Summary
Denne protokol demonstrerer brugen af opdelte mikrofluidiske chips, injektion støbt i en cyklisk olefin copolymer til dyrkede neuroner differentieret fra humane stamceller. Disse chips er færdigmonterede og lettere at bruge end traditionelle opdelte poly (dimethylsiloxan) enheder. Flere almindeligt eksperimentelle paradigmer er beskrevet her, herunder viral mærkning, Fluidic isolation, axotomi, og immun farvning.
Abstract
Brug af mikrofluidisk-enheder til at opdele kulturperler er blevet en standardmetode i neurovidenskab. Denne protokol viser, hvordan man bruger en pre-monteret multi-rum chip lavet i en cyklisk olefin copolymer (COC) til at opdele neuroner differentieret fra humane stamceller. Fodaftryk af disse COC chips er de samme som en standard mikroskop slide og er lige kompatible med høj opløsning mikroskopi. Neuroner er differentieret fra humane neurale stamceller (NSCs) i glutamaterge neuroner i chippen og vedligeholdes i 5 uger, hvilket giver tilstrækkelig tid til disse neuroner til at udvikle synapser og dendritiske spines. Yderligere, vi demonstrere flere fælles eksperimentelle procedurer ved hjælp af disse multi-rum chips, herunder viral mærkning, etablering af mikromiljøer, axotomi, og immunocytochemistry.
Introduction
Humane stamceller differentierede neuroner (hSC-neuroner) anvendes i stigende grad til biologisk forskning. Disse neuroner, som kan være afledt af menneskelige kildemateriale, er af stor interesse for Translationel forskning, herunder studiet af traumatiske hjerneskader og neurodegenerative lidelser såsom Alzheimers sygdom. Der er således behov for værktøjer til at forbedre og lette studiet af hSC-neuroner.
For at studere den unikke polariserede morfologi af neuroner, mange forskere bruger multi-opdelte mikrofluidisk enheder1,2,3,4,5,6, 7,8,9,10,11. Disse enheder muliggør målinger og manipulationer af lang projektion neuroner med unik subcellulære adgang. Multi-opdelte mikrofluidisk enheder består af to parallelle mikrofluidisk rum adskilt af microgrooves, som fører axonal vækst. Neuroner eller neurale stamceller (NSCs) er belagt i det somatodendritiske rum, og derefter holde sig til bunden af rummets overflade efter minutter. Differentierede neuroner vokser og udvider deres axoner/projektioner gennem mikrogroove-regionen til et tilstødende og isoleret axonal rum. I fortiden, disse anordninger blev udelukkende lavet ved hjælp af poly (dimethylsiloxan) (PDMS) replika Molding. PDMS-enheder har mange ulemper, der tidligere er beskrevet12, herunder vedvarende hydrofobicitet og behovet for at samle til en glas dækseddel umiddelbart før brug. Færdigmonterede sprøjtestøbte chips overvinde mange af disse ulemper og sælges kommercielt (Se tabel over materialer)12. Rummene af disse chips er permanent fremstillet hydrofile og hele chippen er indsprøjtning støbt i optisk transparent cyklisk olefin copolymer (COC).
Denne protokol demonstrerer, hvordan man bruger denne COC chip til at differentiere humane NSCs i excitatoriske neuroner, og til at adskille og fluidically isolere deres lange neuronal projektioner. Til denne demonstration blev neuroner differentieret fra NIH-godkendte H9 stamceller. Lignende procedurer kan anvendes til at differentiere menneskeskabte pluripotente stamceller.
Protocol
Bemærk: figur 1a, B viser en skematisk af den præ-monterede COC chip, herunder placeringen af de vigtigste kanaler eller rum, brønde, og microgrooves. Den opdelte chip kan etablere særskilte Fluidic mikromiljøer inden for et rum som demonstrere ved isolering af fødevarer farvestof (figur 1c). Protokollen til klargøring af den forudmonterede multi-rum chip er givet i Nagendran et al., afsnit 112.
1. belægning af chips til flere rum til hSC-neuroner
Bemærk: figur 2a viser en oversigt over belægnings procedurerne.
- Poly-L-ornidin opløses i cellekultur-grade destilleret vand for at fremstille 600 μL opløsning pr. chip af en 20 μg/mL arbejdsopløsning.
- Aspirer de resterende PBS tilbage efter tilberedning af chips fra brøndene. Sørg for, at pipet spidsen er væk fra kanalåbningen, når du aspirerer.
Bemærk: de mikrofluidiske kanaler skal forblive fyldte i hele denne procedure. Du må ikke aspirere væske fra kanalerne/rummene, kun brøndene. - Indlæs 150 μL poly-L-ornithin-arbejdsopløsning i øverste højre brønd. Vent til 90 s eller indtil væsken begynder at fylde den nederste højre brønd. Tilsæt 150 μL medier til den nederste højre brønd og vent i 5 minutter for at lade væsken passere gennem mikrorillerne.
- Tilsæt 150 μL af mediet til øverste venstre brønd. Vent 90 s, og tilsæt derefter 150 μL til den nederste venstre brønd. Pak chippen (-erne) med parafilm, og Placer den natten over ved 4 °C.
Bemærk: Alternativt kan du anbringe chippen og holderen ved 37 °C i 1 time. - Aspirer medierne fra brøndene, hvilket sikrer, at pipet spidsen er placeret væk fra kanalen åbning. Tilsæt 150 μL sterilt vand til den øverste højre brønd. Vent 90 s, og tilsæt derefter 150 μL til den nederste højre brønd. Vent i 5 minutter for at lade væsken passere gennem mikrorillerne.
- Tilsæt 150 μL sterilt vand til øverste venstre brønd, vent 90 s og tilsæt derefter yderligere 150 μL til den nederste venstre brønd.
- Gentag trin 1.5-1.6.
- Tø laminer langsomt ved 2 °C til 8 °C, og Forbered en 10 μg/mL arbejdsopløsning.
- Læg 150 μL af Laminin arbejdsopløsningen på den øverste højre brønd. Vent til 90 s eller indtil væsken begynder at fylde den nederste højre brønd. Pipet 150 μL til den nederste højre brønd. Vent i 5 minutter for at lade Laminin gå gennem mikrorillerne.
- Tilsæt 150 μL Laminin til øverste venstre brønd. Vent 90 s, og tilsæt derefter 150 μL til den nederste venstre brønd. Spånen i holderen i 2 timer ved 37 °C.
- Skyl chippen med PBS (uden ca2 + og mg2 +). Læg 150 μL PBS i øverste højre brønd. Vent til 90 s eller indtil væsken begynder at fylde den nederste højre brønd. Tilsæt 150 μL PBS til den nederste højre brønd og vent i 5 minutter for at lade PBS gå gennem mikrorillerne.
- Pipet 150 μL PBS til øverste venstre brønd. Efter 90 s pipet 150 μL til nederste venstre brønd.
- Aspirer PBS fra chippen, og skyl derefter chippen med NSC-medier (Se tabel over materialer). Indlæs 150 μL af mediet i øverste højre brønd. Efter 90 s, eller når væsken passerer gennem den højre kanal ind i nederste højre brønd, tilsættes 150 μL til nederste højre brønd. Vent i 5 minutter for at lade mediet flyde gennem mikrorillerne.
- Tilsæt 150 μL af mediet til øverste venstre brønd og en anden 150 μL til nederste venstre brønd. Spåningen af chippen i en 37 °C-inkubator med 5% CO2 for at pre-condition chippen, indtil den er klar til at lægge nscs.
Bemærk: chips kan forudkonditioneret natten over, hvis det er nødvendigt.
2. såning af NSCs i multirum-chippen
Bemærk: denne protokol brugt kommercielt købte NSCs, i modsætning til vores tidligere publikation, som begyndte med humane embryonale stængler celler5. I denne protokol er neurale stamceller belagt direkte ind i plastik spåner, hvor de skelner til neuroner. Cellerne kan få lov til at formere sig som NSCs (uden differentiering) i op til 2 passager og opbevares i hætteglas i flydende N2 til videre anvendelse. Denne protokol bruger NSC-hætteglas opbevaret i flydende N2 efter passage 1 eller 2. Figur 2b viser en oversigt over belægnings procedurerne.
- Tø NSCs i henhold til producentens anvisninger.
Bemærk: denne procedure gælder for H9-afledte NSCs. Andre cellelinjer vil kræve celletæthed optimering. - Tæl celle koncentrationen ved hjælp af et hemocytometer og Juster ved hjælp af NSC-medier for at få en koncentration på 7 x 106 celler pr. ml.
- Aspirere medier fra hver brønd af chippen. Undgå at aspirere medier fra hovedkanalerne.
- Pipet 5 μL af celle opløsningen til den øverste højre brønd, efterfulgt af 5 μL til nederste højre brønd (70.000 celler i alt). Sørg for, at cellerne pipetteres mod de vigtigste kanal åbninger. Brug et mikroskop til at kontrollere, at cellerne har indtastet kanalen. Vent 5 min for celler til at holde sig til bunden af chippen.
Bemærk: enten eller begge rum kan bruges til at indlæse celler. - Pipet ~ 150 μL NSC-medier til det øverste højre godt og derefter 150 μL til den nederste højre brønd. Gentag i venstre side. Der inkubates ved 5% CO2, 37 °c i en egnet befuret beholder.
- Efter 48 timer, aspirere NSC medier fra brøndene og erstatte med neurale differentiering medier ved at tilføje 150 μL til hver top godt og hver bund godt.
- Kultur neuroner inden for en 5% CO2, 37 °c inkubator i en egnet befuret beholder.
Bemærk: medierne skal udskiftes hver 2-3 dage. På grund af de små mængder, der anvendes i chippen, kan fordampning selv inden for en befuret inkubator i væsentlig grad påvirke cellernes levedygtighed. Brug en passende sekundær beholder til at give ekstra fugtighed til langsigtet kultur af celler med chippen (Se tabel over materialer).
3. viral fluorescerende mærkning af hSC-neuroner i chippen
Bemærk: flere virus kan bruges til at mærke neuroner i chippen. Instruktionerne nedenfor beskriver brugen af G-Deleted rabies-mCherry eller-eGFP virus. Potentielt infektiøse materialer skal håndteres i henhold til gældende regler og bestemmelser og kan kræve yderligere uddannelse og institutionel godkendelse.
- Varm ~ 400 μL frisk neurale differentierings medie pr. chip til 37 °C.
- Fjern 50 μL af mediet fra en brønd af Axon-rummet til et centrifugeglas, og tilsæt derefter 100.000 virale enheder af modificeret rabiesvirus til røret.
Bemærk: Smid brugte pipet-spidser og centrifugeglas, der indeholder virus, korrekt. - Fjern det resterende neurale differentierings medie fra det axonale rum, og Placer det i et centrifugeglas. Opbevares ved 37 °C.
Bemærk: Sørg for, at kanalerne forbliver fyldt med væske. - Bland 50 μL virus opløsningen med 150 μL varmet medie. Pipet 100 μL til en brønd i Axon-rummet og 100 μL til det andet Axon-rum. Inkubér i 2 timer inden for en 37 °C-inkubator.
Bemærk: forskellen i volumener mellem de axonale og somatiske rum hjælper med at sikre, at virusset forbliver i det axonal rum under infektion/inkubationstider. - Udtag og bortskaf virus indeholdende medier.
Forsigtig: Fjern ikke væsken i de medfølgende mikrofluidiske kanaler. - Pipet forsigtigt 75 μL friske medier til et Axon-rum godt og lad mediet flyde gennem kanalen til andre Axon brønd.
- Fjern mediet fra Axon-rummet, og kassér det korrekt.
- Gentag trin 3,6 og 3,7.
- Fyld Axon-rummet med det gemte medie. Pipet en ekstra 50 μL friske medier, hvis det er nødvendigt, og derefter returnere chippen til inkubator. Denne ekstra friske medier er at tælle mod tab af medier under væske overførsel og fordampning under processen.
Bemærk: synlig fluorescerende mærkning ved hjælp af disse modificerede rabiesvirus opstår ved 48 h og op til 8 dage efter som celledød af inficerede neuroner generelt opstår på grund af virus toksicitet. Neuron Imaging kan udføres som med andre standard kultur platforme (f. eks. glasbund retter), men særlig overvejelse er nødvendig for at opretholde tilstrækkelig fugtighed til at forhindre fordampningstabet.
4. Fluidic isolation, axotomi og immun farvning i chippen
- Følg Fluidic isolation, axotomi og immun farvning med chippen som beskrevet i Nagendran et al.12.
Representative Results
Efter en uge (7-10 dage) i chippen med differentierings medier, differentieres NSCs i neuroner og neuronal projektioner ind i det axonal rum (figur 3). I chippen fastgøres og fordeles neuronerne jævnt i det somatiske rum. I sammenligning, neuroner i PDMS enheder clump/aggregat så tidligt som 5 dage efter tilsætning af differentiering medier, fører til kompromitteret celle sundhed som kan ses i figur 3b (dag 13 forstørret billede). Neuroner i chips ser sundt med bundtede axons. Sunde neuroner kan opretholdes inden for chips for 4-5 uger.
For at visualisere neuron modning og dendritiske rygsøjle udvikling, blev modificeret rabiesvirus leveret til axonal rummet på dag 29 til tilbage label neuroner, herunder dendritiske spines, med mcherry fluorescerende protein. Fire dage efter rabiesvirus infektion, neuroner udvide axoner i axonal rum udtrykt mCherry. Neuronerne på differentierings dagen 33 viste dannelsen af dendritiske Spiner (figur 4). Visualisering af dendritiske Spiner viser, at NSC afledte neuroner differentieret inden for chips form modne synapser.
Multi-rum chip er også kompatibel med immuncytokemi at visualisere cellulære lokalisering af protein. Efter 26 dage med at vedligeholde neuroner i differentiering medier, neuroner blev mærket for excitatoriske synaptisk markør, vGlut1 (figur 5). Disse resultater viser, at viralt mærkede neuroner Co-Localize med vGlut1 (figur 5e) og neuron specifik markør, β-TUBULIN III (figur 5F-H).
Evnen til at skabe særskilte mikromiljøer isoleret til axoner blev også demonstreret ved hjælp af Alexa fluor 488 hydrazid, et fluorescerende lavmolekylært farvestof (figur 6).
Axon skades undersøgelser udføres almindeligvis inden for opdelte enheder. Et proof of princip eksperiment blev udført for selektivt at skade axoner af differentierede neuroner med den præ-monterede COC chip (figur 7). Resultaterne svarede til silikone opdelte enheder6,13,14.
Figur 1: den præ-monterede COC, multirum mikrofluidisk chip. A) en tegning af chippen, der identificerer de øvre og nedre brønde. Størrelsen af chippen er 75 mm x 25 mm, størrelsen af standard mikroskop slides. B) en zoomet ind i en region, der viser kanalerne og mikrorillerne, der adskiller kanalerne. Yderligere oplysninger findes i Nagendran et al.12. (C) Dette fotografi illustrerer skabelsen af isolerede mikromiljøer inden for hvert rum ved hjælp af mad farvestof. Hele dette tal er blevet gengivet fra 12. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: plast opdelte spån belægning og NSC celle plating tidslinje. (A) plastic multirum chips blev belagt med en pre-coating opløsning, og derefter poly-L-ornithine og Laminin før konditionering med NSC medier. B) nscs blev belagt med 7 x 104 celler i det somatiske rum i chippen. Cellerne blev dyrket i NSC medier for 24 h og derefter medierne blev erstattet med neurale differentiering medier. Differentierede neuroner blev observeret af 7-10 dage efter differentiering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: hSC-neuron-vækst sammenligning i chips og PDMS-enheder. A) et fasekontrast billede af hSC-neuroner, der dyrkes 13 dage efter differentieringen i plastik multirum-chippen. B) en zoomet ind i regionen hSC-neuroner, der dyrkes inden for den hvide boks i (A) og en tilsvarende region i en PDMS-enhed (højre). hSC-neuroner i chips vedhæfte godt. Aggregerede neuron klynger form i PDMS-baserede enheder. Repræsentant for 2 uafhængige eksperimenter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: humane NSC afledte neuroner viser dendritiske rygsøjle morfologi. Retrograde mærket mCherry neuron på differentiering dag 33 dyrkes i chippen. Den forstørrede region skitseret i rødt, fremhæver tilstedeværelsen af dendritiske spines, som giver dokumentation, der støtter udviklingen af modne glutamaterge synapser. Røde pile peger mod dendritiske spines. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: humane NSC afledte neuroner kultiveret i chips udviser excitatoriske synapser. Immun farvning blev udført på differentierings dagen 26. Neuron Imaging blev udført i det somatiske rum. A) vGlut1 (grøn) og (B) dapi (blå) immunolabeling. (C) mcherry-mærkede neuroner (rød) tilbage mærket ved hjælp af en modificeret rabiesvirus. D) en fusioneret fluorescerende Mikrograf af (A-C). E) dendritiske Spiner og vGlut1 positiv punkta, der er colokaliseret med mcherry-positive dendritter, vist i et zoomet i område fra (D). Immunofluorescenmikrografer af (F) neuron-specifik markør, β-TUBULIN III (magenta) og (G) vGlut1 (grøn). H) overlejring af β-TUBULIN III og vGlut1. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: viralt transducerede mcherry neuroner udvider projektioner til et Axon lokaliseret mikromiljø etableret i den præmonterede COC-chip. (A) mcherry mærket neuron udvider axoner gennem mikrorillerne i chippen og ind i et isoleret Axon-rum. Isolering af Axon-rummet visualiseres ved hjælp af Alexa fluor 488 hydrazid. Imaging af neuroner forekom ved differentiering dag 26 og 3 dage efter infektion med den modificerede rabiesvirus. B) Fluorescens billedet i (A) FUSIONERES med et dic-billede. Bemærk placeringen af mikrorillerne. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Axotomi udført inden for COC multirum chip. (A) mcherry mærket neuroner på differentierings dagen 33 blev afbildet før axotomi. ' Brand ' farve look-up bord. B) umiddelbart efter axotomi, der viser, at axoner er fuldstændig afskåret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Plast multi-rum chips | PDMS multi-rum enheder |
| Isoler axoner | Isoler axoner |
| oprettelse af mikromiljøer | oprettelse af mikromiljøer |
| axotomize neuroner | axotomize neuroner |
| optisk transparent | optisk transparent |
| kompatibel med billedbehandling i høj opløsning | kompatibel med billedbehandling i høj opløsning |
| kompatibel med Fluorescens mikroskopi | kompatibel med Fluorescens mikroskopi |
| fuldt samlet | montering til substrat påkrævet |
| sunde axoner > 21 dage | sunde axoner > 14 dage |
| hydrofile dyrkning overflade | Hydrofobe |
| gas uigennemtrængelig | gas gennemtrængelig |
| afrundede mikroriller og kanaler | lige mikroriller |
| ikke kompatibel med laser ablation | Kan bruges til laser ablation, når PDMS kamre er samlet på særlige laser ablation kompatible slides. |
| enheden kan ikke ændres til at fjerne top | toppen er aftagelig til farvning i mikroriller |
| ikke kompatibel med mineralolie-baserede nedsænknings olier (silikone-baserede olier er fine) | kompatibel med mineraloliebaserede nedsænknings olier |
| uigennemtrængelige for små molekyler og organiske opløsningsmidler | absorption af små molekyler & organiske opløsningsmidler |
| Ingen lækage problemer med chippen | belægning med poly-L-ornithine og Laminin gør enhederne utætte |
| differentierede neuroner forbliver jævnt fordelt (> 4 uger) ved de testede celle tætheer | differentierede neuroner begynder at aggregere efter 3-4 dage i kulturen ved de testede celle tætheer |
Tabel 1: Komparision af multi-rum COC chips og silikone udstyr til dyrkning neuroner
Discussion
Den præmonterede multi-rum COC chip er en nem at bruge opdelte platform til at differentiere og vedligeholde menneskelige NSCs i neuroner for langsigtede (> 4 uger). I denne protokol demonstrerer vi differentieringen af humane nscs i glutamaterge neuroner, tilbage label neuroner, udføre immunocytochemistry, visualisere dendritiske rygsøjle morfologi og udføre axotomi. Disse chips er kompatible med høj opløsning Imaging og der er ingen autofluorescens med COC12.
COC multi-rum chips er funktionelt ækvivalent til silikone-baserede opdelte enheder, og har fordele og ulemper som beskrevet tidligere12. Tabel 1 sammenligner multi-rum COC chips og silikone udstyr til dyrkning hSC-neuroner. COC-opdelte chips giver en bedre hydrofile overflade til fastgørelse og vedligeholdelse af stamceller over en lang kultur periode. PDMS-baserede enheder skal samles og fastgøres til glas dæksedler. Den hydrofobe karakter af PDMS-anordninger forårsager sammenlægning af stamceller5; Dette fører til begge udfordringer i Imaging på cellulært niveau og større modtagelighed for fysisk skade på grund af bevægelsen af celle aggregater under medieændringer. Plastik chippen overvinder disse udfordringer. COC er gas uigennemtrængelig, i modsætning til PDMS, så luftlommer fanget eller dannet i kanalerne skal fjernes af brugeren. Forbelægnings opløsningen mindsker muligheden for, at luften bliver fanget i kanalerne. Denne løsning består af ethanol og andre stoffer. En tidligere offentliggjort protokol til dyrkning af murine neuroner inden for disse plastik chips giver yderligere detaljer om pipette Rings celler og medier i chips12. NSCs er mere skrøbelige, at murine neuroner, så skal håndteres mere forsigtigt. Det er også vigtigt at blande stamcellerne grundigt før plating ved forsigtigt at pipettere dem op og ned.
Brug af neuroner afledt af in vitro-differentierede humane stamceller bliver mere og mere populære inden for medicin og forskning. Disse neuroner er vigtige for forskning og kliniske anvendelser for mange CNS lidelser, herunder neurodegenerative sygdomme og traumatiske hjerneskader. Disse neuroner ligner nøje humane føtal neuroner15. I fremtiden, passende alderen neuroner kunne genereres fra stamceller til efterligne aldersrelaterede neuronal funktion og anvendes i forbindelse med disse opdelte enheder. Disse anordninger vil lette forskning i sygdomme, der påvirker Axon sundhed og funktion såsom Axon underskud i neuroner af patienter diagnosticeret med autisme spektrum lidelser og axonal regenerering efter skade16,17.
Disclosures
S.P. og T.N. erklærer ingen konkurrerende finansielle interesser. VP er ansat hos Xona Microfluidics, LLC. J.H. er medlem af Xona Microfluidics, LLC. A.M.T. er en opfinder af mikrofluidisk kammer/chip (US 7419822 B2, EPO 2719756 B1) og er medlem af xona microfluidics, LLC.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender støtte fra Xona Microfluidics, LLC, National Institute of Mental Health (R42 MH097377), og National Institute of neurologiske lidelser og slagtilfælde (R41 NS108895, P30 NS045892). Indholdet er udelukkende ansvaret for forfatterne og ikke nødvendigvis repræsenterer de officielle synspunkter af de nationale institutter for sundhed.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor hydrazide 488 | ThermoFisher Scientific | A10436 | |
| Alexa Fluor secondary antibodies | ThermoFisher Scientific | 1:1000 | |
| anti_beta-tubulin III | Aves | TUJ | 1:1000 |
| anti-vGAT antibody | Synaptic Systems | 131 003 | 1:1000 |
| anti-vGlut1 antibody | NeuroMab | 75-066 | clone N28/9, 1:100 |
| complete neural stem cell media: | |||
| REC HU EGF 10 UG BIOSOURCE (TM) |
ThermoFisher Scientific | PHG0314 | 20ng/mL |
| REC HU FGF BASIC 10 UG BIOSOURCE (TM) |
ThermoFisher Scientific | PHG0024 | 20ng/mL |
| GlutaMAX Supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 35050061 | 2mM |
| KnockOut DMEM/F-12 | ThermoFisher Scientific | 12660012 | |
| StemPro Neural Supplement | ThermoFisher Scientific | A1050801 | 2% |
| Epifluorescence imaging system | EVOS Fluorescence imaging system | AMF4300 | 10x objective |
| fluorinated ethylene propylene film | American Durafilm | 50A | 0.5 mil thickness |
| Fluoromount G | ThermoFisher Scientific | 00-4958-02 | |
| Gibco DPBS without Calcium and Magnesium | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| GIBCO HUMAN NSC (H9) KIT COMBO KIT |
Gibco | N7800200 | |
| Gibco Laminin | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
| Glass Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich | CLS7095D5X SIGMA | 5.75 in length |
| H9-DERIVED HU NEURAL STEM CELL 1E6 CELLS/VIAL; 1 ML |
ThermoFisher Scientific | 510088 | |
| hibernate-E Medium | ThermoFisher Scientific | A1247601 | |
| Incubator, 5% CO2 37 °C | |||
| Laser scanning confocal imaging system | Olympus | FV3000RS | 30x silicone oil objective |
| modified rabies virus | Salk Institute for Biological Studies | G-deleted Rabies-eGFP | Material Transfer Agreement required |
| Mr. Frosty | ThermoFisher Scientific | 5100-0001 | |
| Neural differentiation media | Per 100 mL. | ||
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermoFisher Scientific | 15240112 | 1mL (100X) |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich | A8960 | 200mM |
| BDNF | ThermoFisher Scientific | PHC7074 | 40 ng/mL |
| Gibco B27 Plus Supplement (50X) | FisherScientific | A3582801 | 2mL (50X) |
| Gibco CultureOne Supplement (100X) | FisherScientific | A3320201 | 1mL (100X) |
| Gibco Neurobasal Plus Medium | FisherScientific | A3582901 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | ThermoFisher Scientific | A1110501 | |
| Taylor Wharton Liquid N2 dewar | FisherScientific | 20HCB11M | |
| triton X-100 | ThermoFisher Scientific | 28314 | |
| XC pre-coat | Xona Microfluidics, LLC | XC Pre-Coat | included with XonaChips |
| XonaChip | Xona Microfluidics, LLC | XC450 | 450 µm length microgroove barrier |
| Humidifier Tray | Xona Microfluidics, LLC | humidifier tray |
References
- Taylor, A. M., Wu, J., Tai, H. C., Schuman, E. M. Axonal translation of beta-catenin regulates synaptic vesicle dynamics. The Journal of Neuroscience. 33 (13), 5584-5589 (2013).
- Virlogeux, A., et al. Reconstituting Corticostriatal Network on-a-Chip Reveals the Contribution of the Presynaptic Compartment to Huntington’s Disease. Cell Reports. 22 (1), 110-122 (2018).
- Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research. The Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
- Pinto, M. J., et al. The proteasome controls presynaptic differentiation through modulation of an on-site pool of polyubiquitinated conjugates. The Journal of Cell Biology. 212 (7), 789-801 (2016).
- Bigler, R. L., Kamande, J. W., Dumitru, R., Niedringhaus, M., Taylor, A. M. Messenger RNAs localized to distal projections of human stem cell derived neurons. Scientific Reports. 7 (1), 611 (2017).
- Nagendran, T., et al. Distal axotomy enhances retrograde presynaptic excitability onto injured pyramidal neurons via trans-synaptic signaling. Nature Communications. 8 (1), 625 (2017).
- Van Laar, V. S., et al. Evidence for compartmentalized axonal mitochondrial biogenesis: Mitochondrial DNA replication increases in distal axons as an early response to Parkinson's disease-relevant stress. The Journal of Neuroscience. , (2018).
- del Río, J. A., Ferrer, I., Gavín, R. Role of cellular prion protein in interneuronal amyloid transmission. Progress in Neurobiology. 165-167, 87-102 (2018).
- Jia, L., et al. MiR-34a Regulates Axonal Growth of Dorsal Root Ganglia Neurons by Targeting FOXP2 and VAT1 in Postnatal and Adult Mouse. Molecular Neurobiology. , (2018).
- Taylor, A. M., Dieterich, D. C., Ito, H. T., Kim, S. A., Schuman, E. M. Microfluidic local perfusion chambers for the visualization and manipulation of synapses. Neuron. 66 (1), 57-68 (2010).
- Menon, S., et al. The E3 Ubiquitin Ligase TRIM9 Is a Filopodia Off Switch Required for Netrin-Dependent Axon Guidance. Developmental cell. 35 (6), 698-712 (2015).
- Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. Use of Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips for Compartmentalizing Primary Murine Neurons. Journal of visualized experiments : JoVE. (141), (2018).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature Methods. 2 (8), 599-605 (2005).
- Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. The Journal of Neuroscience. 29 (15), 4697-4707 (2009).
- Oh, J. H., Jung, C. R., Lee, M. O., Kim, J., Son, M. Y. Comparative analysis of human embryonic stem cellderived neural stem cells as an in vitro human model. International Journal of Molecular Medicine. 41 (2), 783-790 (2018).
- Lazar, M., Miles, L. M., Babb, J. S., Donaldson, J. B. Axonal deficits in young adults with High Functioning Autism and their impact on processing speed. Neuroimage Clinical. 4, 417-425 (2014).
- DePaul, M. A., Lin, C. Y., Silver, J., Lee, Y. S. Combinatory repair strategy to promote axon regeneration and functional recovery after chronic spinal cord injury. Scientific Reports. 7 (1), 9018 (2017).
