Summary
Denne protokol beskriver induktion af pulmonal hypertension (PH) i mus baseret på eksponering for hypoxi og injektion af en VEGF receptor antagonist. Dyrene udvikler PH og højre ventrikel (RV) hypertrofi 3 uger efter indledningen af protokollen. Den funktionelle og morfometriske karakterisering af modellen præsenteres også.
Abstract
Pulmonal hypertension (PH) er en patofysiologisk tilstand, defineret ved et gennemsnitligt lungearterialtryk på over 25 mm Hg i hvile, vurderet ved højre hjertekateterisation. Et bredt spektrum af sygdomme kan føre til PH, forskellige i deres ætiologi, histopatologi, klinisk præsentation, prognose, og respons på behandling. Trods betydelige fremskridt i de seneste år er PH fortsat en uhærdet sygdom. Forståelse af de underliggende mekanismer kan bane vejen for udviklingen af nye behandlingsformer. Dyremodeller er vigtige forskningsværktøjer til at nå dette mål. I øjeblikket er der flere modeller til rådighed for recapitulating PH. Denne protokol beskriver en to-hit mus PH model. Stimuli for PH udvikling er hypoxi og injektion af SU5416, en vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF) receptor antagonist. Tre uger efter indledningen af Hypoxi/SU5416 udvikler dyrene lunge-vaskulær remodellering, der efterligner de histopatologiske forandringer, der er observeret i human PH (overvejende gruppe 1). Vaskulær remodeling i lungecirkulationen resulterer i remodeling af højre hjertekammer (RV). Procedurerne for måling af RV-tryk (ved hjælp af den åbne brystmetode), de morfometriske analyser af RV (ved dissekere og vejning af både hjertesektriker) og de histologiske vurderinger af remodelleringen (både pulmonal ved at vurdere vaskulær remodellering og hjertebåren ved at vurdere RV-kardiomyocythypertrofi og fibrose) beskrives i detaljer. Fordelene ved denne protokol er muligheden for anvendelse både i vild type og i genetisk modificerede mus, den relativt nemme og billige gennemførelse, og den hurtige udvikling af den sygdom af interesse (3 uger). Begrænsninger af denne metode er, at mus ikke udvikler en alvorlig fænotype og PH er reversibel ved tilbagevenden til normoxia. Forebyggelse, samt terapi undersøgelser, kan nemt gennemføres i denne model, uden at det er nødvendigt at avancerede færdigheder (i modsætning til kirurgisk gnaver modeller).
Introduction
Pulmonal hypertension (PH) er en patofysiologisk tilstand, defineret ved et gennemsnitligt lungearterial (PA) tryk på over 25 mm Hg i hvile, vurderet ved højre hjertekateterisation1,2. Der er en række sygdomme, der kan føre til PH. I et forsøg på at organisere de PH-tilknyttede forhold er der udviklet flere klassifikationssystemer. Den nuværende kliniske klassificering kategoriserer de mange PH-relaterede sygdomme i 5 forskellige grupper1. Denne skelnen er vigtig, da forskellige grupper af patienter har sygdomme, der adskiller sig i deres kliniske præsentation, patologi, prognose og respons på behandling2. Tabel 1 opsummerer den nuværende klassificering suppleret med de grundlæggende histopatologiske egenskaber ved hver sygdom.
Tabel 1: Oversigt over den kliniske klassificering af PH samt de vigtigste histopatologiske træk i grupperne. Egnethed af Hypoxi/SU5416-protokollen til modellering af PH. Denne tabel er blevet ændret fra19. PH: Pulmonal hypertension, PAH: Pulmonal arteriel hypertension
Trods betydelige fremskridt i behandlingen af PH-relaterede sygdomme, PH stadig uden en kur, med en 3-årig dødelighed spænder mellem 20% og 80%3. Dette indikerer det bydende nødvendigt behov for at forstå de underliggende mekanismer i PH og derefter udviklingen af nye behandlingsformer for at forebygge, bremse progression, og helbrede sygdommen. Dyremodeller er af afgørende betydning for dette anvendelsesområde. I øjeblikket findes der forskellige modeller til at studere PH. Den interesserede læser er henvist til de fremragende anmeldelser om dette emne2,,3,4. I betragtning af de mange forskellige sygdomme, der fører til PH, er det indlysende, at de forskellige forhold i human PH ikke kan perfekt opsummeres i én dyremodel. De tilgængelige dyremodeller kan kategoriseres i i) single-hit, ii) to-hit, iii) knockout, og iv) overexpression modeller3. I single-hit modeller, er PH induceret af en enkelt patologisk stimulus, mens to-hit modeller kombinerer to patologiske stimuli med det mål at fremkalde mere alvorlige PH og dermed tættere efterligne den komplekse menneskelige sygdom. Ud over de ætiologiske forskelle resulterer de mange stimuli i PH-modelleringsforskelle, der også afhænger af dyrenes art og genetiske baggrund4.
En af de mest almindeligt anvendte klassiske PH gnaver modeller er den kroniske hypoxi model2. Hypoxi er kendt for at fremkalde PH hos mennesker såvel som hos flere dyrearter. Hypoxi har den fordel, at det er en fysiologisk stimulus for PH (Tabel 1). Men, mens graden af hypoxi anvendes til inducerende PH i gnavere er langt mere alvorlig end hos mennesker, den enkelte fornærmelse (hypoxi) fører kun til en mild form for vaskulær remodeling. Dette efterligner ikke sværhedsgraden af den menneskelige sygdom. Tilføjelsen af en anden-hit, en ekstra stimulus for at fremkalde PH, viste lovende resultater: injektion af forbindelsen SU5416 til gnavere kombineret med hypoxisk stimulus inducerer en mere alvorlig PH fænotype2,,5,6. SU5416 er en hæmmer af vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) receptor-2. Det blokerer VEGF receptorer og fører til endotelcelle apoptose. Under hypoxiske tilstande stimulerer dette udbredelsen af en delmængde af apoptoseresistente endotelceller. Desuden fører SU5416 til glat muskelcelleproliferedning. Kombinationen af disse effekter resulterer i patologisk vaskulær remodeling af lungecirkulationen og fører til forhøjet PA tryk og højre ventrikulære remodeling2,5,7. Modellen blev først beskrevet hos rotter6 og senere anvendt på mus4,5,7. Musemodellen udviser mindre svær vaskulær remodeling sammenlignet med rotter. Desuden fortsætter PH, når den vender tilbage til normoxia, med at udvikle sig i rotter, mens det hos mus er delvist reversibelt.
Følgende protokol beskriver alle trin til modellering af PH i mus ved hjælp af metoden Hypoxia/SU5416 (planlægning, tidslinje, udførelse). Derudover er karakteriseringen af modellen beskrevet i denne protokol: funktionelt (ved invasivt måling af højre ventrikeltryk (RV) ved hjælp af den åbne brystteknik), morfemetrisk (ved dissekting og vejning af både højre og venstre ventrikler) samt histologisk (ved at evaluere lungevaskulær remodeling, højre ventrikelmyocyt hypertrofi og fibrose).
Alle de trin og metoder, der er beskrevet i denne protokol, kan nemt implementeres af efterforskere på ethvert oplevelsesniveau. Mens de funktionelle målinger af RV ved hjælp af det åbne bryst teknik (beskrevet her) er ikke guld standard metode i marken, det har den fordel, at det hurtigt kan læres og præcist gengives selv af en mindre erfaren eksperimentator.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forud for eventuelle dyreforsøg opnå den lokale institutionelle dyrepleje udvalg tilladelse. De nuværende eksperimenter blev udført efter godkendelse af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) på Icahn School of Medicine på Mount Sinai.
1. PH induktion
- Under forberedelse
- Før du begynder undersøgelsen, omhyggeligt planlægge det eksperimentelle design. Sørg for, at mus udsættes for hypoxi på samme tidspunkt som den første SU5416-injektion. Et eksempel på det eksperimentelle design til fremstilling af PH ved hjælp af metoden Hypoxia/SU5416 er vist i figur 1A. Kontrolmus modtog kun køretøjet. Til denne model vil SU5416 blive injiceret til musene en gang om ugen i 3 på hinanden følgende uger.
- Brug otte til tolv uger gamle C57BL/6 mus til denne undersøgelse. Huset dyrene ved 18-20 °C i en 12-timers lys-mørk cyklus. Sørg for, at mad og vand er tilgængelige ad libitum.
- Afvej dyrene. Tildel dem tilfældigt til hver gruppe: Normoxia og Hypoxia/SU5416.
- Det hypoxiske kammer klargørs som vist i figur 1B. Fastgør nitrogenbeholdere (N2)i nærheden af kammeret. Indstil iltregulatoren (O2)til et punkt på 10% O2. Lad systemet nå en stabil tilstand.
- Su5416 tilberedes til injektion (brug en dosis på 20 mg/kg kropsvægt). SU5416 opløses ikke i vandige opløsninger. Den beregnede mængde opløses derfor i 100 μL DMSO8. For eksempel er den mængde SU5416, der skal injiceres, 0,5 mg opløst i 100 μL opløsningsmiddel (DMSO) for en mus på 25 g. Den endelige koncentration af SU5416 for denne mus er derfor 5 mg/ml.
FORSIGTIG: SU5416 er et farligt materiale. Læs omhyggeligt sikkerhedsdatabladet ledsaget af produktet, og sørg for at tage de anbefalede forholdsregler ved håndtering af dette stof. Bær beskyttelseshandsker og (som for enhver injektion) brug øjenbeskyttelse. Su5416's kemiske struktur er vist i figur 1C.
BEMÆRK: Beregn en passende overskridelse af opløsningen for at kompensere for den mængde, der vil gå tabt under injektionen (f.eks. i sprøjten, hætteglasset osv.). Afhængigt af den anvendte sprøjte er det døde volumen ca. 200 μL. For en gruppe på 10 mus beregnes et overskud på 2 musedoser. - Gør sprøjterne klar til injektion. Brug 1 ml sprøjter med en 25 G x 5/8" nåle.
- SU5416 subkutan injektion
- Hold dyret tilbage. Placer musen på låget af buret for at hjælpe fastholdelsesanordningen. Tag fat i huden og form et telt parallelt med rygsøjlen. Sørg for at gribe til bagsiden af hovedet stramt, for at undgå den potentielle bid skade af musen.
BEMÆRK: Tilstedeværelsen af to efterforskere gør proceduren hurtigere og mere præcis, da man kan holde dyret, mens den anden udfører injektionen. - Sæt nålen subkutane over flanken på den løse fold af huden. Sørg for at stikke nålen parallelt med huden. Undgå at trænge ind i bugvæggen.
- Sprøjtens indhold (100 μL opløst SU5416 eller køretøj) injiceres.
BEMÆRK: For at undgå lækage efter fuldstændig levering skal sprøjten holdes i ca. 10 s, og nålen drejes en smule under huden. - Træk nålen tilbage og vend dyret tilbage i buret. Efter SU5416 injektion, placere burene i ventileret hypoxi kammer.
- Hold dyret tilbage. Placer musen på låget af buret for at hjælpe fastholdelsesanordningen. Tag fat i huden og form et telt parallelt med rygsøjlen. Sørg for at gribe til bagsiden af hovedet stramt, for at undgå den potentielle bid skade af musen.
- Eksponering for hypoxi
- Overvåg ventilationen over tid. Sørg for at opretholde 10% af iltforsyningen. Normoxia-dyr i et halvlukkeligt kammer fastholdes ved 21 % O2.
- Sørg for, at kamrene er udstyret med en iltsensor til måling af iltniveauet. Undgå omfattende åbning af kamrene. Til rengøring og tilsætning af mad og vand åbne kamrene i højst 20 min hver 3 dage.
- Efterse dyrene dagligt. Overvej stress signaler såsom piloerection eller betydelige vægttab.
BEMÆRK: Dyr under Hypoxi/SU5416 forventes at tabe sig5. Dette er en indikation af sygdomsudvikling. - Gentag SU5416 injektion ugentligt i 3 på hinanden følgende uger (se figur 1A for oversigten over forsøgsdesign).
BEMÆRK: Hvis injektionsstedet varierer, kan det være med til at reducere hudirritationer.
2. Funktionel karakterisering ved invasive RV-trykmålinger
- Under forberedelse
BEMÆRK: Vælg et bedøvelsesregime. Injicerbare eller inhalerbare bedøvelsesmidler kan anvendes. Da en lille overdosis af injicerbar anæstesi (især fra ketamin/xylazin eller pentobarbital) i væsentlig grad kan påvirke hjertefunktionen, anbefales det at anvende flygtige anæstesi. Det er af stor betydning at bruge den samme bedøvelse for alle mus i en undersøgelse.- Brug en vaporizer til at sikre en nøjagtig bedøvelsesdosis pr. dyr. Dosis for isofluran er som følger: induktion 3-4%, vedligeholdelse 1% blandet med 100% ilt.
BEMÆRK: Bær personlige værnemidler, og undgå at indånde dampen. - Forbered en varmepude og/eller opvarmningslamper for at opretholde kropstemperaturen. Forbered en rektal temperatursonde til overvågning af kropstemperaturen.
- Sørg for korrekt ventilation. Gør ventilatoren klar på forhånd. Klargør Y-rørstikket, og kontroller ventilatorens funktion ved hjælp af manuel tilstand. Sørg for, at inspiratoriet er <1 cm H2O for at undgå barotrauma. Indstil respirationshastigheden til 110 vejrtrækninger/min.
- Forbered et endotrakealt rør ved at skære et 20 G intravaskulært kateter.
- Forbered de nødvendige instrumenter: små snævler, saks, elastiske krog retractors, fartøj cauterizer, og vatpinde. På en vatpind justere en lille 25 G x 5 / 8 "nål, der vil blive brugt til at gøre en lille punktering i højre hjertekammer.
- Forbered trykkateteret, trykvolumenkontrolenheden, og initier dataindkøbssoftwaren. PV Kateteret anbringes i et 15 ml rør fyldt med PBS ved 37 °C i 15 minutter, og kalibrer i henhold til fabrikantens protokol.
- Til perfusion og fiksering af organerne skal du forberede PBS og en opløsning på 50% PBS / 50% OKT. Forbered 2 x 10 ml sprøjter (med en 25 G nål): en vil blive brugt til perfusing hjertet og lungen med PBS in situ og den anden til injektion af OCT / PBS (50/50) opløsning til lungeprøven, der vil blive brugt til histologisk undersøgelse.
- Brug en vaporizer til at sikre en nøjagtig bedøvelsesdosis pr. dyr. Dosis for isofluran er som følger: induktion 3-4%, vedligeholdelse 1% blandet med 100% ilt.
- Intubation
- Afvej musen og registrere sundhedsstatus før anæstesi.
- Fremkalde anæstesi med 3-4% isofluran. Kontroller anæstesidybden ved at teste tå-pinch refleks: klem tåen på en af lemmerne fast. Hvis dyret trækker lemmer, er det et tegn på utilstrækkelig anæstesi.
- Efter anæstesi induktion, barbere halsen og brystet områder.
- Placer musen på varmepuden. Placer en rektal temperatursonde til overvågning af kropstemperaturen.
BEMÆRK: Vedligeholdelse af kropstemperaturen er af betydning for de funktionelle målinger. Kropstemperaturen skal være ca. 36,5-37 °C. - Ved hjælp af buede kraftbehæftninger vedhæfte en sutur tråd til de øverste fortænder af musen, strække og fastsætte til varmepuden med kirurgisk tape. Fastgør musens lemmer ved hjælp af kirurgiske bånd.
- Til intubering af dyret gøre et lille snit på ca 1 cm i den mediale livmoderhalskræft hud ved hjælp af små saks.
BEMÆRK: Oral intubation er en alternativ metode, der kræver mere erfaring. - Med en bomuld-tippet applikator adskille ligefrem parotideale og submandibulære spytkirtler i midten niveau. Dette vil udsætte musklerne overliggende luftrøret.
- Skær forsigtigt disse muskler udsætter luftrøret.
- Med små saks gøre et lille snit mellem luftrør brusk brusk og indsætte den forberedte endotrakeal rør. Tag metalstyret af det intravaskulære kateter ud.
- Tilslut kateteret til ventilatoren. Kontroller luftrørets position ved manuelt at puste lungerne op. Fastgør positionen med tape.
- Opretholde en 1% isofluran anæstesi under hele proceduren.
- Regelmæssigt overvåge dybden af anæstesi ved at teste tå knivspids refleks. Juster anæstesien i overensstemmelse hermed.
BEMÆRK: Den anbefalede puls under forsøgene, under 1% isofluran anæstesi, er ca. 400 slag /min. Vedligeholdelse af kropstemperatur og anæstesi er afgørende for at kontrollere pulsen. Overskydende isofluran kan reducere pulsen. Men, opsving kan opnås ved at reducere isoflurane sats.
- RV-trykmålinger (åben brysttilgang)
- Med små saks udføre et hud snit på ca 1 cm over xiphoid processen og den øvre abdominale del. Adskiv huden, der dækker brystet og bugvæggen af de øvre abdominalkvadranter: start på den midterste linje, distalt over for xiphoid og forsigtigt bevæge sig side om side på begge sider. Brug thermocautery til at kontrollere blødning.
BEMÆRK: Målet er at få adgang til brysthulen gennem bugvæggen. - Åbn bughulen og skær mellemgulvet omhyggeligt, passe på ikke at skade det bankende hjerte eller lungerne.
BEMÆRK: Målet er at eksponere toppen og højre hjertekammer af hjertet. God eksponering og udsigt over hjertet er af afgørende betydning for den korrekte placering af kateteret. Det er af stor betydning at undgå blødning under hele proceduren. Selv små ændringer i den intravasale volumen kan ændre belastningen af højre hjerte og påvirke de registrerede parametre. - Fjern forsigtigt pericardium med en applikator med bomuldsspids.
- Lige før du placerer trykkateteret i hjertet, skal kateteret bringes ved siden af musen.
- Ved hjælp af den forberedte bomuldsspidsapplikator med nålen laver et stiksår i den apikale distale del af højre hjertekammer. Fjern forsigtigt nålen og sæt trykkateteret ind i dette hul.
BEMÆRK: Dette bør fungere uden at anvende kraft. I tilfælde af dette ikke er muligt, så prøv at lave et nyt hul i nærheden af den første for at undgå længere skade på hjertet. Nålen må ikke indsættes dybere end ca. 3 mm. - Sæt trykkateteret parallelt med retningen af højre hjertekammer, med spidsen vender lungepulsåren.
- Hold øje med trykbølgens sporing for at sikre den korrekte placering af kateteret. Repræsentative sporinger er vist i figur 2.
- Tryksignalet stabiliseres. Sæt respirationerne på pause, og få mindst 3 målinger. Mellem de enkelte målinger kan dyret ventileres.
- Når alle målinger er registreret, skal kateteret fjernes, og det anbringes tilbage i PBS-fyldt rør i vandbadet.
BEMÆRK: Når forsøget er afsluttet, rengøres kateteret i overensstemmelse med producentens anvisninger.
- Med små saks udføre et hud snit på ca 1 cm over xiphoid processen og den øvre abdominale del. Adskiv huden, der dækker brystet og bugvæggen af de øvre abdominalkvadranter: start på den midterste linje, distalt over for xiphoid og forsigtigt bevæge sig side om side på begge sider. Brug thermocautery til at kontrollere blødning.
- Eutanasi og lungeperfusion
- Efter afslutningen af eksperimentet aflive musen ved exsanguination.
- Åbn brystet bredt. Brug saks, skære hele brystbenet og være opmærksom på ikke at skade hjertet eller lungerne.
- Brug iris saks gør et lille snit i venstre hjertekammer at tillade blod til at forlade kammeret.
- 25 G-nålen på en sprøjte, der indeholder 10 ml PBS, i højre hjertekammer, og injicer PBS-opløsningen, indtil lungerne er renset for blod.
- Når dette trin er afsluttet, bekræfte dødshjælp ved vitale væv høst (hjerte og lunger): skære cava og aorta vedhæftede filer og fjerne hjertet og lungerne en blok.
3. Morfmetrisk karakterisering
- Umiddelbart efter fjernelse af hjerte og lunger (Trin 2.4.5), isolere hjertet og fjerne begge atria. Med buede tenotomy saks dissekere forsigtigt højre hjertekammer (RV) fra venstre hjertekammer (LV), forlader septum (S) med venstre hjertekammer. RV og LV+S vejes, og Fulton-indekset= RV/LV+ S (Figur 3)5,9.
- Tag en del af den rigtige hjertekammer og læg den i en OKT fyldt indlejring skimmel. Brug den anden del af højre hjertekammer til RNA- og/eller proteinanalyse. Fastfrysning i tøris og opbevares ved -80 °C.
- Brug iris saks til at isolere lungerne fra hjertet og andre resterende væv.
BEMÆRK: Ved fremstilling af lungerne er perfusionen som beskrevet ovenfor (trin 2.4.3-2.4.5) af stor betydning. - Snap fryse en del af lungerne og gemme det for RNA, protein ekstraktion eller andre analyser.
- Brug den anden del af lungerne til histologisk analyse. Til dette formål indsættes sprøjten med 50 % PBS og 50 % OLT i en bronkos af den brugte lap10,11. Eksperimentatoren kan nemt se, at lungen bliver oppustet, når sprøjtens indhold er perfunderet i vævet.
- Placer disse stykker af lunge i indlejring forme fyldt med OCT og snap fryse dem i tøris. Prøverne opbevares ved -80 °C, efter at de er frosset.
- Forbered 8 μm dele af RV og lunge ved hjælp af en kryostat maskine. Lufttørre sektionerne ved stuetemperatur i 30 min.
- Fastgør objektglassene ved stuetemperatur med 10% paraformaldehyd (PFA) i 10 min.
BEMÆRK: PFA er et kendt kræftfremkaldende stof hos mennesker. Reducer eksponeringsrisikoen ved hjælp af en kemisk røghætte, korrekte procedurer og personlige værnemidler. Yderligere oplysninger finder du i det materialesikkerhedsdatablad (MSDS), der skal finde yderligere oplysninger. - Vaskulær remodellering vurdering af Hematoxylin / Eosin farvning
Bemærk: Udfør hematoxylin/Eosin farvning for at vurdere de strukturelle ændringer i hjertet og vaskulær remodellering i lungerne (Figur 3).- Plet med Hematoxylin opløsning i 8 min.
- Skyl med rindende vand fra hanen i 5 min efterfulgt af en hurtig skylning i destilleret vand.
- Skyl i 95% EtOH i 1 min og kontraplet i Eosin-opløsningen i 1 min.
- Dehydrer (80% Ethanol 10-30 s, 100 Ethanol i 1 min og 100% Toluol i 3 min).
- Monter og dæk med en dæksel. Tør rutsjebanerne natten over ved stuetemperatur.
BEMÆRK: De opløsninger, der anvendes til farvning, kan være farlige. Reducer eksponeringsrisikoen ved hjælp af en kemisk røghætte, korrekte procedurer og personlige værnemidler. Yderligere oplysninger finder du i MSDS.
- Højre ventrikelfibrose vurdering af Picrosirius Red Farvning
BEMÆRK: I Picrosirius Red Staining, Picrosirius Red, som er syre, binder sig til kollagen12. Derfor kan denne farvning bruges til en histologisk undersøgelse af kollagenindholdet.- Rutsjebanerne inkuberes i en forvarmet Bouins opløsning ved 58 °C i 1 time.
- Vask dias i rindende vand fra hanen for at fjerne gul farve fra sektioner i 10-15 min.
- Pletten i 0,1% Fast Green i 20 min ved stuetemperatur.
- Skyl i 1% eddikesyre i 1 min.
- Skyl i postevand i 5 min.
- Plet i 0,1% Sirius rød i 30 min ved stuetemperatur efterfulgt af dehydrering i Toluol.
FORSIGTIG: De opløsninger, der anvendes til farvning, kan være farlige. Reducer eksponeringsrisikoen ved hjælp af en kemisk røghætte, korrekte procedurer og personlige værnemidler. Yderligere oplysninger finder du i MSDS.
- RV cardiomyocyte hypertrofi vurdering af WGA Farvning
BEMÆRK: Hypertrofi af højre hjertekammer (RV) på celleniveau kan vurderes ved at udføre en Hvede Kim Agglutinin (WGA) farvning (Figur 4).- Fastgør objektglassene i kold Acetone opløsning i 15 min efterfulgt af 3 trin vask i PBS (5 min hver).
- Blok med 10% gedeserum i en Dako opløsning i 30 min ved stuetemperatur.
- Inkuber objektglassene med WGA: Tilsæt WGA 1:200 og inkuber i 1 1/2 time ved 37 °C i mørke.
- Vask objektglassene tre gange med PBS.
- Inkuber objektglassene med et nukleinsyrefarvestof.
- Vask objektglassene tre gange med PBS.
- Til montering fjernes overskydende væske og påføres monteringsmedier og en dæksling. Rutsjebanerne tørres i 1 time ved stuetemperatur i mørke og opbevares ved 4 °C.
BEMÆRK: De opløsninger, der anvendes til farvning, kan være farlige. Reducer eksponeringsrisikoen ved hjælp af en kemisk røghætte, korrekte procedurer og personlige værnemidler. Yderligere oplysninger finder du i MSDS.
- Udfør immunkemi af lungen til yderligere og specifikt vurdere vaskulær remodeling. For eksempel kan glat muskelcelle farvning bruges til at vurdere muscularization af fartøjerne, mens von Willebrand Factor farvning kan bruges til at visualisere endotel ændringer. Disse metoder er beskrevet andetsteds5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne protokol beskriver vi i detaljer oprettelsen af Hypoxia/SU5416-modellen til at fremkalde PH i mus. Desuden beskriver vi alle de nødvendige trin til at udføre lungevaskulær og hjerteevaluering ved observationsperiodens afslutning.
En oversigt over forsøgsdesignet for denne model findes i figur 1A13,14. Mus udsættes for normobarisk hypoxi (10% O2) og injiceres subkutisk en gang om ugen med SU5416 i tre på hinanden følgende uger. De stimuli, der anvendes til at fremkalde PH i denne protokol, er vist i figur 1B og 1C.
VEGF-receptoranttagonist SU5416 virker ved at forårsage endotelcelleapoptose og dermed tillade spredning af apoptoseresistente endotelceller. Dette fører til vaskulær remodeling i lunge vaskulaturen og øget vaskulær modstand5. Det forhøjede tryk i lungecirkulationen øger RV-efterbelastningen og fører gradvist til RV-dysfunktion og svigt9. I det første trin kan hypoxi/SU5416-protokollens succes evalueres ved funktionel vurdering af RV-funktionen ved observationsperiodens afslutning. I denne protokol beskriver vi i detaljer den invasive vurdering af RV systolisk tryk ved hjælp af den åbne bryst RV trykmålingsmetode. Repræsentative trykkurver og kvantitativ analyse af højre ventrikeltryk vises i figur 2.
Hvordan kan vi kvantificere vaskulær remodeling, hvilket fører til forhøjet vaskulær modstand og dermed PH? Histomorphometri er guldstandarden for at karakterisere lungevaskekulaturen. I denne protokol beskriver vi i detaljer Hematoxylin & Eosin Farvning (H&E) protokollen. Efter farvning og optagelse af billederne, kan lungearterierne skelnes i små (<50 μm) og større (> 50 μm). Bronkierne blev udelukket fra vores undersøgelse. Til vurdering af den mediale tykkelse måles arteriernes ydre (ED) samt den indvendige diameter (ID). Repræsentative billeder af ombyggede lungearterier efter behandling med hypoxi/SU5416 er vist i figur 3A. Procentdelen af arteriernes mediale tykkelse i forhold til tværsnitsdiameter er vist i figur 3B. Morfometrisk analyse af distale lungearterier viser en betydelig stigning i den mediale tykkelse hos hypoxi/SU5416-behandlede mus sammenlignet med normoxiadyr (Figur 3).
Den øgede efterbelastning fører til RV hypertrofi og som sygdommen skrider frem til RV fibrose9,15. RV hypertrofi kan vurderes morfemetrisk ved at måle Fulton Index (RV/LV+Septum) samt ved at måle kardiomyocyt (CM) hypertrofi. Vægtforholdet mellem højre ventrikel (RV) til venstre hjertekammer (LV) plus septum [RV/(LV+S)] beregnes som et indeks over højre ventrikelhypertrofi. Repræsentative resultater fra Fulton-indekset i hypoxi/SU5416 og normoxiamus er vist i figur 4B. Den metode, der er beskrevet her til vurdering af CM hypertrofi er farvning af højre ventrikel sektioner med Hvede Kim Agglutinin (WGA). WGA binder sig til glykoproteiner af cellemembranen og kan bruges til bestemmelse af tværsnitsområdet af myocytter16,17. Repræsentative billeder af højre ventrikelsektioner, der er besyvet med WGA, er vist i figur 4A. Kvantificeringer af CM-område i både syge og kontrolmus er vist i figur 4A. Hypoxi/SU5416 medfører en markant stigning i kardiomyocytstørrelse og højre ventrikelhypertrofi (Figur 4). Vi og andre har tidligere vist, at sammenlignet med det enkelte hit (kun hypoxi), forværrer Hypoxi/SU5416 RV-fænotype5,18.
Figur 1: Oversigt over hypoxi/SU5416-metoden. (A) Eksperimentelt design til musmodellen Hypoxia/SU5416. SU5416 injiceres subkutende en gang om ugen i 3 på hinanden følgende uger. B) Skematisk repræsentation af hypoxisystemet. Controlleren registrerer og regulerer ilt inde i kammeret ved at tilføre kvælstof gennem gasinfusionsrøret. CC) Kemisk struktur af SU5416. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Højre ventrikeltryk hos mus, der udsættes for kronisk hypoxi kombineret med SU5416-injektion. A bB) RV systolisk tryk i hypoxi/SU5416 mus og kontroldyr, der eksponeres for normoxia. n = 6-8 mus pr. gruppe. p < 0,001. Alle kvantitative data rapporteres som ± SEM. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Hypoxi/SU5416 fremkalder pulmonal vaskulær remodeling. (A) Repræsentative hematoxylin/Eosin-farvede dele af lungerne fra de angivne grupper viser øget medievægtykkelse i lungearterier af hypoxi/SU5416 mus. Skalabar: 50 μm. (B) Procentdel af arteriernes mediale tykkelse i forhold til tværsnitsdiameter. n = 5 mus pr. gruppe. p < 0,001. Alle kvantitative data rapporteres som ± SEM. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Højre ventrikelhypertrofi hos mus, der udsættes for kronisk hypoxi kombineret med SU5416-injektion. A Skalabar: 50 μm. (Højre) Kvantitativ analyse af dataene. n = 5 mus pr. gruppe. (B) RV hypertrofi afspejles af RV vægt over LV plus interventricular septum (S) vægtforhold (Fulton index = RV / LV + S) i hver gruppe. n = 8 mus pr. gruppe. p < 0,001. Alle kvantitative data rapporteres som ± SEM. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskriver, hvordan man model PH i mus ved at kombinere to patologiske stimuli: kronisk hypoxi og SU5416 injektion (Hypoxi/SU5416)18. I et forsøg på at korrelere denne musemodel med den menneskelige PH tilstand, man uundgåeligt skal se på den nuværende PH klassificering, vist i tabel 1. PH i næsten alle former er karakteriseret ved lunge vasokonstriktion og afvigende spredning af endotel og glatte muskelceller. Dette fører til forhøjet tryk i lungearterierne og dermed til øget efterbelastning af højre hjertekammer.
Ethvert forsøg på at karakterisere et dyr model af PH bør omfatte dokumentation for den histopatologiske remodeling af lungevaskulaturen og højre hjertekammer. Den enkelt-hit hypoxi mus model fører til en mild form for vaskulatur remodeling2,3. Disse patologiske resultater omfatter muscularization af tidligere ikke-muskuløse fartøjer, ledsaget af endotelcelle, glat muskelcelle og fibroblast spredning. Disse fund forværres ved tilsætning af det andet hit (SU5416-injektion). Virkningerne er reversible i single-hit (hypoxi) model og kun delvis reversibel i Hypoxi/SU5416 model.
Den vigtigste dødsårsag for PH-patienter er den rigtige ventrikelsvigt (RVF)4,20. Pulmonal vaskulær remodeling i dyremodeller er ikke altid ledsaget af RVF. For at karakterisere en dyremodel i form af RVF morfologiske, funktionelle og molekylære data bør analyseres. Sidstnævnte ligger uden for denne protokols anvendelsesområde. RV morfologisk remodellering omfatter både makro- og mikroskopiske aspekter. På makroskopisk niveau er det vigtigste indeks for RV hypertrofi Fulton-indekset, defineret som vægten af RV divideret med venstre ventrikelvægt (LV) og Septum (S) vægt (RV/LV+S). På det mikroskopiske niveau, fibrose, inflammation, og hypertrofi kan vurderes ved Sirius rød, Hematoxylin / Eosin og WGA farvning, henholdsvis.
Musen Hypoxi/SU5146 model (som er beskrevet her) viser en RV dysfunktion, målt ved forhøjede systoliske tryk og morfologiske kriterier. Med hensyn til lungevaskulær remodeling, mediale hypertrofi er observeret tre uger efter indledningen af protokollen. Sammenlignet med Hypoxi/SU5416-modellen hos rotter forårsager musemodellen ikke RV-svigt (kun moderat dysfunktion), fører ikke til svær obliterativ angiopati, som observeret hos alvorligt syge mennesker, og lungepatologien forbedrer efter tilbagevenden til normoxia. Samlet set er musehypoksi/SU5416-modellen egnet til at efterligne vaskulær skade som forekommet i PH, overvejende gruppe I (delvist gruppe III, se tabel 1)1,19. Fordelen ved denne model er anvendelsen i vilde type (genetisk uændrede) mus, den relativt nemme og billige gennemførelse, den relativt lave dødelighed af de syge dyr, og den hurtige udvikling af sygdommen af interesse (3 uger). PH forebyggelse og terapi undersøgelser kan nemt gennemføres i denne model, uden at det er nødvendigt at avancerede færdigheder i modsætning til kirurgisk gnaver modeller.
Ved gennemførelsen af protokollen er der nogle kritiske trin, som man skal huske på. Når man planlægger undersøgelsen, skal man huske på, at i Hypoxi/SU5416-gruppen varierer dyrenes dødelighed mellem 0-10% (ikke-offentliggjorte observationer). Derfor, for at nå statistisk effekt og undgå underdimensionerede undersøgelser, mindst 10 mus pr gruppe anbefales. Opløseligheden af SU5416 er lav. Dmso eller et andet opløsningsmiddel (f.eks. carboxymethylcellulose, CMC) skal derfor anvendes. DMSO i høje doser kan være giftigt. LD50 til subkutan (s.c.) brug i mus er rapporteret til at være 13,9 - 25,6 g/kg21,22. LD50 defineres som den dosis , der kræves for at dræbe 50 % af medlemmerne af en testet population efter en nærmere angivet testvarighed21,22. For en mus, der vejer 25 g, anvendes 4,4 g/kg DMSO (beregninger baseret på DMSO-massen på 1,1 g/ml og 0,1 ml påført s.c./mus). Derfor er den subkutanet givne dosis meget lavere end LD50-værdien. I vores hænder kan anvendelsen af SU5416 opløst i DMSO, som beskrevet her, forårsage hudirritation i nogle tilfælde, men ingen andre toksiske virkninger observeres. Flere rapporter anbefaler dog, at CMC anvendes som et alternativt middel til SU541614. Når du udfører RV funktionelle målinger, skal der lægges stor vægt på kropstemperaturen, blødning, og dybden af anæstesi, som vurderet ved at teste musen reflekser. Den åbne bryst teknik til vurdering af RV-trykket, som beskrevet her, har den fordel, let at blive gennemført selv af en uerfaren bruger. Metoden med lukket bryst (beskrevet andetsteds23,24,25) har den fordel, at den er mindre invasiv og derfor også kan gennemføres i ikke-terminale eksperimenter. Det kræver dog en høj grad af ekspertise.
Efter den første beskrivelse af Hypoxi/SU5416-modellen hos rotter er musemodellen blevet anvendt med succes i flereundersøgelser 5,9,13. Der er dog tegn på, at resultaterne afhænger af musenes genetiske baggrund og køn, producenten af SU5416 og hyppigheden af SU5416 injektion26. Mens injektion SU5416 over tre på hinanden følgende uger fører til PH i mus, en enkelt dosis ville ikke fremkalde PH4. Desuden, andre former for PH, såsom dem, der er forbundet med venstre hjertesygdom eller på grund af kronisk tromboembolisk sygdom, kræver ætiologi-relaterede modeller. Nye behandlingsformer bør afprøves i mindst 2 forskellige dyremodeller, før de kan bane vejen for translationelle undersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at erklære.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra American Heart Association (AHA- 17SDG3370112 og 18IPA34170258) og fra National Institutes of Health NIH K01 HL135474 til Y.S. O.B blev støttet af Deutsche Herzstiftung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid glacial | Roth | 3738.1 | |
| Acetone, Histology Grade | The Lab Depot | VT110D | |
| ADVantage Pressure-Volume System | Transonic | ADV500 | |
| Bouin's solution | Sigma | Ht10132 | |
| Cautery System | Fine Science Tools | 18000-00 | |
| Connection tubing and valves | |||
| Cotton-Tipped Applicators | Covidien | 8884541300 | |
| Coverslips, 24 x50 mm | Roth | 1871 | |
| Data Acquisition and Analysis | Emka | iox2 | |
| Direct Red 80 | Sigma | 365548-5G | |
| DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | Sigma Aldrich | 276855 | |
| Dry ice | |||
| Dumont # 5 forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Dumont # 7 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | |
| Embedding molds | Sigma Aldrich | E-6032 | |
| Eosin Solution Aqueous | Sigma | HT110216 | |
| Ethanol, laboratory Grade | Carolina Biological Supply Company | 861285 | |
| Fast Green FCF | Sigma | F7252-5G | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Goat Serum | invitrogen | 16210-064 | |
| Heating pad | Gaymar | T/Pump | |
| Hematoxylin 2 | Thermo Scientific | 7231 | |
| Hypoxic chamber | Biospherix | A30274P | |
| Induction chamber | DRE Veterinary | 12570 | |
| Intubation catheter (i.v. catheter SurFlash (20 G x 1") ) | Terumo | SR*FF2025 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Isoflurane | Baxter | NDC-10019-360-40 | |
| Isoflurane vaporizer | DRE Veterinary | 12432 | |
| Mice (C57BL/6) | Charles River | ||
| Needles 25 G x 5/8" | BD | 305122 | |
| OCT | Tissue Tek | 4583 | |
| PBS (Phosphate Buffered Saline) | Corning | 21-031-CV | |
| Piric Acid- Saturated Solution 1.3 % | Sigma | P6744-1GA | |
| Pressure volume catheter | Transonic | FTH-1212B-4018 | |
| Retractor | Kent Scientific | SURGI-5001 | |
| Static oxygen Controller ProOx 360 | Biospherix | P360 | |
| SU 5416 | Sigma Aldrich | S8442 | |
| Surgical Suture, black braided silk, 5.0 | Surgical Specialties Corp. | SP116 | |
| Surgical tape | 3M | 1527-1 | |
| Syringe 10 ml | BD | 303134 | |
| Syringes with needle 1 ml | BD | 309626 | |
| Sytox Green Nuclein Acid Stain | Thermo Scientific | S7020 | |
| Tenotomy scissors | Pricon | 60-521 | |
| Toluol | Roth | 9558.3 | |
| Ventilator | CWE | SAR-830/P | |
| WGA Alexa Fluor | Thermo Scientific | W11261 | |
| Xylene | Roth |
References
- Galie, N., et al. 2015 ESC/ERS Guidelines for the diagnosis and treatment of pulmonary hypertension: The Joint Task Force for the Diagnosis and Treatment of Pulmonary Hypertension of the European Society of Cardiology (ESC) and the European Respiratory Society (ERS): Endorsed by: Association for European Paediatric and Congenital Cardiology (AEPC), International Society for Heart and Lung Transplantation (ISHLT). European Heart Journal. 37 (1), 67-119 (2016).
- Stenmark, K. R., Meyrick, B., Galie, N., Mooi, W. J., McMurtry, I. F. Animal models of pulmonary arterial hypertension: the hope for etiological discovery and pharmacological cure. American Journal of Physiology-Lung Cell Molecular Physiology. 297 (6), 1013-1032 (2009).
- Maarman, G., Lecour, S., Butrous, G., Thienemann, F., Sliwa, K. A comprehensive review: the evolution of animal models in pulmonary hypertension research; are we there yet. Pulmonary Circulation. 3 (4), 739-756 (2013).
- Gomez-Arroyo, J., et al. A brief overview of mouse models of pulmonary arterial hypertension: problems and prospects. American Journal of Physiology-Lung Cell Molecular Physiology. 302 (10), 977-991 (2012).
- Ciuclan, L., et al. A novel murine model of severe pulmonary arterial hypertension. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 184 (10), 1171-1182 (2011).
- Taraseviciene-Stewart, L., et al. Inhibition of the VEGF receptor 2 combined with chronic hypoxia causes cell death-dependent pulmonary endothelial cell proliferation and severe pulmonary hypertension. FASEB Journal. 15 (2), 427-438 (2001).
- Vitali, S. H., et al. The Sugen 5416/hypoxia mouse model of pulmonary hypertension revisited: long-term follow-up. Pulmonary Circulation. 4 (4), 619-629 (2014).
- Breen, E. C., Scadeng, M., Lai, N. C., Murray, F., Bigby, T. D. Functional magnetic resonance imaging for in vivo quantification of pulmonary hypertension in the Sugen 5416/hypoxia mouse. Experimental Physiology. 102 (3), 347-353 (2017).
- Wang, Z., Schreier, D. A., Hacker, T. A., Chesler, N. C. Progressive right ventricular functional and structural changes in a mouse model of pulmonary arterial hypertension. Physiological Reports. 1 (7), 00184 (2013).
- Momcilovic, M., et al. Utilizing 18F-FDG PET/CT Imaging and Quantitative Histology to Measure Dynamic Changes in the Glucose Metabolism in Mouse Models of Lung Cancer. Journal of Visualized Experiment. (137), 57167 (2018).
- Guma, S. R., et al. Natural killer cell therapy and aerosol interleukin-2 for the treatment of osteosarcoma lung metastasis. Pediatric Blood Cancer. 61 (4), 618-626 (2014).
- Lattouf, R., et al. Picrosirius red staining: a useful tool to appraise collagen networks in normal and pathological tissues. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (10), 751-758 (2014).
- Penumatsa, K. C., et al. Transglutaminase 2 in pulmonary and cardiac tissue remodeling in experimental pulmonary hypertension. American Journal of Physiology-Lung Cell Molecular Physiology. 313 (5), 752-762 (2017).
- Wang, Z., et al. Organ-level right ventricular dysfunction with preserved Frank-Starling mechanism in a mouse model of pulmonary arterial hypertension. Journal of Applied Physiology. 124 (5), 1244-1253 (2018).
- van de Veerdonk, M. C., Bogaard, H. J., Voelkel, N. F. The right ventricle and pulmonary hypertension. Heart Failure Reviews. 21 (3), 259-271 (2016).
- Emde, B., Heinen, A., Godecke, A., Bottermann, K. Wheat germ agglutinin staining as a suitable method for detection and quantification of fibrosis in cardiac tissue after myocardial infarction. European Journal of Histochemistry. 58 (4), 2448 (2014).
- Pena, S. D., Gordon, B. B., Karpati, G., Carpenter, S. Lectin histochemistry of human skeletal muscle. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 29 (4), 542-546 (1981).
- Bueno-Beti, C., Hadri, L., Hajjar, R. J., Sassi, Y. The Sugen 5416/Hypoxia Mouse Model of Pulmonary Arterial Hypertension. Methods in Molecular Biology. 1816, 243-252 (2018).
- Colvin, K. L., Yeager, M. E. Animal Models of Pulmonary Hypertension: Matching Disease Mechanisms to Etiology of the Human Disease. Journal of Pulmonary and Respiratory Medicine. 4 (4), (2014).
- Benza, R. L., et al. Predicting survival in pulmonary arterial hypertension: insights from the Registry to Evaluate Early and Long-Term Pulmonary Arterial Hypertension Disease Management (REVEAL). Circulation. 122 (2), 164-172 (2010).
- Jacob, S. W., Rosenbaum, E. E. The toxicology of dimethyl sulfoxide (DMSO). Headache. 6 (3), 127-136 (1966).
- Jacob, S. W., Wood, D. C. Dimethyl sulfoxide (DMSO). Toxicology, pharmacology, and clinical experience. American Journal of Surgery. 114 (3), 414-426 (1967).
- Abraham, D., Mao, L. Cardiac Pressure-Volume Loop Analysis Using Conductance Catheters in Mice. Journal of Visualized Experiment. (103), 52942 (2015).
- Ma, Z., Mao, L., Rajagopal, S. Hemodynamic Characterization of Rodent Models of Pulmonary Arterial Hypertension. Journal of Visualized Experiment. (110), 53335 (2016).
- Townsend, D. Measuring Pressure Volume Loops in the Mouse. Journal of Visualized Experiment. (111), 53810 (2016).
- Penumatsa, K. C., Warburton, R. R., Hill, N. S., Fanburg, B. L. CrossTalk proposal: The mouse SuHx model is a good model of pulmonary arterial hypertension. Journal of Physiology. 597 (4), 975-977 (2019).
