Summary
Denne protokollen demonstrerer bruken av compartmentalized mikrovæskebasert chips, injeksjon støpt i en syklisk olefin kopolymer til kultivert neurons differensiert fra menneskelige stamceller. Disse brikkene er forhåndsmonterte og enklere å bruke enn tradisjonelle compartmentalized Poly (dimethylsiloxane) enheter. Flere vanlige eksperimentelle paradigmer er beskrevet her, inkludert viral merking, fluidic isolering, axotomy, og immunostaining.
Abstract
Bruk av mikrovæskebasert enheter til fordeler kultivert neurons har blitt en standard metode i nevrovitenskap. Denne protokollen viser hvordan du bruker en pre-montert multi-kupé chip gjort i en syklisk olefin kopolymer (COC) til fordeler neurons differensiert fra humane stamceller. Fotavtrykket til disse COC-prosessorene er de samme som et standard objektglass, og er like kompatible med mikroskopi med høy oppløsning. Neurons er differensiert fra menneskelige nevrale stamceller (NSCs) inn glutamatergic neurons innenfor chip og vedlikeholdes i 5 uker, slik at tilstrekkelig tid for disse neurons å utvikle synapser og dendrittiske pigger. Videre viser vi flere vanlige eksperimentelle prosedyrer ved hjelp av disse multi-kupé chips, inkludert viral merking, etablering microenvironments, axotomy, og immuncytokjemi.
Introduction
Human stilk cellen differensiert neurons (hSC-neurons) blir stadig mer brukt for biologisk forskning. Disse neurons, som kan utledes fra humant kildemateriale, er av stor interesse for translational forskning, inkludert studiet av traumatiske hjerne skader og nevrodegenerative lidelser som Alzheimers sykdom. Dermed verktøy for å forbedre og tilrettelegge studiet av hSC-neurons er etterspurt.
For å studere den unike polarisert morfologi av neurons, mange forskere bruker multi-compartmentalized mikrovæskebasert enheter1,2,3,4,5,6, 7,8,9,10,11. Disse enhetene muliggjør målinger og manipulasjoner av lange projeksjons neurons med unik subcellulære tilgang. Multi-compartmentalized mikrovæskebasert enheter består av to parallelle mikrovæskebasert rom adskilt av microgrooves, som veileder axonal vekst. Neurons eller nevrale stamceller (NSCs) er belagt i somatodendritic kupé, og deretter holde seg til bunnen av kupé overflaten etter minutter. Differensiert neurons vokse og utvide sine axons/anslag gjennom Mikrokuttspor regionen til en tilstøtende og isolert axonal kupé. I det siste, disse enhetene ble utelukkende laget ved hjelp av Poly (dimethylsiloxane) (PDMS) kopi molding. PDMS enheter har mange ulemper tidligere beskrevet12, inkludert vedvarende hydrofobisiteten og behovet for å montere til et glass dekkglass umiddelbart før bruk. Pre-montert sprøytestøpte chips overvinne mange av disse ulempene og selges kommersielt (se tabell av materialer)12. Seksjonene av disse brikkene er permanent gjort hydrofile og hele brikken er injeksjon støpt i optisk transparent syklisk olefin kopolymer (COC).
Denne protokollen demonstrerer hvordan du bruker denne COC chip å skille menneskelige NSCs inn eksitatoriske neurons, og å skille og fluidically isolere sine lange neuronal anslag. For denne demonstrasjonen var neurons differensiert fra NIH-godkjente H9 stamceller. Lignende prosedyrer kan brukes til å differensiere humant indusert Pluripotent stamceller.
Protocol
Merk: figur 1a, B viser en skjematisk av pre-monterte COC chip, inkludert plasseringen av de viktigste kanaler eller rom, brønner, og microgrooves. Den compartmentalized chip kan etablere distinkte fluidic microenvironments i en kupé som viser ved isolering av mat fargestoff (figur 1C). Protokollen for klargjøring av ferdig montert multi-kupé chip er gitt i Nagendran et al., § 112.
1. coating av multi-kupé chips for hSC-neurons
Merk: figur 2a viser en oversikt over belegg prosedyrene.
- Løs opp Poly-L-Ornithine i cellekultur-grade destillert vann for å lage 600 μL av oppløsning per chip på en 20 μg/mL arbeids løsning.
- Aspirer gjenværende PBS igjen etter å ha tilberedt sjetongene fra brønnene. Når aspirating, må du sørge for at Pipet spissen er borte fra kanalåpningen.
Merk: mikrovæskebasert kanaler må være fylt for helheten av denne prosedyren. Ikke aspirer væske fra kanaler/rom, bare brønnene. - Last 150 μL av Poly-L-Ornithine arbeids løsning i øvre høyre brønn. Vent til 90 s eller til væsken begynner å fylle nedre høyre godt. Tilsett 150 μL av medier i nedre høyre brønn og vent i 5 minutter for å la væsken passere gjennom microgrooves.
- Tilsett 150 μL av medier øverst til venstre godt. Vent 90 s og tilsett deretter 150 μL i nedre venstre brønn. Pakk innehaveren av brikken (e) med parafilm og plasser ved 4 ° c over natten.
Merk: du kan også plassere brikken og holderen ved 37 ° c i 1 time. - Aspirer mediene fra brønnene, slik at Pipet spissen er plassert vekk fra kanalåpningen. Tilsett 150 μL av sterilt vann i øvre høyre brønn. Vent på 90 s og legg deretter til 150 μL i nedre høyre brønn. Vent i 5 minutter for å la væsken passere gjennom microgrooves.
- Tilsett 150 μL av sterilt vann til øvre venstre brønn, vent 90 s og legg deretter til en annen 150 μL til nedre venstre brønn.
- Gjenta trinn 1.5-1.6.
- Tin laminin langsomt ved 2 ° c til 8 ° c og Forbered en arbeids løsning på 10 μg/mL.
- Last 150 μL av laminin arbeids løsning i øvre høyre brønn. Vent til 90 s eller til væsken begynner å fylle nedre høyre godt. Pipet 150 μL til nedre høyre brønn. Vent i 5 minutter for å la laminin gå gjennom microgrooves.
- Tilsett 150 μL av laminin i øvre venstre brønn. Vent 90 s og tilsett deretter 150 μL i nedre venstre brønn. Ruge brikken i holderen for 2 timer ved 37 ° c.
- Skyll brikken med PBS (uten ca2 + og mg2 +). Last 150 μL av PBS til øvre høyre brønn. Vent til 90 s eller til væsken begynner å fylle nedre høyre godt. Legg 150 μL av PBS til nedre høyre godt og vente i 5 min å la PBS gå gjennom microgrooves.
- Pipet 150 μL av PBS til øvre venstre brønn. Etter 90 s Pipet 150 μL til nedre venstre brønn.
- Aspirer PBS fra brikken og deretter skylle chip med NSC Media (se tabell over materialer). Last 150 μL av medier til øvre høyre brønn. Etter 90 s eller når væsken passerer gjennom den høyre kanalen i nedre høyre brønn, tilsett 150 μL til nedre høyre brønn. Vent i 5 minutter for å la mediene strømme gjennom microgrooves.
- Tilsett 150 μL av media til øvre venstre brønn og en annen 150 μL til nedre venstre brønn. Ruge chip i en 37 ° c inkubator med 5% CO2 til pre-condition brikken til klar til å frø NSCs.
Merk: chips kan være pre-conditioned overnatter hvis nødvendig.
2. seeding NSCs i multicompartment chip
Merk: denne protokollen brukes kommersielt kjøpt NSCs, i motsetning til vår forrige publikasjon som begynte med menneskelige embryonale stammer celler5. I denne protokollen nevrale stamceller er belagt direkte inn i plast brikker der de differensiere til neurons. Cellene kan få lov til å spre seg som NSCs (uten differensiering) for opptil 2 passasjer og lagres i hetteglass i flytende N2 for videre bruk. Denne protokollen bruker NSC hetteglass lagret i flytende N2 etter passering 1 eller 2. Figur 2b viser en oversikt over belegg prosedyrene.
- Tin NSCs i henhold til produsentens instruksjoner.
Merk: denne fremgangsmåten gjelder for H9-avledet NSCs. Andre cellelinjer vil kreve optimalisering av celle tetthet. - Tell celle konsentrasjonen ved hjelp av en hemocytometer, og Juster ved hjelp av NSC-mediet for å få en konsentrasjon på 7 x 106 celler per ml.
- Aspirer Media fra hver brønn av chip. Unngå aspirating medier fra de viktigste kanalene.
- Pipet 5 μL av celle løsningen til øvre høyre brønn, etterfulgt av 5 μL til nedre høyre brønn (70 000-celler totalt). Sørg for at cellene er Pipet tert mot de viktigste kanal åpningene. Bruk et mikroskop for å kontrollere at cellene har kommet inn i kanalen. Vent 5 min for at cellene skal holde seg til bunnen av brikken.
Merk: én eller begge rom kan brukes til å laste celler. - Pipet ~ 150 μL av NSC-medier til øvre høyre brønn og deretter 150 μL til nedre høyre brønn. Gjenta på venstre side. Ruge ved 5% CO2, 37 ° c i en egnet fuktet beholder.
- Etter 48 timer, aspirer NSC Media fra brønnene og erstatte med nevrale differensiering Media ved å legge 150 μL til hver topp brønn og hver bunn godt.
- Kultur neurons innen 5% CO2, 37 ° c inkubator i en egnet fuktet container.
Merk: mediene bør skiftes ut hver 2-3 dag. På grunn av de små volumene som brukes i chip, fordampning selv innenfor en fuktet inkubator kan vesentlig påvirke celle levedyktighet. Bruk en egnet sekundær beholder for å gi ekstra fuktighet for lang tids kultur av celler med brikken (se tabell over materialer).
3. viral fluorescerende merking av hSC-neurons innen chip
Merk: flere virus kan brukes til å merke neurons innenfor chip. Instruksjoner neden beskrive bruken av G-fjernet rabiat-mCherry eller – eGFP virus. Potensielt smittsomme materialer må håndteres i henhold til gjeldende regler og forskrifter, og kan kreve ytterligere opplæring og institusjonell godkjenning.
- Varm ~ 400 μL av fersk nevrale differensiering Media per chip til 37 ° c.
- Fjern 50 μL av Media fra en brønn av axon kupé i en sentrifugerør og deretter legge 100 000 viral enheter av modifisert rabies virus til røret.
Merk: Kast brukte Pipet tips og sentrifugerør som inneholder virus, riktig. - Fjern gjenværende nevrale differensiering Media fra axonal kupeen og plasser i en sentrifuge tube. Oppbevares ved 37 ° c.
Merk: Sørg for at kanalene forblir fylt med væske. - Bland 50 μL av virus løsning med 150 μL av varmet medium. Pipet 100 μL til en brønn av axon kupé og 100 μL til den andre axon kupeen godt. Ruge for 2 t innen en 37 ° c inkubator.
Merk: forskjellen i volumer mellom axonal og somatiske rom bidrar til å sikre at viruset forblir i det axonal rommet under infeksjoner/inkubasjons tider. - Ta ut og kast virus som inneholder Media.
FORSIKTIG: ikke Fjern væske i de vedlagte mikrovæskebasert kanalene. - Forsiktig Pipet 75 μL av ferske medier til en axon kupé godt og la Media strømme gjennom kanalen inn i andre axon også.
- Fjern mediet fra axon og kast det på riktig måte.
- Gjenta trinn 3,6 og 3,7.
- Fyll axon rom med det lagrede mediet. Pipet ytterligere 50 μL ferske medier, om nødvendig, og deretter returnere brikken til inkubator. Denne ekstra ferske medier er å telle mot tap av Media under væske overføring og fordampning under prosessen.
Merk: synlig fluorescerende merking ved hjelp av disse modifiserte rabies virus oppstår ved 48 t og opp til 8 dager etter som celle død av infiserte neurons vanligvis oppstår på grunn av virus toksisitet. Nevron Imaging kan utføres som med andre standard kultur plattformer (f. eks glassbunn retter), men spesiell omtanke er nødvendig for å opprettholde tilstrekkelig fuktighet for å hindre fordamping tap.
4. Fluidic isolasjon, axotomy, og immunostaining innenfor chip
- Følg fluidic isolasjon, axotomy og immunostaining med brikken som beskrevet i Nagendran et al.12.
Representative Results
Etter en uke (7-10 dager) i chip med differensiering Media, NSCs differensiere til neurons og neuronal anslag inn axonal kupé (Figur 3). Innenfor chip, neurons feste og fordele jevnt i somatiske kupé. Til sammenligning neurons i PDMS enheter klump/aggregat så tidlig som 5 dager etter tilsetning av differensiering Media, som fører til kompromittert celle helse som kan sees i figuren 3b (dag 13 forstørret bilde). Neurons i chips ser sunt med buntet axons. Sunne neurons kan opprettholdes i sjetonger for 4-5 uker.
For å visualisere Nevron modning og dendrittiske ryggraden utvikling, modifisert rabies viruset ble levert til axonal kupé på dag 29 til retrograd Label neurons, inkludert dendrittiske pigger, med mCherry fluorescerende protein. Fire dager etter rabiat virus infeksjon, neurons utvide axons inn i axonal avlukke uttrykt mCherry. Neurons på differensiering dag 33 viste dannelsen av dendrittiske pigger (Figur 4). Visualisering av dendrittiske pigger viser at NSC avledet neurons differensiert innenfor chips form modne synapser.
Det mange--avlukke flis er likeledes forenlig med immuncytokjemi å visualisere det cellular lokaliseringen av protein. Etter 26 dager med å opprettholde neurons i differensiering Media, neurons ble merket for eksitatoriske Synaptic markør, vGlut1 (figur 5). Disse resultatene viser at virally merket neurons co-lokalisere med vGlut1 (figur 5e) og Nevron bestemt markør, β-tubulin III (figur 5F-H).
Evnen til å skape distinkte microenvironments isolert til axons ble også demonstrert ved hjelp av Alexa fluor 488 hydrazide, en lav molekylvekt fluorescerende fargestoff (figur 6).
Axon skade studier utføres vanligvis i compartmentalized enheter. Et bevis på prinsippet eksperimentet ble utført for å selektivt skade axons av differensiert neurons med pre-monterte COC chip (figur 7). Resultatene var tilsvarende silikon compartmentalized enheter6,13,14.
Figur 1: pre-MONTERTE COC, multicompartment mikrovæskebasert chip. (A) en tegning av brikken identifisere øvre og nedre brønner. Størrelsen på brikken er 75 mm x 25 mm, størrelsen på standard mikroskop lysbilder. (B) et zoomet inn i regionen som viser kanalene og microgrooves som skiller kanalene. Du finner mer informasjon i Nagendran et al.12. (C) dette fotografiet illustrerer etablering av isolerte microenvironments i hvert rom ved hjelp av mat fargestoff. Hele denne figuren har blitt gjengitt fra 12. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Plastic compartmentalized chip belegg og NSC celle plating tidslinje. (A) plast multicompartment chips var belagt med en pre-belegg løsning, og deretter Poly-L-Ornithine og laminin før pre-condition med NSC Media. (B) NSCs ble belagt med 7 x 104 celler i somatiske kupé av brikken. Cellene ble dyrket i NSC Media for 24 h og deretter Media ble erstattet med nevrale differensiering Media. Differensiert neurons ble observert ved 7-10 dager etter differensiering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: hSC-Nevron vekst sammenligning i sjetonger og PDMS enheter. (A) en fase kontrast bilde av hSC-neurons vokst på 13 dager etter differensiering i plast multicompartment chip. (B) et zoomet i regionen hSC-neurons kultivert innenfor den hvite boksen i (a) og en tilsvarende region innenfor en PDMS enhet (høyre). hSC-neurons innen chips fest godt. Aggregert Nevron klynger form i PDMS-baserte enheter. Representant for 2 uavhengige eksperimenter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Human NSC avledet neurons viser dendrittiske ryggraden morfologi. Retrograd merket mCherry Nevron på differensiering dag 33 vokst innenfor chip. Den forstørrede regionen skissert i rødt, fremhever tilstedeværelsen av dendrittiske pigger, som gir bevis som støtter utviklingen av modne glutamatergic synapser. Røde piler peker mot dendrittiske pigger. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Human NSC avledet neurons kultivert innen chips utstillingen eksitatoriske synapser. Immunostaining ble utført ved differensiering dag 26. Nevron Imaging ble utført i somatiske kupé. A) vGlut1 (grønn) og (B) DAPI (blå) immunolabeling. (C) mCherry-benevnt neurons (rød) retrograd benevnt benytter en modifisert rabiat virus. (D) en flettet fluorescerende mikroskop av (A-C). (E) dendrittiske pigger og vGlut1 positive puncta Colocalized med mCherry-positive dendrites, vist i et zoomet i region fra (D). Immunofluorescence micrographs av (F) Nevron bestemt markør, β-tubulin III (magenta), og (G) vGlut1 (grønn). (H) overlapping av β-tubulin III, og vGlut1. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: virally Transduced mCherry neurons forlenge anslag i en axon lokaliserte mikromiljøet etablert innenfor FORHÅNDSMONTERTE COC chip. (A) mCherry merket Nevron forlenge axons gjennom microgrooves av chip og inn i en isolert axon kupé. Isolering av axon rommet er i en visualisere med Alexa fluor 488 hydrazide. Imaging av neurons oppstod ved differensiering dag 26 og 3 dager etter smitte med modifisert rabies viruset. (B) fluorescens-bildet i (A) er slått sammen med et dic-bilde. Legg merke til plasseringen av microgrooves. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: Axotomy utført innenfor COC multicompartment chip. (A) mCherry merket neurons på differensiering dag 33 ble avbildet før axotomy. ' Brann ' farge blikk opp tabellen. (B) umiddelbart etter axotomy, viser at axons er helt kuttet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Plast chips i flere rom | PDMS enheter med flere rom |
| isolere axons | isolere axons |
| etablere microenvironments | etablere microenvironments |
| axotomize neurons | axotomize neurons |
| optisk transparent | optisk transparent |
| kompatibel med bildebehandling med høy oppløsning | kompatibel med bildebehandling med høy oppløsning |
| kompatibel med fluorescens mikroskopi | kompatibel med fluorescens mikroskopi |
| ferdig montert | montering til substrat kreves |
| sunn axons > 21 dager | sunn axons > 14 dager |
| hydrofile dyrking overflate | hydrofobe |
| gass ugjennomtrengelig | gass gjennomtrengelig |
| avrundede microgrooves og kanaler | rett microgrooves |
| ikke kompatibel med laser ablasjon | Kan brukes til laser ablasjon når PDMS kamre er montert på spesielle laser ablasjon kompatible lysbilder. |
| enheten kan ikke endres for å fjerne | toppen er avtagbart for farging innenfor microgrooves |
| ikke kompatibel med mineralolje-baserte nedsenking oljer (silikon-baserte oljer er fine) | kompatibel med mineralolje-baserte nedsenking oljer |
| ugjennomtrengelig til små molekyler og organiske løsemidler | absorpsjon av små molekyler & organiske løsemidler |
| Ingen lekkasje problemer med brikken | belegg med Poly-L-Ornithine og laminin gjør enhetene lekk |
| differensiert neurons forbli jevnt fordelt (> 4 uker) ved testet celle tettheten | differensiert neurons begynner å samle etter 3-4 dager i kulturen på testet celle tettheten |
Tabell 1: sammenligning i flere rom COC-brikker og silikon-enheter for dyrking neurons
Discussion
Den forhåndsmonterte multi-kupé COC chip er en lett-å-bruke compartmentalized plattform for å differensiere og vedlikeholde menneskelige NSCs i neurons for langsiktig (> 4 uker). I denne protokollen, viser vi differensiering av menneskelige NSCs inn glutamatergic neurons, retrograd Label neurons, utføre immuncytokjemi, visualisere dendrittiske ryggraden morfologi og utføre axotomy. Disse brikkene er kompatible med høyoppløselig bildebehandling og det er ingen autofluorescence med COC12.
COC multi-kupé chips er funksjonelt tilsvarende silikon-baserte compartmentalized enheter, og har fordeler og ulemper som beskrevet tidligere12. Tabell 1 sammenligner multi-kupé COC chips og silikon enheter for dyrking hSC-neurons. COC compartmentalized chips gir en bedre hydrofile overflate for festing og vedlikehold av stamceller over en lang kultur periode. PDMS-baserte enheter må monteres og festes til glass coverslips. Hydrofobe natur PDMS enheter forårsaker aggregering av stamceller5; Dette fører til både utfordringer i Imaging på cellenivå og større mottakelighet for fysisk skade på grunn av bevegelse av celle aggregater under Media endringer. Plast brikken overvinner disse utfordringene. COC er gass ugjennomtrengelig, i motsetning til PDMS, så luftlommer fanget eller dannet i kanalene må fjernes av brukeren. Den pre-belegg løsning reduserer muligheten for luft å bli fanget i kanalene. Denne løsningen består av etanol og andre agenter. En tidligere publisert protokoll for dyrking murine neurons innenfor disse plast chips gir ytterligere detaljer om pipettering celler og Media innenfor chips12. NSCs er mer skjøre at murine neurons, så må håndteres mer forsiktig. Det er også viktig å blande stamcellene grundig før plating ved å forsiktig pipettering dem opp og ned.
Bruk av neurons avledet fra in vitro differensiert menneskelige stamceller blir stadig mer populært i medisin og forskning. Disse neurons er viktig for forskning og kliniske anvendelser for mange CNS lidelser, inkludert nevrodegenerative sykdommer og traumatisk hjerne skader. Disse neurons ligner menneskets fosterets neurons15. I fremtiden, hensiktsmessig alderen neurons kan genereres fra stamceller å etterligne alder-relaterte neuronal funksjon og brukes i forbindelse med disse compartmentalized enheter. Disse enhetene vil lette forskning i sykdommer som berører axon helse og funksjon som axon underskudd i neurons av pasienter diagnostisert med Autism Spectrum lidelser og axonal regenerering etter skade16,17.
Disclosures
S.P. og T.N. erklærer ingen konkurrerende finansielle interesser. V.P. er ansatt i Xona materialer, LLC. J.H. er medlem av Xona materialer, LLC. A.M.T. er en oppfinner av mikrovæskebasert kammer/chip (US 7419822 B2, EPO 2719756 B1) og er medlem av Xona materialer, LLC.
Acknowledgments
Forfatterne erkjenner støtte fra Xona materialer, LLC, National Institute of Mental Health (R42 MH097377), og National Institute of nevrologiske lidelser og Stroke (R41 NS108895, P30 NS045892). Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synspunktene til National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor hydrazide 488 | ThermoFisher Scientific | A10436 | |
| Alexa Fluor secondary antibodies | ThermoFisher Scientific | 1:1000 | |
| anti_beta-tubulin III | Aves | TUJ | 1:1000 |
| anti-vGAT antibody | Synaptic Systems | 131 003 | 1:1000 |
| anti-vGlut1 antibody | NeuroMab | 75-066 | clone N28/9, 1:100 |
| complete neural stem cell media: | |||
| REC HU EGF 10 UG BIOSOURCE (TM) |
ThermoFisher Scientific | PHG0314 | 20ng/mL |
| REC HU FGF BASIC 10 UG BIOSOURCE (TM) |
ThermoFisher Scientific | PHG0024 | 20ng/mL |
| GlutaMAX Supplement (100X) | ThermoFisher Scientific | 35050061 | 2mM |
| KnockOut DMEM/F-12 | ThermoFisher Scientific | 12660012 | |
| StemPro Neural Supplement | ThermoFisher Scientific | A1050801 | 2% |
| Epifluorescence imaging system | EVOS Fluorescence imaging system | AMF4300 | 10x objective |
| fluorinated ethylene propylene film | American Durafilm | 50A | 0.5 mil thickness |
| Fluoromount G | ThermoFisher Scientific | 00-4958-02 | |
| Gibco DPBS without Calcium and Magnesium | ThermoFisher Scientific | 14190144 | |
| GIBCO HUMAN NSC (H9) KIT COMBO KIT |
Gibco | N7800200 | |
| Gibco Laminin | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
| Glass Pasteur pipettes | Sigma-Aldrich | CLS7095D5X SIGMA | 5.75 in length |
| H9-DERIVED HU NEURAL STEM CELL 1E6 CELLS/VIAL; 1 ML |
ThermoFisher Scientific | 510088 | |
| hibernate-E Medium | ThermoFisher Scientific | A1247601 | |
| Incubator, 5% CO2 37 °C | |||
| Laser scanning confocal imaging system | Olympus | FV3000RS | 30x silicone oil objective |
| modified rabies virus | Salk Institute for Biological Studies | G-deleted Rabies-eGFP | Material Transfer Agreement required |
| Mr. Frosty | ThermoFisher Scientific | 5100-0001 | |
| Neural differentiation media | Per 100 mL. | ||
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermoFisher Scientific | 15240112 | 1mL (100X) |
| Ascorbic acid | Sigma Aldrich | A8960 | 200mM |
| BDNF | ThermoFisher Scientific | PHC7074 | 40 ng/mL |
| Gibco B27 Plus Supplement (50X) | FisherScientific | A3582801 | 2mL (50X) |
| Gibco CultureOne Supplement (100X) | FisherScientific | A3320201 | 1mL (100X) |
| Gibco Neurobasal Plus Medium | FisherScientific | A3582901 | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | ThermoFisher Scientific | A1110501 | |
| Taylor Wharton Liquid N2 dewar | FisherScientific | 20HCB11M | |
| triton X-100 | ThermoFisher Scientific | 28314 | |
| XC pre-coat | Xona Microfluidics, LLC | XC Pre-Coat | included with XonaChips |
| XonaChip | Xona Microfluidics, LLC | XC450 | 450 µm length microgroove barrier |
| Humidifier Tray | Xona Microfluidics, LLC | humidifier tray |
References
- Taylor, A. M., Wu, J., Tai, H. C., Schuman, E. M. Axonal translation of beta-catenin regulates synaptic vesicle dynamics. The Journal of Neuroscience. 33 (13), 5584-5589 (2013).
- Virlogeux, A., et al. Reconstituting Corticostriatal Network on-a-Chip Reveals the Contribution of the Presynaptic Compartment to Huntington’s Disease. Cell Reports. 22 (1), 110-122 (2018).
- Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research. The Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
- Pinto, M. J., et al. The proteasome controls presynaptic differentiation through modulation of an on-site pool of polyubiquitinated conjugates. The Journal of Cell Biology. 212 (7), 789-801 (2016).
- Bigler, R. L., Kamande, J. W., Dumitru, R., Niedringhaus, M., Taylor, A. M. Messenger RNAs localized to distal projections of human stem cell derived neurons. Scientific Reports. 7 (1), 611 (2017).
- Nagendran, T., et al. Distal axotomy enhances retrograde presynaptic excitability onto injured pyramidal neurons via trans-synaptic signaling. Nature Communications. 8 (1), 625 (2017).
- Van Laar, V. S., et al. Evidence for compartmentalized axonal mitochondrial biogenesis: Mitochondrial DNA replication increases in distal axons as an early response to Parkinson's disease-relevant stress. The Journal of Neuroscience. , (2018).
- del Río, J. A., Ferrer, I., Gavín, R. Role of cellular prion protein in interneuronal amyloid transmission. Progress in Neurobiology. 165-167, 87-102 (2018).
- Jia, L., et al. MiR-34a Regulates Axonal Growth of Dorsal Root Ganglia Neurons by Targeting FOXP2 and VAT1 in Postnatal and Adult Mouse. Molecular Neurobiology. , (2018).
- Taylor, A. M., Dieterich, D. C., Ito, H. T., Kim, S. A., Schuman, E. M. Microfluidic local perfusion chambers for the visualization and manipulation of synapses. Neuron. 66 (1), 57-68 (2010).
- Menon, S., et al. The E3 Ubiquitin Ligase TRIM9 Is a Filopodia Off Switch Required for Netrin-Dependent Axon Guidance. Developmental cell. 35 (6), 698-712 (2015).
- Nagendran, T., Poole, V., Harris, J., Taylor, A. M. Use of Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips for Compartmentalizing Primary Murine Neurons. Journal of visualized experiments : JoVE. (141), (2018).
- Taylor, A. M., et al. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature Methods. 2 (8), 599-605 (2005).
- Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. The Journal of Neuroscience. 29 (15), 4697-4707 (2009).
- Oh, J. H., Jung, C. R., Lee, M. O., Kim, J., Son, M. Y. Comparative analysis of human embryonic stem cellderived neural stem cells as an in vitro human model. International Journal of Molecular Medicine. 41 (2), 783-790 (2018).
- Lazar, M., Miles, L. M., Babb, J. S., Donaldson, J. B. Axonal deficits in young adults with High Functioning Autism and their impact on processing speed. Neuroimage Clinical. 4, 417-425 (2014).
- DePaul, M. A., Lin, C. Y., Silver, J., Lee, Y. S. Combinatory repair strategy to promote axon regeneration and functional recovery after chronic spinal cord injury. Scientific Reports. 7 (1), 9018 (2017).
