Summary
Detta protokoll beskriver induktion av lunghypertension (PH) hos möss baserat på exponeringen för hypoxi och injektion av en VEGF-receptorantagonist. Djuren utvecklar PH och höger ventrikulära (RV) hypertrofi 3 veckor efter inledandet av protokollet. Modellens funktionella och morfinmetriska karakterisering presenteras också.
Abstract
Pulmonell Hypertoni (PH) är ett patofysiologiskt tillstånd, definierat med ett medelfymtärt artärtryck som överstiger 25 mm Hg i vila, enligt bedömning av höger hjärtkateterisering. Ett brett spektrum av sjukdomar kan leda till PH, olika i deras etiologi, histopatologi, klinisk presentation, prognos och svar på behandling. Trots betydande framsteg under de senaste åren, ph är fortfarande en ocured sjukdom. Att förstå de underliggande mekanismerna kan bana väg för utvecklingen av nya terapier. Djurmodeller är viktiga forskningsverktyg för att nå detta mål. För närvarande finns det flera modeller tillgängliga för rekapitulering PH. Detta protokoll beskriver en två-hit mus PH-modell. Stimuli för PH utveckling är hypoxi och injektionen av SU5416, en vaskulär endotel tillväxtfaktor (VEGF) receptorantagonist. Tre veckor efter inledandet av Hypoxi/SU5416, djur utveckla pulmonell Vaskulär remodeling imitera de histopatologiska förändringar som observerats i mänskliga PH (främst grupp 1). Vaskulär remodeling i lungcirkulationen resulterar i remodeling av den högra ventrikeln (RV). Förfarandena för mätning av RV-tryck (med hjälp av metoden med öppet bröst), RV:s morphometricalanalyser (genom dissekering och vägning av både hjärtkammar) och de histologiska bedömningarna av ombildningen (både pulmonell genom bedömning av vaskulär ombyggnad och hjärt genom att bedöma RV kardiomycythypertrofi och fibros) beskrivs i detalj. Fördelarna med detta protokoll är möjligheten att ansökan både i vild typ och i genetiskt modifierade möss, den relativt enkla och billiga genomförandet, och den snabba utvecklingen av sjukdomen av intresse (3 veckor). Begränsningar av denna metod är att möss inte utvecklar en allvarlig fenotyp och PH är reversibel vid återkomsten till normoxia. Förebyggande, liksom terapistudier, kan lätt genomföras i denna modell, utan nödvändigheten av avancerade färdigheter (i motsats till kirurgiska gnagare modeller).
Introduction
Pulmonell Hypertension (PH) är ett patofysiologiskt tillstånd, definierat med ett medelpulorskt arteriellt (PA) tryck som överstiger 25 mm Hg i vila, enligt bedömning av höger hjärtkateterisering1,2. Det finns en mängd olika sjukdomar som kan leda till PH. I ett försök att organisera de PH-associerade villkoren har flera klassificeringssystem utvecklats. Den nuvarande kliniska klassificeringen kategoriserar de flera PH-associerade sjukdomarna i 5 olika grupper1. Denna distinktion är av betydelse eftersom olika grupper av patienter har sjukdomar som skiljer sig i sin kliniska presentation, patologi, prognos, och svar på behandling2. Tabell 1 sammanfattar den nuvarande klassificeringen, kompletterad med de grundläggande histopatologiska egenskaperna hos varje sjukdom.
Tabell 1: Översikt av den kliniska klassificeringen av PH, tillsammans med de viktigaste histopatologiska inslagen inom grupperna. Lämplighet för hypoxi/SU5416-protokollet för modellering av PH. Den här tabellen har ändrats från19. PH: Pulmonell Hypertension, PAH: Pulmonell Arteriell Hypertoni
Trots betydande framsteg i behandlingen av PH-associerade sjukdomar, ph fortfarande kvar utan ett botemedel, med en 3-års dödlighet mellan 20% och 80%3. Detta indikerar det tvingande behovet av att förstå de underliggande mekanismerna för PH och, därefter, utvecklingen av nya terapier för att förhindra, bromsa utvecklingen och bota sjukdomen. Djurmodeller är av avgörande betydelse för denna omfattning. För närvarande finns olika modeller för att studera PH. Den intresserade läsaren hänvisas till den utmärkta recensioner om detta ämne2,3,4. Med tanke på de olika sjukdomar som leder till PH, är det uppenbart att de olika villkoren för mänskliga PH inte kan vara perfekt sammanfattas i ett djur modell. De djurmodeller som finns tillgängliga kan kategoriseras i i) single-hit, ii) två-hit, iii) knockout, och iv) överuttryck modeller3. I de single-hit modellerna, PH induceras av en enda patologisk stimulans, medan två-hit modeller kombinera två patologiska stimuli med målet att inducera mer allvarliga PH och därmed närmare imitera den komplexa mänskliga sjukdomen. Förutom de etiologiska skillnaderna resulterar de flera stimulina i PH-modelleringsskillnader som beror också på arten och djurens genetiska bakgrund4.
En av de mest använda klassiska PH-gnagarmodellerna är den kroniska hypoximodellen2. Hypoxi är känt för att inducera PH hos människor samt hos flera djurarter. Hypoxi har fördelen av att vara en fysiologstimulans för PH (Tabell 1). Men medan graden av hypoxi som används för att inducera PH hos gnagare är mycket allvarligare än hos människor, leder den enda förolämpningen (hypoxi) endast till en mild form av vaskulär ombyggnad. Detta imiterar inte svårighetsgraden av den mänskliga sjukdomen. Tillägg av en andra-träff, en extra stimulans för att inducera PH, visade lovande resultat: injektion av föreningen SU5416 till gnagare i kombination med den hypoxiska stimulans inducerar en mer allvarlig PH fenotyp2,5,6. SU5416 är en hämmare av vaskulär endoteltillväxtfaktor (VEGF) receptor-2. Det blockerar VEGF-receptorerna och leder till endotelcell apoptos. Under hypoxiska förhållanden stimulerar detta proliferationen av en delmängd av apoptosresistenta endotelceller. Vidare, SU5416 leder till glatt muskel cellproliferation. Kombinationen av dessa effekter resulterar i patologiskt vaskulär ombyggnad av pulmonell cirkulation och leder till förhöjt PA-tryck och högerkammarremodellering2,5,7. Modellen beskrevs först hos råttor6 och senare applicerades på möss4,5,7. Musmodellen uppvisar mindre allvarlig vaskulär ombyggnad jämfört med råttor. Vidare, när den returneras till normoxia, PH fortsätter att utvecklas hos råttor, medan det hos möss är delvis reversibel.
I följande protokoll beskrivs alla steg för modellering av PH i möss med metoden Hypoxi/SU5416 (planering, tidslinje, körning). Dessutom är karakterisering av modellen beskrivs i detta protokoll: funktionellt (genom invasivt mäta den högra Ventrikulärt (RV) tryck med hjälp av den öppna bröstet tekniken), morphometrically (genom dissekera och väga både höger och vänster ventriklar), samt histologiskt (genom att utvärdera pulmonell vaskulär remodeling, höger ventrikulär kardiomycyt hypertrofi och fibros).
Alla steg och metoder som beskrivs i detta protokoll kan enkelt genomföras av utredare på någon erfarenhetsnivå. Medan de funktionella mätningar av RV med hjälp av den öppna bröst teknik (beskrivs här) är inte guldmyntfoten metoden i fält, har den fördelen att det snabbt kan läras och exakt återges även av en mindre erfaren experimentör.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Före alla djurförsök få den lokala institutionella djurvårdskommittén tillstånd. De nuvarande experimenten utfördes efter godkännande av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Icahn School of Medicine på Mount Sinai.
1. PH induktion
- Förberedelser
- Innan studien påbörjas, planera noggrant den experimentella designen. Se till att möss utsätts för hypoxi vid samma tidpunkt som den första SU5416-injektionen. Ett exempel på den experimentella konstruktionen för att inducera PH med hypoxi/SU5416-metoden visas i figur 1A. Kontrollmöss fick endast fordonet. För denna modell kommer SU5416 att injiceras till mössen en gång per vecka under 3 på varandra följande veckor.
- Använd åtta till tolv veckor gamla C57BL/6-möss för denna studie. Hus djuren på 18-20 °C i en 12-h ljus-mörker cykel. Se till att mat och vatten är åtkomliga ad libitum.
- Väg djuren. Tilldela dem slumpmässigt till varje grupp: Normoxia och Hypoxi/SU5416.
- Förbered den hypoxiska kammaren enligt bild 1B. Säkra kväve (N2) tankar nära kammaren. Ställ in styrenheten för syrgas (O2)på en punkt av 10% O2. Låt systemet nå ett stabilt tillstånd.
- Förbered SU5416 för injektion (använd en dos på 20 mg/kg kroppsvikt). SU5416 löses inte upp i vattenlösningar; därför lös upp den beräknade mängden i 100 μL DMSO8. För en 25 g mus är exempelvis mängden SU5416 som ska injiceras 0,5 mg upplöst i 100 μL-lösningsmedel (DMSO). Den slutliga koncentrationen av SU5416 för den här musen är därför 5 mg/mL.
FÖRSIKTIGHET: SU5416 är ett farligt material. Läs noga igenom Säkerhetsdatabladet som produkten åtföljer och se till att vidta de rekommenderade försiktighetsåtgärderna vid hantering av detta ämne. Använd skyddshandskar och (som för eventuell injektion) använd ögonskydd. Den kemiska strukturen hos SU5416 visas i figur 1C.
OBS: Beräkna ett lämpligt överskott av lösningen för att kompensera för den volym som kommer att gå förlorad under injektionen (t.ex. i sprutan, injektionsflaskan etc.). Beroende på vilken spruta som används är dödvolymen cirka 200 μL. För en grupp på 10 möss, beräkna ett överskott av 2 musdoser. - Förbered sprutorna för injektion. Använd 1 mL-sprutor med en 25 G x 5/8"-nålar.
- SU5416 subkutan injektion
- Hindra djuret. Placera musen på locket på buren för att hjälpa fasthållningsanordning. Ta tag i huden och bilda ett tält parallellt med ryggraden. Se till att greppa till baksidan av huvudet tätt, för att undvika den potentiella bita skada av musen.
OBS: Närvaron av två prövare gör proceduren snabbare och mer exakt eftersom den ena kan hålla djuret medan den andra utför injektionen. - Stick in nålen subkutant över flanken vid hudens lösa veck. Se till att för in nålen parallellt med huden. Undvik att tränga in i bukväggen.
- Injicera sprutans innehåll (100 μL löst SU5416 eller fordon).
OBS: För att undvika läckage efter fullständig leverans, håll sprutan i cirka 10 s och rotera nålen en aning under huden. - Återta nålen och återför djuret till sin bur. Efter SU5416 injektion, placera burarna i ventilerade hypoxi kammaren.
- Hindra djuret. Placera musen på locket på buren för att hjälpa fasthållningsanordning. Ta tag i huden och bilda ett tält parallellt med ryggraden. Se till att greppa till baksidan av huvudet tätt, för att undvika den potentiella bita skada av musen.
- Exponering för hypoxi
- Övervaka ventilationen över tid. Se till att bibehålla 10% av syretillförseln. Upprätthålla normoxidjur i en halvseglebar kammare i vid 21% O2.
- Se till att kamrarna är utrustade med en syresensor för att mäta syrenivån. Undvik omfattande öppning av kamrarna. För rengöring och tillsätta mat och vatten öppna kamrarna i högst 20 min var 3 dagar.
- Inspektera djur dagligen. Överväg stresssignaler såsom piloerection eller betydande förlust av vikt.
OBS: Djur under Hypoxi/SU5416 förväntas gå ner i vikt5. Detta är en indikation på sjukdomsutveckling. - Upprepa SU5416 injektion varje vecka under 3 veckor i följd (se bild 1A för översikten över den experimentella utformningen).
OBS: Varierande injektionsstället kan bidra till att minska hudirritationer.
2. Funktionell karakterisering genom invasiva RV-tryckmätningar
- Förberedelser
OBS: Välj en narkosregim. Injicerbara eller inhalerbara bedövningsmedel kan användas. Eftersom en liten överdos av injicerbara bedövningsmedel (särskilt från ketamin/xylazin eller pentobarbital) kan påverka hjärtfunktionen avsevärt, rekommenderas användning av flyktiga bedövningsmedel. Det är av stor vikt att använda samma bedövningsmedel för alla möss inom en studie.- Använd en spridare för att försäkra en korrekt bedövningsmedel dos per djur. Dosen för isofluran är som följande: induktion 3-4%, underhåll 1% blandat med 100% syre.
OBS: Använd personlig skyddsutrustning och undvik att andas ångan. - Förbered en värmedyna och/eller värmande lampor för att hålla kroppstemperaturen. Förbered en rektal temperatursond för övervakning kroppstemperatur.
- Se till att ventilationen är korrekt. Förbered ventilatorn i förväg. Förbered Y-rörkontakten och kontrollera ventilatorns funktion med hjälp av det manuella läget. Se till att inandningstrycket är <1 cm H2O för att undvika barotrauma. Ställ in andningsfrekvensen till 110 andetag/min.
- Förbered ett endotrakealrör genom att skära en 20 G intravaskulär kateter.
- Förbered de instrument som behövs: små tång, sax, elastiska krok upprullningsdon, kärrauterizer, och bomullspinne. På en bomullspinne justera en liten 25 G x 5/8 "nål som kommer att användas för att göra en liten punktering i den högra ventrikeln.
- Förbered Tryckkatetern, Tryck-volymstyrenheten och initiera dataanskaffningsprogrammet. Placera PV-katetern i ett 15 mL-rör fyllt med PBS vid 37 °C i 15 min och kalibrera enligt tillverkarens protokoll.
- För perfusion och fixering av organen, förbered PBS och en lösning på 50% PBS / 50% OKT. Förbered 2 x 10 mL-sprutor (med en 25 G-nål): en kommer att användas för perfusing av hjärta och lunga med PBS in situ och den andra för att injicera OCT/ PBS (50/50) lösning till lungexempeln som kommer att användas för histoundersökning.
- Använd en spridare för att försäkra en korrekt bedövningsmedel dos per djur. Dosen för isofluran är som följande: induktion 3-4%, underhåll 1% blandat med 100% syre.
- Intubation
- Väg musen och registrera hälsostatus före anestesi.
- Framkalla anestesi med 3-4% isofluran. Kontrollera anestesidjupet genom att testa tå-nypa reflex: nyp tå av en av armar och ben ordentligt. Om djuret drar tillbaka lemmen är det ett tecken på otillräcklig anestesi.
- Efter anestesiinduktion, raka halsen och bröstet områden.
- Placera musen på värmedynan. Placera en rektal temperatursond för övervakning av kroppstemperaturen.
OBS: Underhåll av kroppstemperaturen är av betydelse för de funktionella mätningarna. Kroppstemperaturen bör vara cirka 36,5-37 °C. - Använda böjda tlyktor fästa en sutur tråd till de övre framtimorna av musen, sträcka och fixera till värmedynan med kirurgisk tejp. Säkra musens lemmar med hjälp av kirurgband.
- För intuberande djuret göra ett litet snitt på cirka 1 cm i den mediala cervikal hud med hjälp av små saxar.
OBS: Oral intubation är en alternativ metod som kräver mer erfarenhet. - Med en bomull-tippade applikator separat rakt på sak den parotid och submandibular salivary körtlar vid mellannivå. Detta kommer att exponera musklerna överlydande luftstrupen.
- Skär försiktigt dessa muskler utsätta luftstrupen.
- Med små saxar göra ett litet snitt mellan trakeal brosk och sätt in den förberedda endotrakeal röret. Ta ut metallguiden av den intravaskulära katetern.
- Anslut katetern till ventilatorn. Verifiera trakealrörets position genom att manuellt försiktigt blåsa upp lungorna. Säkra positionen med tejp.
- Upprätthålla en 1% isofluran anestesi under hela förfarandet.
- Övervaka regelbundet anestesidjupet genom att testa tånyckreflexen. Justera anestesi därefter.
OBS: Den rekommenderade pulsen under experimenten, under 1% isofluran anestesi, är cirka 400 slag / min. Underhåll av kroppstemperatur och anestesi är avgörande för att kontrollera hjärtfrekvensen. Överskott av isofluran kan minska hjärtfrekvensen. Återhämtning kan dock uppnås genom att minska isofluranhastigheten.
- RV-tryckmätningar (öppet bröst tillvägagångssätt)
- Med små saxar utföra en hud snitt på cirka 1 cm över den xiphoid processen och den övre buken delen. Separera huden som täcker bröstet och bukväggen i övre bukkvadranterna: börja vid mittlinjen, distala till xiphoiden och försiktigt röra sig i laterled på båda sidor. Använd termocautery för att kontrollera blödning.
OBS: Målet är att ha tillgång till brösthålan genom bukväggen. - Öppna bukhålan och skär membranet försiktigt, var noga med att inte skada det bultande hjärtat eller lungorna.
OBS: Målet är att exponera apex och höger kammare i hjärtat. God exponering och syn på hjärtat är av avgörande betydelse för korrekt placering av katetern. Det är av stor vikt att undvika blödning under hela förfarandet. Även små förändringar i den intravasala volymen kan ändra belastningen på höger hjärta och påverka de registrerade parametrarna. - Ta försiktigt bort hjärtsäcken med hjälp av en bomullsspetsad applikator.
- Strax innan tryckkatetern placeras i hjärtat ska du ta med katetern bredvid musen.
- Med hjälp av den förberedda bomullsspetsad applikator med nålen gör ett knivhugg i den apikala distala delen av den högra ventrikeln. Ta försiktigt bort nålen och för in tryckkatetern i detta hål.
OBS: Detta bör fungera utan att tillämpa kraft. I fall detta inte är möjligt, försök att göra ett nytt hål nära den första för att undvika förlängd skada av hjärtat. Nålen ska inte föras in djupare än cirka 3 mm. - För in tryckkatetern parallellt med höger kammares riktning, med spetsen vänd mot lungartären.
- Titta på tryckvågsspårningen för att säkerställa korrekt positionering av katetern. Representativa spårningar visas i figur 2.
- Låt trycksignalen stabiliseras. Pausa andningar och få minst 3 mätningar. Mellan de enskilda mätningarna gör att djuret kan ventileras.
- När alla mätningar registreras ta bort katetern och placera den tillbaka i PBS fyllda röret i vattenbadet.
OBS: Efter avslutad experiment, rengör katetern enligt tillverkarens anvisningar.
- Med små saxar utföra en hud snitt på cirka 1 cm över den xiphoid processen och den övre buken delen. Separera huden som täcker bröstet och bukväggen i övre bukkvadranterna: börja vid mittlinjen, distala till xiphoiden och försiktigt röra sig i laterled på båda sidor. Använd termocautery för att kontrollera blödning.
- Dödshjälp och lungperfusion
- Efter slutförandet av experimentet avliva musen genom exsanguination.
- Öppna bröstet brett. Använda sax, klippa hela bröstbenet och uppmärksamma att inte skada hjärtat eller lungorna.
- Använda iris sax gör ett litet snitt i den vänstra ventrikeln för att låta blod lämna kammaren.
- Placera 25 G-nålen på en spruta som innehåller 10 mL PBS i höger kammare och injicera PBS-lösningen tills lungorna rensas från blod.
- När detta steg är klar, bekräfta dödshjälp av vital vävnad skörd (hjärta och lungor): skär cava och aorta bilagor och ta bort hjärta och lungor en block.
3. Morfometrisk karakterisering
- Omedelbart efter att du tagit bort hjärta och lungor (Steg 2.4.5), isolera hjärtat och ta bort båda atria. Med böjda tenotomy sax dissekera noggrant höger kammare (RV) från vänster kammare (LV), lämnar septum (S) med vänster kammare. Väg RV och LV+S och beräkna Fultonindex= RV/LV+ S (Bild 3)5,9.
- Ta en del av den högra ventrikeln och placera den i en OCT förfylld inbäddning mögel. Använd den andra delen av höger kammare för RNA och/eller proteinanalys. Snäpp frysa i torris och förvara vid -80 °C.
- Använd iris sax för att isolera lungorna från hjärtat och alla andra kvarvarande vävnad.
OBS: För beredning av lungorna är perfusionen enligt ovan (steg 2.4.3-2.4.5) av stor betydelse. - Snap frysa del av lungorna och lagra den för RNA, protein extraktion eller andra analyser.
- Använd den andra delen av lungorna för histologisk analys. För detta ändamål, sätt in sprutan som innehåller 50% PBS och 50% OCT i en bronk av den använda loben10,11. Försöksmaskinen kan lätt se att lungan blir uppblåst när sprutans innehåll är perfunderas i vävnaden.
- Placera dessa bitar av lungan i inbäddning formar förfyllda med OCT och knäppa frysa dem i torris. Förvara proverna vid -80 °C efter att de frysts.
- Förbered 8 μm sektioner av RV och lunga med hjälp av en kryostatmaskin. Lufttorka sektionerna i rumstemperatur i 30 min.
- Fixera objektglasen i rumstemperatur med hjälp av 10% paraformaldehyd (PFA) i 10 min.
OBS: PFA är ett känt cancerframkallande för människor. Minska exponeringsrisken genom att använda en kemisk rökhuv, korrekta procedurer och personlig skyddsutrustning. Se Materialsäkerhetsdatabladet (MSDS) för ytterligare information. - Vaskulär ombyggnad bedömning av Hematoxylin/Eosin färgning
Obs: Utför Hematoxylin/Eosinfärgning för att bedöma de strukturella förändringarna i hjärtat och kärlremodellering i lungan (Figur 3).- Fläck med Hematoxylin lösning i 8 min.
- Skölj med rinnande kranvatten i 5 min följt av en snabb sköljning i destillerat vatten.
- Skölj i 95% EtOH i 1 min och mot-fläck i Eosinlösningen i 1 min.
- Dehydrate (80% Etanol 10-30 s, 100 Etanol för 1 min och 100% Toluol i 3 min).
- Montera och täck med ett täckskydd. Torka rutschkanorna över natten i rumstemperatur.
OBS: De lösningar som används vid färgning kan vara farliga. Minska exponeringsrisken genom att använda en kemisk rökhuv, korrekta procedurer och personlig skyddsutrustning. Se MSDS för ytterligare information.
- Rätt ventrikel fibros bedömning av Picrosirius Red Färgning
OBS: I Picrosirius Red Staining, Picrosirius Red, som är syra, binder till kollagen12. Därför kan denna färgning användas för en histologisk undersökning av kollagenhalten.- Inkubera objektglasen i en förvärmd Bouins Lösning vid 58 °C i 1 h.
- Tvätta diabilderna i rinnande kranvatten för att ta bort gul färg från sektioner i 10-15 min.
- Fläck i 0,1% Fast Green för 20 min vid rumstemperatur.
- Skölj i 1% Ättiksyra i 1 min.
- Skölj i kranvatten i 5 min.
- Fläck i 0,1% Sirius röd i 30 min vid rumstemperatur följt av uttorkning i Toluol.
FÖRSIKTIGHET: De lösningar som används vid infärgning kan vara farliga. Minska exponeringsrisken genom att använda en kemisk rökhuv, korrekta procedurer och personlig skyddsutrustning. Se MSDS för ytterligare information.
- RV kardiomyocyte hypertrofi bedömning av WGA Färgning
OBS: Hypertrofi av höger kammare (RV) på cellnivå kan bedömas genom att utföra en Vetegroddar Agglutinin (WGA) färgning (Figur 4).- Fixera glidbanorna i kall Acetonlösning i 15 min följt av 3 steg av tvätt i PBS (5 min vardera).
- Block med 10% getserum i en Dako-lösning i 30 min i rumstemperatur.
- Inkubera objektglasen med WGA: Lägg till WGA 1:200 och inkubera i 1 1/2 h vid 37 °C i mörker.
- Tvätta diabilderna tre gånger med PBS.
- Inkubera objektglasen med ett nukleinsyrafärgämne.
- Tvätta diabilderna tre gånger med PBS.
- För montering, ta bort överskottet av vätska och applicera monteringsmedia och ett täckskydd. Torka rutschkanorna i 1 timme i rumstemperatur i mörker och förvara vid 4 °C.
OBS: De lösningar som används vid färgning kan vara farliga. Minska exponeringsrisken genom att använda en kemisk rökhuv, korrekta procedurer och personlig skyddsutrustning. Se MSDS för ytterligare information.
- Utför immunokemi i lungan för att ytterligare och specifikt bedöma vaskulär ombyggnad. Till exempel, glatt muskel cell färgning kan användas för att bedöma muskulös av kärlen, medan von Willebrand Factor färgning kan användas för att visualisera endotel förändringar. Dessa metoder beskrivs på annan plats5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I detta protokoll beskriver vi i detalj skapandet av Hypoxia/SU5416-modellen för att inducera PH hos möss. Vidare detaljer vi alla nödvändiga steg för att utföra pulmonell vaskulär och hjärt utvärdering i slutet av observationsperioden.
En översikt över den experimentella utformningen för denna modell visas i figur 1A13,14. Möss utsätts för normobarisk hypoxi (10% O2) och subkutant injiceras en gång i veckan med SU5416 under tre på varandra följande veckor. De stimuli som används för att inducera PH i detta protokoll visas i figur 1B och 1C.
VEGF-receptorantagonisten SU5416 verkar genom att orsaka endotelcell apoptos och, därför, att tillåta spridning av apoptosresistenta endotelceller. Detta leder till vaskulär ombyggnad i lungvasculaturen och ökad vaskulär resistens5. Det förhöjda trycket i lungcirkulationen ökar RV-efterlasten och leder progressivt till RV-dysfunktionen och misslyckandet9. I det första steget kan framgången för hypoxi/SU5416-protokollet utvärderas genom att RV-funktionen vid slutet av observationsperioden funktionellt utvärderas. I detta protokoll beskriver vi i detalj den invasiva bedömningen av RV systoliskt tryck med hjälp av den öppna metoden bröst RV tryckmätning. Representativa tryckkurvor och kvantitativ analys av det högra ventrikulära trycket visas i figur 2.
Hur kan vi kvantifiera vaskulär ombyggnad, vilket leder till förhöjt vaskulärt motstånd och följaktligen PH? Histomorphometry är guldmyntfoten för att karakterisera den pulmonary vasculaturen. I detta protokoll beskriver vi i detalj Protokollet Hematoxylin & Eosin Staining (H&E). Efter färgning och infångande av bilderna kan lungartärerna särskiljas i små (<50 μm) och större (> 50 μm). Bronkial artärer uteslöts från vår studie. För bedömning av den mediala tjockleken mäts den externa (ED), liksom den inre diametern (ID) av artärerna. Representativa bilder av ombyggda lungartärer efter Hypoxi/SU5416-behandling visas i figur 3A. Andelen artärer medial tjocklek i förhållande till tvärsnittsdiameter visas i figur 3B. Den morfometriska analysen av distala lungartärer visar en signifikant ökning av medial tjocklek i Hypoxi/SU5416-behandlade möss i jämförelse med normoxiadjur (Figur 3).
Den ökade afterload leder till RV hypertrofi och som sjukdomen fortskrider till RV fibros9,15. RV hypertrofi kan bedömas morfietiskt genom att mäta Fulton Index (RV/LV+Septum) samt genom att mäta kardiomycyt (CM) hypertrofi. Viktförhållandet för höger kammare (RV) till vänster kammare (LV) plus septum [RV/(LV+S)] beräknas som ett index för högerkammarhypertrofi. Representativa resultat från Fultonindexet i Hypoxi/SU5416 och normoximöss visas i figur 4B. Den metod som beskrivs här för bedömning av CM hypertrofi är färgning av rätt ventrikulära sektioner med Vete Germ Agglutinin (WGA). WGA binder till glykoproteiner i cellmembranet och kan användas för bestämning av tvärsnittsarean på myocyter16,17. Representativa bilder av höger ventrikulära sektioner som färgats med WGA visas i figur 4A. Kvantifieringar av CM-området hos både sjuka och kontrollmöss visas I figur 4A. Hypoxi/SU5416 exponering resulterar i en markant ökning av kardiomyocytestorlek och högerkammarhypertrofi (Figur 4). Vi och andra har tidigare visat att, vid jämförelse med den enda träffen (endast hypoxi), Hypoxi/SU5416 förvärrar RV fenotyp5,18.
Figur 1: Översikt av Hypoxi/SU5416-metoden. (A) Experimentell design för musmodellen Hypoxi/SU5416. SU5416 injiceras subkutant en gång i veckan under 3 veckor i följd. (B) Schematisk återgivning av hypoxisystemet. Regulatorn känner av och reglerar syre inuti kammaren genom att infundera kväve genom gasinfusionsröret. (C) Kemisk struktur av SU5416. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: Högerkammartryck hos möss som utsätts för kronisk hypoxi kombinerat med SU5416 injektion. (A) Representativa spårningar av invasiva tryckmätningar av höger kammare (RV). (B) RV systoliskt tryck i Hypoxi/SU5416 möss och kontrolldjur som exponeras för normoxia. n = 6-8 möss per grupp. p < 0.001. Alla kvantitativa uppgifter rapporteras som ± SEM. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 3: Hypoxi/SU5416 inducerar pulmonell vaskulär ombyggnad. (A) Representativa Hematoxylin/Eosin-färgade sektioner av lungor från de angivna grupperna visar ökad mediaväggtjocklek i lungartärer hos hypoxi/SU5416-möss. Skala bar: 50 μm. (B) Andel artärer mediala tjocklek i förhållande till tvärsnittsdiameter. n = 5 möss per grupp. p < 0.001. Alla kvantitativa uppgifter rapporteras som ± SEM. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 4: Höger ventrikulär hypertrofi hos möss som exponeras för kronisk hypoxi kombinerat med SU5416 injektion. (A) (Vänster) Representativ WGA (Vetegroddar Agglutinin) färgning av högerkammarvävnad efter den angivna behandlingen. Skala bar: 50 μm. (Höger) Kvantitativ analys av uppgifterna. n = 5 möss per grupp. (B) RV hypertrofi som återspeglas av RV-vikten över LV plus interventricular septum (S) viktförhållande (Fulton index= RV/LV + S) i varje grupp. n = 8 möss per grupp. p < 0.001. Alla kvantitativa uppgifter rapporteras som ± SEM. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver hur man modellerar PH hos möss genom att kombinera två patologiska stimuli: kronisk hypoxi och SU5416 injektion (Hypoxi/SU5416)18. I ett försök att korrelera denna musmodell med det mänskliga PH-tillståndet måste man oundvikligen titta på den aktuella PH-klassificeringen, som visas i tabell 1. PH i nästan alla former kännetecknas av pulmonell vasoconstriction och avvikande spridning av endotel och glatta muskelceller. Detta leder till förhöjt tryck i lungartärerna och följaktligen till ökad afterload av rätt ventrikel.
Varje försök att karakterisera ett djur modell av PH bör innehålla bevis för histopatologiska remodeling av pulmonell vasculature och rätt ventrikel. Den enda-hit hypoxi mus modell leder till en mild form av vasculature remodeling2,3. Dessa patologiska resultaten inkluderar muskulös av tidigare icke-muskulösa fartyg, åtföljs av endotelcell, glatt muskelcell och fibroblast spridning. Dessa fynd förvärras genom tillägg av den andra träffen (SU5416 injektion). Effekterna är reversibla i modellen med en träff (hypoxi) och endast delvis reversibla i hypoxi/SU5416-modellen.
Den främsta dödsorsaken för PH-patienter är rätt ventrikulärt misslyckande (RVF)4,20. Pulmonell vaskulär ombyggnad i djurmodeller är inte alltid åtföljs av RVF. För att karakterisera en djurmodell vad gäller RVF morfologiska, funktionella och molekylära data bör analyseras. Det senare ligger utanför räckvidden för detta protokoll. RV morfologiska ombyggnad omfattar både makro- och mikroskopiska aspekter. På makroskopal nivå är huvudindexet för RV-hypertrofi Fulton-index, definierat som vikten av RV dividerat med vänsterkammarvikt (LV) och Septum (S) vikt (RV/LV+S). På mikroskopisk nivå kan fibros, inflammation och hypertrofi bedömas av Sirius röd, Hematoxylin/Eosin respektive WGA-färgning.
Musen Hypoxi/SU5146 modell (som beskrivs här) visar en RV dysfunktion, mätt med förhöjda systoliskt tryck och morfologiska kriterier. Angående pulmonell Vaskulär remodeling, medial hypertrofi observeras tre veckor efter inledandet av protokollet. Jämfört med Hypoxi/SU5416-modellen hos råttor orsakar inte musmodellen RV-fel (endast måttlig dysfunktion), leder inte till allvarlig obliterativ angiopati, som observerats hos svårt sjuka människor, och lungpatologin lindrar efter återgång till normoxia. Sammantaget är musen Hypoxi/SU5416 modellen lämplig för att imitera vaskulär skada som påträffas i PH, främst grupp I (delvis Grupp III, se tabell 1)1,19. Fördelen med denna modell är tillämpningen i vildtyp (genetiskt omodifierade) möss, det relativt enkla och billiga genomförandet, den relativt låga dödligheten hos de sjuka djuren, och den snabba utvecklingen av den sjukdom av intresse (3 veckor). PH förebyggande och terapi studier kan lätt genomföras i denna modell, utan nödvändigheten av avancerade färdigheter i motsats till kirurgiska gnagare modeller.
När du implementerar protokollet finns några kritiska steg, som man bör ha i åtanke. När man planerar studien bör man ha i åtanke att i gruppen Hypoxi/SU5416 varierar dödligheten hos djuren mellan 0-10% (opublicerade observationer). För att nå statistisk effekt och undvika underpowered studier rekommenderas därför minst 10 möss per grupp. Lösligheten hos SU5416 är låg. Därför måste DMSO eller ett annat lösningsmedel (t.ex. karboximetylcellulosa, CMC) användas. DMSO i höga doser kan vara giftiga. LD50 för subkutan (s.c.) användning på möss har rapporterats vara 13,9 - 25,6 g/kg21,22. LD50 definieras som den dos som krävs för att döda 50% av medlemmarna i en testad population efter en angiven testvaraktighet21,22. För en mus som väger 25 g används 4,4 g/Kg DMSO (beräkningar baserade på DMSO-densitet på 1,1 g/mL och 0,1 mL applicerad s.c./mus). Därför är den subkutant givna dosen mycket lägre än LD50-värdet. I våra händer, tillämpningen av SU5416 upplöst i DMSO, som beskrivs här, kan orsaka hudirritation i vissa fall, men inga andra toxiska effekter observeras. Flera rapporter rekommenderar dock användning av CMC som ett alternativt fordon till SU541614. När du utför RV funktionella mätningar, nära uppmärksamhet måste ägnas vid kroppstemperatur, blödning och djup anestesi, som bedöms genom att testa musen reflexer. Den öppna brösttekniken för att bedöma RV-trycket, som beskrivs här, har fördelen att lätt implementeras även av en oerfaren användare. Den closed-chest metoden (beskrivit någonannanstans 23,24,25) har fördelen av att vara mindre invasive och kan, därför, genomföras också i non-terminal experiment. Det kräver dock en hög nivå av expertis.
Efter den första beskrivningen av Hypoxia/SU5416-modellen på råtta har musmodellen framgångsrikt använts i flera studier5,9,13. Det finns dock belägg för att resultaten beror på mössens genetiska bakgrund och kön, tillverkaren av SU5416 och frekvensen av SU5416-injektion26. Medan injicera SU5416 under tre på varandra följande veckor leder till PH hos möss, en enda dos skulle inte inducera PH4. Vidare, andra former av PH, såsom de som är associerade med vänster hjärtsjukdom eller på grund av kronisk tromboembolic sjukdom, kräver etiologi-relaterade modeller. Nya terapier bör testas i minst 2 olika djurmodeller, innan de kan bana väg för translationella studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att deklarera.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av bidrag från American Heart Association (AHA- 17SDG33370112 och 18IPA34170258) och från National Institutes of Health NIH K01 HL135474 till Y.S. O.B stöddes av Deutsche Herzstiftung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid glacial | Roth | 3738.1 | |
| Acetone, Histology Grade | The Lab Depot | VT110D | |
| ADVantage Pressure-Volume System | Transonic | ADV500 | |
| Bouin's solution | Sigma | Ht10132 | |
| Cautery System | Fine Science Tools | 18000-00 | |
| Connection tubing and valves | |||
| Cotton-Tipped Applicators | Covidien | 8884541300 | |
| Coverslips, 24 x50 mm | Roth | 1871 | |
| Data Acquisition and Analysis | Emka | iox2 | |
| Direct Red 80 | Sigma | 365548-5G | |
| DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | Sigma Aldrich | 276855 | |
| Dry ice | |||
| Dumont # 5 forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Dumont # 7 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | |
| Embedding molds | Sigma Aldrich | E-6032 | |
| Eosin Solution Aqueous | Sigma | HT110216 | |
| Ethanol, laboratory Grade | Carolina Biological Supply Company | 861285 | |
| Fast Green FCF | Sigma | F7252-5G | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| Goat Serum | invitrogen | 16210-064 | |
| Heating pad | Gaymar | T/Pump | |
| Hematoxylin 2 | Thermo Scientific | 7231 | |
| Hypoxic chamber | Biospherix | A30274P | |
| Induction chamber | DRE Veterinary | 12570 | |
| Intubation catheter (i.v. catheter SurFlash (20 G x 1") ) | Terumo | SR*FF2025 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Isoflurane | Baxter | NDC-10019-360-40 | |
| Isoflurane vaporizer | DRE Veterinary | 12432 | |
| Mice (C57BL/6) | Charles River | ||
| Needles 25 G x 5/8" | BD | 305122 | |
| OCT | Tissue Tek | 4583 | |
| PBS (Phosphate Buffered Saline) | Corning | 21-031-CV | |
| Piric Acid- Saturated Solution 1.3 % | Sigma | P6744-1GA | |
| Pressure volume catheter | Transonic | FTH-1212B-4018 | |
| Retractor | Kent Scientific | SURGI-5001 | |
| Static oxygen Controller ProOx 360 | Biospherix | P360 | |
| SU 5416 | Sigma Aldrich | S8442 | |
| Surgical Suture, black braided silk, 5.0 | Surgical Specialties Corp. | SP116 | |
| Surgical tape | 3M | 1527-1 | |
| Syringe 10 ml | BD | 303134 | |
| Syringes with needle 1 ml | BD | 309626 | |
| Sytox Green Nuclein Acid Stain | Thermo Scientific | S7020 | |
| Tenotomy scissors | Pricon | 60-521 | |
| Toluol | Roth | 9558.3 | |
| Ventilator | CWE | SAR-830/P | |
| WGA Alexa Fluor | Thermo Scientific | W11261 | |
| Xylene | Roth |
References
- Galie, N., et al. 2015 ESC/ERS Guidelines for the diagnosis and treatment of pulmonary hypertension: The Joint Task Force for the Diagnosis and Treatment of Pulmonary Hypertension of the European Society of Cardiology (ESC) and the European Respiratory Society (ERS): Endorsed by: Association for European Paediatric and Congenital Cardiology (AEPC), International Society for Heart and Lung Transplantation (ISHLT). European Heart Journal. 37 (1), 67-119 (2016).
- Stenmark, K. R., Meyrick, B., Galie, N., Mooi, W. J., McMurtry, I. F. Animal models of pulmonary arterial hypertension: the hope for etiological discovery and pharmacological cure. American Journal of Physiology-Lung Cell Molecular Physiology. 297 (6), 1013-1032 (2009).
- Maarman, G., Lecour, S., Butrous, G., Thienemann, F., Sliwa, K. A comprehensive review: the evolution of animal models in pulmonary hypertension research; are we there yet. Pulmonary Circulation. 3 (4), 739-756 (2013).
- Gomez-Arroyo, J., et al. A brief overview of mouse models of pulmonary arterial hypertension: problems and prospects. American Journal of Physiology-Lung Cell Molecular Physiology. 302 (10), 977-991 (2012).
- Ciuclan, L., et al. A novel murine model of severe pulmonary arterial hypertension. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 184 (10), 1171-1182 (2011).
- Taraseviciene-Stewart, L., et al. Inhibition of the VEGF receptor 2 combined with chronic hypoxia causes cell death-dependent pulmonary endothelial cell proliferation and severe pulmonary hypertension. FASEB Journal. 15 (2), 427-438 (2001).
- Vitali, S. H., et al. The Sugen 5416/hypoxia mouse model of pulmonary hypertension revisited: long-term follow-up. Pulmonary Circulation. 4 (4), 619-629 (2014).
- Breen, E. C., Scadeng, M., Lai, N. C., Murray, F., Bigby, T. D. Functional magnetic resonance imaging for in vivo quantification of pulmonary hypertension in the Sugen 5416/hypoxia mouse. Experimental Physiology. 102 (3), 347-353 (2017).
- Wang, Z., Schreier, D. A., Hacker, T. A., Chesler, N. C. Progressive right ventricular functional and structural changes in a mouse model of pulmonary arterial hypertension. Physiological Reports. 1 (7), 00184 (2013).
- Momcilovic, M., et al. Utilizing 18F-FDG PET/CT Imaging and Quantitative Histology to Measure Dynamic Changes in the Glucose Metabolism in Mouse Models of Lung Cancer. Journal of Visualized Experiment. (137), 57167 (2018).
- Guma, S. R., et al. Natural killer cell therapy and aerosol interleukin-2 for the treatment of osteosarcoma lung metastasis. Pediatric Blood Cancer. 61 (4), 618-626 (2014).
- Lattouf, R., et al. Picrosirius red staining: a useful tool to appraise collagen networks in normal and pathological tissues. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (10), 751-758 (2014).
- Penumatsa, K. C., et al. Transglutaminase 2 in pulmonary and cardiac tissue remodeling in experimental pulmonary hypertension. American Journal of Physiology-Lung Cell Molecular Physiology. 313 (5), 752-762 (2017).
- Wang, Z., et al. Organ-level right ventricular dysfunction with preserved Frank-Starling mechanism in a mouse model of pulmonary arterial hypertension. Journal of Applied Physiology. 124 (5), 1244-1253 (2018).
- van de Veerdonk, M. C., Bogaard, H. J., Voelkel, N. F. The right ventricle and pulmonary hypertension. Heart Failure Reviews. 21 (3), 259-271 (2016).
- Emde, B., Heinen, A., Godecke, A., Bottermann, K. Wheat germ agglutinin staining as a suitable method for detection and quantification of fibrosis in cardiac tissue after myocardial infarction. European Journal of Histochemistry. 58 (4), 2448 (2014).
- Pena, S. D., Gordon, B. B., Karpati, G., Carpenter, S. Lectin histochemistry of human skeletal muscle. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 29 (4), 542-546 (1981).
- Bueno-Beti, C., Hadri, L., Hajjar, R. J., Sassi, Y. The Sugen 5416/Hypoxia Mouse Model of Pulmonary Arterial Hypertension. Methods in Molecular Biology. 1816, 243-252 (2018).
- Colvin, K. L., Yeager, M. E. Animal Models of Pulmonary Hypertension: Matching Disease Mechanisms to Etiology of the Human Disease. Journal of Pulmonary and Respiratory Medicine. 4 (4), (2014).
- Benza, R. L., et al. Predicting survival in pulmonary arterial hypertension: insights from the Registry to Evaluate Early and Long-Term Pulmonary Arterial Hypertension Disease Management (REVEAL). Circulation. 122 (2), 164-172 (2010).
- Jacob, S. W., Rosenbaum, E. E. The toxicology of dimethyl sulfoxide (DMSO). Headache. 6 (3), 127-136 (1966).
- Jacob, S. W., Wood, D. C. Dimethyl sulfoxide (DMSO). Toxicology, pharmacology, and clinical experience. American Journal of Surgery. 114 (3), 414-426 (1967).
- Abraham, D., Mao, L. Cardiac Pressure-Volume Loop Analysis Using Conductance Catheters in Mice. Journal of Visualized Experiment. (103), 52942 (2015).
- Ma, Z., Mao, L., Rajagopal, S. Hemodynamic Characterization of Rodent Models of Pulmonary Arterial Hypertension. Journal of Visualized Experiment. (110), 53335 (2016).
- Townsend, D. Measuring Pressure Volume Loops in the Mouse. Journal of Visualized Experiment. (111), 53810 (2016).
- Penumatsa, K. C., Warburton, R. R., Hill, N. S., Fanburg, B. L. CrossTalk proposal: The mouse SuHx model is a good model of pulmonary arterial hypertension. Journal of Physiology. 597 (4), 975-977 (2019).
