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Medicine

हाइपोक्सिया/SU5416 मॉडल का उपयोग कर चूहों में फेफड़े के उच्च रक्तचाप का प्रेरण और लक्षण वर्णन

Published: June 3, 2020 doi: 10.3791/59252
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Cardiovascular Research Center, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Phospholamban Foundation

Summary

यह प्रोटोकॉल हाइपोक्सिया के संपर्क में आने और वीजीएफ रिसेप्टर विरोधी के इंजेक्शन के आधार पर चूहों में फेफड़े के उच्च रक्तचाप (पीएच) के शामिल होने का वर्णन करता है। प्रोटोकॉल की शुरुआत के 3 सप्ताह बाद जानवर पीएच और राइट वेंट्रिकुलर (आरवी) हाइपरट्रॉफी विकसित करते हैं। मॉडल का कार्यात्मक और मॉर्फोमेट्रिकल लक्षण वर्णन भी प्रस्तुत किया गया है।

Abstract

पल्मोनरी हाइपरटेंशन (पीएच) एक रोगविज्ञानी स्थिति है, जो एक मतलब पल्मोनरी धमनी दबाव द्वारा परिभाषित किया गया है जो बाकी में 25 मिमी एचजी से अधिक है, जैसा कि सही हृदय कैथेटराइजेशन द्वारा मूल्यांकन किया गया है। बीमारियों का एक व्यापक स्पेक्ट्रम पीएच का कारण बन सकता है, उनके एटियोलॉजी, हिस्टोपैथोलॉजी, नैदानिक प्रस्तुति, पूर्वानुमान और उपचार के जवाब में भिन्न हो सकता है। पिछले वर्षों में महत्वपूर्ण प्रगति के बावजूद, पीएच एक असुरक्षित बीमारी बनी हुई है । अंतर्निहित तंत्र को समझना नए उपचारों के विकास का मार्ग प्रशस्त कर सकता है । पशु मॉडल इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण अनुसंधान उपकरण हैं। वर्तमान में, पीएच के पुनर्मूल्यांकन के लिए कई मॉडल उपलब्ध हैं। यह प्रोटोकॉल दो हिट माउस पीएच मॉडल का वर्णन करता है। पीएच विकास के लिए उत्तेजनाएं हाइपोक्सिया और SU5416 का इंजेक्शन, एक संवहनी एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर (VEGF) रिसेप्टर विरोधी हैं। हाइपोक्सिया/SU5416 की दीक्षा के तीन सप्ताह बाद, जानवरों ने मानव पीएच (मुख्य रूप से समूह 1) में मनाए गए हिस्टोपैथोलॉजिकल परिवर्तनों की नकल करते हुए फेफड़े के संवहनी पुनर्मॉडलिंग का विकास किया । पल्मोनरी सर्कुलेशन में वैस्कुलर रीमॉडलिंग के परिणामस्वरूप सही वेंट्रिकल (आरवी) की रीमॉडलिंग होती है। आरवी दबाव (खुली छाती विधि का उपयोग करके), आरवी के रूपोमेट्रिकल विश्लेषण (हृदय वेंट्रिकल्स दोनों को विच्छेदन और वजन से) और रीमॉडलिंग के हिस्टोलॉजिकल आकलन (आरवी कार्डियोमायोसाइट हाइपरट्रॉफी और फाइब्रोसिस का आकलन करके संवहनी रिमॉडलिंग और कार्डियक का आकलन करके दोनों पल्मोनरी) के बारे में विस्तार से वर्णित किया गया है। इस प्रोटोकॉल के फायदे जंगली प्रकार और आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों, अपेक्षाकृत आसान और कम लागत वाले कार्यान्वयन, और ब्याज की बीमारी (3 सप्ताह) दोनों में आवेदन की संभावना है। इस विधि की सीमाएं यह हैं कि चूहों एक गंभीर फेनोटाइप विकसित नहीं करते हैं और पीएच नॉर्मोक्सिया में लौटने पर उलटा होता है। रोकथाम, साथ ही चिकित्सा अध्ययन, उन्नत कौशल की आवश्यकता के बिना इस मॉडल में आसानी से लागू किया जा सकता है (सर्जिकल कृंतक मॉडल के विपरीत)।

Introduction

पल्मोनरी हाइपरटेंशन (पीएच) एक रोगविज्ञानी स्थिति है, जो एक मतलब पल्मोनरी धमनी (पीए) दबाव द्वारा परिभाषित किया गया है, जो बाकी में 25 मिमी एचजी से अधिक है, जैसा कि सही हृदय कैथेटराइजेशन1,,2द्वारा मूल्यांकन किया गया है। कई तरह की बीमारियां होती हैं जो पीएच का कारण बन सकती हैं। पीएच से जुड़ी स्थितियों को व्यवस्थित करने के प्रयास में, कई वर्गीकरण प्रणालियां विकसित की गई हैं। वर्तमान नैदानिक वर्गीकरण 5 विभिन्न समूहों में कई पीएच से जुड़े रोगों को वर्गीकृत करता है1। यह अंतर महत्वपूर्ण है क्योंकि रोगियों के विभिन्न समूहों में ऐसी बीमारियां होती हैं जो उनकी नैदानिक प्रस्तुति, पैथोलॉजी, पूर्वानुमान और उपचार के प्रति प्रतिक्रियामेंभिन्न होती हैं। तालिका 1 वर्तमान वर्गीकरण को संक्षेप में प्रस्तुत करता है, जो प्रत्येक रोग की बुनियादी हिस्टोपैथोलॉजिकल विशेषताओं के साथ पूरित होता है।

Table 1
तालिका 1: समूहों के भीतर मुख्य हिस्टोपैथोलॉजिकल सुविधाओं के साथ पीएच के नैदानिक वर्गीकरण का अवलोकन। मॉडलिंग पीएच के लिए हाइपोक्सिया/SU5416 प्रोटोकॉल की उपयुक्तता । इस तालिका को19से संशोधित किया गया है । पीएच: फेफड़े उच्च रक्तचाप, पीएएच: पल्मोनरी धमनी उच्च रक्तचाप

पीएच से जुड़े रोगों के उपचार में महत्वपूर्ण प्रगति के बावजूद, पीएच अभी भी एक इलाज के बिना रहता है, एक 3 साल की मृत्यु दर के साथ 20% और ८०%3के बीच लेकर । यह पीएच के अंतर्निहित तंत्र को समझने की अनिवार्य आवश्यकता को इंगित करता है और उसके बाद, प्रगति को रोकने, धीमा करने और बीमारी का इलाज करने के लिए उपन्यास चिकित्सा के विकास को इंगित करता है। पशु मॉडल इस दायरे के लिए महत्वपूर्ण महत्व के हैं । वर्तमान में, पीएच का अध्ययन करने के लिए विभिन्न मॉडल मौजूद हैं। इच्छुक पाठक को इस विषय 2,3,4,पर उत्कृष्ट समीक्षाओं के लिए संदर्भित कियाजाताहै । पीएच की ओर जाने वाली बीमारियों की विविधता को ध्यान में रखते हुए, यह स्पष्ट है कि मानव पीएच की विविध स्थितियों को एक पशु मॉडल में पूरी तरह से पुन: प्रतिस्थापित नहीं किया जा सकता है। उपलब्ध पशु मॉडल ों को आई में वर्गीकृत किया जा सकता है) एकल हिट, ii) दो हिट, iii) नॉकआउट, और iv) ओवरएक्सप्रेशन मॉडल3. एकल हिट मॉडलों में, पीएच एक ही रोग उत्तेजना से प्रेरित है, जबकि दो हिट मॉडल अधिक गंभीर पीएच उत्प्रेरण के लक्ष्य के साथ दो रोग उत्तेजनाओं गठबंधन और इस तरह अधिक बारीकी से जटिल मानव रोग की नकल । एटियोलॉजिकल मतभेदों के अलावा, पीएच मॉडलिंग मतभेदों में कई उत्तेजनाओं के परिणामस्वरूप जो प्रजातियों और जानवरों की आनुवंशिक पृष्ठभूमि पर भी निर्भर करता है4।

सबसे अधिक इस्तेमाल किया क्लासिक पीएच कृंतक मॉडल में से एक क्रोनिक हाइपोक्सिया मॉडल2है । हाइपोक्सिया मनुष्यों के साथ-साथ कई जानवरों की प्रजातियों में पीएच को प्रेरित करने के लिए जाना जाता है। हाइपोक्सिया को पीएच(टेबल 1)के लिए एक शारीरिक प्रोत्साहन होने का लाभ है। हालांकि, जबकि कृंतक में पीएच को प्रेरित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले हाइपोक्सिया की डिग्री मनुष्यों की तुलना में बहुत अधिक गंभीर है, एकल अपमान (हाइपोक्सिया) केवल संवहनी रीमॉडलिंग के हल्के रूप की ओर जाता है। यह मानव रोग की गंभीरता की नकल नहीं करता है। पीएच को प्रेरित करने के लिए एक दूसरी हिट, एक अतिरिक्त उत्तेजना के अलावा, आशाजनक परिणाम दिखाए: हाइपोक्सिक उत्तेजना के साथ संयुक्त कृंतक को यौगिक SU5416 का इंजेक्शन एक अधिक गंभीर पीएच फेनोटाइप2,,5,,6प्रेरित करता है। SU5416 संवहनी एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर (VEGF) रिसेप्टर-2 का अवरोधक है। यह वीजीएफ रिसेप्टर्स को ब्लॉक करता है और एंडोथेलियल सेल एपोप्टोसिस की ओर जाता है। हाइपोक्सिक स्थितियों के तहत, यह एपोप्टोसिस प्रतिरोधी एंडोथेलियल कोशिकाओं के सबसेट के प्रसार को उत्तेजित करता है। इसके अलावा, SU5416 चिकनी मांसपेशियों की कोशिका प्रसार की ओर जाता है। इन प्रभावों के संयोग से फेफड़े के परिसंचरण की रोगात्मक संवहनी पुन: तैयार होती है और इससे पीए दबाव और दाएं वेंट्रिकुलर रीमॉडलिंग2,5,7होताहै . इस मॉडल का वर्णन पहले चूहों में6 और बाद में चूहों पर 4,5,7से लगाया गया था .7 माउस मॉडल चूहों की तुलना में कम गंभीर संवहनी रीमॉडलिंग प्रदर्शित करता है। इसके अलावा, जब नॉर्मोक्सिया में वापस आ जाता है, तो पीएच चूहों में प्रगति करता रहता है, जबकि चूहों में यह आंशिक रूप से प्रतिवर्ती होता है।

निम्नलिखित प्रोटोकॉल हाइपोक्सिया/SU5416 विधि (योजना, समय रेखा, निष्पादन) का उपयोग कर चूहों में पीएच मॉडलिंग के लिए सभी चरणों का वर्णन करता है । इसके अतिरिक्त, मॉडल के लक्षण वर्णन को इस प्रोटोकॉल में वर्णित किया गया है: कार्यात्मक रूप से (खुले सीने की तकनीक का उपयोग करके सही वेंट्रिकुलर (आरवी) दबाव को आक्रामक रूप से मापकर), रूपांतर (दाएं और बाएं वेंट्रिकल्स दोनों को विच्छेदन और वजन करके), साथ ही हिस्टोलॉजिकल रूप से (पल्मोनरी वैस्कुलर रिमॉडलिंग, दाएं वेंट्रिक कार्डियोकुलेर हाइपरट्रॉफी और फाइब्रोसिस का मूल्यांकन करके)।

इस प्रोटोकॉल में वर्णित सभी कदमों और तरीकों को जांचकर्ताओं द्वारा किसी भी अनुभव स्तर पर आसानी से लागू किया जा सकता है। जबकि खुली छाती तकनीक का उपयोग करके आरवी के कार्यात्मक माप (यहां वर्णित) क्षेत्र में स्वर्ण मानक विधि नहीं है, इसका लाभ यह है कि इसे कम अनुभवी प्रयोगकर्ता द्वारा भी जल्दी से सीखा और सटीक रूप से पुन: पेश किया जा सकता है।

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Protocol

किसी भी पशु प्रयोग से पहले स्थानीय संस्थागत पशु देखभाल समिति प्राधिकरण प्राप्त करते हैं। वर्तमान प्रयोगों को माउंट सिनाई स्थित इकाहान स्कूल ऑफ मेडिसिन में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदन के बाद किया गया था ।

1. पीएच इंडक्शन

  1. तैयारी
    1. अध्ययन शुरू करने से पहले, ध्यान से प्रयोगात्मक डिजाइन की योजना है। सुनिश्चित करें कि चूहों को पहले SU5416 इंजेक्शन के रूप में एक ही समय बिंदु पर हाइपोक्सिया के अधीन किया जाता है। हाइपोक्सिया/SU5416 विधि का उपयोग कर पीएच उत्प्रेरण के लिए प्रयोगात्मक डिजाइन का एक उदाहरण चित्र 1एमें दिखाया गया है । नियंत्रण चूहों केवल वाहन प्राप्त किया। इस मॉडल के लिए, SU5416 चूहों को लगातार 3 सप्ताह के लिए प्रति सप्ताह एक बार इंजेक्शन दिया जाएगा।
    2. इस अध्ययन के लिए आठ से बारह सप्ताह पुराने C57BL/6 चूहों का उपयोग करें । जानवरों को 12-h हल्के-अंधेरे चक्र में 18-20 डिग्री सेल्सियस पर घर दें। सुनिश्चित करें कि भोजन और पानी सुलभ विज्ञापन लिबिटमहैं।
    3. जानवरों का वजन करें। उन्हें प्रत्येक समूह को बेतरतीब ढंग से असाइन करें: नॉर्मॉक्सिया और हाइपोक्सिया/SU5416 ।
    4. कक्ष के पास चित्रा 1बी सुरक्षित नाइट्रोजन (एन2)टैंकों में दिखाए गए हाइपोक्सिक चैंबर तैयार करें। ऑक्सीजन (O2)नियंत्रक को 10% O2के बिंदु पर सेट करें । सिस्टम को स्थिर अवस्था में पहुंचने दें।
    5. इंजेक्शन के लिए SU5416 तैयार करें (20 मिलीग्राम/किलो शरीर के वजन की खुराक का उपयोग करें)। SU5416 जलीय समाधानों में भंग नहीं होता है; इसलिए, 100 माइक्रोल DMSO8में गणना राशि भंग . उदाहरण के लिए, 25 ग्राम माउस के लिए, इंजेक्शन लगाने के लिए SU5416 की मात्रा 100 माइक्रोन सॉल्वेंट (डीएमएसओ) में 0.5 मिलीग्राम भंग हो जाती है। इस माउस के लिए SU5416 की अंतिम एकाग्रता, इसलिए, 5 मिलीग्राम/एमएल है।
      सावधानी: SU5416 एक खतरनाक सामग्री है। उत्पाद के साथ सुरक्षा डेटा शीट को ध्यान से पढ़ें और इस पदार्थ को संभालते समय अनुशंसित सावधानियां बरतना सुनिश्चित करें। सुरक्षात्मक दस्ताने पहनें और (किसी भी इंजेक्शन के लिए) आंखों की सुरक्षा का उपयोग करें। SU5416 की रासायनिक संरचना चित्रा 1सी में दिखाया गयाहै।
      नोट: इंजेक्शन के दौरान खो जाने वाली मात्रा (जैसे सिरिंज, शीशी आदि में) की भरपाई के लिए समाधान की उचित अतिरिक्त गणना करें। उपयोग की गई सिरिंज के आधार पर, मृत मात्रा लगभग 200 माइक्रोन है। 10 चूहों के समूह के लिए, 2 माउस खुराक की अधिकता की गणना करें।
    6. इंजेक्शन के लिए सीरिंज तैयार करें। 25 जी x 5/8 "सुइयों के साथ 1 एमएल सीरिंज का उपयोग करें।
  2. SU5416 चमड़े के नीचे इंजेक्शन
    1. जानवर को नियंत्रित करें। संयम की सहायता के लिए पिंजरे के ढक्कन पर माउस रखें। त्वचा को पकड़ें और रीढ़ के समानांतर एक तम्बू बनाएं। माउस द्वारा संभावित काटने की चोट से बचने के लिए, सिर के पीछे कसकर समझना सुनिश्चित करें।
      नोट: दो जांचकर्ताओं की उपस्थिति प्रक्रिया को तेजी से और अधिक सटीक बनाती है क्योंकि एक जानवर को पकड़ सकता है जबकि दूसरा इंजेक्शन करता है।
    2. त्वचा के ढीले मोड़ पर पार्श्व पर सुई को चमड़े के रूप में डालें। त्वचा के समानांतर सुई डालने के लिए सुनिश्चित करें। पेट की दीवार को भेदने से बचें।
    3. सिरिंज की सामग्री (भंग SU5416 या वाहन के 100 माइक्रोल) इंजेक्ट करें।
      नोट: पूरी डिलीवरी के बाद रिसाव से बचने के लिए, सिरिंज को लगभग 10 एस के लिए पकड़ें और त्वचा के नीचे सुई को थोड़ा घुमाएं।
    4. सुई वापस ले लें और जानवर को उसके पिंजरे में वापस कर दें। SU5416 इंजेक्शन के बाद, पिंजरों को हवादार हाइपोक्सिया कक्ष में रखें।
  3. हाइपोक्सिया के संपर्क में
    1. समय के साथ वेंटिलेशन की निगरानी करें। ऑक्सीजन की आपूर्ति का 10% बनाए रखना सुनिश्चित करें। 21% O2में एक अर्ध-सील करने योग्य कक्ष में नॉर्मॉक्सिया जानवरों को बनाए रखें।
    2. सुनिश्चित करें कि कक्षों ऑक्सीजन के स्तर को मापने के लिए एक ऑक्सीजन सेंसर से सुसज्जित हैं। कक्षों के व्यापक उद्घाटन से बचें। सफाई और भोजन और पानी जोड़ने के लिए हर 3 दिनों में 20 मिनट से अधिक नहीं के लिए कक्षों को खोलें।
    3. रोजाना जानवरों का निरीक्षण करें। इस तरह के पिलोरेक्शन या वजन के महत्वपूर्ण नुकसान के रूप में तनाव संकेतों पर विचार करें।
      नोट: हाइपोक्सिया/SU5416 के तहत पशुओं को5वजन कम करने की उम्मीद है । यह रोग के विकास का संकेत है।
    4. लगातार 3 हफ्तों के लिए साप्ताहिक SU5416 इंजेक्शन दोहराएं (प्रायोगिक डिजाइन के अवलोकन के लिए चित्रा 1ए देखें)।
      नोट: इंजेक्शन की साइट अलग त्वचा की जलन को कम करने में मदद कर सकते हैं ।

2. आक्रामक आरवी दबाव माप द्वारा कार्यात्मक लक्षण वर्णन

  1. तैयारी
    नोट: एक संवेदनाहारी शासन का चयन करें। इंजेक्शन या साँस लेने योग्य एनेस्थेटिक्स का उपयोग किया जा सकता है। चूंकि इंजेक्शन एनेस्थेटिक्स (विशेष रूप से केटामाइन/जाइलाज़ीन या पेंटोबार्बिटल से) का थोड़ा अधिक मात्रा हृदय कार्य को काफी प्रभावित कर सकती है, इसलिए अस्थिर एनेस्थेटिक्स के उपयोग की सिफारिश की जाती है। एक अध्ययन के भीतर सभी चूहों के लिए एक ही संवेदनाहारी का उपयोग करना बहुत महत्वपूर्ण है।
    1. प्रति पशु एक सटीक एनेस्थेटिक्स खुराक को आश्वस्त करने के लिए वाष्पीकरण का उपयोग करें। आइसोफ्लुएरे के लिए खुराक निम्नलिखित के रूप में है: प्रेरण 3-4%, रखरखाव 1% 100% ऑक्सीजन के साथ मिश्रित।
      नोट: व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें और वाष्प को सांस लेने से बचें।
    2. शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए एक हीटिंग पैड और/या वार्मिंग लैंप तैयार करें । शरीर के तापमान की निगरानी के लिए गुदा तापमान जांच तैयार करें।
    3. उचित वेंटिलेशन सुनिश्चित करें। वेंटिलेटर पहले से तैयार कर लें। वाई-ट्यूब कनेक्टर तैयार करें और मैनुअल मोड का उपयोग करके वेंटिलेटर के फ़ंक्शन की जांच करें। सुनिश्चित करें कि प्रेरणापूर्ण दबाव और लेफ्टिनेंट; 1 सेमी एच2ओ है जो बारोत्रामा से बचने के लिए है। ११० सांस/मिनट पर श्वसन दर निर्धारित करें ।
    4. 20 ग्राम इंट्रावैस्कुलर कैथेटर काटकर एंडोट्रेक्ल ट्यूब तैयार करें।
    5. आवश्यक उपकरणों को तैयार करें: छोटे संदंश, कैंची, लोचदार हुक रिट्रैक्टर, पोत कॉटराइजर और कपास झाड़ू। एक कपास झाड़ू पर एक छोटे से 25 जी x 5/8 "सुई है कि सही वेंट्रिकल में एक छोटे से पंचर बनाने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा समायोजित करें ।
    6. प्रेशर कैथेटर, प्रेशर-वॉल्यूम कंट्रोल यूनिट तैयार करें और डेटा एक्विजिशन सॉफ्टवेयर शुरू करें । पीवी कैथेटर को 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस से भरी 15 एमएल ट्यूब में रखें और निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार कैलिब्रेट करें।
    7. अंगों के परफ्यूजन और निर्धारण के लिए, पीबीएस तैयार करें और 50% पीबीएस /50% अक्टूबर का समाधान तैयार करें 2 x 10 मिलीएल सीरिंज (25 जी सुई के साथ): एक का उपयोग दिल और फेफड़ों को सीटू में पीबीएस के साथ और दूसरे फेफड़ों के नमूने को इंजेक्शन देने के लिए किया जाएगा जिसका उपयोग उसकी विज्ञान परीक्षा के लिए किया जाएगा।
  2. इंट्यूबेशन
    1. माउस का वजन करें और संज्ञाहरण से पहले स्वास्थ्य की स्थिति रिकॉर्ड करें।
    2. 3-4% आइसोफ्लुन के साथ संज्ञाहरण को प्रेरित करें। पैर के पैर के पैर की अंगुली-चुटकी पलटा परीक्षण द्वारा संज्ञाहरण गहराई की जांच करें: अंगों में से एक के पैर के अंगुली को मजबूती से चुटकी लें। यदि जानवर अंग वापस ले लेता है, तो यह अपर्याप्त संज्ञाहरण का संकेत है।
    3. संज्ञाहरण प्रेरण के बाद, गर्दन और छाती क्षेत्रों को दाढ़ी।
    4. माउस को हीटिंग पैड पर रखें। शरीर के तापमान की निगरानी के लिए एक गुदा तापमान जांच रखें।
      नोट: कार्यात्मक माप के लिए शरीर के तापमान का रखरखाव महत्वपूर्ण है। शरीर का तापमान लगभग 36.5-37 डिग्री सेल्सियस होना चाहिए।
    5. घुमावदार संदंश का उपयोग माउस के ऊपरी छेदक के लिए एक सीवन धागा देते हैं, खिंचाव और सर्जिकल टेप के साथ हीटिंग पैड को ठीक । सर्जिकल टेप का उपयोग कर माउस के अंगों को सुरक्षित करें।
    6. इंडबटिंग के लिए जानवर छोटी कैंची का उपयोग करके मध्याह्न गर्भाशय ग्रीवा की त्वचा में लगभग 1 सेमी का एक छोटा सा चीरा बनाते हैं।
      नोट: ओरल इंस्टीक्यूबेशन एक वैकल्पिक तरीका है जिसके लिए अधिक अनुभव की आवश्यकता होती है।
    7. एक कपास इत्तला दे दी applicator के साथ स्पष्ट रूप से मध्य स्तर पर पेरोटिड और उपमंडीबुलर लार ग्रंथियों को अलग करता है। यह श्वासनली की मांसपेशियों को बेनकाब करेगा।
    8. श्वासनली को उजागर करने वाली इन मांसपेशियों को सावधानी से काट लें।
    9. छोटी कैंची के साथ श्वासनली काराल्टेज के बीच एक छोटा सा चीरा बनाते हैं और तैयार एंडोट्रेक् सील ट्यूब डालें। इंट्रावैस्कुलर कैथेटर की मेटल गाइड को बाहर निकालें।
    10. कैथेटर को वेंटिलेटर से कनेक्ट करें। फेफड़ों को मैन्युअल रूप से धीरे-धीरे फुलाने से श्वास नली की स्थिति को सत्यापित करें। टेप के साथ स्थिति को सुरक्षित करें।
    11. प्रक्रिया के दौरान एक 1% आइसोफ्लुन एनेस्थीसिया बनाए रखें।
    12. नियमित रूप से अंगुली चुटकी पलटा परीक्षण करके संज्ञाहरण की गहराई की निगरानी करें। एनेस्थीसिया को तदनुसार समायोजित करें।
      नोट: प्रयोगों के दौरान अनुशंसित हृदय गति, 1% आइसोफ्लुएं एनेस्थीसिया के तहत, लगभग 400 धड़कता है / हृदय गति को नियंत्रित करने के लिए शरीर के तापमान और संज्ञाहरण का रखरखाव आवश्यक है। आइसोफ्लुन की अधिकता हृदय गति को कम कर सकती है। हालांकि आइसोफलुन रेट को कम करके रिकवरी हासिल की जा सकती है।
  3. आरवी दबाव माप (खुली छाती दृष्टिकोण)
    1. छोटी कैंची के साथ xiphoid प्रक्रिया और पेट के ऊपरी हिस्से पर लगभग 1 सेमी की त्वचा चीरा प्रदर्शन करते हैं। ऊपरी पेट के चतुर्भुज की छाती और पेट की दीवार को कवर करने वाली त्वचा को अलग करें: मध्य रेखा पर शुरू करें, xiphoid के लिए डिस्टल करें और ध्यान से दोनों तरफ बाद में आगे बढ़ें। रक्तस्राव को नियंत्रित करने के लिए थर्मोकुटेरी का उपयोग करें।
      नोट: लक्ष्य पेट की दीवार के माध्यम से छाती गुहा के लिए उपयोग किया है ।
    2. पेट की गुहा को खोलें और डायाफ्राम को ध्यान से काटें, इस बात का ध्यान रखें कि धड़कने वाले दिल या फेफड़ों को घायल न करें।
      नोट: लक्ष्य के लिए शीर्ष और दिल के सही वेंट्रिकल का पर्दाफाश है । कैथेटर के सही प्लेसमेंट के लिए दिल का अच्छा एक्सपोजर और व्यू महत्वपूर्ण है । प्रक्रिया के दौरान रक्तस्राव से बचने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। यहां तक कि इंट्रावैसल वॉल्यूम में छोटे-छोटे बदलाव भी सही दिल के लोड को बदल सकते हैं और रिकॉर्ड किए गए मापदंडों को प्रभावित कर सकते हैं।
    3. धीरे-धीरे एक कपास इत्तला दे दी applicator का उपयोग कर पेरिकार्डियम हटा दें।
    4. दिल में प्रेशर कैथेटर रखने से ठीक पहले कैथेटर को माउस के बगल में लाएं।
    5. सुई के साथ तैयार कपास इत्तला दे दी applicator का उपयोग सही वेंट्रिकल के एपिकल डिस्टल भाग में एक चाकू घाव बनाता है । ध्यान से सुई को हटा दें और इस छेद में प्रेशर कैथेटर डालें।
      नोट: यह बल लागू करने के बिना काम करना चाहिए । यदि यह संभव नहीं है, तो दिल की विस्तारित चोट से बचने के लिए पहले एक के पास एक नया छेद बनाने का प्रयास करें। सुई लगभग 3 मिमी से अधिक गहराई से नहीं डाला जाना चाहिए।
    6. पल्मोनरी धमनी का सामना करना पड़ टिप के साथ, सही वेंट्रिकल की दिशा के समानांतर दबाव कैथेटर डालें।
    7. कैथेटर की सही स्थिति सुनिश्चित करने के लिए दबाव तरंग ट्रेसिंग देखें। चित्र 2में प्रतिनिधि ट्रेसिंग का प्रदर्शन किया जाता है ।
    8. दबाव संकेत को स्थिर करने की अनुमति दें। श्वसन को रोकें और कम से कम 3 माप प्राप्त करें। अलग-अलग माप के बीच में जानवर को हवादार होने की अनुमति देता है।
    9. एक बार सभी माप दर्ज कर रहे है कैथेटर को हटा दें और यह पानी स्नान में PBS भरा ट्यूब में वापस जगह है ।
      नोट: प्रयोग पूरा होने के बाद, निर्माता के निर्देशों के अनुसार कैथेटर को साफ करें।
  4. इच्छामृत्यु और फेफड़ों का परफ्यूजन
    1. प्रयोग के पूरा होने पर उत्तेजन द्वारा माउस इच्छामृत्यु।
    2. छाती को व्यापक रूप से खोलें। कैंची का उपयोग करके, पूरे उरोस्थि को काटें और ध्यान दें कि दिल या फेफड़ों को घायल न करें।
    3. आईरिस कैंची का उपयोग करने से बाएं वेंट्रिकल में एक छोटा सा चीरा लगता है ताकि रक्त को कक्ष छोड़ने की अनुमति दी जा सके।
    4. पीबीएस की 10 एमएल वाली सिरिंज की 25 जी सुई को सही वेंट्रिकल में रखें और पीबीएस घोल को तब तक इंजेक्ट करें जब तक फेफड़े खून से साफ न हो जाएं।
    5. एक बार जब यह कदम पूरा हो जाता है, तो महत्वपूर्ण ऊतक फसल (दिल और फेफड़ों) द्वारा इच्छामृत्यु की पुष्टि करें: कावा और महाधमनी अनुलग्नकों को काटें और ब्लॉक मेंदिल और फेफड़ों को हटा दें।

3. मॉर्फोमेट्रिक लक्षण वर्णन

  1. दिल और फेफड़ों (चरण 2.4.5) को हटाने के तुरंत बाद, दिल को अलग करें और दोनों अटरिया को हटा दें। घुमावदार टेनोटॉमी कैंची के साथ बाएं वेंट्रिकल (एलवी) से दाएं वेंट्रिकल (आरवी) को सावधानीपूर्वक विच्छेदन करें, जिससे पट (एस) बाएं वेंट्रिकल के साथ छोड़ दिया जाता है। आरवी और एलवी + एस का वजन करें और फुल्टन इंडेक्स की गणना करें = आरवी/एलवी + एस(चित्रा 3)5,,9।
  2. सही वेंट्रिकल का एक हिस्सा लें और इसे एक अक्टूबर प्रीफिल्ड एम्बेडिंग मोल्ड में रखें। आरएनए और/या प्रोटीन विश्लेषण के लिए सही वेंट्रिकल के दूसरे हिस्से का उपयोग करें । सूखी बर्फ में स्नैप फ्रीज और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. दिल और किसी अन्य शेष ऊतक से फेफड़ों को अलग करने के लिए आईरिस कैंची का प्रयोग करें।
    नोट: फेफड़ों की तैयारी के लिए, ऊपर वर्णित परफ्यूजन (चरण 2.4.3-2.4.5) बहुत महत्व रखता है।
  4. स्नैप फेफड़ों का हिस्सा फ्रीज और आरएनए, प्रोटीन निष्कर्षण या अन्य परख के लिए इसे स्टोर करें।
  5. हिस्टोलॉजिकल एनालिसिस के लिए फेफड़ों के दूसरे हिस्से का इस्तेमाल करें। इस उद्देश्य के लिए, इस्तेमाल किए गए पालि10, 11,11के ब्रोंकस में 50% पीबीएस और 50% अक्टूबर युक्त सिरिंज डालें। प्रयोगकर्ता आसानी से देख सकता है कि जब सिरिंज की सामग्री ऊतक में व्याप्त हो जाती है तो फेफड़े फुला जाते हैं।
  6. अक्टूबर के साथ पहले से भरे मोल्डों एम्बेडिंग में फेफड़ों के इन टुकड़ों को रखें और उन्हें सूखी बर्फ में स्नैप फ्रीज करें। नमूनों को जमे हुए होने के बाद -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  7. क्रायोस्टेट मशीन का उपयोग करके आरवी और फेफड़ों के 8 माइक्रोन सेक्शन तैयार करें। हवा 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर वर्गों सूखी ।
  8. 10 मिनट के लिए 10% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) का उपयोग करके कमरे के तापमान पर स्लाइड ठीक करें।
    नोट: पीएफए एक ज्ञात मानव कैंसरकारक है। रासायनिक धुएं हुड, उचित प्रक्रियाओं और व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों का उपयोग करके जोखिम जोखिम को कम करें। अधिक जानकारी के लिए सामग्री सुरक्षा डेटा शीट (एमएसडीएस) को देखें।
  9. हेमटॉक्सीलिन/ईओसिन स्टेनिंग द्वारा वैस्कुलर रीमॉडलिंग असेसमेंट
    नोट: दिल के संरचनात्मक परिवर्तनों और फेफड़ों में संवहनी रीमॉडलिंग(चित्र 3)का आकलन करने के लिए हेमेटॉक्सीलिन/इओसिन धुंधला प्रदर्शन करें ।
    1. 8 मिनट के लिए हेमेटॉक्सीलिन समाधान के साथ दाग।
    2. 5 मिनट के लिए चल रहे नल के पानी के साथ कुल्ला आसुत पानी में एक त्वरित कुल्ला के बाद ।
    3. 1 मिनट के लिए 95% एटोह में कुल्ला और 1 मिनट के लिए Eosin समाधान में काउंटर दाग।
    4. निर्जलित (80% इथेनॉल 10-30 एस, 1 मिनट के लिए 100 इथेनॉल और 3 मिनट के लिए 100% टोलूल)।
    5. माउंट और एक कवरस्लिप के साथ कवर। कमरे के तापमान पर रात भर स्लाइड सुखाएं।
      नोट: धुंधला करने के लिए इस्तेमाल किया समाधान खतरनाक हो सकता है । रासायनिक धुएं हुड, उचित प्रक्रियाओं और व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों का उपयोग करके जोखिम जोखिम को कम करें। अधिक जानकारी के लिए एमएसडीएस को देखें।
  10. पिरोसिरियस रेड स्टेनिंग द्वारा राइट वेंट्रिकुलर फाइब्रोसिस मूल्यांकन
    नोट: पिरोसिरियस रेड स्टेनिंग में, पिरोसिरियस रेड, जो एसिड है,कोलेजन 12से बांधता है । इसलिए, इस धुंधला कोलेजन सामग्री की एक हिस्टोलॉजिकल परीक्षा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
    1. 1 घंटे के लिए 58 डिग्री सेल्सियस पर एक पूर्व गरम Bouin के समाधान में स्लाइड इनक्यूबेट।
    2. 10-15 मिनट के लिए वर्गों से पीले रंग को हटाने के लिए नल का पानी चलाने में स्लाइड धोएं।
    3. कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए 0.1% फास्ट ग्रीन में दाग।
    4. 1 मिनट के लिए 1% एसीटिक एसिड में कुल्ला।
    5. 5 मिनट के लिए नल के पानी में कुल्ला।
    6. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 0.1% सीरियस लाल रंग में दाग टोलूल में निर्जलीकरण के बाद।
      सावधानी: धुंधला करने के लिए उपयोग किए जाने वाले समाधान खतरनाक हो सकते हैं। रासायनिक धुएं हुड, उचित प्रक्रियाओं और व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों का उपयोग करके जोखिम जोखिम को कम करें। अधिक जानकारी के लिए एमएसडीएस को देखें।
  11. WGA स्टेनिंग द्वारा आरवी कार्डियोमायोसाइट हाइपरट्रॉफी मूल्यांकन
    नोट: सेलुलर स्तर पर सही वेंट्रिकल (आरवी) की हाइपरट्रॉफी का आकलन गेहूं के रोगाणु एग्लुटिनिन (डब्ल्यूजीए) स्टेनिंग(चित्रा 4)का प्रदर्शन करके किया जा सकता है।
    1. 15 मिनट के लिए ठंडे एसीटोन समाधान में स्लाइड ठीक करें और इसके बाद पीबीएस (प्रत्येक 5 मिनट) में धोने के 3 चरण।
    2. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए एक डाको समाधान में 10% बकरी सीरम के साथ ब्लॉक करें।
    3. WGA के साथ स्लाइड्स को इनक्यूबेट करें: WGA 1:200 जोड़ें और अंधेरे में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 1/2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    4. स्लाइड्स में पीबीएस से तीन बार धोएं।
    5. एक न्यूक्लिक एसिड डाई के साथ स्लाइड्स को इनक्यूबेट करें।
    6. स्लाइड्स में पीबीएस से तीन बार धोएं।
    7. बढ़ते के लिए, तरल की अधिकता को हटा दें और बढ़ते मीडिया और एक कवरलिप लागू करें। अंधेरे में कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए स्लाइड सुखाएं और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: धुंधला करने के लिए इस्तेमाल किया समाधान खतरनाक हो सकता है । रासायनिक धुएं हुड, उचित प्रक्रियाओं और व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों का उपयोग करके जोखिम जोखिम को कम करें। अधिक जानकारी के लिए एमएसडीएस को देखें।
  12. आगे और विशेष रूप से संवहनी रीमॉडलिंग का आकलन करने के लिए फेफड़ों की इम्यूनोकेमिस्ट्री करें। उदाहरण के लिए, जहाजों की मांसपेशियों का आकलन करने के लिए चिकनी मांसपेशी सेल धुंधला का उपयोग किया जा सकता है, जबकि वॉन विलेब्रांड फैक्टर धुंधला का उपयोग एंडोथेलियल परिवर्तनों की कल्पना करने के लिए किया जा सकता है। इन तरीकों को कहीं और वर्णित किया गया है5.

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल में, हम चूहों में पीएच उत्प्रेरण के लिए हाइपोक्सिया/SU5416 मॉडल के निर्माण का विस्तार से वर्णन करते हैं । इसके अलावा, हम अवलोकन अवधि के अंत में फेफड़े के संवहनी और हृदय मूल्यांकन करने के लिए सभी आवश्यक कदमों का विस्तार करते हैं।

इस मॉडल के लिए प्रायोगिक डिजाइन का अवलोकन चित्र 1ए 13,14में दिखाया गया है ।14 चूहों को नॉर्मोबट्रिक हाइपोक्सिया (10% ओ2)के अधीन किया जाता है और लगातार तीन सप्ताह तक SU5416 के साथ सप्ताह में एक बार इंजेक्शन दिया जाता है। इस प्रोटोकॉल में पीएच को प्रेरित करने के लिए उपयोग की जाने वाली उत्तेजनाओं को चित्र 1बी और1सीमें दिखाया गया है ।

VEGF रिसेप्टर विरोधी SU5416 एंडोथेलियल सेल एपोप्टोसिस पैदा करके कार्य करता है और इसलिए, एपोप्टोसिस प्रतिरोधी-एंडोथेलियल कोशिकाओं के प्रसार की अनुमति देता है। इससे पल्मोनरी वैसकुलेचर में वैस्कुलर रीमॉडलिंग होती है और संवहनी प्रतिरोध5में वृद्धि होती है । पल्मोनरी सर्कुलेशन में ऊंचा दबाव आरवी आफलोड को बढ़ाता है और उत्तरोत्तर आरवी डिसफंक्शन और फेलियर 9 की ओर लेजाताहै । पहले चरण में, हाइपोक्सिया/SU5416 प्रोटोकॉल की सफलता का मूल्यांकन अवलोकन अवधि के अंत में आरवी समारोह का कार्यात्मक रूप से आकलन करके किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल में, हम खुली छाती आरवी दबाव माप विधि का उपयोग करके आरवी सिस्टोलिक दबाव के आक्रामक आकलन का विस्तार से वर्णन करते हैं। प्रतिनिधि दबाव घटता है और सही वेंट्रिकुलर दबाव का मात्रात्मक विश्लेषण चित्र 2में प्रदर्शित किया जाता है ।

हम संवहनी रीमॉडलिंग की मात्रा कैसे निर्धारित कर सकते हैं, जिससे संवहनी प्रतिरोध और फलस्वरूप पीएच की ओर जाता है? हिस्टोमॉर्मोमेट्री पल्मोनरी वैक्यूलेचर की विशेषता के लिए सोने का मानक है। इस प्रोटोकॉल में, हम हेमटॉक्सीलिन और ईओसिन स्टेनिंग (एच एंड ई) प्रोटोकॉल का विस्तार से वर्णन करते हैं। छवियों को धुंधला करने और कैप्चर करने के बाद, फेफड़े की धमनियों को छोटे (<50 माइक्रोन) और बड़े लोगों (> 50 माइक्रोन) में प्रतिष्ठित किया जा सकता है। ब्रोंकियल धमनियों को हमारे अध्ययन से बाहर रखा गया था। मध्य मोटाई का आकलन करने के लिए, बाहरी (ईडी), साथ ही धमनियों के आंतरिक व्यास (आईडी) को मापा जाता है। हाइपोक्सिया/SU5416 उपचार के बाद पुनः तैयार फेफड़े की धमनियों के प्रतिनिधि छवियां चित्र 3ए में दिखाई जाती हैं। पार अनुभागीय व्यास के संबंध में धमनियों का प्रतिशत मोटाई का प्रतिशत चित्र 3बीमें दिखायागया है । डिस्टल पल्मोनरी धमनियों का मॉर्फोमेट्रिक विश्लेषण हाइपोक्सिया/SU5416-इलाज चूहों में नॉर्मॉक्सिया जानवरों(चित्रा 3)की तुलना में मध्य मोटाई में उल्लेखनीय वृद्धि को दर्शाता है ।

बढ़े हुए आशोष से आरवी हाइपरट्रॉफी हो जाती है और जैसे - जैसे यह रोग आरवी फाइब्रोसिस9,15तक बढ़ता है . आरवी हाइपरट्रॉफी का आकलन फुल्टन इंडेक्स (आरवी/एलवी + सेप्टम) के साथ-साथ कार्डियोमायोसाइट (सीएम) हाइपरट्रॉफी को मापकर मॉर्फोमेट्रिकली किया जा सकता है । बाएं वेंट्रिकल (एलवी) प्लस पट [आरवी/(एलवी +S)] के लिए दाएं वेंट्रिकल (आरवी) के वजन अनुपात की गणना दाएं वेंट्रिकुलर हाइपरट्रॉफी के सूचकांक के रूप में की जाती है। हाइपोक्सिया/SU5416 और नॉर्मोक्सिया चूहों में फुल्टन इंडेक्स से प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 4बीमें दिखाए गए हैं । सीएम हाइपरट्रॉफी का आकलन करने के लिए यहां वर्णित विधि गेहूं रोगाणु एग्लुटिनिन (डब्ल्यूजीए) के साथ सही वेंट्रिकुलर वर्गों का धुंधला है । डब्ल्यूजीए कोशिका झिल्ली के ग्लाइकोप्रोटीन से बांधता है और इसका उपयोग मायोसाइट्स16, 17,17के क्रॉस-सेक्शनल क्षेत्र को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। डब्ल्यूजीए से दागदार सही वेंट्रिकुलर वर्गों की प्रतिनिधि छवियां चित्र 4एमें दिखाई जाती हैं । रोगग्रस्त और नियंत्रण चूहों दोनों में सीएम क्षेत्र के मात्राकरण चित्रा 4ए हाइपोक्सिया/SU5416 एक्सपोजर परिणामों में कार्डियोमायोसाइट आकार और सही वेंट्रिकुलर हाइपरट्रॉफी(चित्रा 4)में उल्लेखनीय वृद्धि हुई है। हमने और अन्य लोगों ने पहले दिखाया है कि, जब एकल हिट (केवल हाइपोक्सिया) की तुलना में, हाइपोक्सिया/SU5416 आरवी फेनोटाइप5,,18को बढ़ा देता है।

Figure 1
चित्रा 1:हाइपोक्सिया/SU5416 विधि का अवलोकन । (क) हाइपोक्सिया/SU5416 माउस मॉडल के लिए प्रायोगिक डिजाइन । SU5416 लगातार 3 हफ्तों के लिए एक सप्ताह में एक बार चमड़े के इंजेक्शन है । (ख) हाइपोक्सिया प्रणाली का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । नियंत्रक होश और गैस जलसेक ट्यूब के माध्यम से नाइट्रोजन जलसेक द्वारा कक्ष के अंदर ऑक्सीजन को नियंत्रित करता है । (ग)SU5416 की रासायनिक संरचना । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:चूहों में सही वेंट्रिकुलर दबाव जो कि SU5416 इंजेक्शन के साथ संयुक्त पुरानी हाइपोक्सिया के संपर्क में है।(ए)सही वेंट्रिकल (आरवी) के आक्रामक दबाव माप के प्रतिनिधि ट्रेसिंग। (ख)हाइपोक्सिया/SU5416 चूहों में आरवी सिस्टोलिक प्रेशर और नॉर्मोक्सिया के संपर्क में आने वाले जानवरों को नियंत्रित करें । n = प्रति समूह 6-8 चूहों। पी एंड एलटी; 0.001। सभी मात्रात्मक डेटा एसईएम ± साधन के रूप में सूचित किए जाते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3:हाइपोक्सिया/SU5416 पल्मोनरी वैस्कुलर रीमॉडलिंग को प्रेरित करता है। (क) संकेतित समूहों से फेफड़ों के प्रतिनिधि हेमटॉक्सीलिन/ईओसिन-दाग वर्गों ने हाइपोक्सिया/SU5416 चूहों की फेफड़े की धमनियों में मीडिया की दीवार की मोटाई में वृद्धि का प्रदर्शन किया । स्केल बार: 50 माइक्रोन। (ख) धमनियों का प्रतिशत क्रॉस-सेक्शनल व्यास के संबंध में मोटाई का मध्य ागत । n = प्रति समूह 5 चूहे। पी एंड एलटी; 0.001। सभी मात्रात्मक डेटा एसईएम ± साधन के रूप में सूचित किए जाते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:चूहों में दाएं वेंट्रिकुलर हाइपरट्रॉफी जो कि SU5416 इंजेक्शन के साथ संयुक्त क्रोनिक हाइपोक्सिया के संपर्क में हैं। (ए)(बाएं) प्रतिनिधि डब्ल्यूजीए (गेहूं रोगाणु एग्लुटिनिन) संकेत उपचार के बाद दाएं वेंट्रिकुलर ऊतक का धुंधला। स्केल बार: 50 माइक्रोन। (दाएं) आंकड़ों का मात्रात्मक विश्लेषण। n = प्रति समूह 5 चूहे। (ख)आरवी हाइपरट्रॉफी प्रत्येक समूह में एलवी प्लस इंटरस्ट्रिकुलर पट (एस) भार अनुपात (फुल्टन इंडेक्स= आरवी/एलवी + एस) से अधिक आरवी वजन से परिलक्षित होता है । n = प्रति समूह 8 चूहों। पी एंड एलटी; 0.001। सभी मात्रात्मक डेटा एसईएम ± साधन के रूप में सूचित किए जाते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे दो रोग उत्तेजनाओं के संयोजन से चूहों में पीएच मॉडल के लिए: पुरानी हाइपोक्सिया और SU5416 इंजेक्शन (Hypoxia/SU5416)18। मानव पीएच स्थिति के साथ इस माउस मॉडल को सहसंबंधित करने के प्रयास में, तालिका 1में दिखाए गए वर्तमान पीएच वर्गीकरण को अनिवार्य रूप से देखना चाहिए। लगभग सभी रूपों में पीएच को फेफड़े के वासोकॉन्स्ट्रक्शन और एंडोथेलियल और चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के उल्लंघन प्रसार की विशेषता है। इससे फेफड़े की धमनियों में दबाव बढ़ जाता है और परिणामस्वरूप सही वेंट्रिकल का आँसलोड बढ़ जाता है।

पीएच के एक पशु मॉडल की विशेषता के लिए हर प्रयास में फेफड़े के वास्कुलेचर और सही वेंट्रिकल के हिस्टोपैथोलॉजिकल रीमॉडलिंग के सबूत शामिल होने चाहिए। एकल हिट हाइपोक्सिया माउस मॉडल में वैकुलेचर रिमॉडलिंग2, 3,का हल्का रूपहोताहै। इन रोग निष्कर्षों में पहले गैर-मस्कुलरीकृत जहाजों की मांसपेशियों में शामिल है, जिसमें एंडोथेलियल सेल, चिकनी मांसपेशी कोशिका और फाइब्रोब्लास्ट प्रसार शामिल हैं। ये निष्कर्ष दूसरी हिट (SU5416 इंजेक्शन) के अलावा से बढ़ रहे हैं । प्रभाव एकल हिट (हाइपोक्सिया) मॉडल में प्रतिवर्ती और केवल आंशिक रूप से हाइपोक्सिया/SU5416 मॉडल में प्रतिवर्ती हैं ।

पीएच रोगियों के लिए मौत का मुख्य कारण सही वेंट्रिकुलर विफलता (RVF)4,,20है । पशु मॉडल में पल्मोनरी वैस्कुलर रीमॉडलिंग हमेशा आरवीएफ के साथ नहीं होती है। आरवीएफ रूपात्मक के संदर्भ में एक पशु मॉडल की विशेषता के लिए, कार्यात्मक और आणविक डेटा का विश्लेषण किया जाना चाहिए। बाद इस प्रोटोकॉल के दायरे से बाहर है । आरवी रूपात्मक रीमॉडलिंग में मैक्रो और सूक्ष्म दोनों पहलू शामिल हैं। मैक्रोस्कोपिकल स्तर पर, आरवी हाइपरट्रॉफी के लिए मुख्य सूचकांक फुल्टन इंडेक्स है, जो बाएं वेंट्रिकुलर (एलवी) और पट (एस) वजन (आरवी/एलवी + एस) द्वारा विभाजित आरवी के वजन के रूप में परिभाषित किया गया है। सूक्ष्म स्तर पर, फाइब्रोसिस, सूजन, और हाइपरट्रॉफी क्रमशः सीरियस रेड, हेमटॉक्सीलिन/इओसिन और डब्ल्यूजीए स्टेनिंग द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है।

माउस हाइपोक्सिया/SU5146 मॉडल (जो यहां वर्णित है) एक आरवी रोग से पता चलता है, के रूप में ऊंचा सिस्टोलिक दबाव और रूपात्मक मापदंड से मापा । पल्मोनरी वैस्कुलर रिमॉडलिंग के बारे में, प्रोटोकॉल की शुरुआत के तीन सप्ताह बाद मध्य पर हाइपरट्रॉफी मनाया जाता है। चूहों में हाइपोक्सिया/SU5416 मॉडल की तुलना में, माउस मॉडल आरवी विफलता (केवल मध्यम शिथिलता) का कारण नहीं बनता है, गंभीर रूप से रोगग्रस्त मनुष्यों में मनाया जाता है, और नॉर्मोक्सिया में लौटने के बाद फेफड़े की विकृति। कुल मिलाकर, माउस हाइपोक्सिया/SU5416 मॉडल पीएच में सामने आई वैस्कुलर चोट की नकल करने के लिए उपयुक्त है, मुख्य रूप से समूह 1 (आंशिक रूप से समूह III, तालिका 1)1,,19देखें । इस मॉडल का लाभ जंगली प्रकार (आनुवंशिक रूप से असंशोधित) चूहों में आवेदन, अपेक्षाकृत आसान और कम लागत वाले कार्यान्वयन, रोगग्रस्त जानवरों की अपेक्षाकृत कम मृत्यु दर, और ब्याज की बीमारी (3 सप्ताह) का त्वरित विकास है। पीएच रोकथाम और चिकित्सा अध्ययन आसानी से इस मॉडल में लागू किया जा सकता है, उन्नत कौशल की आवश्यकता के बिना के रूप में शल्य कृंतक मॉडल के विपरीत ।

प्रोटोकॉल को लागू करते समय कुछ महत्वपूर्ण कदम होते हैं, जिन्हें ध्यान में रखना चाहिए। अध्ययन की योजना बनाते समय, किसी को ध्यान रखना चाहिए कि हाइपोक्सिया/SU5416 समूह में जानवरों की मृत्यु दर 0-10% (अप्रकाशित टिप्पणियों) के बीच भिन्न होती है। इसलिए, सांख्यिकीय शक्ति तक पहुंचने और कम शक्ति वाले अध्ययनों से बचने के लिए, प्रति समूह कम से कम 10 चूहों की सिफारिश की जाती है। SU5416 की घुलनशीलता कम है। इसलिए, DMSO या किसी अन्य सॉल्वेंट (जैसे Carboxymethyl सेल्यूलोज, सीएमसी) का उपयोग किया जाना है। उच्च खुराक में डीएमएसओ विषाक्त हो सकता है। चूहों में चमड़े के नीचे (एससी) उपयोग के लिएएलडी 50 13.9 - 25.6 ग्राम/किलो21, 22,22बताया गया है। एलडी50 को एक निर्धारित परीक्षण अवधि 21,22के बाद21एक परीक्षण आबादी के 50% सदस्यों को मारने के लिए आवश्यक खुराक के रूप में परिभाषित किया गया है। एक माउस के लिए जिसका वजन 25 ग्राम, 4.4 ग्राम/किलो का डीएमएसओ (1.1 ग्राम/एमएल और 0.1 एमएल एप्लाइड एससी/माउस के डीएमएसओ घनत्व के आधार पर गणना) किया जाता है। इसलिए, चमड़े की खुराक एलडी50 मूल्य की तुलना में बहुत कम है। हमारे हाथों में, DMSO में भंग SU5416 के आवेदन, जैसा कि यहां वर्णित है, कुछ मामलों में त्वचा जलन पैदा कर सकता है, लेकिन कोई अन्य विषाक्त प्रभाव नहीं देखा जाता है। हालांकि, कई रिपोर्टों SU541614के लिए एक वैकल्पिक वाहन के रूप में सीएमसी के उपयोग की सिफारिश । आरवी कार्यात्मक माप करते समय, शरीर के तापमान, रक्तस्राव और संज्ञाहरण की गहराई पर बारीकी से ध्यान दिया जाना चाहिए, जैसा कि माउस सजगता का परीक्षण करके मूल्यांकन किया जाता है। आरवी दबाव का आकलन करने के लिए खुली छाती तकनीक, जैसा कि यहां वर्णित है, एक अनुभवहीन उपयोगकर्ता द्वारा आसानी से लागू किए जाने का लाभ है। बंद छाती विधि (कहीं औरवर्णित 23,,24,,25)कम आक्रामक होने का लाभ है और इसलिए, गैर टर्मिनल प्रयोगों में भी लागू किया जा सकता है । इसके लिए उच्च स्तर की विशेषज्ञता की आवश्यकता है ।

चूहों में हाइपोक्सिया/SU5416 मॉडल के पहले विवरण के बाद, माउस मॉडल का सफलतापूर्वक कई अध्ययनों में उपयोग किया गया है5,,9,,13। हालांकि, इस बात के सबूत हैं कि परिणाम चूहों की आनुवंशिक पृष्ठभूमि और सेक्स, SU5416 के निर्माता और SU5416 इंजेक्शन26की आवृत्ति पर निर्भर करते हैं। लगातार तीन हफ्तों में SU5416 इंजेक्शन चूहों में पीएच की ओर जाता है, एक खुराक पीएच4प्रेरित नहीं होगा । इसके अलावा, पीएच के अन्य रूपों, जैसे कि बाएं हृदय रोग से जुड़े या क्रोनिक थ्रोम्बोलिक रोग के कारण, एटियोलॉजी से संबंधित मॉडलों की आवश्यकता होती है। अनुवाद अध्ययन के लिए मार्ग प्रशस्त करने में सक्षम होने से पहले, नए उपचारों का कम से कम 2 विभिन्न पशु मॉडलों में परीक्षण किया जाना चाहिए।

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Disclosures

लेखकों के पास घोषणा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (एएचए-17SDG33370112 और 18IPA34170258) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों NIH K01 HL135474 से Y.S. O.B को ड्यूश हर्ज़स्टिफ्टंग द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid glacial Roth 3738.1
Acetone, Histology Grade The Lab Depot VT110D
ADVantage Pressure-Volume System Transonic ADV500
Bouin's solution Sigma Ht10132
Cautery System Fine Science Tools 18000-00
Connection tubing and valves
Cotton-Tipped Applicators Covidien 8884541300
Coverslips, 24 x50 mm Roth 1871
Data Acquisition and Analysis Emka iox2
Direct Red 80 Sigma 365548-5G
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) Sigma Aldrich 276855
Dry ice
Dumont # 5 forceps Fine Science Tools 11251-10
Dumont # 7 Fine Forceps Fine Science Tools 11274-20
Embedding molds Sigma Aldrich E-6032
Eosin Solution Aqueous Sigma HT110216
Ethanol, laboratory Grade Carolina Biological Supply Company 861285
Fast Green FCF Sigma F7252-5G
Fine scissors Fine Science Tools 14090-09
Goat Serum invitrogen 16210-064
Heating pad  Gaymar  T/Pump
Hematoxylin 2 Thermo Scientific 7231
Hypoxic chamber Biospherix A30274P
Induction chamber DRE Veterinary 12570
Intubation catheter (i.v. catheter SurFlash (20 G x 1") ) Terumo  SR*FF2025
Iris scissors Fine Science Tools 14084-08
Isoflurane Baxter NDC-10019-360-40
Isoflurane vaporizer DRE Veterinary 12432
Mice (C57BL/6) Charles River
Needles 25 G x 5/8" BD 305122
OCT Tissue Tek 4583
PBS (Phosphate Buffered Saline) Corning 21-031-CV
Piric Acid- Saturated Solution 1.3 % Sigma P6744-1GA
Pressure volume catheter Transonic FTH-1212B-4018
Retractor Kent Scientific SURGI-5001
Static oxygen Controller ProOx 360 Biospherix P360
SU 5416 Sigma Aldrich S8442
Surgical Suture, black braided silk, 5.0 Surgical Specialties Corp.  SP116
Surgical tape 3M 1527-1
Syringe 10 ml BD 303134
Syringes with needle 1 ml BD 309626
Sytox Green Nuclein Acid Stain Thermo Scientific S7020
Tenotomy scissors Pricon 60-521
Toluol Roth 9558.3
Ventilator  CWE SAR-830/P
WGA Alexa Fluor  Thermo Scientific W11261
Xylene Roth

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References

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मेडिसिन अंक 160 हाइपोक्सिया SU5416 सुजेन पल्मोनरी हाइपरटेंशन पीएच राइट वेंट्रिकुलर प्रेशर पल्मोनरी वैस्कुलर रिमॉडलिंग राइट वेंट्रिकुलर रीमॉडलिंग
हाइपोक्सिया/SU5416 मॉडल का उपयोग कर चूहों में फेफड़े के उच्च रक्तचाप का प्रेरण और लक्षण वर्णन
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Bikou, O., Hajjar, R. J., Hadri, L., … More

Bikou, O., Hajjar, R. J., Hadri, L., Sassi, Y. Induction and Characterization of Pulmonary Hypertension in Mice using the Hypoxia/SU5416 Model. J. Vis. Exp. (160), e59252, doi:10.3791/59252 (2020).

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