Summary
이 프로토콜은 인간 줄기 세포로부터 분화된 배양 뉴런에 순환 올레핀 공중합체로 성형된 구획화된 미세 유체 칩의 사용을 입증한다. 이 칩은 기존의 구획 형 폴리 (디메틸 실록산) 장치보다 사전 조립되고 사용하기 쉽습니다. 바이러스성 표지, 유동성 격리, 축사 절제술 및 면역 염색을 포함하여 다중 일반적인 실험 패러다임은 여기에서 기술됩니다.
Abstract
배양 된 뉴런을 구획화하기 위해 미세 유체 장치를 사용하는 것은 신경 과학의 표준 방법이되었습니다. 이 프로토콜은 인간 줄기 세포로부터 분화된 뉴런을 구획화하기 위해 순환 올레핀 공중합체(COC)로 만들어진 미리 조립된 다중 구획 칩을 사용하는 방법을 보여줍니다. 이 COC 칩의 풋프린트는 표준 현미경 슬라이드와 동일하며 고해상도 현미경 검사법과 동일하게 호환됩니다. 뉴런은 인간 신경 줄기 세포 (NSC)에서 칩 내의 글루타마테르지뉴런으로 분화되고 5 주 동안 유지되므로 이러한 뉴런이 시냅스와 수지상 척추를 개발할 수있는 충분한 시간을 허용합니다. 추가, 우리는 바이러스 성 표지, 미세 환경 확립, 축사 절제술 및 면역 세포 화학을 포함하여 이 다중 구획 칩을 사용하여 다중 일반적인 실험 절차를 설명합니다.
Introduction
인간 줄기 세포 분화 뉴런 (hSC-뉴런)은 생물학적 연구에 점점 더 사용됩니다. 인간 적인 근원 물자에서 파생될 수 있는 이 뉴런은, 알츠하이머병과 같은 외상성 뇌 손상 및 신경 퇴행성 질환의 연구를 포함하여 번역 연구에 큰 관심을 가지고 있습니다. 따라서, hSC-뉴런의 연구를 개선하고 용이하게 하는 도구가 요구되고 있다.
뉴런의 독특한 편광 형태를 연구하기 위해 많은 연구자들은 다구획형미세 유체 장치 1, 2,3,4,5,6을사용합니다. 7,8,9,10,11. 이 장치는 독특한 세포 내 접근을 가진 긴 투영 뉴런의 측정 그리고 조작을 가능하게 합니다. 다중 구획형 미세 유체 장치는 축축한 성장을 유도하는 마이크로홈으로 분리된 두 개의 병렬 미세 유체 구획으로 구성됩니다. 뉴런 또는 신경 줄기 세포 (NSC)는 somatodendritic 구획에서 도금되고, 분 후에 구획 표면의 바닥에 부착됩니다. 분화된 뉴런은 마이크로그루브 영역을 통해 축산/돌출부를 성장하고 확장하여 인접하고 고립된 축색구로 확장합니다. 과거에는 이러한 장치가 폴리(디메틸실록산)(PDMS) 복제 성형을 사용하여 독점적으로 제작되었습니다. PDMS 장치는 사용 직전에 유리 커버슬립에 조립할 필요성및 지속적인 소수성 및 필요성을 포함하여 앞서 설명한12가지많은 단점을 가지고 있다. 사전 조립된 사출 성형 칩은 이러한 많은 단점을 극복하고 상업적으로 판매된다(재료표 참조)12. 이 칩의 구획은 영구적으로 친수성으로 만들어지며 전체 칩은 광학적으로 투명한 순환 올레핀 공중합체 (COC)로 성형됩니다.
이 프로토콜은 이 COC 칩을 사용하여 인간 신경 세포를 흥분성 뉴런으로 분화하고 긴 뉴런 프로젝션을 분리하고 유동적으로 분리하는 방법을 보여줍니다. 이 데모를 위해, 뉴런은 NIH 승인 H9 줄기 세포로부터 분화되었다. 유사한 절차는 인간 유도 만능 줄기 세포를 분화하는 데 사용될 수 있다.
Protocol
참고 : 그림 1A,B는 메인 채널 또는 구획, 웰 및 마이크로 홈의 위치를 포함하여 미리 조립 된 COC 칩의 회로도를 보여줍니다. 구획화된 칩은 식품 착색 염료의 분리에 의해 입증된 바와 같이구획 내에서 뚜렷한 유체 미세 환경을 확립할 수 있다(도 1C). 미리 조립된 다중 구획 칩을 준비하기 위한 프로토콜은 Nagendran 외, 섹션 112에주어진다.
1. hSC 뉴런용 멀티 컴파트먼트 칩 코팅
참고: 그림 2A는 코팅 절차에 대한 개요를 보여줍니다.
- 폴리-L-오르니틴을 세포 배양 등급 증류수에 용해하여 20 μg/mL 작동 용액의 칩당 600 μL의 용액을 만듭니다.
- 우물에서 칩을 준비 한 후 남아있는 PBS를 흡인. 피펫 팁이 채널 개구부에서 떨어져 있는지 확인하십시오.
참고: 미세 유체 채널은 이 절차 의 전체 를 위해 채워진 상태로 유지되어야 합니다. 채널 / 구획에서 액체를 흡인하지 마십시오, 단지 우물. - 오른쪽 상단에 폴리 L-오르니틴 작업 용액 150 μL을 적재하십시오. 90s 또는 액체가 오른쪽 아래를 잘 채우기 시작할 때까지 기다립니다. 150 μL의 용지를 오른쪽 하단에 넣고 액체가 마이크로홈을 통과할 때까지 5분 동안 기다립니다.
- 왼쪽 상단에 150 μL의 용지를 추가합니다. 90s를 기다린 다음 왼쪽 아래쪽에 150 μL을 추가하십시오. 칩의 홀더를 파라필름으로 감고 밤새 4°C에 놓습니다.
참고: 칩과 홀더를 37°C에서 1시간 동안 놓습니다. - 웰에서 용지를 흡인하여 파이펫 팁이 채널 개구부에서 멀리 떨어져 있는지 확인합니다. 오른쪽 상단에 멸균수 150 μL을 추가합니다. 90s를 기다린 다음 오른쪽 하단에 150 μL을 추가합니다. 액체가 마이크로홈을 통과할 때까지 5분 동안 기다립니다.
- 왼쪽 상단에 멸균수 150 μL을 넣고 90s를 기다린 다음 왼쪽 아래 웰에 150 μL을 추가합니다.
- 1.5-1.6단계를 반복합니다.
- 2°C ~ 8°C에서 천천히 라미닌을 해동하고 10 μg/mL 작동 용액을 준비한다.
- 라미닌 작업 용액의 150 μL을 오른쪽 상단에 잘 적재하십시오. 90s 또는 액체가 오른쪽 아래를 잘 채우기 시작할 때까지 기다립니다. 파이펫 150 μL을 오른쪽 하단에 잘. 라미닌이 마이크로 홈을 통과 할 수 있도록 5 분 기다립니다.
- 왼쪽 상단에 150 μL의 라미닌을 추가합니다. 90s를 기다린 다음 왼쪽 아래쪽에 150 μL을 추가하십시오. 37 °C에서 2 시간 동안 홀더 내에서 칩을 인큐베이션합니다.
- PBS로 칩을 헹구십시오 (Ca2 + 및 Mg2 +없이). PBS 의 150 μL을 오른쪽 상단에 잘 로드합니다. 90s 또는 액체가 오른쪽 아래를 잘 채우기 시작할 때까지 기다립니다. 150 μL의 PBS를 오른쪽 하단에 추가하고 PBS가 마이크로 홈을 통과할 때까지 5 분 동안 기다립니다.
- 피펫 150 μL의 PBS를 왼쪽 상단에 잘. 90 s 후 파이펫 150 μL 하부 왼쪽잘.
- 칩에서 PBS를 흡인한 다음 NSC 용지로 칩을 헹구는 다(재료 표참조). 150 μL의 미디어를 오른쪽 상단에 잘 로드합니다. 90년대 후 또는 오른쪽 채널을 통해 오른쪽 하단우물로 들어갈 때, 오른쪽 하단에 150 μL을 추가합니다. 미디어가 마이크로홈을 통과할 때까지 5분 정도 기다립니다.
- 왼쪽 상단에 150 μL의 용지를 추가하고 왼쪽 아래쪽우물에 150 μL을 추가합니다. 칩을 5% CO2로 37°C 인큐베이터에 배양하여 칩을 종자 할 준비가 될 때까지 미리 컨디셔닝합니다.
참고: 필요한 경우 칩을 하룻밤 동안 사전 조절할 수 있습니다.
2. NC를 멀티컴파트먼트 칩에 시딩
참고 :이 프로토콜은 인간 배아 줄기 세포 5로 시작 한우리의 이전 간행물과는 달리 상업적으로 구입 한 NSC를 사용했습니다. 이 프로토콜에서 신경 줄기 세포는 뉴런으로 분화 플라스틱 칩으로 직접 도금됩니다. 세포는 최대 2개의 대구에 대해 NSC로서 증식하도록 허용되고 추가 사용을 위해 액체 N2에 바이알에 저장될 수 있다. 이 프로토콜은 제1 또는 2항 후에 액체 N2에 저장된 NSC 바이알을 사용한다. 도 2B는 코팅 절차의 개요를 나타낸다.
- 제조업체의 지침에 따라 NCS를 해동합니다.
참고: 이 절차는 H9 파생 NSC에 적용됩니다. 다른 세포주에는 세포 밀도 최적화가 필요합니다. - 혈세포계를 사용하여 세포 농도를 계산하고 NSC 매체를 사용하여 mL당 7 x 106 세포의 농도를 얻습니다.
- 칩의 각 웰에서 미디어를 흡인합니다. 메인 채널에서 미디어를 흡입하지 마십시오.
- 피펫 5 μL의 세포 용액을 우측 위 쪽웰로, 그 뒤를 이어 우측 하단웰(총 70,000개)에 5 μL을 실시한다. 셀이 주 채널 개구부쪽으로 파이펫이 있는지 확인합니다. 현미경을 사용하여 세포가 채널에 들어갔는지 확인합니다. 셀이 칩 바닥에 부착될 때까지 5분 동안 기다립니다.
참고: 셀을 로드하는 데 구획 을 사용할 수 있습니다. - 피펫 ~150 μL의 NSC 용지를 오른쪽 상단에 잘 하고 150 μL을 오른쪽 아래웰로 잘 한다. 왼쪽에서 반복합니다. 적당한 가습 용기내에서 5% CO2, 37°C에서 배양한다.
- 48시간 후, 웰로부터 NSC 매체를 흡인하고 각 상판에 150 μL을 추가하여 신경 분화 매체로 교체하고 각 하단을 잘.
- 적합한 가습 용기 내에서5% CO2, 37°C 인큐베이터 내의 배양 뉴런.
참고: 미디어는 2-3일마다 교체해야 합니다. 칩에 사용되는 소량으로 인해 가습 된 인큐베이터 내에서도 증발은 세포 생존에 실질적으로 영향을 미칠 수 있습니다. 칩을 사용하여 세포의 장기 배양에 추가 습도를 제공하기 위해 적합한 보조 용기를 사용합니다(재료 표참조).
3. 칩 내의 hSC-뉴런의 바이러스 성 형광 라벨링
참고: 칩 내의 뉴런에 여러 바이러스를 사용하여 레이블을 지정할 수 있습니다. 아래 지침은 G 삭제 광견병 -mCherry 또는 -eGFP 바이러스의 사용을 설명합니다. 잠재적으로 전염성이 있는 물질은 해당 규칙 및 규정에 따라 처리되어야 하며 추가 교육 및 기관의 승인이 필요할 수 있습니다.
- 37°C로 칩당 신선한 신경 분화 매체의 ~400 μL을 따뜻하게.
- 축사 구획의 한 우물에서 원심 분리관으로 50 μL의 미디어를 제거한 다음 수정된 광견병 바이러스 의 100,000 개의 바이러스 단위를 튜브에 추가합니다.
참고: 바이러스가 들어 있는 파이펫 팁과 원심분리기 튜브를 적절히 폐기하십시오. - 축색 구획에서 나머지 신경 분화 매체를 제거하고 원심 분리튜브에 넣습니다. 37°C에서 보관하십시오.
참고: 채널이 액체로 채워진 상태로 유지되도록 합니다. - 바이러스 용액의 50 μL을 150 μL의 데온 매체와 혼합합니다. 파이펫 100 μL은 축산 구획의 한 웰에 잘 및 다른 축색 구획에 100 μL 잘. 37°C 인큐베이터 내에서 2시간 동안 배양한다.
참고: 축색및 체세포 구획 사이의 부적 차이는 바이러스가 감염/배양 시간 동안 축색 구획에 머무르는 것을 보장하는 데 도움이 됩니다. - 바이러스가 포함된 미디어를 철회하고 폐기합니다.
주의: 밀폐된 미세 유체 채널 내에서 액체를 제거하지 마십시오. - 신선한 용지75μL을 하나의 축산 구획에 부드럽게 파이펫하고 채널을 통해 다른 축산으로 잘 흐르게 합니다.
- 축색 구획에서 용지를 제거하고 올바르게 폐기하십시오.
- 3.6 단계와 3.7단계를 반복합니다.
- 축색 구획을 저장된 용지로 채웁니다. 필요한 경우 추가로 50 μL 의 신선한 매체를 피펫한 다음 칩을 인큐베이터로 되돌려 보입니다. 이러한 추가적인 신선한 매체는 공정 중 액체 전달 및 증발 동안 매체의 손실을 계산하는 것이다.
참고 : 이러한 수정 된 광견병 바이러스를 사용하여 눈에 보이는 형광 라벨은 감염된 뉴런의 세포 사멸이 일반적으로 바이러스 독성으로 인해 발생하는 48 시간 및 최대 8 일 동안 발생합니다. 뉴런 이미징은 다른 표준 배양 플랫폼(예: 유리 바닥 접시)과 같이 수행될 수 있지만, 증발 손실을 방지하기 위해 충분한 습도를 유지하기 위해서는 특별한 고려가 필요합니다.
4. 칩 내의 유체 절연, 축수술 및 면역 염색
- Nagendran 외12에기재된 바와 같이 유체 절연, 축술 및 칩으로 면역 염색을 따르십시오.
Representative Results
분화 매체를 가진 칩에서 1 주일 (7-10 일) 후에, NSCs는 축축한 구획을입력하는 신경 세포 및 신경 돌기로 분화합니다 (그림 3). 칩 내에서 뉴런은 체세포 구획 내에서 균등하게 부착하고 분배합니다. 이에 비해, PDMS 디바이스의 뉴런은 분화 매체의 첨가 후 5일 이내에 덩어리/집계되며, 도 3B(13일째 확대 이미지)에서 볼 수 있는 바와 같이 손상된 세포 건강을 이끈다. 칩의 뉴런은 번들축액으로 건강해 보입니다. 건강한 뉴런은 4-5 주 동안 칩 내에서 유지 될 수 있습니다.
뉴런 성숙 및 수지상 척추 발달을 시각화하기 위해, 수정된 광견병 바이러스는 mCherry 형광 단백질과 함께 수지상 척추를 포함한 라벨 뉴런을 역행하기 위해 29일째에 축색 구획으로 전달되었다. 광견병 바이러스 감염 4일 후, 축축액을 축세포로 확장하는 뉴런은 mCherry를 발현하였다. 분화일(33)에서 뉴런은 수지상 척추의 형성을 나타내보였다(도 4). 수지상 척추의 가시화는 칩 내에서 분화된 NSC 유래 뉴런이 성숙한 시냅스를 형성한다는 것을 보여준다.
다중 구획 칩은 또한 단백질의 세포 국소화를 가시화하기 위하여 면역 세포 화학과 호환됩니다. 분화 매체에서 뉴런을 유지한 후 26일 후, 뉴런은 흥분성 시냅스 마커,vGlut1(도 5)에 대해 표지되었다. 이러한 결과는 바이러스성 표지된 뉴런이 vGlut1(도5E)및 뉴런 특이적 마커, β-tubulin III(도5F-H)와공존하는 것을 보여준다.
축색에 단리된 뚜렷한 미세 환경을 생성하는 능력은 또한 낮은 분자량형광염료인 Alexa Fluor 488하이드라지드를 사용하여 입증되었다(그림 6).
축사 부상 연구는 일반적으로 구획화 된 장치 내에서 수행됩니다. 원리실험의 증거는 미리 조립된 COC 칩으로 분화된 뉴런의 축세포를 선택적으로손상시키도록 수행하였다(도 7). 결과는 실리콘 구획화 장치6,13,14와동일했다.
그림 1: 미리 조립된 COC, 다중 구획 미세 유체 칩. (A) 상부 및 하부 웰을 식별하는 칩의 도면. 칩의 크기는 75mm x 25mm이며 표준 현미경 슬라이드 크기입니다. (B) 채널을 분리하는 채널과 마이크로홈을 보여주는 영역을 확대한 것입니다. 자세한 내용은 나엔드란 외12. (C) 이 사진은 식품 착색 염료를 사용하여 각 구획 내에서 격리 된 미세 환경의 생성을 보여줍니다. 이 전체 그림은 12에서재현되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 플라스틱 구획칩 코팅 및 NSC 셀 도금 타임라인. (a) 플라스틱 멀티컴파트먼트 칩을 사전 코팅 용액으로 코팅한 다음, NSC 매체로 사전 컨디셔닝하기 전에 폴리-L-오르니틴 및 라미닌을 코팅하였다. (B) NSC를 칩의 체세포 구획에서 7 x 104 셀로 도금하였다. 세포를 24시간 동안 NSC 미디어에서 성장시키고 나서 미디어를 신경 분화 매체로 대체하였다. 분화 뉴런은 분화 후 7-10일 후에 관찰되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 칩 및 PDMS 디바이스에서의 hSC-뉴런 성장 비교. (a) 플라스틱 멀티컴파트먼트 칩에서 분화 한 후 13 일 에서 성장 한 hSC-뉴런의 위상 대비 이미지. (B) (A) 및 PDMS 장치 내의 동등한 영역(오른쪽)에서 백색 상자 내에서 배양된 hSC-뉴런 영역을 확대하였다. 칩 내의 hSC-뉴런은 잘 부착됩니다. 집계된 뉴런 클러스터는 PDMS 기반 장치에서 형성됩니다. 2 개의 독립적 인 실험을 대표합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 인간 NSC 유래 뉴런은 수지상 척추 형태를 보여준다. 퇴행성 표지 m체리 뉴런은 분화일(33)에서 칩 내에서 성장한다. 빨간색으로 윤곽이 잡힌 영역은 성숙한 글루타마테르지시냅스의 발달을 뒷받침하는 증거를 제공하는 수지상 척추의 존재를 강조합니다. 빨간색 화살표는 수지상 척추를 가리킵니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 칩 내에서 배양된 인간 NSC 유래 뉴런은 흥분성 시냅스를 나타낸다. 면역염색은 분화일 26일에 수행되었다. 신경 영상은 체세포 구획에서 수행되었다. A)vGlut1 (녹색) 및 (B) DAPI (파란색) 면역 라벨링. (C) mCherry 표지 뉴런(적색)은 변형된 광견병 바이러스를 사용하여 표지된 역행. (D) (A-C)의 병합형형광 현미경. (E) 수지상 척추 및 vGlut1 양성 punctamCherry 양성 모수석과 동국화, (D)에서확대 된 영역으로 도시. 면역형광 현미경 (F) 뉴런 특이적 마커, β-튜불린 III(마젠타), 및 (G) vGlut1(녹색). (H) β-튜불린 III 및 vGlut1의 오버레이. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 바이러스성 으로 변환된 mCherry 뉴런은 미리 조립된 COC 칩 내에 확립된 축슨 국부적 미세 환경으로 프로젝션을 확장합니다. (A) mCherry 표지 된 뉴런은 칩의 마이크로 홈을 통해 절연 축색 구획으로 축세포를 확장합니다. 축색구의 분리는 알렉사 플루오르 488 히드라지드를 사용하여 가시화된다. 뉴런의 이미징은 변형된 광견병 바이러스에 감염된 후 26일 및 3일째 분화일에 발생하였다. (B) (A)의 형광이미지가 DIC 이미지와 병합됩니다. 마이크로그루브의 위치를 기록합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: COC 멀티컴파트먼트 칩 내에서 수행된 축술. (A) mCherry 표지된 뉴런은 분화일(33)에 축세포전을 이미지화하였다. '화재' 컬러 룩업 테이블. (B) 축술 직후 축색이 완전히 절단된 것을 보여준다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 플라스틱 멀티 컴파트먼트 칩 | PDMS 멀티 컴파트먼트 장치 |
| 축색분리 | 축색분리 |
| 미세 환경 설정 | 미세 환경 설정 |
| 축색 뉴런 | 축색 뉴런 |
| 광학적으로 투명한 | 광학적으로 투명한 |
| 고해상도 이미징과 호환 | 고해상도 이미징과 호환 |
| 형광 현미경 검사법과 호환 | 형광 현미경 검사법과 호환 |
| 완전히 조립 | 기판에 조립필요 |
| 건강한 축새 >21일 | 건강한 축새 >14 일 |
| 친수성 배양 표면 | 소수 |
| 가스 불투과성 | 가스 투과성 |
| 둥근 마이크로그루브 및 채널 | 스트레이트 마이크로그루브 |
| 레이저 절제와 호환되지 않음 | PDMS 챔버가 특수 레이저 절제 호환 슬라이드에 조립될 때 레이저 절제에 사용할 수 있습니다. |
| 상단을 제거하도록 장치를 변경할 수 없습니다. | 상단은 마이크로 홈 내에서 염색을 위해 분리 가능 |
| 미네랄 오일 기반 침지 오일과 호환되지 않음 (실리콘 기반 오일은 괜찮습니다) | 광유 기반 침수 오일과 호환 |
| 소분자 및 유기 용매에 불투과성 | 소분자 및 유기 용매의 흡수 |
| 칩누출 문제 없음 | 폴리-L-오르니틴 및 라미닌 코팅으로 인해 장치가 새어 나오게 됩니다. |
| 분화 된 뉴런은 시험 된 세포 밀도에서 균등하게 분포 (> 4 주)로 유지됩니다. | 분화 된 뉴런은 시험 된 세포 밀도에서 배양 3-4 일 후에 집계되기 시작합니다. |
표 1: 뉴런 배양용 멀티 컴파트먼트 COC 칩 및 실리콘 장치의 비교
Discussion
사전 조립된 멀티 컴파트먼트 COC 칩은 사용하기 쉬운 구획형 플랫폼으로 인간 NCS를 장기간(>4주) 뉴런으로 분화하고 유지합니다. 이 프로토콜에서는 인간 신경 세포를 글루타마테르시성 뉴런으로 분화하고, 역행 라벨 뉴런을 역행하고, 면역 세포 화학을 수행하고, 수지상 척추 형태를 시각화하고, 축절제술을 수행합니다. 이 칩은 고해상도 이미징과 호환되며 COC12와자동 형광이 없습니다.
COC 멀티 컴파트먼트 칩은 실리콘 기반 구획형 장치와 기능적으로 동일하며, 앞서12에설명된 바와 같이 장점과 단점이 있다. 표 1은 hSC-뉴런을 배양하기 위한 다중 구획 COC 칩 및 실리콘 장치를 비교합니다. COC 구획화된 칩은 긴 배양 기간 동안 줄기 세포의 부착 및 유지를 위한 더 나은 친수성 표면을 제공합니다. PDMS 기반 장치는 유리 커버립에 조립하고 부착해야 합니다. PDMS 장치의 소수성 성질은 줄기 세포의 응집을일으킨다 5; 이것은 세포 수준에 있는 화상 진찰에 있는 두 도전 및 매체 변경 도중 세포 응집체의 운동 때문에 물리적 손상에 더 중대한 감수성으로 이끌어 냅니다. 플라스틱 칩은 이러한 문제를 극복합니다. COC는 PDMS와 달리 가스 불투과성이므로 채널 내에 갇혀 있거나 형성된 에어 포켓은 사용자가 제거해야 합니다. 사전 코팅 솔루션은 공기가 채널에 갇힐 가능성을 줄입니다. 이 솔루션은 에탄올 및 기타 제제로 구성됩니다. 이러한 플라스틱 칩 내에서 뮤린 뉴런을 배양하기 위한 이전에 발표된 프로토콜은칩(12)내의 파이펫팅 세포 및 매체에 대한 추가 세부 정보를 제공한다. 신경 세포는 뮤린 뉴런보다 더 깨지기 쉽기 때문에 더 부드럽게 처리해야합니다. 또한 줄기 세포를 위아래로 부드럽게 파이펫팅하여 도금하기 전에 철저히 혼합하는 것이 중요합니다.
시험관 내 분화 인간 줄기 세포에서 파생 된 뉴런의 사용은 의학 및 연구에서 점점 더 인기를 끌고있다. 이 뉴런은 신경 퇴행성 질환 및 외상성 뇌 손상을 포함한 많은 CNS 장애에 대한 연구 및 임상 응용 프로그램에 중요합니다. 이 뉴런은 인간의 태아뉴런과 밀접하게 유사15. 미래에, 적당히 노화된 뉴런은 줄기 세포에서 생성되어 노화와 관련된 뉴런 기능을 모방하고 이러한 구획화된 장치와 함께 사용될 수 있습니다. 이러한 장치는 자폐스펙트럼장애 및 상해 후 축축재생으로 진단된 환자의 뉴런에서 축사 결핍과 같은 축세포 건강과 기능에 영향을 미치는 질병에 대한 연구를 용이하게 한다16,17.
Disclosures
S.P.와 T.N.은 경쟁적인 재정적 이익을 선언하지 않습니다. V.P.는 Xona 미세 유체, LLC의 직원입니다. J.H.는 Xona 미세 유체 학적, LLC의 회원입니다. A.M.T.는 미세 유체 챔버/칩(US 7419822 B2, EPO 2719756 B1)의 발명가이며 Xona 미세 유체학적, LLC의 회원입니다.
Acknowledgments
저자는 Xona 미세 유체학, LLC, 정신 건강의 국립 연구소 (R42 MH097377), 및 신경 장애 및 뇌졸중의 국립 연구소 (R41 NS108895, P30 NS045892)에서 지원을 인정합니다. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor hydrazide 488 | ThermoFisher Scientific | A10436 | |
| Alexa Fluor secondary antibodies | ThermoFisher Scientific | 1:1000 | |
| anti_beta-tubulin III | Aves | TUJ | 1:1000 |
| anti-vGAT antibody | Synaptic Systems | 131 003 | 1:1000 |
| anti-vGlut1 antibody | NeuroMab | 75-066 | clone N28/9, 1:100 |
| complete neural stem cell media: | |||
| REC HU EGF 10 UG BIOSOURCE (TM) |
ThermoFisher Scientific | PHG0314 | 20ng/mL |
| REC HU FGF BASIC 10 UG BIOSOURCE (TM) |
ThermoFisher Scientific | PHG0024 | 20ng/mL |
| GlutaMAX Supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 35050061 | 2mM |
| KnockOut DMEM/F-12 | ThermoFisher Scientific | 12660012 | |
| StemPro Neural Supplement | ThermoFisher Scientific | A1050801 | 2% |
| Epifluorescence imaging system | EVOS Fluorescence imaging system | AMF4300 | 10x objective |
| fluorinated ethylene propylene film | American Durafilm | 50A | 0.5 mil thickness |
| Fluoromount G | ThermoFisher Scientific | 00-4958-02 | |
| Gibco DPBS without Calcium and Magnesium | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| GIBCO HUMAN NSC (H9) KIT COMBO KIT |
Gibco | N7800200 | |
| Gibco Laminin | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
| Glass Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich | CLS7095D5X SIGMA | 5.75 in length |
| H9-DERIVED HU NEURAL STEM CELL 1E6 CELLS/VIAL; 1 ML |
ThermoFisher Scientific | 510088 | |
| hibernate-E Medium | ThermoFisher Scientific | A1247601 | |
| Incubator, 5% CO2 37 °C | |||
| Laser scanning confocal imaging system | Olympus | FV3000RS | 30x silicone oil objective |
| modified rabies virus | Salk Institute for Biological Studies | G-deleted Rabies-eGFP | Material Transfer Agreement required |
| Mr. Frosty | ThermoFisher Scientific | 5100-0001 | |
| Neural differentiation media | Per 100 mL. | ||
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermoFisher Scientific | 15240112 | 1mL (100X) |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich | A8960 | 200mM |
| BDNF | ThermoFisher Scientific | PHC7074 | 40 ng/mL |
| Gibco B27 Plus Supplement (50X) | FisherScientific | A3582801 | 2mL (50X) |
| Gibco CultureOne Supplement (100X) | FisherScientific | A3320201 | 1mL (100X) |
| Gibco Neurobasal Plus Medium | FisherScientific | A3582901 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | ThermoFisher Scientific | A1110501 | |
| Taylor Wharton Liquid N2 dewar | FisherScientific | 20HCB11M | |
| triton X-100 | ThermoFisher Scientific | 28314 | |
| XC pre-coat | Xona Microfluidics, LLC | XC Pre-Coat | included with XonaChips |
| XonaChip | Xona Microfluidics, LLC | XC450 | 450 µm length microgroove barrier |
| Humidifier Tray | Xona Microfluidics, LLC | humidifier tray |
References
- Taylor, A. M., Wu, J., Tai, H. C., Schuman, E. M. Axonal translation of beta-catenin regulates synaptic vesicle dynamics. The Journal of Neuroscience. 33 (13), 5584-5589 (2013).
- Virlogeux, A., et al. Reconstituting Corticostriatal Network on-a-Chip Reveals the Contribution of the Presynaptic Compartment to Huntington’s Disease. Cell Reports. 22 (1), 110-122 (2018).
- Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research. The Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
- Pinto, M. J., et al. The proteasome controls presynaptic differentiation through modulation of an on-site pool of polyubiquitinated conjugates. The Journal of Cell Biology. 212 (7), 789-801 (2016).
- Bigler, R. L., Kamande, J. W., Dumitru, R., Niedringhaus, M., Taylor, A. M. Messenger RNAs localized to distal projections of human stem cell derived neurons. Scientific Reports. 7 (1), 611 (2017).
- Nagendran, T., et al. Distal axotomy enhances retrograde presynaptic excitability onto injured pyramidal neurons via trans-synaptic signaling. Nature Communications. 8 (1), 625 (2017).
- Van Laar, V. S., et al. Evidence for compartmentalized axonal mitochondrial biogenesis: Mitochondrial DNA replication increases in distal axons as an early response to Parkinson's disease-relevant stress. The Journal of Neuroscience. , (2018).
- del Río, J. A., Ferrer, I., Gavín, R. Role of cellular prion protein in interneuronal amyloid transmission. Progress in Neurobiology. 165-167, 87-102 (2018).
- Jia, L., et al. MiR-34a Regulates Axonal Growth of Dorsal Root Ganglia Neurons by Targeting FOXP2 and VAT1 in Postnatal and Adult Mouse. Molecular Neurobiology. , (2018).
- Taylor, A. M., Dieterich, D. C., Ito, H. T., Kim, S. A., Schuman, E. M. Microfluidic local perfusion chambers for the visualization and manipulation of synapses. Neuron. 66 (1), 57-68 (2010).
- Menon, S., et al. The E3 Ubiquitin Ligase TRIM9 Is a Filopodia Off Switch Required for Netrin-Dependent Axon Guidance. Developmental cell. 35 (6), 698-712 (2015).
- Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. Use of Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips for Compartmentalizing Primary Murine Neurons. Journal of visualized experiments : JoVE. (141), (2018).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature Methods. 2 (8), 599-605 (2005).
- Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. The Journal of Neuroscience. 29 (15), 4697-4707 (2009).
- Oh, J. H., Jung, C. R., Lee, M. O., Kim, J., Son, M. Y. Comparative analysis of human embryonic stem cellderived neural stem cells as an in vitro human model. International Journal of Molecular Medicine. 41 (2), 783-790 (2018).
- Lazar, M., Miles, L. M., Babb, J. S., Donaldson, J. B. Axonal deficits in young adults with High Functioning Autism and their impact on processing speed. Neuroimage Clinical. 4, 417-425 (2014).
- DePaul, M. A., Lin, C. Y., Silver, J., Lee, Y. S. Combinatory repair strategy to promote axon regeneration and functional recovery after chronic spinal cord injury. Scientific Reports. 7 (1), 9018 (2017).
