MMP9 assim permite delinear endotelial contra perturbações de barreira glia em correlação à infiltração de células imunes. Combinado com panlaminina e CD45 imunofluorescência manchas nas seções do cérebro EAE, permite tanto a localização da actividade de gelatinase por DQ unquenching-gelatina e localização de infiltração de células do sistema imunológico ao mesmo tempo. Unquenching de fluoresceína de resultados DQ-gelatina em um sinal típico granular fluorescência verde brilhante, enquanto desiguais áreas de ofuscante verdes fluorescentes em cortes de tecido devem ser consideradas como sinal inespecíficos12. Assim, uma avaliação cuidadosa das secções de tecido e controles adequados são indispensáveis ao executar em situ zimografia. Neste protocolo, realizamos em situ zimografia em combinação com CD45 e laminina coloração. Anticorpos primários contra CD45 e laminina foram incubados como uma mistura ao mesmo tempo. Da mesma forma, anticorpos secundários foram incubados como uma mistura em uma segunda etapa de coloração. Essa combinação de anticorpos precisa de testes para garantir que a segundo anticorpos de fase são absorvidos contra outros IgGs para evitar reactividade cruzada.
Tomados em conjunto, os protocolos aqui apresentados fornecem ferramentas para investigar detalhadamente qual elemento do NVU é prejudicado em condições MPTP da EAE. Avaliação de permeabilidade in vivo por marcadores exógenos permite identificar o atual comprometimento da integridade de células endoteliais microvascular ou comprometimento atual do NVU. Além disso, permite introdução de marcadores com tamanhos diferentes para estimar a gravidade da deficiência do BBB. Adicional in situ zimografia revela gelatinase focal atividade em astrócitos e células potencialmente inflamatórias, o que é necessário para romper a glia limitans como uma última barreira antes de obter acesso ao CNS parênquima10.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Reconhecemos com gratidão Lydia Sorokin, quem tem compartilhado seu original em situ zimografia protocolo10 conosco.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AMCA anti-rabbit antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-156-045 | Store at 4 °C; protect from light |
| Anti-CD45 Antibody (30F11) | Pharmingen | 07-1401 | Store at 4 °C |
| Anti-Laminin Antibody | DAKO | Z0097 | Store at 4 °C |
| Breeding food | e.g. PROVIMI KLIBA SA | 3336 | |
| Individually ventilated cages, Blue line Type II or III | e.g. Tecniplast | 1145T, 1285L | |
| BSA fraction V | Applichem | A1391 | Store at 4 °C |
| Cold gelatine | Sigma-Aldrich | G 9391 | |
| Coplin jar + rack | e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG | H554.1; H552.1 | |
| Cy3 anti-rat antibody | Jackson ImmunoResearch | 111-156-144 | Store at 4 °C; protect from light |
| Cover slips 24 x 40 mm # 1 | e.g. Thermo Scientific | 85-0186-00 | |
| Dextran Alexa Fluor 488 (10,000 MW) | e.g. Molecular probes | D22910 | Store at -20 °C; protect from light |
| Dextran Texas Red (3000 MW) | Invitrogen | D3328 | Store at -20 °C; protect from light |
| EnzChek Gelatinase/Collagenase Assay Kit | Thermo Fisher Scientific; EnzCheck | E12055 | Store at -20 °C; protect form light |
| Female C57BL/6J mice (8-12 weeks) | e.g. Janvier Labs | Females, 8-12 weeks | |
| Freezing box for histology slides | e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG | 2285.1 | |
| 18G x 1½’’ (1.2mm x 40mm) injection needle | e.g. BD, BD Microlance 3 | 304622 | |
| 27G x ¾’’ – Nr. 20 (0.4mm x 19mm) injection needle | e.g. BD, BD Microlance 3 | 302200 | |
| 30G x ½’’ (0.3 mm x 13 mm) injection needle | e.g. BD, BD Microlance 3 | 304000 | |
| Incomplete Freund’s adjuvant (IFA) | e.g. Santa Cruz Biotechnology | sc-24648 | Store at 4°C |
| Maintenance food | e.g. PROVIMI KLIBA SA | 3436 | |
| MOGaa35-55 peptide | e.g. GenScript | Store at -80 °C | |
| microscope slides (Superfrost Plus ) | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Mycobacterium tuberculosis H37RA | e.g. BD | 231141 | Store at 4 °C |
| NaCl 0.9 % | B. Braun | 3535789 | |
| O.C.T. compound (Tissue-Tek ) | Sakura | 4583 | |
| Omnican 50 30G x ½’’ | B. Braun | 9151125S | |
| Paraformaldehyde | Merck | 30525-89-4 | |
| Pertussis toxin | e.g. List biological laboratories, Inc. | 180 | Store at 4 °C |
| poly(vinyl alcohole) (Mowiol 4-88) | Sigma-Aldrich | 81381 | |
| Protease Inhibitor EDTA free (Roche) | Sigma-Aldrich | 4693132001 | Store at 4 °C |
| repelling pen e.g. DAKO Pen | e.g. DAKO | S2002 | |
| sealing film e.g. Parafilm M | e.g Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Silica gel | e.g. Carl Roth GmbH + Co. KG | 9351.1 | |
| Stitch scissor | F.S.T | 15012-12 | |
| syringe 1 ml | e.g. PRIMO | 62.1002 | |
| syringe 10 ml | e.g. CODAN Medical ApS | 2022-05 | |
| vaporizer system Univentor 400 | UNO.BV |
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