Summary
इस प्रोटोकॉल commentalized microfluidic चिप्स के उपयोग को दर्शाता है, मानव स्टेम कोशिकाओं से विभेदित सुसंस्कृत न्यूरॉन्स के लिए एक चक्रीय olefin copolymer में ढाला इंजेक्शन. इन चिप्स preassembled और आसान करने के लिए उपयोग पारंपरिक commentalized पाली (dimethylsiloxane) उपकरणों की तुलना में कर रहे हैं. एकाधिक आम प्रयोगात्मक प्रतिमान यहाँ वर्णित हैं, वायरल लेबलिंग सहित, fluidic अलगाव, axotomy, और इम्यूनोस्टेनिंग.
Abstract
सुसंस्कृत न्यूरॉन्स को कम्पार्टमेंटल करने के लिए माइक्रोफ्लूइडिक उपकरणों का उपयोग तंत्रिका विज्ञान में एक मानक विधि बन गया है। इस प्रोटोकॉल से पता चलता है कि कैसे मानव स्टेम कोशिकाओं से विभेदित न्यूरॉन्स commentalize करने के लिए एक चक्रीय olefin copolymer (COC) में किए गए एक पूर्व इकट्ठे बहु-कम्पार्टमेंट चिप का उपयोग करने के लिए। इन सीओसी चिप्स के पदचिह्न एक मानक माइक्रोस्कोप स्लाइड के रूप में ही कर रहे हैं और उच्च संकल्प माइक्रोस्कोपी के साथ समान रूप से संगत कर रहे हैं. न्यूरॉन्स चिप के भीतर glutamatergic न्यूरॉन्स में मानव तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं (एनएससी) से विभेदित कर रहे हैं और 5 सप्ताह के लिए बनाए रखा, इन न्यूरॉन्स synapses और डेन्ड्रिटिक रीढ़ विकसित करने के लिए पर्याप्त समय की अनुमति. इसके अलावा, हम वायरल लेबलिंग, माइक्रो-एसोटॉमी, और इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री की स्थापना सहित इन बहु-कम्पार्टमेंट चिप्स का उपयोग करके कई सामान्य प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं का प्रदर्शन करते हैं।
Introduction
मानव स्टेम सेल विभेदित न्यूरॉन्स (एचएससी न्यूरॉन्स) तेजी से जैविक अनुसंधान के लिए उपयोग किया जाता है. इन न्यूरॉन्स, जो मानव स्रोत सामग्री से प्राप्त किया जा सकता है, अनुवाद अनुसंधान के लिए बहुत रुचि के हैं, दर्दनाक मस्तिष्क की चोटों और अल्जाइमर रोग जैसे neurodegenerative विकारों के अध्ययन सहित. इस प्रकार, सुधार और एचएससी न्यूरॉन्स के अध्ययन की सुविधा के लिए उपकरण मांग में हैं.
न्यूरॉन्स के अद्वितीय polarized आकारिकी का अध्ययन करने के लिए, कई शोधकर्ताओं बहु-compartmentalized microfluidic उपकरणों का उपयोगकरें 1,2,3,4,5,6, 7,8,9,10,11. इन उपकरणों माप और अद्वितीय subcellular उपयोग के साथ लंबे प्रक्षेपण न्यूरॉन्स के जोड़तोड़ सक्षम. बहु-compartmentalized microfluidic उपकरणों microgrooves द्वारा अलग दो समानांतर microfluidic डिब्बों से मिलकर बनता है, जो axonal विकास गाइड. न्यूरॉन्स या तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं (एनएससी) somatodendritic डिब्बे में चढ़ाया जाता है, और फिर मिनट के बाद डिब्बे की सतह के नीचे का पालन करें. विभेदित न्यूरॉन्स बढ़ने और एक आसन्न और अलग axonal डिब्बे में microgroove क्षेत्र के माध्यम से अपने axons / अतीत में, इन उपकरणों को विशेष रूप से पाली (dimethylsiloxane) (PDMS) प्रतिकृति मोल्डिंग का उपयोग कर बनाया गया था. PDMS उपकरणों कई कमियां पहले वर्णितहै 12, लगातार hydrophobicity और तुरंत उपयोग करने से पहले एक गिलास coverslip को इकट्ठा करने की जरूरत सहित. पूर्व इकट्ठे इंजेक्शन ढाला चिप्स इन कमियों के कई दूर और व्यावसायिक रूप से बेच रहे हैं (सामग्री की तालिकादेखें )12. इन चिप्स के डिब्बों को स्थायी रूप से हाइड्रोफिलिक बना दिया जाता है और पूरी चिप ऑप्टिकली पारदर्शी चक्रीय ओलिफिन कोपॉलीमर (सीओसी) में ढाला गया इंजेक्शन है।
इस प्रोटोकॉल दर्शाता है कि कैसे इस सीओसी चिप का उपयोग करने के लिए उत्तेजक न्यूरॉन्स में मानव NSCs अंतर करने के लिए, और अलग और fluidically उनके लंबे न्यूरॉन अनुमानों को अलग करने के लिए. इस प्रदर्शन के लिए, न्यूरॉन्स NIH से विभेदित थे मंजूरी दे दी H9 स्टेम कोशिकाओं. इसी तरह की प्रक्रियाओं मानव प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं में अंतर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Protocol
नोट: चित्र 1A, बी मुख्य चैनलों या डिब्बों, कुओं, और microgrooves के स्थानों सहित पूर्व इकट्ठे सीओसी चिप की एक योजनाबद्ध से पता चलता है। कम्पार्टमेंटल चिप एक डिब्बे के भीतर अलग-अलग तरल सूक्ष्म वातावरण स्थापित कर सकती है जो खाद्य रंग रंजक के अलगाव द्वारा प्रदर्शित होती है (चित्र 1च) । पूर्व इकट्ठे बहु-कंपार्टमेंट चिप तैयार करने के लिए प्रोटोकॉल नागेन्दर एट अल में दिया गया है।
1. एचएससी-न्यूरॉन्स के लिए बहु-कंपार्टमेंट चिप्स की कोटिंग
नोट: चित्र 2A कोटिंग प्रक्रियाओं का ओवरव्यू दिखाता है।
- 20 ग्राम/एमएल कार्य समाधान के प्रति 600 डिग्री सेल्सियस घोल बनाने के लिए कोशिका संस्कृति-ग्रेड आसुत जल में पॉली-एल-ऑर्निथिन को भंग करें।
- शेष पीबीएस को कुओं से चिप्स तैयार करने के बाद छोड़ दिया गया। जब aspirating, सुनिश्चित करें कि पाइप टिप चैनल खोलने से दूर है.
नोट: microfluidic चैनल इस प्रक्रिया की संपूर्णता के लिए भरा रहना चाहिए. चैनलों/डिब्बों, केवल कुओं से तरल पदार्थ न निकालें। - ऊपरी दाएँ कुएं में 150 डिग्री पॉली-एल-ऑर्निथिन कार्य समाधान लोड करें। 90 s के लिए प्रतीक्षा करें या जब तक तरल कम सही अच्छी तरह से भरने के लिए शुरू होता है. कम सही अच्छी तरह से मीडिया के 150 $L जोड़ें और 5 मिनट के लिए प्रतीक्षा करने के लिए तरल microgrooves के माध्यम से पारित करते हैं.
- ऊपरी बाएँ अच्छी तरह से करने के लिए मीडिया के 150 $L जोड़ें. 90 s प्रतीक्षा करें और फिर निचले बाएँ अच्छी तरह से करने के लिए 150 $L जोड़ें. चिप के धारक को पैराफिल्म के साथ लपेटें और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
नोट: वैकल्पिक रूप से, चिप और धारक को 1 ज के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें। - कुओं से मीडिया को प्रेरित करें, यह सुनिश्चित करना कि पाइप टिप को चैनल खोलने से दूर रखा गया है। ऊपरी दाईं ओर अच्छी तरह से बाँझ पानी के 150 डिग्री एल जोड़ें. 90 s के लिए प्रतीक्षा करें और फिर कम सही अच्छी तरह से 150 $L जोड़ें. 5 मिनट के लिए प्रतीक्षा करने के लिए तरल microgrooves के माध्यम से पारित करते हैं.
- ऊपरी बाएँ अच्छी तरह से करने के लिए बाँझ पानी के 150 $L जोड़ें, 90 s प्रतीक्षा करें और फिर निचले बाएँ अच्छी तरह से करने के लिए एक और 150 डिग्री सेल्सियस जोड़ें.
- 1.5-1.6 चरणों को दोहराएँ.
- थावे लेमिनन धीरे-धीरे 2 डिग्री सेल्सियस से 8 डिग्री सेल्सियस पर और 10 ग्राम/एमएल कार्य समाधान तैयार करें।
- ऊपरी दाएँ कुएं में लेमिनन कार्य समाधान का 150 डिग्री सेल्सियस भार। 90 s के लिए प्रतीक्षा करें या जब तक तरल कम सही अच्छी तरह से भरने के लिए शुरू होता है. निचले सही अच्छी तरह से पाइप्ट 150 $L. लेमिन को माइक्रोग्रोव के माध्यम से जाने देने के लिए 5 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
- ऊपरी बाएँ कुएं में 150 डिग्री सेल्सियस लैमइन डालें। 90 s प्रतीक्षा करें और फिर निचले बाएँ अच्छी तरह से करने के लिए 150 $L जोड़ें. 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 एच के लिए अपने धारक के भीतर चिप इनक्यूबेट करें।
- पीबीएस के साथ चिप कुल्ला (के बिना2 + और Mg2+). पीबीएस के 150 डिग्री सेल्सियस को ऊपरी दाएं अच्छी तरह से लोड करें। 90 s के लिए प्रतीक्षा करें या जब तक तरल कम सही अच्छी तरह से भरने के लिए शुरू होता है. निचले सही अच्छी तरह से पीबीएस के 150 डिग्री सेल्सियस जोड़ें और 5 मिनट के लिए प्रतीक्षा करने के लिए पीबीएस microgrooves के माध्यम से जाना.
- ऊपरी बाएँ अच्छी तरह से पीबीएस के 150 $L पाइप्ट. 90 s pipet के बाद 150 $L निचले हिस्से में अच्छी तरह से छोड़ दिया.
- चिप से पीबीएस को प्रेरित करें और फिर एनएससी मीडिया के साथ चिप को कुल्लाएं (सामग्री की तालिकादेखें )। ऊपरी सही अच्छी तरह से करने के लिए मीडिया के 150 $L लोड. 90 s के बाद या जब तरल निचले सही अच्छी तरह से सही चैनल के माध्यम से गुजरता है, कम सही अच्छी तरह से 150 डिग्री सेल्सियस जोड़ें. 5 मिनट के लिए प्रतीक्षा करने के लिए मीडिया microgrooves के माध्यम से प्रवाह.
- मीडिया के 150 $L ऊपरी बाएँ अच्छी तरह से और एक और 150 $L निचले भाग में अच्छी तरह से छोड़ दिया करने के लिए जोड़ें. एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में चिप को 5% सीओ2 के साथ इनक्यूबेट करें, चिप को पूर्व-शर्त करने के लिए जब तक कि एनएससी बीज के लिए तैयार न हो जाए।
नोट: चिप्स पूर्व वातानुकूलित रात भर किया जा सकता है अगर जरूरत है.
2. मल्टीकॉम्पार्टमेंट चिप में एनएससी सीडिंग
नोट: इस प्रोटोकॉल व्यावसायिक रूप से खरीदा NSCs इस्तेमाल किया, हमारे पिछले प्रकाशन जो मानव भ्रूण उपजी कोशिकाओं के साथ शुरू हुआ के विपरीत5. इस प्रोटोकॉल में तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को सीधे प्लास्टिक के चिप्स में चढ़ाया जाता है जहां वे न्यूरॉन्स में अंतर करते हैं। कोशिकाओं को एनएससी के रूप में बढ़ने की अनुमति दी जा सकती है (भेदभाव के बिना) अप करने के लिए 2 मार्ग और आगे उपयोग के लिए तरल एन2 में शीशियों में संग्रहीत. इस प्रोटोकॉल NSC शीशियों तरल N 2 में संग्रहीत मार्ग 1 या2 के बाद का उपयोग करता है। चित्र 2B कोटिंग प्रक्रियाओं का एक सिंहावलोकन से पता चलता है.
- निर्माता के निर्देशों के अनुसार Thaw NSCs.
नोट: यह प्रक्रिया H9 व्युत्पन्न NSCs करने के लिए लागू होता है। अन्य सेल लाइनों सेल घनत्व अनुकूलन की आवश्यकता होगी. - एक हेमोसाइटोमीटर का उपयोग कर सेल एकाग्रता की गणना और एनएससी मीडिया का उपयोग कर समायोजित करने के लिए एक एकाग्रता प्राप्त करने के लिए 7 x 106 प्रति एमएल कोशिकाओं.
- चिप के प्रत्येक अच्छी तरह से Aspirate मीडिया. मुख्य चैनलों से मीडिया को चोट न आने से बचें।
- पाइप्ट 5 $L कक्ष समाधान के ऊपरी दाएँ भाग में अच्छी तरह से, उसके बाद 5 डिग्री सेल्सियस निचले दाएँ भाग में (70,000 कोशिकाएं कुल) होती हैं. सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को मुख्य चैनल के उद्घाटन की ओर पाइप किया जाता है। जाँच करने के लिए कि कोशिकाओं को चैनल में प्रवेश किया है एक माइक्रोस्कोप का प्रयोग करें. चिप के नीचे का पालन करने के लिए कोशिकाओं के लिए 5 मिनट प्रतीक्षा करें।
नोट: या तो या दोनों डिब्बों कोशिकाओं को लोड करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। - NSC मीडिया के 150 डिग्री सेल्सियस ऊपरी सही अच्छी तरह से और फिर 150 डिग्री सेल्सियस के निचले सही करने के लिए अच्छी तरह से पाइप्ट. बाईं ओर दोहराएँ. एक उपयुक्त आर्द्रीकृत कंटेनर के भीतर 5% सीओ2, 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
- 48 घंटे के बाद, कुओं से एनएससी मीडिया aspirate और तंत्रिका भेदभाव मीडिया के साथ प्रत्येक शीर्ष अच्छी तरह से और प्रत्येक नीचे अच्छी तरह से करने के लिए 150 $L जोड़कर बदलें.
- एक उपयुक्त humidified कंटेनर के भीतर एक 5% सीओ2, 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर के भीतर संस्कृति न्यूरॉन्स।
नोट: मीडिया हर 2-3 दिन प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए। चिप में प्रयुक्त छोटे संस्करणों के कारण, एक आर्द्र इनक्यूबेटर के भीतर भी वाष्पीकरण सेल व्यवहार्यता को काफी हद तक प्रभावित कर सकता है। चिप के साथ कोशिकाओं की दीर्घकालिक संस्कृति के लिए अतिरिक्त आर्द्रता प्रदान करने के लिए एक उपयुक्त द्वितीयक कंटेनर का उपयोग करें (सामग्री की तालिकादेखें)।
3. चिप के भीतर एचएससी-न्यूरॉन्स की वायरल फ्लोरोसेंट लेबलिंग
नोट: एकाधिक वायरस चिप के भीतर न्यूरॉन्स लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. नीचे दिए गए निर्देश ों में जी-हटाए गए रेबीज-मचेरी या -eGFP वायरस के उपयोग का वर्णन किया गया है। संभावित संक्रामक सामग्री लागू नियमों और विनियमों के अनुसार नियंत्रित किया जाना चाहिए, और अतिरिक्त प्रशिक्षण और संस्थागत अनुमोदन की आवश्यकता हो सकती है.
- 37 डिग्री सेल्सियस के लिए चिप प्रति ताजा तंत्रिका विभेदन मीडिया के गर्म $400 डिग्री सेल्सियस।
- एक्सॉन डिब्बे के एक कुएं से मीडिया के 50 डिग्री सेल्सियस को अपकेंद्रित्र ट्यूब में निकालें और फिर ट्यूब में संशोधित रेबीज वायरस की 100,000 वायरल इकाइयां जोड़ें।
नोट: ठीक से खर्च पाइप टिप्स और वायरस युक्त अपकेंद्रित्र ट्यूबों का निपटान। - एक्सोनल डिब्बे से शेष तंत्रिका विभेदन मीडिया निकालें और एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में रखें। 37 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
नोट: सुनिश्चित करें कि चैनल तरल से भरा रहता है। - गर्म मीडिया के 150 डिग्री सेल्सियस के साथ वायरस समाधान के 50 डिग्री एल मिलाएं। एक अच्छी तरह से एक्सॉन डिब्बे के लिए 100 $L और अन्य एक्सॉन डिब्बे को 100 डिग्री सेल्सियस अच्छी तरह से पिट्ट। 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर के भीतर 2 एच के लिए इनक्यूबेट।
नोट: एक्सोनल और कायिक डिब्बों के बीच मात्रा में अंतर यह सुनिश्चित करने में मदद करता है कि वायरस संक्रमण/इनक्यूबेशन समय के दौरान एक्सोनल डिब्बे में रहता है। - वायरस युक्त मीडिया को वापस लेना और निपटान करना।
चेतावनी: संलग्न microfluidic चैनलों के भीतर तरल को दूर न करें। - धीरे से एक एक्सॉन डिब्बे में ताजा मीडिया के 75 डिग्री सेल्सियस पाइप अच्छी तरह से और अन्य एक्सॉन अच्छी तरह से चैनल के माध्यम से मीडिया प्रवाह करते हैं.
- एक्सॉन डिब्बे से मीडिया निकालें और ठीक से निपटान.
- चरण 3.6 और 3.7 दोहराएँ.
- सहेजे गए मीडिया के साथ एक्सॉन डिब्बे भरें. एक अतिरिक्त 50 डिग्री सेल्सियस ताजा मीडिया, यदि आवश्यक हो, और फिर इनक्यूबेटर को चिप वापस करें। इस अतिरिक्त ताजा मीडिया के लिए तरल हस्तांतरण और प्रक्रिया के दौरान वाष्पीकरण के दौरान मीडिया के नुकसान की ओर गिनती है.
नोट: इन संशोधित रेबीज वायरस का उपयोग कर दृश्यमान फ्लोरोसेंट लेबलिंग 48 एच और 8 दिनों के बाद होती है जिसके बाद संक्रमित न्यूरॉन्स की कोशिका मृत्यु आम तौर पर वायरस विषाक्तता के कारण होती है। न्यूरॉन इमेजिंग अन्य मानक संस्कृति प्लेटफार्मों (जैसे, कांच के नीचे व्यंजन) के साथ के रूप में किया जा सकता है, लेकिन विशेष विचार वाष्पीकरण नुकसान को रोकने के लिए पर्याप्त आर्द्रता बनाए रखने की जरूरत है.
4. Fluidic अलगाव, axotomy, और चिप के भीतर इम्यूनोस्टेनिंग
- तरल अलगाव का पालन करें, axotomy, और चिप के साथ इम्यूनोस्टेनिंग के रूप में Nagendran एट अल में वर्णित12.
Representative Results
भेदभाव मीडिया के साथ चिप में एक सप्ताह (7-10 दिन) के बाद, एनएससी न्यूरॉन्स में अंतर और न्यूरॉन अनुमानों axonal डिब्बे में प्रवेश (चित्र3)। चिप के भीतर, न्यूरॉन्स देते हैं और दैहिक डिब्बे के भीतर समान रूप से वितरित. तुलना में, PDMS उपकरणों में न्यूरॉन्स clump / समग्र के रूप में जल्दी के रूप में 5 दिनों के बाद भेदभाव मीडिया के अलावा, समझौता सेल स्वास्थ्य के लिए अग्रणी के रूप में चित्रा 3B में देखा जा सकता है (दिन 13 बढ़ाया छवि). चिप्स में न्यूरॉन्स बंडल एक्सॉन के साथ स्वस्थ लग रहे हैं। स्वस्थ न्यूरॉन्स के लिए चिप्स के भीतर बनाए रखा जा सकता है 4-5 सप्ताह.
न्यूरॉन परिपक्वता और डेन्ड्रिटिक रीढ़ के विकास की कल्पना करने के लिए, संशोधित रेबीज वायरस दिन 29 में axonal डिब्बे को दिया गया था प्रतिगामी लेबल न्यूरॉन्स, डेन्ड्रिटिक रीढ़ सहित, mCherry फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ. रेबीज वायरस के संक्रमण के चार दिन बाद, एक्सोनल डिब्बे में एक्सॉन का विस्तार करने वाले न्यूरॉन्स ने एमचेरी व्यक्त किया। विभेदन के दिन न्यूरॉन्स 33 में डेन्ड्रिटिक रीढ़ का गठन दिखाया गया (चित्र 4)। डेन्ड्रिटिक रीढ़ की हड्डी के दृश्य दर्शाता है कि एनएससी व्युत्पन्न न्यूरॉन्स चिप्स के भीतर विभेदित परिपक्व synapses फार्म.
बहु-कम्पार्टमेंट चिप प्रोटीन के सेलुलर स्थानीयकरण की कल्पना करने के लिए इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री के साथ भी संगत है। विभेदन मीडिया में न्यूरॉन्स को बनाए रखने के 26 दिनों के बाद, न्यूरॉन्स उत्तेजक synaptic मार्कर के लिए लेबल किया गया, vGlut1 (चित्र 5). इन परिणामों से पता चलता है कि वायरल लेबल न्यूरॉन्स vGlut1 के साथ सह-स्थानांकित (चित्र 5E) और न्यूरॉन विशिष्ट मार्कर, जेड-ट्यूबुलिन III (चित्र 5F-H) .
Axons के लिए अलग अलग microenvironments बनाने की क्षमता भी एलेक्सा फ्लोर 488 hydrazide, एक कम आणविक वजन फ्लोरोसेंट डाई (चित्र 6) का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया था.
Axon चोट अध्ययन आमतौर पर commentalized उपकरणों के भीतर प्रदर्शन कर रहे हैं. पूर्व-संयोजित सीओसी चिप के साथ विभेदित न्यूरॉन्स के एक्सन कोचुनिंदा रूप से घायल करने के लिए सिद्धांत प्रयोग का एक प्रमाण किया गया था (चित्र 7)। परिणाम सिलिकॉन कम्पार्टमेंटल उपकरणों6,13,14के बराबर थे .
चित्र 1: पूर्व इकट्ठे सीओसी, बहु-कंपार्टमेंट माइक्रोफ्लूइडिक चिप। (ए) चिप का एक ड्राइंग जो ऊपरी और निचले कुओं की पहचान करता है। थे साइज ऑफ़ थे चिप इस 75 मम x 25 मम, थे साइज ऑफ़ स्टैण्डर्ड माइक्रोस्कोप स्लाइड्स. (बी) चैनलों को अलग करने वाले चैनलों और माइक्रोग्रोवों को दर्शाने वाले क्षेत्र में तेजी से बढ़ी। अतिरिक्त विवरण Nagendran एट अल12में प्रदान की जाती हैं. (ग) यह तस्वीर प्रत्येक डिब्बे में अलग-अलग माइक्रोएन्यूएशन के निर्माण को खाद्य रंग डाई का उपयोग करके दिखाती है। यह संपूर्ण आंकड़ा 12से पुनरुत्पादित किया गया है . कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: प्लास्टिक commentalized चिप कोटिंग और एनएससी सेल चढ़ाना समय रेखा। (ए) प्लास्टिक बहु-कम्पार्टमेंट चिप्स को पूर्व-कोटिंग समाधान के साथ लेपित किया गया था, और फिर एनएससी मीडिया के साथ प्री-कंडीशनिंग से पहले पॉली-एल-ऑर्निथिन और लेमिनिन। (बी) एनएससी को चिप के कायिक कम्पार्टमेंट में 7 x 104 कोशिकाओं के साथ चढ़ाया गया था। कोशिकाओं 24 एच के लिए एनएससी मीडिया में बड़े हो रहे थे और फिर मीडिया तंत्रिका भेदभाव मीडिया के साथ बदल दिया गया था. विभेद के बाद 7-10 दिनों तक विभेदित न्यूरॉन्स को देखा गया। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3: चिप्स और PDMS उपकरणों में एचएससी-न्यूरॉन वृद्धि की तुलना। (क) प्लास्टिक बहु-संपार्टमेंट चिप में विभेदन के 13 दिनों के बाद एचएससी-न्यूरॉन्स की एक चरण विपरीत छवि। (ख) एचएससी-न्यूरॉन्स के क्षेत्र में बढ़ी हुई (ए) में सफेद बॉक्स के भीतर सुसंस्कृत और एक पीडीएमएस डिवाइस (दाएं) के भीतर एक समकक्ष क्षेत्र. चिप्स के भीतर एचएससी-न्यूरॉन्स अच्छी तरह से देते हैं। पीडीएमएस-आधारित उपकरणों में एकत्रित न्यूरॉन क्लस्टर फार्म। 2 स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र ाााला: मानव एनएससी व्युत्पन्न न्यूरॉन्स डेन्ड्रिटिक स्पाइन आकारिकी दर्शाते हैं। रेट्रोग्रेड भेदभाव दिन में mCherry न्यूरॉन लेबल 33 चिप के भीतर हो. बढ़ाया क्षेत्र लाल रंग में उल्लिखित, डेन्ड्रिटिक रीढ़ की उपस्थिति पर प्रकाश डाला गया है, जो परिपक्व ग्लूटामेटर्जिक synapses के विकास का समर्थन सबूत प्रदान करते हैं. लाल तीर डेन्ड्रिटिक रीढ़ की ओर इशारा करते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 5: मानव एनएससी व्युत्पन्न न्यूरॉन्स चिप्स के भीतर सुसंस्कृत उत्तेजक synapses प्रदर्शन. 26 दिन में इम्युनोस्टेनिंग किया गया था। न्यूरोन इमेजिंग कायिक डिब्बे में किया गया था. A) vGlut1 (हरा) और(B) DAPI (नीला) इम्यूनोलेबलिंग। (सी) मेरैड रेबीज वायरस का उपयोग करके चिह्नित मचेरी लेबल वाले न्यूरॉन्स (लाल) प्रतिगामी। (घ) (ए -सी) का विलयित फ्लोरोसेंट माइक्रोग्राफ । (ई) डेन्ड्रिटिक रीढ़ और vGlut1 सकारात्मक puncta mchery-सकारात्मक dendrites के साथ colocalized, से क्षेत्र में एक बढ़ी हुई में दिखाया गया है (डी) (F ) न्यूरॉन विशिष्टमार्कर के इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोग्राफ्स, जेड-ट्युबुलिन III (मैजेंटा), और (जी) vGlut1 (हरा)। (एच) जेड-टुबुलिन III, और vGlut1 के ओवरले। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 6: Virally transduced mCherry न्यूरॉन्स एक एक्सॉन स्थानीयकृत microenvironment preassembled सीओसी चिप के भीतर स्थापित में अनुमानों का विस्तार. (ए) मचेरी लेबल न्यूरॉन चिप के microgrooves के माध्यम से और एक अलग एक्सॉन डिब्बे में axons का विस्तार. एक्सॉन डिब्बे के अलगाव एलेक्सा फ्लोर 488 हाइड्राज़ाइड का उपयोग कर कल्पना की है। संशोधित रेबीज वायरस के संक्रमण के बाद 26 और 3 दिनों के बाद विभेदकेशन दिन में न्यूरॉन्स की इमेजिंग हुई। (ठ) में फ्लोरोसेंट छवि (ए) डीआईसी छवि के साथ विलय कर दी जाती है। माइक्रोग्रोव के स्थान को नोट की जा सकता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 7: Axotomy सीओसी multicompartment चिप के भीतर प्रदर्शन किया. (ए) एम चेरी को विभेदकेदिन 33 में न्यूरॉन्स के रूप में लेबल किया गया था, जो एक्सोटोमी से पहले लगाया गया था। 'आग' रंग देखो टेबल. (बी) एक्सोटोमी के तुरंत बाद, यह दर्शाता है कि एक्सॉन पूरी तरह से टूट जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
| प्लास्टिक बहु-कंपार्टमेंट चिप्स | पीडीएमएस बहु-पार्टपार्टमेंट डिवाइस |
| वियुक् त अक्ष | वियुक् त अक्ष |
| सूक्ष्म पर्यावरण स्थापित करना | सूक्ष्म पर्यावरण स्थापित करना |
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| प्रकाशत: पारदर्शी | प्रकाशत: पारदर्शी |
| उच्च संकल्प इमेजिंग के साथ संगत | उच्च संकल्प इमेजिंग के साथ संगत |
| फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के साथ संगत | फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के साथ संगत |
| पूर्णरूप | सब्सट्रेट करने के लिए विधानसभा आवश्यक |
| स्वस्थ एक्सॉन्स और 21 दिन | स्वस्थ एक्सॉन्स और 14 दिन |
| जलरागी संपोषण पृष् ठ | जलविरागी |
| गैस अपारगम्य | गैस पारगम्य |
| गोल माइक्रोग्रोव और चैनल | ऋजु सूक्ष्मनाली |
| लेजर ablation के साथ संगत नहीं | जब PDMS कक्षों विशेष लेजर ablation संगत स्लाइड पर इकट्ठे होते हैं लेजर ablation के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। |
| शीर्ष को निकालने के लिए डिवाइस को बदला नहीं जा सकता | शीर्ष microgrooves के भीतर धुंधला के लिए हटाने योग्य है |
| खनिज तेल आधारित विसर्जन तेलों के साथ संगत नहीं (सिलिकॉन आधारित तेलों ठीक कर रहे हैं) | खनिज तेल आधारित विसर्जन तेलों के साथ संगत |
| छोटे अणुओं और कार्बनिक सॉल्वैंट्स के लिए अपारगम्य | छोटे अणुओं और कार्बनिक सॉल्वैंट्स का अवशोषण |
| चिप के साथ कोई रिसाव समस्याओं | पॉली-एल-ऑर्निथिन और लेमिनिन के साथ कोटिंग उपकरणों लीक कर |
| विभेदित न्यूरॉन्स समान रूप से वितरित रहते हैं (gt; 4 सप्ताह) परीक्षण सेल घनत्व पर | विभेदित न्यूरॉन्स परीक्षण सेल घनत्व पर संस्कृति में 3-4 दिनों के बाद कुल करने के लिए शुरू |
तालिका 1: न्यूरॉन्स culturing के लिए बहु-कंपार्टमेंट सीओसी चिप्स और सिलिकॉन उपकरणों की तुलना
Discussion
preassembled बहु-कम्पार्टमेंट सीओसी चिप एक आसान करने के लिए उपयोग commentalized मंच अंतर और लंबी अवधि के लिए न्यूरॉन्स में मानव NSCs बनाए रखने के लिए है (gt; 4 सप्ताह). इस प्रोटोकॉल में, हम glutamatergic न्यूरॉन्स में मानव NSCs के भेदभाव का प्रदर्शन, प्रतिगामी लेबल न्यूरॉन्स, इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री प्रदर्शन, डेन्ड्रिटिक रीढ़ आकृति विज्ञान कल्पना और एक्सोटोमी प्रदर्शन. इन चिप्स उच्च संकल्प इमेजिंग के साथ संगत कर रहे हैं और वहाँ सीओसी12के साथ कोई autofluorence है.
सीओसी बहु-कम्पार्टमेंट चिप्स कार्यात्मक सिलिकॉन आधारित कम्पार्टमेंटल उपकरणों के बराबर हैं, और लाभ और कमियां हैं जैसा कि पहले12वर्णित है। तालिका 1 एचएससी-न्यूरॉन्स को गढ़ने के लिए बहु-कंपार्टमेंट सीओसी चिप्स और सिलिकॉन उपकरणों की तुलना करता है। सीओसी commentalized चिप्स लगाव और एक लंबी संस्कृति अवधि में स्टेम कोशिकाओं के रखरखाव के लिए एक बेहतर हाइड्रोफिलिक सतह प्रदान करते हैं. पीडीएमएस-आधारित उपकरणों को इकट्ठा करने और कांच के कवरलिप्स से जुड़े होने की आवश्यकता है। PDMS उपकरणों की हाइड्रोफोबिक प्रकृति स्टेम कोशिकाओं के एकत्रीकरण का कारण बनताहै 5; यह सेलुलर स्तर पर इमेजिंग में दोनों चुनौतियों और मीडिया में परिवर्तन के दौरान सेल समुच्चय के आंदोलन के कारण शारीरिक क्षति के लिए अधिक से अधिक संवेदनशीलता की ओर जाता है. प्लास्टिक चिप इन चुनौतियों पर काबू पा लिया. सीओसी PDMS के विपरीत गैस अपारगम्य है, तो हवा जेब फंस या चैनलों के भीतर गठित उपयोगकर्ता द्वारा हटाया जाना चाहिए. पूर्व-कोटिंग समाधान चैनलों में फंस जाने के लिए हवा की संभावना को कम कर देता है। इस विलयन में एथेनोल और अन्य एजेंट होते हैं। इन प्लास्टिक चिप्स के भीतर murine न्यूरॉन्स culturing के लिए एक पहले से प्रकाशित प्रोटोकॉल चिप्स12के भीतर pipeting कोशिकाओं और मीडिया के बारे में अतिरिक्त विवरण प्रदान करता है . NSCs अधिक नाजुक है कि murine न्यूरॉन्स रहे हैं, तो और अधिक धीरे से संभाला जाना चाहिए. यह भी धीरे उन्हें ऊपर और नीचे pipeting द्वारा चढ़ाना से पहले अच्छी तरह से स्टेम कोशिकाओं मिश्रण करने के लिए महत्वपूर्ण है।
इन विट्रो विभेदित मानव स्टेम कोशिकाओं से व्युत्पन्न न्यूरॉन्स का उपयोग चिकित्सा और अनुसंधान में तेजी से लोकप्रिय होता जा रहा है. इन न्यूरॉन्स अनुसंधान और कई सीएनएस विकारों के लिए नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण हैं, neurodegenerative रोगों और दर्दनाक मस्तिष्क चोटों सहित. ये न्यूरॉन्स मानव भ्रूण न्यूरॉन्स के समान15. भविष्य में, उचित आयु वर्ग न्यूरॉन्स स्टेम कोशिकाओं से उत्पन्न किया जा सकता है उम्र से संबंधित न्यूरॉन समारोह की नकल और इन commentalized उपकरणों के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया. इन उपकरणों से एक्सॉन स्वास्थ्य को प्रभावित करने वाले रोगों में अनुसंधान की सुविधा होगी और ऑटिज्म स्पेक्ट्रम विकारों से पीड़ित रोगियों के न्यूरॉन्स में एक्सॉन की कमी जैसे कार्य 16,17.
Disclosures
एस.पी. और टी.एन. वी.पी. Xona Microfluidics, LLC के एक कर्मचारी है. J.H. Xona Microfluidics, LLC के एक सदस्य है. ए.एम.टी. माइक्रोफ्लूइडिक चैम्बर/चिप (यूएस 7419822 बी 2, ईपीओ 2719756 बी 1) का आविष्कारक है और Xona Microfluidics, LLC का एक सदस्य है।
Acknowledgments
लेखकXona Microfluidics, LLC, राष्ट्रीय मानसिक स्वास्थ्य संस्थान (R42 MH097377) से समर्थन स्वीकार करते हैं, और न्यूरोलॉजिकल विकार और स्ट्रोक के राष्ट्रीय संस्थान (R41 NS108895, P30 NS045892). सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करता है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor hydrazide 488 | ThermoFisher Scientific | A10436 | |
| Alexa Fluor secondary antibodies | ThermoFisher Scientific | 1:1000 | |
| anti_beta-tubulin III | Aves | TUJ | 1:1000 |
| anti-vGAT antibody | Synaptic Systems | 131 003 | 1:1000 |
| anti-vGlut1 antibody | NeuroMab | 75-066 | clone N28/9, 1:100 |
| complete neural stem cell media: | |||
| REC HU EGF 10 UG BIOSOURCE (TM) |
ThermoFisher Scientific | PHG0314 | 20ng/mL |
| REC HU FGF BASIC 10 UG BIOSOURCE (TM) |
ThermoFisher Scientific | PHG0024 | 20ng/mL |
| GlutaMAX Supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 35050061 | 2mM |
| KnockOut DMEM/F-12 | ThermoFisher Scientific | 12660012 | |
| StemPro Neural Supplement | ThermoFisher Scientific | A1050801 | 2% |
| Epifluorescence imaging system | EVOS Fluorescence imaging system | AMF4300 | 10x objective |
| fluorinated ethylene propylene film | American Durafilm | 50A | 0.5 mil thickness |
| Fluoromount G | ThermoFisher Scientific | 00-4958-02 | |
| Gibco DPBS without Calcium and Magnesium | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| GIBCO HUMAN NSC (H9) KIT COMBO KIT |
Gibco | N7800200 | |
| Gibco Laminin | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
| Glass Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich | CLS7095D5X SIGMA | 5.75 in length |
| H9-DERIVED HU NEURAL STEM CELL 1E6 CELLS/VIAL; 1 ML |
ThermoFisher Scientific | 510088 | |
| hibernate-E Medium | ThermoFisher Scientific | A1247601 | |
| Incubator, 5% CO2 37 °C | |||
| Laser scanning confocal imaging system | Olympus | FV3000RS | 30x silicone oil objective |
| modified rabies virus | Salk Institute for Biological Studies | G-deleted Rabies-eGFP | Material Transfer Agreement required |
| Mr. Frosty | ThermoFisher Scientific | 5100-0001 | |
| Neural differentiation media | Per 100 mL. | ||
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermoFisher Scientific | 15240112 | 1mL (100X) |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich | A8960 | 200mM |
| BDNF | ThermoFisher Scientific | PHC7074 | 40 ng/mL |
| Gibco B27 Plus Supplement (50X) | FisherScientific | A3582801 | 2mL (50X) |
| Gibco CultureOne Supplement (100X) | FisherScientific | A3320201 | 1mL (100X) |
| Gibco Neurobasal Plus Medium | FisherScientific | A3582901 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | ThermoFisher Scientific | A1110501 | |
| Taylor Wharton Liquid N2 dewar | FisherScientific | 20HCB11M | |
| triton X-100 | ThermoFisher Scientific | 28314 | |
| XC pre-coat | Xona Microfluidics, LLC | XC Pre-Coat | included with XonaChips |
| XonaChip | Xona Microfluidics, LLC | XC450 | 450 µm length microgroove barrier |
| Humidifier Tray | Xona Microfluidics, LLC | humidifier tray |
References
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