Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Billeddannelse af ekstracellulære vesikler ved atomkraften mikroskopi

Published: September 11, 2019 doi: 10.3791/59254
Automatic Translation
1,2, 3,4
1Department of Chemical Engineering, University of Utah, 2The Nano Institute of Utah, University of Utah, 3Center for Photonics and Quantum Materials, Skolkovo Institute of Science and Technology, 4Biopharmaceutical Cluster 'Northern', Moscow Institute of Physics and Technology

Summary

En trin-for-trin procedure er beskrevet for label-fri immobilisering af exosomer og ekstracellulære vesikler fra flydende prøver og deres billeddannelse ved atomkraften mikroskopi (AFM). AFM-billederne anvendes til at estimere størrelsen af vesikler i opløsningen og karakterisere andre biofysiske egenskaber.

Abstract

Exosomer og andre ekstracellulære vesikler (EVs) er molekylære komplekser bestående af en lipidmembran vesikel, dens overflade dekoration af membran proteiner og andre molekyler, og forskelligt luminale indhold nedarvet fra en forælder celle, som omfatter RNAs, proteiner og DNAs. Karakteriseringen af de hydrodynamiske størrelser af EVs, som afhænger af størrelsen af vesikel og dens koronal lag dannet af overflade dekorationer, er blevet rutine. For exosomer, den mindste af EVs, den relative forskel mellem de hydrodynamiske og vesikler størrelser er signifikant. Karakteriseringen af vesikler størrelser ved den kryogene transmission elektronmikroskopi (Cryo-TEM) Imaging, en guld standard teknik, er fortsat en udfordring på grund af omkostningerne ved instrumentet, den ekspertise, der kræves for at udføre prøven forberedelse, billeddannelse og dataanalyse og et lille antal partikler, der ofte observeres i billeder. Et alment tilgængeligt og tilgængeligt alternativ er atomkraften mikroskopi (AFM), som kan producere alsidige data om tredimensionel geometri, størrelse og andre biofysiske egenskaber af ekstracellulære vesikler. Den udviklede protokol vejleder brugerne i at udnytte dette analytiske værktøj og skitserer arbejdsprocessen til analyse af evt af AFM, som omfatter prøveforberedelse til billeddannelse EVs i hydreret eller udtørret form, den elektrostatiske immobilisering af vesikler på et substrat, dataopsamling, analyse og tolkning. De repræsentative resultater viser, at optagelsen af evt på den modificerede glimmer flade er forudsigelig, kan tilpasses, og giver brugeren mulighed for at opnå størrelses resultater for et stort antal vesikler. Vesikel dimensionering baseret på AFM data blev fundet at være i overensstemmelse med Cryo-TEM Imaging.

Introduction

Ekstracellulære vesikler (EVs) er til stede i alle kropsvæsker, herunder blod, urin, spyt, mælk og Foster væsken. Exosomer udgør en distrikts klasse af EVs, der er differentieret fra andre EVs ved endosomal Biogenesis, markører for endosomal pathway og den mindste størrelse blandt alle evt. Størrelsen af exosomer rapporteres ofte med betydelig variation mellem undersøgelserne. Størrelses resultaterne blev fundet at være metode afhængige, hvilket afspejler forskellen i fysiske principper anvendt af forskellige analytiske teknikker til at estimere EV-størrelserne1,2. For eksempel, nanopartikel tracking Analysis (NTA)-den mest udbredte størrelse karakterisering teknik-anslår størrelsen af EVs som deres hydrodynamiske diametre, som karakteriserer modstanden mod den brune mobilitet af EVs i opløsningen. En større Hydrodynamisk diameter af en vesikel indebærer sin lavere mobilitet i væske. Det koronale lag omkring vesikler, der består af overflade proteiner og andre molekyler, der er forankret eller adsorbet til membran overfladen, hæmmer mobiliteten betydeligt og øger den hydrodynamiske størrelse af EVs. I relative tal er denne stigning særlig stor for exosomerne3, som illustreret i figur 1.

Kryogen transmission Electron mikroskopi (Cryo-tem) Imaging er en definitiv teknik til karakterisering af vesikle størrelser og morfologi i deres hydrerede tilstande. Men de høje omkostninger ved instrumentering og den specialiserede ekspertise, der er nødvendige for at bruge det korrekt motivere udforskning af alternative teknikker, der kan billed hydreret EVs. Et relativt lille antal af evt observeret eller karakteriseret i de erhvervede Cryo-TEM billeder er en anden bemærkelsesværdig ulempe ved denne teknik.

Atomkraften mikroskopi (AFM) visualiserer den tredimensionale topografi af hydreret eller udtørret EVS4,5,6 ved at scanne en sonde over substratet til rasterbilledet af partiklerne på overfladen. De vigtigste skridt i protokollen til at karakterisere evt ved AFM er skitseret i denne undersøgelse. Før billeddannelse af vesikler i væske, skal de være immobiliseret på et substrat ved enten tethering til en funktionaliseret overflade, fældefangst i et filter, eller ved elektrostatisk tiltrækning7. Den elektrostatiske fiksering på et positivt ladet substrat er en særlig bekvem mulighed for immobilisering af exosomer kendt for at have en negativ zeta potentiale. Men de samme elektrostatiske kræfter, der immobiliserer de ekstracellulære vesikler på overfladen også forvrænge deres form, hvilket gør post-Imaging dataanalyse afgørende. Vi uddyber dette punkt ved at beskrive algoritmen, der anslår størrelsen af de globulære vesikler i opløsningen baseret på AFM data på den forvrængede form af exosomerne immobiliseret på overfladen.

I den udviklede protokol, er proceduren for den robuste elektrostatiske immobilisering af vesikler præsenteret og efterfulgt af de skridt, der er nødvendige for at udføre atomkraften billeddannelse i de hydrerede eller udtørrede stater. De faktorer, der påvirker overfladekoncentrationen af de immobiliserede vesikler, identificeres. Vejledningen er givet om, hvordan man udfører den elektrostatiske immobilisering for prøver med forskellige koncentrationer af EVs i opløsningen. Udvælgelsen af eksperimentelle betingelser, der gør det muligt at anslå empiriske sandsynlighedsfordelinger af forskellige Biofysisk egenskaber, der er baseret på et tilstrækkeligt stort antal immobiliserede vesikler, drøftes. Der gives eksempler på analyse af AFM-data efter billeddannelse. Specifikt beskrives en algoritme til bestemmelse af størrelsen af vesikler i opløsningen baseret på AFM-karakteriseringen af immobiliseret evt. De repræsentative resultater viser konsistensen af vesikel dimensionering med AFM med resultaterne af Cryo-TEM Imaging.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. isolering af evt fra en biofluid

  1. Isoler evt ved en af de etablerede metoder, såsom differentiale ultracentrifugering8, nedbør eller størrelses udelukkelses kromatografi9.
  2. Bekræft tilstedeværelsen af forventede overflade-og luminale biomarkører og fraværet af biomarkører, der indikerer krydskontaminering af præparatet. Bekræft lipid-tolags morfologi af de isolerede partikler ved elektronmikroskopi.
    Bemærk: ved isolering af exosomerne skal den hydrodynamiske størrelsesfordeling målt ved nanopartikel-sporings analyse (NTA) eller dynamisk lysspredning være i det forventede interval. Detaljerne i EV og exosomvesikler isolation er uden for rammerne af denne protokol. Den valgte metode vil afhænge af eksperimentelle spørgsmål og målet med undersøgelsen10. Følgende trin giver en konkret illustration af proceduren for at berige exosomerne ved udfældning fra vækstmediet for MCF-7 brystkræft celler ved hjælp af en kommercielt tilgængelig udfældnings pakke (tabel over materialer).
  3. Før cellekultur ekspansion, Opbevar MCF-7 brystkræft celler i flydende nitrogen. Tø celler til subkultur.
  4. Efter aseptisk praksis udføres celle plating på 150 mm plader. Brug vækstmediet beståendeaf Ørnensmindste essentielle medium, 0,01 mg/ml humant rekombinant insulin og 10% exosome-frit føtal bovint serum.
  5. Kulturen med 95% luft og 5% CO2 og inkuber ved 37 °C.
  6. Når cellerne er afregnet (ca. 24 timer efter plating), ændres mediet. Opdel pladen ved 1:10 ratio og kultur ti plader, der hver indeholder 20 mL medier.
  7. Høst og poolmedier fra 9 af disse plader (180 mL) ved ~ 70−80% sammenløbet, når cellerne stadig er i vækstfasen.
  8. Inddel mediet i 60 mL og 120 mL, yderligere opdelt i 30 mL/rør, og centrifugeres ved 3.000 x g i 15 min.
  9. Supernatanten overføres fra hvert rør til et nyt sterilt 50 mL rør og udføres exosomvesikler isolation.
  10. Isoler exosomer efter nedbør i henhold til offentliggjorte protokoller (Se f. eks. reference11), ellerFølg producentens anvisninger, hvis der anvendes et kommercielt isolationssæt (tabel over materialer). Som et første skridt i sidstnævnte tilfælde, centrifuge celle medium ved 3.000 x g i 15 min. trække supernatanten og kassere celler og cellerester.
  11. Tilsæt udfældnings opløsningen (1:5 volumen forhold) til supernatanten, bland og køle af natten.
  12. Centrifugeres ved 1.500 x g i 30 minutter ved stuetemperatur. Supernatanten kasseres efter centrifugering.
  13. Drej den resterende exosomvesikler pellet i yderligere 5 minutter ved 1.500 x g. Uden at forstyrre pellet, fjerne den resterende nedbør løsning ved aspiration.
  14. Resuspension pellet i 100−500 μl af 1x fosfat-Buffered saltvand (PBS) buffer og opdele i flere aliquoter efter behov for downstream analyse.
  15. Straks gå videre til overfladen immobilisering af de isolerede exosomer for AFM Imaging. Hvis det er nødvendigt, skal du fryse aliquoterne ved-80 °C til senere brug, mens du tager forholdsregler for at undgå beskadigelse af prøven under fryse-tø-cyklussen.

2. overflade fiksering af ekstracellulære vesikler

  1. Brug stærkt dobbeltsidet tape, epoxy eller en alternativ klæbemiddel til at fastgøre en glimmer disk til en AFM/scanning tunnelføring mikroskop (STM) magnetisk rustfri-stål prøve disk.
  2. Cleave Mica Disc ved hjælp af en skarp barberkniv eller Utility kniv, eller ved at vedhæfte et klæbebånd til den øverste overflade og derefter skaller det ud for at fjerne et lag af materiale.
    Bemærk: begge metoder skal afsløre en jomfru overflade ved at fjerne et tyndt lag glimmer, der tidligere er udsat for miljøet. Efter proceduren skal fastgørelse af glimmer til AFM/STM metal-prøve disken forblive fast.
  3. Ved stuetemperatur behandles den øverste overflade af glimmer i 10 s med 100 μL 10 mM NiCl2 -opløsning, hvilket ændrer overflade ladning fra negativ til positiv.
  4. Blot NiCl2 -opløsning med et fnugfri serviet eller blottende papir. Vask glimmer overfladen 3x med deioniseret (DI) vand og tør den med en strøm af tør nitrogen.
    Bemærk: det er en god praksis at scanne den modificerede overflade med AFM for at bekræfte, at den er fri for forurenende stoffer.
  5. Placer AFM-prøve disken med den vedlagte overflademodificerede glimmer i en petriskål.
  6. Exosomvesikler-prøven fortyndes fra trin 1,14 med 1x PBS for at opnå en koncentration mellem 4,0 x 109 og 4,0 x 1010 partikler pr. ml opløsning. Den fortyndede partikelkoncentration ved hjælp af NTA.
  7. Form en sessile dråbe på overfladen af glimmer ved at tømme 100 μL af den fortyndede exoen opløsning fra en pipette.
  8. Anbring låget på Petri skålen og forsegl det med en paraffin folie for at reducere prøve fordampningen. Prøven inkubates i 12−18 timer ved 4 °c.
    Bemærk: overflade tætheden af de immobiliserede exosomer vil stige med inkubationstiden og koncentrationen af evt i væsken. Længere inkubationstid kan være nødvendig, hvis der er exosomer til stede i prøven ved lavere koncentrationer.
  9. Efter inkubation, aspirere 80−90% af prøven uden at forstyrre overfladen. På dette tidspunkt vil exosomerne være elektrostatisk immobiliseret på glimmer substrat.
  10. Skyl overfladen med 1x PBS før dannelse af hydreret EVs. Gentag 3x. Sørg for at holde prøven hydreret under hele skylle processen.
  11. Efter vask glimmer overfladen med 1x PBS, fjerne 80%−90% af væsken, og pipette ~ 40 μl af frisk 1x PBS til at dække prøven.
  12. Skyl underlaget med DI-vand ved billeddannelse af den udtørrede EVs. Gentag 3x.
    Bemærk: skylning med DI vand vil forhindre dannelsen af Saltkrystaller og aflejring af opløsere på overfladen som substratet tørrer.
  13. Før billeddannelse, der er udtørret EVs, aspireres så meget væske som muligt uden at røre ved overfladen og tørre resten med en strøm af tør nitrogen.

3. AFM-afbildning

  1. Hvis du vil afbilde den tørre EVs, skal du vælge et udskærings håndtag, der er designet til at scanne i luften ved at tappe og ikke-kontaktbilledbehandlings tilstande og montere den på sonde holderen.
    Bemærk: egenskaberne for et eksempel-cantilever, der er opført i tabel over materialer (123 μm længde, 40 μm bredde, 7 nm spids radius og 37 N/m fjederkonstant) kan anvendes som en vejledning, når der vælges en sonde, der er kompatibel med de tilgængelige AFM-instrumentering.
    1. Placer præparatet fra trin 2,13 på AFM-stadiet. Den magnetiske rustfri stål prøve disk vil immobilisere prøven på scenen. Giv tid til forberedelsen og stadiet til at ækvibrere thermally.
    2. Brug trykke tilstanden til at scanne et tilstrækkeligt stort områdeaf glimensoverflade. For eksempel, vælge et område på 5 x 5 μm, rastered i 512 linjer med en scanningshastighed på ~ 1 Hz. erhverve både højde og fase billeder, da de giver supplerende oplysninger om topografi og overflade egenskaber af prøven.
      Bemærk: scanningstiden forøges med det afbildet område og det antal linjer, der er valgt til at danne billedet, men reduceres med scanningshastigheden defineret som antallet af linjer, der scannes pr. sekund. Hurtige scanningshastigheder kan påvirke billedkvaliteten. Derfor bør hastigheden af raste ring judicielt afbalancere afvejning mellem erhvervelse tid og billedkvalitet.
  2. Til billed hydrerede vesikler skal du vælge et Canti håndtag, der er egnet til scanning af bløde, hydrerede prøver, og montere Canti grebet på en sonde holder designet til scanning i væsker.
    Bemærk: ved valg af en sonde, der er kompatibel med de tilgængelige AFM instrumentering, specifikationerne for sonden anført i tabel over materialer (trekantet Canti håndtag med 175 μm nominel længde, 22 μm bredde, 20 Nm spids radius, 0,07 N/m fjederkonstant, og optimeret til billeddannelse med frekvens frekvensen i intervallet mellem 4 og 8 kHz) kan bruges som vejledning.
    1. Våd spidsen af cantilever med 1x PBS at reducere sandsynligheden for at indføre luftbobler i væsken under scanningen.
    2. Placer præparatet fra trin 2,11 på AFM-stadiet. Den magnetiske rustfri stål prøve disk vil immobilisere den vedlagte glimmer, der indeholder immobiliseret evt på dens overflade.
    3. Giv tid til forberedelsen og AFM-stadiet for at ækvibrere thermally.
    4. Billede den hydrerede glimmer overflade i trykke modus. Erhverve både højde og fase billeder.
      Bemærk: billedkvaliteten påvirkes af instrumenterings-, valgte sonde-og scanningsparametre. Ved optimering af scannings forholdene kan følgende valg anvendes som udgangspunkt: 5 x 5 μm område scannet i 512 linjer med ~ 0,8-1,0 Hz scanningshastighed og frekvens på mellem 4 og 8 kHz.

4. billedanalyse

Bemærk: følgende databehandlings-og analyse trin anvendes på de erhvervede højde billeder. En lignende procedure kan tilpasses for at analysere fase data. Beskrivelsen nedenfor er specifik for Gwyddion12, en gratis og open source software til rådighed under GNU General Public License. Lignende funktioner er tilgængelige i alternative softwareværktøjer.

  1. Gå til data proces, Spm-tilstande, Tip , og vælg model tip (figur 2). Vælg geometrien og dimensionerne for det tip, der bruges til at scanne eksemplet, og klik på OK.
  2. Korriger spidsen erosions artefakter ved at udføre overfladen genopbygning. Åbn billedet. I menuen skal du vælge data proces, Spm-tilstande, Tipog derefter vælge Surface-genopbygning og klikke på OK (figur 3).
  3. Juster billedplanet, så det passer til laboratoriets XY-plan, ved at fjerne hældningen i substratet fra scannings dataene. Hvis du vil udføre denne opgave, skal du vælge data proces, niveau og vælge plan niveau (figur 4).
  4. Juster rækkerne i billedet ved at vælge data proces, rette data og derefter vælge Juster rækker. Der findes flere justeringsindstillinger (figur 5). For eksempel er median en algoritme, der finder en gennemsnitshøjde for hver scannings linje og trækker den fra dataene.
  5. Gå til data proces, rette data og vælge Fjern ar (figur 6), som fjerner almindeligt scanningsfejl kendt som ar.
  6. Juster glimmer overfladen ved nulhøjden, Z = 0, ved at vælge Samkopier base i rullemenuen niveau , som er tilgængelig fra data processen (figur 7).
  7. Identificer evt på den scannede overflade ved at bruge Marker efter tærskel i rullemenuen korn (figur 8a). Denne algoritme identificerer overflade immobiliserede exosomer som partikler, der stikker ud fra nulfladens substrat ved højden over den brugervalgte tærskel. Vælg en tærskel i intervallet mellem 1 og 3 nm, hvilket vil eliminere det meste af baggrundsinterferens. Mindre tærskler anvendes med renere baggrund.
    Bemærk: tærsklen i figur 8a er 1,767 nm. Resultatet af MCF-7 exosomvesikler-identifikationen med denne tærskel er vist i figur 8b. Gwyddion tilbyder flere alternativer til tærskel som algoritmen til automatisk at identificere vesikler i billedet, herunder automatiseret tærskel (Otsu metode), Edge Detection, og Watershed algoritme.
    Bemærk: partikelagglomerater, hvis de findes i AFM-billedet, kan maskeres og udelukkes fra analysen.
  8. Udføre geometrisk og dimensionel karakterisering af den identificerede EVs ved hjælp af tilgængelige distributioner algoritmer tilgængelige fra korn menu.
    Bemærk: Gwyddion indeholder værktøjer til vurdering af fordelingen af skalarvurderet, areal, volumetrisk og andre egenskaber af immobiliseret EVs i en hydreret eller dessicated tilstand. Et eksempel på en egenskab af skalarværdier er vist i figur 9, som giver fordelingen af maksimale højder inden for hver identificeret exosome fodspor.
  9. Eksporter AFM data fra Gwyddion til specialiseret analyse af andre beregningsmæssige værktøjer og brugerdefinerede edb-programmer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Overflade fiksering af EVs er et kritisk skridt i billedsekvensen. Elektrostatisk overflade immobilisering af exosomer, kendt for at have en negativ zeta potentiale, vil robust forekomme efter at micas substrat er modificeret til at have en positiv overflade opladning. Uden behandling med NiCl2 for at give positive overflade ændringer, blev immobilisering af evt på substratet fundet ineffektiv. Højde billedet i figur 10a, erhvervet i luften efter MCF-7 exosomvesikler prøve indeholdende 2,59 x 1010 vesikler pr. ml PBS blev inkuberet i 12 timer på umodificeret overflade af frisk kløvet glimmer, viser meget få vesikler tilbage på overfladen, efter at den blev renset med DI-vand. De vesikler, der er synlige i figur 10a , er sandsynligvis resultatet af ufuldstændig ASPIRATION af di-vand, som opslæmmede vesikler, som ikke er fastgjort til overfladen og derefter afsatte dem på substratet, når det fordampes.

Efter ændring af overfladen opladning med nikkel klorid, er det tilrådeligt at bekræfte, at overfladen forbliver fri for forurenende stoffer efter behandlingen. Højde billedet i figur 10b (opnået i luften) giver et eksempel på en ren overflade, efter at den blev behandlet med nicl2 og derefter VASKET tre gange med di vand. Ruhed af kation-derivatiseret overflade var under 0,3 nm, hvilket er i overensstemmelse med den foregående rapport13.

Den dramatiske positive effekt af overflade ladning modifikation på effektiviteten af optagelsen af MCF-7 exosomer illustreres af figur 10C,D. Disse to paneler viser de højde scanninger, som er erhvervet i luften, efter at prøven, som tidligere var indlagret i figur 10a, blev inkuberet i henholdsvis 24 timer og 12 timer på den overflade, som blev behandlet med nikkel klorid.

Den tid, en given prøve inkuberet på den behandlede overflade, afgør overfladekoncentrationen (vesikler pr. område) for den immobiliserede evt. Højde billedet i figur 10c illustrerer tilfælde af overdrevent tæt overfladedækning af immobilisere vesikler opnået efter den beskrevne MCF-7 exosomvesikler prøve blev inkuberet i 24 timer. En række algoritmer er afhængige af at have tilstrækkelig ubesatte substrat mellem kornet til at udføre billedkorrektion og dataanalyse. For eksempel, nivellering og flytte substratet til nul plan, linje korrektion, og vurdering af kornet ' volumen har brug for den mellemliggende flade overflade til at udføre nøjagtige beregninger. Når koncentrationen af de immobiliserede vesikler er så høj som i figur 10C, vil disse algoritmer ikke fungere pålideligt. Et eksempel på en passende overflade koncentration af vesikler, der er immobiliseret fra den samme MCF-7-prøve, vises i højde billedet i figur 10D, som blev opnået efter kortere (12 h) inkubation.
 
Efter behandlingen af de erhvervede rå AFM data er nødvendig for at korrigere for almindeligt scanningsfejl. Følgende beskrivelse er specifik for Gwyddion. Lignende funktioner er tilgængelige i andre AFM/SPM-dataanalyse værktøjer.

Inden for Gwyddion bruges plane niveau funktionen til at korrigere for en hældning i substratet. En sådan baggrundskorrektion opnås ved først at finde planet af substratet ved hjælp af alle datapunkter i billedet og derefter trække det fra de rå data. Korrektionen langs scannings linjerne udføres ved at justere rækker funktion. For eksempel udfører en af de implementerede algoritmer tilpasningen ved at beregne median højden for hver scannings linje og derefter fratrække resultatet fra den tilsvarende række af billeddata. Bidraget fra de lokale fejl i feedback loop kan fjernes ved at anvende Fjern ar -funktion, som fylder hullerne i de justerede data og eliminerer ar ved at sammenligne dataene i de tilstødende scanningslinjer. Skiftet af substratet til elevation Z = 0 kan opnås ved en kombination af en facet og polynomium nivellering af overfladen efter maskering korn og andre funktioner. Gwyddion Flatten base Tool udfører denne opgave autonomt eller med en bruger-specificeret maske. Efter de beskrevne baggrunds-og linje korrektioner kan de elektrostatisk fikseret vesikler identificeres på substratet ved at udføre Mark korn funktionen.

Figur 11a og figur 11b viser højde-og fase billeder af hydrerede MCF-7-exosomer immobiliseret på en glimmer overflade og erhvervet i PBS ved hjælp af tryk modus. I alt 561 hydrerede vesikler blev identificeret i det scannede område ved hjælp af tærskelværdien algoritme af Mark korn funktion med grænseværdien sat til ~ 20%. Faseforskydningen af sondens respons ved frekvens frekvensen er følsom over for lokaliserede stivhed variationer i bløde prøver. Sammenhængen mellem højde og fase billeder, set i figur 11a,B, er derfor en vigtig bekræftelse på, at de afbildet korn er, ja, bløde vesikler immobiliseret på substratet.
 
Figur 11C viser det tværsnit af højde billedet gennem exosomer placeret på den hvide linje i figur 11a. Mens exosomerne i en biofluid har en kugleformet geometri1,14,15,16, er deres form på substratet stærkt forvrænget af den elektrostatiske tiltrækning til den positivt ladede Overflade. Den oblate pandekage-lignende geometri af elektrostatisk immobiliseret vesikler er yderligere illustreret i figur 11D ved close-up højde billede (og dets tværsnit) af en exosomvesikler boxed i figur 11a. Det tilsvarende fase billede vises i figur 11E. Den empiriske Sandsynligheds tæthed (PDF) af tophøjder over overfladen for alle 561 hydrerede vesikler, der er identificeret i AFM-scanningen, er vist i figur 12a. Middelværdien for denne fordeling er 7,9 nm, hvilket omtrent svarer til det dobbelte af tykkelsen af en phospholipid-tolags17 i fravær af deformende kræfter.
 
Arealet på substratet besat af en immobiliseret exosomvesikler blev tilnærmer sig som en cirkel med diameteren svarende til den gennemsnitlige afstand fra vesikles "Center of Mass" til sin grænse på mic's overflade. Fordelingen af disse projektions diametre er vist i figur 12a og har middelværdien lig med 69,6 nm. Den opnåede højde og diameter fordelingerne yderligere kvantificere den betydelige virkning af den elektrostatiske overflade immobilisering på den forvrængede form af immobiliserede exosomer.
 
Protokol procedurernes robusthed og repeterbarhed blev bekræftet ved at reanalysere den samme MCF-7-prøve tre gange, fra prøveforberedelse til billeddannelse, idet hver gentagelse af resultaterne statistisk ligner dem, der er vist i figur 12.

Deformation af immobiliserede vesikler forårsaget af elektrostatiske kræfter kan kompenseres eller fortolkes for at give et indblik i egenskaberne for den afbildet EVS. For eksempel kan AFM-data anvendes til at estimere den globulære størrelse af vesikler i opløsningen. Som udgangspunkt kan vi beregne volumenet indkapslet af membran kuverter af immobiliserede vesikler. Volumenet findes ved at integrere forskellen mellem overflade niveauet for de identificerede vesikler og substratens højde nedenunder. Substrat niveauet under vesikler er ikke direkte tilgængeligt, men kan estimeres ved Laplace eller alternativ interpolation af datapunkter for ubeboede substrat omkring vesikler. I Gwyddion udføres en sådan volumenberegning ved hjælp af fordelingen af forskellige korn egenskaber funktion. Det resultat, der eksporteres fra Gwyddion, kan derefter knyttes til diametrene af volumen ækvivalente kugler.

Anvendelsen af den beskrevne algoritme på AFM-data for 561 analyserede hydrerede MCF-7-vesikler producerede fordelingen af diametrene af volumen ækvivalente kugler vist i figur 12B. Denne fordeling anslår størrelsen af membran vesikler i deres medfødte globulære form i en biofluid før deres elektrostatiske fiksering på glimmer overfladen. Vesikeldimensionering opnået ved analyse af AFM-data blev sammenlignet med resultaterne af kryo-TEM-billeddannelse af den samme prøve og fandtes at være i tæt aftale3 (figur 12b). Sammenligningen af de hydrodynamiske diametre, målt ved NTA, med de opnåede vesikler størrelser (figur 1) indikerer, at mobiliteten for exosomer er meget mindre end forventet fra størrelsen af deres vesikler bestemt fra AFM og Cryo-tem Målinger. Forskellen mellem de hydrodynamiske og vesikelprotein størrelser karakteriserer tykkelsen af det koronale lag omkring exosomale vesikler.

Figure 1
Figur 1: sammenligning af hydrodynamiske og geometriske diametre af EVS. Den geometriske størrelse af den exosomale vesikelprotein er væsentligt mindre end dens hydrodynamiske størrelse bestemmes af dens diffusion i en væske. Forskellen er det koronal lag dannet af membran konjugerede og adsorbede molekyler, der hæmmer mobiliteten af EVs. Dette tal er ændret fra reference3 og genoptrykt med tilladelse.

Figure 2
Figur 2: egenskaberne for AFM-sonden. AFM-sondens geometri og dimensioner kan specificeres ved hjælp af funktionen Modeltip . Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: korrektion af billedbehandlings artefakt forårsaget af Tip-sample-konvolution. Ved at udføre overflade rekonstruktionkan de erhvervede AFM-data korrigeres for spids artefakter.  Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: korrektion for en hældning i substratet. Plane niveau bestemmer planet af substratet og trækker det fra AFM data. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: korrektion af fejljusteringer i scannings rækker. En konventionel algoritme til at justere scannings dataene er at finde en gennemsnitlig højde langs hver scannings linje og trækker resultatet fra den tilsvarende række af datapunkter i billedet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: korrektion for hullerne i de justerede data. Fælles scanningsfejl, kendt som ar, kan fjernes fra AFM data ved at anvende Fjern ar funktion.  Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: justering af et substrat ved nulhøjde. Flatten base option i niveau menu giver brugeren mulighed for at placere substrat overfladen på basisniveau svarende til nulhøjden.  Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: identifikation af immobiliserede vesikler på den scannede overflade. A) de overflade immobiliserede exosomer identificeres som korn, der stikker over substratet ved en brugervalgt højde tærskel, som er angivet i Mark for tærskel. B) resultatet af identifikationen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 9
Figur 9: analyse af AFM-data. Fordelingen af maksimum højder over substratet i det område, der er besat af de identificerede exosomer, vises som kompileret af korn fordelings værktøjet.  Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 10
Figur 10: effekt af overflade modifikation og EV-koncentration af overflade tætheden af immobiliserede vesikler. A) AFM højde billedet af frisk kløvet glimmer substrat efter 12 h inkubation med MCF-7 exosomvesikler prøve efterfulgt af rensning med di vand og tørring. Immobilisering af EVs fra væsken til substratet er ineffektiv uden at give en positiv ladning til micas overflade. Få partikler set i scanningen er sandsynligvis resultatet af ufuldstændig fjernelse af MCF-7 prøven, før substratet blev tørret. B) højde skanningen af micas overflade i luften efter behandling med nikkel klorid viser underlaget fri for forureninger. Paneler (C) og (D) viser AFM højde scanninger opnået efter ændring af overfladen opladning og INKUBATION med samme MCF-7 prøve som i panel (A) for 24 h og 12 h, hhv. Overfladekoncentrationen af immobiliserede vesikler er overdrevent tæt efter 24 timers inkubation. Den 12 h inkubation fører til færre exosomer immobiliseret på overfladen og scanningsdata, der er lettere at analysere præcist.  Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 11
Figur 11: AFM billeder af hydreret MCF-7 exosomer elektrostatisk immobiliseret på den modificerede glimmer overflade. (A) højde billedet. B) det tilsvarende AFM-fase billede bekræfter, at kornet i højde billedet er bløde nanopartikler, som det bør forventes for membran vesikler. C) højde dataene for de tre vesikler, der krydses af linjen i panel (A), illustrerer en flad formet form forårsaget af exosomerne elektrostatiske tiltrækning til den positivt ladede overflade af det modificerede glimmer. (D) form forvrængningen er tydelig i et forstørret visning den immobiliserede vesikle, der er boxed i panel (A) og dens tværsnit. Fase billedet af samme vesikelprotein er vist i (E). Dette tal er ændret fra reference3 og genoptrykt med tilladelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 12
Figur 12: dimensionel karakterisering af hydrerede vesikler immobiliseret på overfladen og vurdering af deres globulære størrelse i opløsningen. A) fordelingen af tophøjder over overfladen (rød kurve) har middelværdien lig med 7,9 nm. Området besat af immobiliserede exosomer har 69,6 nm gennemsnitlig diameter (blå kurve). (B) AFM højde billede for en af de immobiliserede exosomer illustrerer sin meget oblate form forårsaget af elektrostatiske kræfter. Den globulære størrelse af exosomale vesikler i opløsningen kan estimeres ved at matche volumener, der er omsluttet af overflade immobiliserede og sfæriske membran kuverter. C) størrelsesfordelingen af de globulære vesikler i opløsningen (rød kurve) blev bestemt ud fra AFM-data for 561 immobiliserede vesikler. Vesikelprotein-størrelserne i Cryo-tem-billeder (blå kurve) er i overensstemmelse med AFM-resultaterne. Dette tal er ændret fra reference3 og genoptrykt med tilladelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 13
Figur 13: artefakter i overflade koncentration og størrelses opdeling under passiv deposition af EVS fra fordampning af væske. A) billedet af scannings elektronmikroskopi (SEM) viser, at overfladekoncentrationen af exosomer passivt deponeret fra en tørre væske er rumligt variabel, når der ikke udføres overflade immobilisering fra en suspension af biofluid. B) passiv deposition af evt fra en tørrings prøve forårsager vesikler størrelses opdeling. Den betydelige størrelse variabilitet kvantificeres ved Sandsynligheds tæthed funktioner (PDF) for vesikler i forskellige regioner i billedet (A) defineret af hvide Diagonale linjer. Dette tal ændres fra reference1 og genoptrykkes med tilladelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 14
Figur 14: skålformet geometri af tørre vesikler, som passivt aflejres på overfladen under den flydende fordampning. Overfladen udtørring af vesikler, som ikke blev immobiliseret af elektrostatiske kræfter er kendt for at resultere i en kop-formet udseende ofte observeret i SEM billeder af EVs. Dette tal ændres fra reference1 og genoptrykkes med tilladelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Immobilisering af evt fra en biologisk væske, overflade scanning, og billedanalyse er de vigtigste trin i den udviklede protokol for AFM karakterisering af EVs i flydende. Antallet af vesikler, som er modtagelige for AFM-billedbehandlings skalaer, med det afbildet overfladeareal og vesikles overflade koncentration, som er immobiliseret på substratet. I betragtning af et negativt zeta-potentiale for EVS og exosomerne18, anbefaler vi elektrostatisk fiksering af evt fra flydende prøver til AFM-substratet. Immobilisering er effektiv, når overfladen er positivt opladet. Før afspærringen kan det være nødvendigt at give den positive overflade ladning til substratet, som det er tilfældet med glimmer — et lagdelt silicatmineral med generel formel KAl2(alsi3O10) (Oh)2. Frisk kløvet Glims overflade er tæt på perfekt flad, som er ideel til billeddannelse nanopartikler af AFM, men dens overflade opladning er negativ, og derfor skal ændres. Protokollen beskriver proceduren for at give en positiv overflade ændring til AFM-substratet. De repræsentative resultater viser markant forbedring i EV fiksation fra en biofluid til det modificerede glimmer substrat.
 
Ved behandling af hydrerede vesikler er det vigtigt at minimere prøve fordampning, som forårsager overfladen aflejring artefakter og konvektive strømme og øger den flydende koncentration af vesikler med tiden, hvilket fører til højere overflade koncentration af ikke-immobiliseret EVs end forventet, især ved længerevarende inkubationer. Sonde holdere, der eksplicit er konstrueret til væskeprøver, eliminerer eller sænker fordampningen og bør anvendes til at afbilde hydrerede EVs. Uspecifikke bindinger til scannings sonden reduceres ved tilstedeværelse af Ioniske arter. Derfor foretrækkes det at dække substratet med et bufferet medium, såsom PBS, i stedet for DI-vand, når det er hydreret EVs.

Vigtigheden af overflade immobilisering
Den konsekvente og forudsigelige immobilisering af evt på det modificerede substrat fjerner den primære kilde til variabilitet i AFM-resultaterne. Alle downstream trin, fra scanning til dataanalyse, er lettere styres af udvælgelsen af instrumentering, sonder, scanningsparametre, og dataanalyse sekvens og algoritmer. Brugeren skal være opmærksom på upstream variabilitet i biologiske prøver og EV isolation protokoller, som er vigtige spørgsmål uden for rammerne af dette arbejde.

Vi anbefaler at udføre overflade immobilisering af EV på den modificerede mic's overflade fra flydende prøver, selv når målet er at karakterisere udtørrede vesikler i luften-behovet er mindre indlysende, da vesikler uundgåeligt vil deponere på et substrat som den væske fordamper. Faktisk er AFM resultater for tørremiddel EV opnået uden at ændre mic's overflade afgifter, som er et forudsætning skridt for elektrostatisk immobilisering af EVS fra en væske, er blevet rapporteret i de seneste19,20,21 . Når EVs ikke er fastgjort til overfladen fra den flydende prøve, vil deres passive deposition ved fordampning imidlertid fremkalde artefakter, der kollektivt kaldes en kaffe ring effekt22. To sådanne artefakter, der forekommer som en tørring væske recedes, er illustreret i SEM billede (figur 13a) af serum exosomer deponeret ved fordampning på en negativt ladet glasoverfladen. Signifikante variationer i overfladekoncentrationen af bund fældede vesikler er umiddelbart synlige. Den anden artefakt, der er kvantificeret i Figur 13B, er den betydelige variation i vesikelstørrelserne i forskellige områder inden for den tørrede prøves omkreds. I betragtning af disse artefakter kan AFM-karakteriseringen af passivt deponerede vesikler fra en tørre væske producere partiske eller inkonsekvente resultater, medmindre hele overfladearealet, der oprindeligt var besat af en nu tørret væskeprøve, scannes.

Der bør tages hensyn til to yderligere problemer ved billeddannelse af de tørre prøver, der er opnået uden fast immobilisering af vesikler på substratet. Husk, at vores protokol instruerer brugerne til grundigt at vaske overfladen med DI vand, efter at vesikler er immobiliseret fra en flydende prøve. Dette trin har til formål at forhindre ionisk og andre ikke-vesikulære opløseligheder i at danne overflade aflejringer under fordampning af komplekse biofluider med betydelig osmolaritet. Hvis evt ikke er fastgjort, vil grundig vask frigøre et stort antal vesikler fra overfladen, potentielt forspænde resultaterne og efterlader for få partikler til analyse. En anden fælles vanskelighed, reduceret ved at immobilisere EVs på den modificerede glimmer overflade før AFM Imaging, er vedhæftningen af partikler til sonden23 og de vildledende artefakter forårsaget af dette fænomen.
 
Kontrol af overflade tæthed af immobiliseret EVs
De to let kontrollerbare faktorer, der er identificeret i protokollen, giver brugeren mulighed for at tilpasse overfladekoncentrationen af den immobiliserede evt på det modificerede glimmer substrat: koncentrationen af vesikler i den flydende prøve og den tid, hvor prøven inkuberet på underlaget. En høj densitet af immobiliserede vesikler, opnået med længere inkubationstider og højere koncentration af EVs i væsken, øger antallet af vesikler analyseret under scanningen og den statistiske effekt af konklusioner ankom ved analysen af AFM Data. Samtidig er en overdrevent tæt overflade koncentration, som i det tilfælde, der er vist i figur 10C , hvor partikler stramt dækker hele overfladen uden mellemliggende områder af substratet, komplicerer billedanalysen og fortolkningen af resultaterne og kan føre til scanning artefakter forårsaget af samspillet mellem tæt fordelte partikler.

Påvirkning fra elektrostatisk screening og Hydrodynamisk mobilitet af evt
Den gennemsigtige kontrol over overfladekoncentrationen af immobiliseret EVs som en funktion af faktorer, der påvirker det giver en bruger mulighed for at tilpasse eksperimentelle betingelser for at opfylde de specifikke behov i en undersøgelse. Når du udfører tilpasning, er det vigtigt at erkende, at den elektrostatiske overflade immobilisering er en transport-begrænset proces påvirket af den ioniske styrke af biofluid.

Koncentrationen af ionisk og positivt ladede arter påvirker omvendt den Debye længde, over hvilken overfladen og vesikel afgifterne er screenet. Ud over denne længde er de elektrostatiske kræfter ubetydelige. Grænselaget for Substratets elektrostatiske tiltrækning vil være meget mindre i ionisk rige PBS end i DI vand. Denne forskel indebærer, at efter en kort inkubation, der svarer til den tid, der er nødvendig for at udtvære det flydende lag, hvor de elektrostatiske attraktioner mærkes, vil en overflade tæthed af EVs, der er immobiliseret fra suspensionen i DI-vand, være højere end fra PBS suspension, forudsat at koncentrationen af EVs er den samme i begge væsker. På anden måde skal flere vesikler være immobiliseret for at nedbryder et tykkere Tiltræknings lag i DI vand end i PBS under ellers identiske betingelser.

Efter at vesikler er opbrugt fra grænsen lag, immobilisering bliver en helt transport-begrænset proces. I denne ordning vil depositionssatsen ikke afhænge af suspensions mediet (f. eks. DI-vand eller PBS), så længe viskositeten er den samme, og transporten er helt diffusiv. Dog kan transporten af vesikler i Attraktions grænsen lag ikke være helt difsisiv. For eksempel, hvis prøven i en sessile dråbe på AFM substrat delvis fordamper under inkubationen, væsken inde i dråbe vil blive udsat for fordampning-drevet flow, og transporten af vesikler mod substratet vil have, både, åbne systemer og konvektive bidrag. Når fordampningen ikke er tilstrækkeligt kontrolleret, vil bidraget fra en Konvektiv transport være betydeligt, og satsen for immobilisering vil være højere end forventet. Virkningen af den konvektive transport vil ændre sig med tykkelsen af Attraktions laget, som selv afhænger af ionindholdet af væsken. Desuden vil fordampningen øge vesikel immobilisering på substratet ved at koncentrere EVs i opløsningen. Ved højere EV-koncentrationer vil koncentrations gradienten mellem Attraktions laget og den tilstødende væske stige, hvilket skaber en større termodynamisk drivkraft til migrationen af vesikler mod substratet.

Immobiliserede vesikler kan repræsentere en flydende prøve med en bias. I tilfælde, hvor satsen for immobilisering er begrænset ved diffusion, er vesikler med mindre hydrodynamiske størrelser, bestemt ved kombinationen af vesikel størrelse og tykkelsen af det koronale lag omkring det (figur 1), mere tilbøjelige til at komme ind i attraktion lag på grund af deres højere mobilitet. Efter den indledende udtynding vil den hydrodynamiske lille EVs derfor blive overrepræsenteret på substratet sammenlignet med deres bidrag til EV-populationen i den flydende prøve. Bemærk, at en mindre Hydrodynamisk størrelse ikke automatisk peger på EVS med mindre vesikelprotein størrelser på grund af heterogeniteten i tykkelsen af koronal lag3. Den partiske repræsentation undgås med lange inkubationer, der nedbryder hele populationen af EVs i væsken ved sin immobilisering på substratet. Når en bruger har til formål at immobilisere alle evt fra biofluid, for at undgå overdreven tæt dækning af overfladen med immobiliserede vesikler, kan det være nødvendigt at reducere EV koncentrationen i væsken under det interval, der er foreslået i protokollen.

Deformation af evt på substratet
Ekstracellulære vesikler i deres indfødte hydrerede tilstand og efter udtørring kan være karakteriseret ved AFM, som beskrevet i protokollen. De elektrostatiske kræfter24 , der Immobiliserer EVS på glimmer overfladen, forvrænger også deres form fra den kugleformede geometri, hvori de findes i opløsningen. Virkningen af udtørring på størrelsen og morfologien af immobiliseret EVs kan analyseres ved at genscanne det samme overfladeareal før og efter, at prøven har lov til at tørre.

Det er lærerigt at undersøge, hvilken virkning prøve præparatet har på formen på den udtørrede EVs. Den elektrostatisk immobiliserede EVs opretholder den meget obsent geometri efter tørring, men er yderligere fladtrykt af desiccation. Højden over overfladen af de tørre vesikler bliver mindre end i figur 12a, mens deres fodaftryk areal stiger (data ikke vist). På den anden side, når vesikler deponeres passivt under den flydende fordampning og uden forudgående immobilisering på overfladen, de har tendens til at opnå en kop-form geometri ved tørring, som det længe er blevet observeret i SEM billeder og, for nylig, i AFM Scanninger. Denne Cupped form er nu anerkendt som en prøveforberedelse artefakt25 forårsaget af ikke-ensartethed i kapillar kræfter under overfladen udtørring, som mekanisk forklaret i Figur 141.
 
Billedanalyse og fortolkning af AFM-data
Reaktionerne på elektrostatiske og kapillar kræfter, der virker til at forvride formen af evt, giver værdifulde oplysninger om elevs strukturelle og kompositoriske egenskaber. For eksempel, en flerdimensionel sæt af biofysiske egenskaber, såsom deformeret størrelse og form udvundet fra AFM data, blev for nylig brugt til at demonstrere gennemførligheden til at skelne mellem exosomer udskilles af forskellige Host celler5. Fordrejningerne kan også tages i betragtning og kompenseres. For eksempel viste vi, hvordan man bruger AFM data til at karakterisere den globulære størrelse af vesikler i opløsningen ved at anslå diametrene af kugler, der indkapsles samme volumen som immobiliserede exososmes3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne anerkender finansiel støtte fra National Science Foundation (Award nummer IGERT-0903715), University of Utah (Department of Chemical Engineering Seed Grant og graduate Research Fellowship Award), og Skolkovo Institute of Science og teknologi (Skoltech Fellowship).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AFM/STM Controller  Bruker Multimode Nanoscope V This AFM controller supports imaging of biological samples in liquid and air. 
AFM/STM metal specimen discs (10 mm) TedPella 16207 Metal specimen disc on which a mica disk is attached by a double-sided tape or other means.
AFM/STM Mica discs (10 mm) TedPella 50 Highest quality grade V1 mica, 0.21mm (0.0085”) thick. Interleaved, in packages of 10. Can be mounted on AFM/STM discs. Available in four diameters
AFM probe for imaging in the air Bruker TESP-V2 High quality etched silicon probes for tapping mode and non-contact mode for scanning in the air.
AFM probe for soft sample imaging in liquid Bruker MLCT Soft silicon nitride cantilevers with silicon nitride tips, which are well-suited for liquid operation.  The range in force constants enables users to image extremely soft samples in contact mode as well as high load vs distance spectroscopy.
Double sided tape Spectrum 360-77705 Used to fix the mica disk on the metal specimen disc.
ExoQuick-TC System Biosciences EXOTC50A-1 ExoQuick-TC is a proprietary polymer-based kit designed for exosome isolation from tissue culture media. 
Glass probe AFM holder for imaging in liquid Bruker  MTFML-V2 This glass probe holder is designed for scanning in fluid with the MultiMode AFM.  The holder can be used in peak force tapping mode, contact mode, tapping mode, and force modulation.  The probe is acoustically driven by a separate piezo oscillator for larger amplitude modulation.  The holder is supplied with two ports, required fittings, and accessories kit for adding and removing fluids.
Gwyddion Czech Metrology Institute. Version 2.52 Open Source software for visualization and analysis of data fields obtained by scanning probe microscopy techniques.
Lint-free blotting paper GE Healthcare Whatman  Grade GB003 Blotting Paper Use this blotting paper to remove NiCl2 after the modification of the mica's substrate.  
Lint-free cleanroom wipes Texwipe AlphaWipe TX1004 Use these polyester wipes for surface cleaning. 
Nickel(II) chloride (NiCl2) Sigma-Aldrich 339350 Powder used to make 10 mM NiCl2 in DI water
Phosphate Buffered Saline (1x) Gibco 10010023 PBS, pH 7.4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chernyshev, V. S., et al. Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407, 3285-3301 (2015).
  2. Ramirez, M. I., et al. Technical challenges of working with extracellular vesicles. Nanoscale. 10, 881-906 (2018).
  3. Skliar, M., et al. Membrane proteins significantly restrict exosome mobility. Biochemical and Biophysical Research Communications. 501, 1055-1059 (2018).
  4. Parisse, P., et al. Atomic force microscopy analysis of extracellular vesicles. European Biophysics Journal. 46, 813-820 (2017).
  5. Ito, K., et al. Host Cell Prediction of Exosomes Using Morphological Features on Solid Surfaces Analyzed by Machine Learning. Journal of Physical Chemistry B. 122, 6224-6235 (2018).
  6. Sharma, S., LeClaire, M., Gimzewski, J. K. Ascent of atomic force microscopy as a nanoanalytical tool for exosomes and other extracellular vesicles. Nanotechnology. 29, 132001 (2018).
  7. Meyer, R. L. Immobilisation of living bacteria for AFM imaging under physiological conditions. Ultramicroscopy. 110, 1349-1357 (2010).
  8. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A., et al. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current protocols in cell biology. Chapter 3 (Unit 3.22), (2006).
  9. Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling. Methods in Molecular Biology. 728, 235-246 (2011).
  10. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1535750 (2019).
  11. Weng, Y., et al. Effective isolation of exosomes with polyethylene glycol from cell culture supernatant for in-depth proteome profiling. The Analyst. 141, 4640-4646 (2016).
  12. Nečas, D., Klapetek, P. Gwyddion: an open-source software for SPM data analysis. Open Physics. 10, 181-188 (2012).
  13. Hsueh, C., Chen, H., Gimzewski, J. K., Reed, J., Abdel-Fattah, T. M. Localized nanoscopic surface measurements of nickel-modified Mica for single-molecule DNA sequence sampling. ACS Applied Materials and Interfaces. 2, 3249-3256 (2010).
  14. Conde-Vancells, J., et al. Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes. Journal of Proteome Research. 7, 5157-5166 (2008).
  15. Zhou, Y., et al. Exosomes released by human umbilical cord mesenchymal stem cells protect against cisplatin-induced renal oxidative stress and apoptosis in vivo and in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 4, 34 (2013).
  16. Coleman, B. M., Hanssen, E., Lawson, V. A., Hill, A. F. Prion-infected cells regulate the release of exosomes with distinct ultrastructural features. FASEB Journal. 26, 4160-4173 (2012).
  17. Briegel, A., et al. Universal architecture of bacterial chemoreceptor arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 17181-17186 (2009).
  18. Akagi, T., et al. On-Chip Immunoelectrophoresis of Extracellular Vesicles Released from Human Breast Cancer Cells. PLOS ONE. 10, e0123603 (2015).
  19. Sharma, S., et al. Structural-mechanical characterization of nanoparticle exosomes in human saliva, using correlative AFM, FESEM, and force spectroscopy. ACS Nano. 4, 1921-1926 (2010).
  20. Radeghieri, A., et al. Cultured human amniocytes express hTERT, which is distributed between nucleus and cytoplasm and is secreted in extracellular vesicles. Biochemical and Biophysical Research Communications. 483, 706-711 (2017).
  21. Woo, J., Sharma, S., Gimzewski, J. The Role of Isolation Methods on a Nanoscale Surface Structure and Its Effect on the Size of Exosomes. Journal of Circulating Biomarkers. 5, 11 (2016).
  22. Deegan, R. D., et al. Capillary flow as the cause of ring stains from dried liquid drops. Nature. 389, 827-829 (1997).
  23. Johnson, C. A., Lenhoff, A. M. Adsorption of Charged Latex Particles on Mica Studied by Atomic Force Microscopy. Journal of Colloid and Interface Science. 179, 587-599 (1996).
  24. Pastré, D., et al. Adsorption of DNA to Mica Mediated by Divalent Counterions: A Theoretical and Experimental Study. Biophysical Journal. 85, 2507-2518 (2003).
  25. van der Pol, E., Böing, A. N., Harrison, P., Sturk, A., Nieuwland, R. Classification, functions, and clinical relevance of extracellular vesicles. Pharmacological Reviews. 64, 676-705 (2012).

Tags

Biokemi atomkraften mikroskopi exosomer og ekstracellulære vesikler overflade immobilisering dimensionel karakterisering morfologiske karakterisering biofysiske karakterisering størrelse af membran vesikler hydreret og udtørrede prøver billedanalyse
Billeddannelse af ekstracellulære vesikler ved atomkraften mikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Skliar, M., Chernyshev, V. S.… More

Skliar, M., Chernyshev, V. S. Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (151), e59254, doi:10.3791/59254 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter