Summary
הליך צעד-אחר-צעד מתואר עבור השתק ללא תווית של אקסוזומים ושלפוחיות מעיים מדגימות נוזל והדמיה שלהם באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM). התמונות AFM משמשות כדי להעריך את הגודל של השלפוחיות בפתרון ולאפיין מאפיינים ביופיזיים אחרים.
Abstract
אקסוזומים ושלפוחיות אחרות (EVs) הם מתחמי מולקולריים המורכב של קרום שומנים ושלפוחית, עיטור פני השטח שלה על ידי חלבונים ממברנות ומולקולות אחרות, ותוכן מגוון לומיאל בירושה מתא הורה, הכולל RNAs, חלבונים ו-DNAs. האפיון של גדלים הידרודינמיים של EVs, אשר תלוי בגודל של שלפוחית ואת השכבה הקורולית שלה נוצר על ידי קישוטי פני השטח, הפך שגרתי. עבור האקסוזומים, הקטן ביותר של EVs, ההבדל היחסי בין ההידרודינמיקה והשלפוחיות הוא משמעותי. אפיון של גדלים ושלפוחיות על-ידי מיקרוסקופ אלקטרוני שידור הקריוגני (הקפאה-TEM), טכניקת הזהב בתקן, נשאר אתגר בשל עלות המכשיר, המומחיות הנדרשת לבצע את ההכנה לדוגמה, הדמיה ו ניתוח נתונים, ומספר קטן של חלקיקים שנצפו לעתים קרובות בתמונות. חלופה רחבה ונגישה לשימוש היא מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM), אשר יכול לייצר נתונים מגוונים על גאומטריה תלת ממדית, גודל, ומאפיינים אחרים ביופיזיים של שלפוחיות. הפרוטוקול המפותח מדריך את המשתמשים באמצעות כלי אנליטי זה ומתווה את זרימת העבודה לניתוח של EVs על ידי AFM, הכולל את ההכנה לדוגמא לדימות EVs בצורה מהתייבשות או מיובש, השתק אלקטרוסטטי של שלפוחיות על מצע, רכישת נתונים, ניתוח ופרשנות. תוצאות הנציג להפגין כי קיבעון של EVs על משטח נציץ שונה צפוי, להתאמה אישית, ומאפשר למשתמש להשיג תוצאות לשינוי גודל עבור מספר רב של שלפוחיות. שינוי הגודל המבוסס על נתוני AFM נמצא להיות עקבי עם הדמיה הקפאה-TEM.
Introduction
שלפוחיות (EVs) קיימות בכל נוזלי הגוף, כולל דם, שתן, רוק, חלב ונוזל השפיר. אקסוזומים טופס מחלקה מחוז של EVs הבדיל מתוך EVs אחרים על ידי ביוגנזה אנדוזומבית, סמנים של השביל האנדוזומבית, ואת הגודל הקטן ביותר בין כל EVs. הגודל של האקסוזומים מדווח לעתים קרובות עם שינויים ניכרים בין הלימודים. תוצאות שינוי גודל נמצאו להיות תלויים שיטה, המשקף את ההבדל בעקרונות פיזיים המועסקים על ידי טכניקות אנליטיות שונות כדי להעריך EV גדלים1,2. לדוגמה, ניתוח המעקב הננו-חלקיק (נ. ת. ע)-טכניקת האפיון בגודל הנפוץ ביותר-מעריך את הגודל של EVs כקטרים ההידרודינמיים שלהם, המאפיינים את ההתנגדות לניידות הבראונית של EVs בפתרון. קוטר הידרודינמי גדול יותר של שלפוחית מרמזת על הניידות הנמוכה שלה בנוזל. השכבה הקורלית סביב שלפוחיות, המורכב של חלבונים פני השטח ומולקולות אחרות מעוגן או נספחת אל פני הקרום, מאוד מעכבת את הניידות ומגבירה את הגודל ההידרודינמי של EVs. במונחים יחסיים, גידול זה גדול במיוחד עבור האקסוזומים3, כפי שמודגם באיור 1.
שידור הקריוגני (המיקרוסקופיה) הוא טכניקה מוחלטת באפיון גדלים ומורפולוגיה במדינות ההתייבשות. עם זאת, את העלות הגבוהה של המכשור ואת המומחיות המקצועית הדרושים כדי להשתמש בו נכון להמריץ את החקירה של טכניקות חלופיות שיכול לEVs נוזלים. מספר קטן יחסית של EVs שנצפו או מאופיין בתמונות הקריו-TEM הנרכשים, הוא חיסרון בולט נוסף של טכניקה זו.
מיקרוסקופ כוח אטומי (afm) לדמיין את הטופוגרפיה תלת מימדי של רטוב או מיובש EVs4,5,6 על ידי סריקת בדיקה על פני המצע כדי לסרוק את התמונה של החלקיקים על פני השטח. הצעדים החיוניים של הפרוטוקול לאפיון EVs על ידי AFM מתוארים במחקר זה. לפני הדמיה של שלפוחיות בנוזל, הם חייבים להיות מקיבוע על מצע על ידי הקשירה למשטח פונקציונליזציה, השמנה במסנן, או על ידי משיכה אלקטרוסטטית7. הקיבעון האלקטרוסטטי על מצע טעונה באופן חיובי הוא אופציה נוחה במיוחד עבור השתק של אקזומים הידוע כי יש פוטנציאל זטה שלילי. עם זאת, את אותם כוחות אלקטרוסטטית ששתק את שלפוחיות החילוץ על פני השטח גם לעוות את צורתם, מה שהופך ניתוח נתונים לאחר הדמיה חיוני. אנו להרחיב נקודה זו על ידי תיאור האלגוריתם המתאר את הגודל של כדורי שלפוחיות בפתרון מבוסס על נתוני AFM על הצורה מעוותת של האקסוזומים מקיבוע על פני השטח.
בפרוטוקול המפותח מוצג הנוהל של הטיפול הסטטי של השלפוחיות ולאחריו השלבים הדרושים לביצוע הדמיה של כוח אטומי במצבי היובש או ההתייבשות. הגורמים המשפיעים על הריכוז של פני השטח של השלפוחית הקיבוע מזוהים. ההדרכה ניתנת על איך לבצע את השתק אלקטרוסטטי עבור דגימות עם ריכוזים שונים של EVs בפתרון. הבחירה של התנאים הניסיוניים המתיר הערכה של הפצות ההסתברות האמפירית של מאפיינים ביופיזיים שונים המבוססים על מספר גדול מספיק של קיבוע ושלפוחיות הוא נדון. דוגמאות לניתוח לאחר הדמיה של נתוני AFM ניתנים. באופן ספציפי, אלגוריתם מתואר לקביעת גודל ושלפוחיות בתמיסה המבוססת על אפיון AFM של קיבוע EVs. תוצאות הנציג להראות את העקביות של שלפוחית האחיזה על ידי AFM עם התוצאות של הדמיה הקפאה-TEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. בידוד EVs מתוך ביולואיד
- בידוד EVs על ידי אחת השיטות הוקמה, כגון ההבדלים הדיפרנציאלי8, משקעים, או גודל כרומטוגרפיה הדרה9.
- לאשר נוכחות של משטח צפוי וביואריטים בסמנים והעדר סמנים ביואריטים המצביעים על זיהום של ההכנה. מאשרים את המבנה המיורפולוגיה של החלקיקים המבודדים באמצעות אלקטרון מיקרוסקופ.
הערה: בעת בידוד האקסוזומים, התפלגות הגודל ההידרודינמי הנמדד על-ידי ניתוח מעקב ננו-חלקיק (נ. ת. ע) או פיזור אור דינאמי צריכים להיות בטווח הצפוי. הפרטים של EV ו אקסוחלק בידוד הם מעבר להיקף של פרוטוקול זה. השיטה שנבחרה תהיה תלויה בשאלות הנסיוניות ובמטרה של המחקר10. השלבים הבאים מספקים איור בטון של ההליך להעשיר את האקסוזומים על ידי משקעים מתוך המדיום צמיחה של MCF-7 סרטן השד תאים באמצעות ערכת משקעים זמינים מסחרית (טבלת חומרים). - לפני הרחבת תרבות התא, לאחסן MCF-7 סרטן השד תאים בחנקן נוזלי. הפשרת תאים לתת-תרבות.
- לאחר שיטות ספיגה, לבצע ציפוי תאים על 150 מ"מ לוחות. השתמש במדיום צמיחה מורכב של הנשר's בינוני חיוני מינימלי, 0.01 Mg/mL האדם רקומביננטי אינסולין, ו 10% אקסוכמה-בחינם העובר סרום.
- מאוורר את התרבות על ידי 95% האוויר ו 5% CO2 ו-דגירה ב 37 °C.
- לאחר התיישבו התאים (כ -24 שעות לאחר הציפוי), שנו את המדיה. לפצל את הצלחת ב 1:10 יחס ותרבות עשר צלחות, כל המכיל 20 מ ל של מדיה.
- מדיית הקציר והבריכות מתשע לוחות אלה (180 mL) בשעה~ 70-80% כאשר התאים עדיין בשלב הצמיחה.
- חלק את המדיה לתוך 60 mL ו 120 mL, לפצל עוד לתוך 30 מ"ל/tube, ו צנטריפוגה ב 3,000 x g עבור 15 דקות.
- להעביר את supernatant מכל צינור לצינור חדש סטרילי 50 mL ולבצע את אקסוקצת בידוד.
- בידוד אקסוזומים באמצעות משקעים בהתאם לפרוטוקולים שפורסמו (ראה, לדוגמה, הפניה11) או פעל לפי הוראותהיצרן אםערכת בידוד מסחרית (טבלת חומרים) משמשת. כצעד הראשון במקרה האחרון, תא צנטריפוגה בינונית ב 3,000 x g עבור 15 דקות נסיגה supernatant ולהשליך תאים ופסולת תא.
- הוסף את פתרון המשקעים (1:5 יחס הנפח) אל הסופרנטאנט, ערבב ומקרר בין לילה.
- צנטריפוגה ב 1,500 x g עבור 30 דקות בטמפרטורת החדר. לבטל את הסופרנטנט לאחר צנטריפוגה.
- ספין שנותר אקזום גלולה עבור אחר 5 דקות ב 1,500 x g. מבלי לפגוע בגלולה, הסר את פתרון המשקעים הנותר בשאיפה.
- השהה מחדש את הגלולהב 100-500 μl של מאגר מתמיסת מלח באגירה של 1x פוספט (PBS) וחלק לתוך מספר מאגרים לפי הצורך בניתוח במורד הזרם.
- המשיכו מיד אל פני השטח של האקסוזומים המבודדים עבור דימות AFM. במקרה הצורך, הקפא את הפחת ב-80 °C לשימוש מאוחר יותר בעת נקיטת אמצעי זהירות כדי למנוע נזק למדגם במהלך המחזור הקפאת ההפשרה.
2. קיבוע פני השטח של שלפוחית המים
- השתמש בקלטת כפולה וחזקה, אפוקסי או דבק חלופי כדי לצרף בחוזקה דיסק נציץ אל מיקרוסקופ מינהור AFM/סריקה (STM) מגנטי מדגם פלדת אל-חלד.
- קליב מיכה דיסק באמצעות תער חדה או סכין השירות, או על ידי הצמדת קלטת דבק למשטח העליון ולאחר מכן להוציא אותו כדי להסיר שכבה של חומר.
הערה: כל אחת מהשיטות אמורה לחשוף משטח בתולי על ידי הסרת שכבה דקה של נציץ שנחשפה בעבר לסביבה. לאחר ההליך, את הקובץ המצורף של נציץ לדיסק הדגימה AFM/STM חייב להישאר יציב. - בטמפרטורת החדר, לטפל במשטח העליון של נציץ עבור 10 s עם 100 μL של 10 מ"מ2 פתרון, אשר משנה את הטעינה על פני השטח משלילי לחיובי.
- כתמים לחסום2 פתרון עם מחיקה נטול מוך או נייר מוכתם. שטוף את משטח נציץ 3 x עם מים מוכי (DI) ויבש אותו עם זרם של חנקן יבש.
הערה: מומלץ לסרוק את משטח השינוי באמצעות AFM כדי לוודא שהוא חופשי ממזהמים. - הצב את הדיסק הדגימה של AFM עם נציץ משטח מחובר בצלחת פטרי.
- לדלל את הדגימה אקסוזום משלב 1.14 עם 1x PBS לקבל ריכוז בין 4.0 x 109 ו 4.0 x 1010 חלקיקים לכל mL של הפתרון. אמת את ריכוז החלקיקים המדולל. בעזרת נ. ב. א
- טופס ירידה sessile על פני השטח של נציץ על ידי ריקון 100 μL של פתרון אקסוחלק מדולל של פיפטה.
- הנח את המכסה על צלחת הפטרי וחתום אותו בסרט פרפין כדי להפחית את האידוי לדוגמה. מודג את המדגםעבור 12 עד18 h ב 4 °צלזיוס.
הערה: צפיפות פני השטח של האקסוזזומים יגדל עם זמן הדגירה והריכוז של EVs בנוזל. זמן דגירה ארוך יותר עשוי להיות נחוץ אם האקסוזומים נוכחים במדגם בריכוזים נמוכים. - לאחר הדגירה, מאספירין80-90% של המדגם מבלי להפריע את פני השטח. בשלב זה, האקסוזומים יהיה מכוון אלקטרוסטטי על מצע נציץ.
- לפני הדמיה EVs להתייבש, לשטוף את פני השטח עם 1x PBS. חזור על 3x. דאג לשמור את הדגימה להתייבש במהלך תהליך השטיפה.
- לאחר שטיפת משטח נציץ עם 1x PBS, להסיר80%-90% שלנוזל, ו פיפטה ~ 40 μl של חדש 1x pbs לכסות את המדגם.
- בעת הדמיה EVs מיובש, לשטוף את המצע עם מים DI. חזור על 3x.
הערה: שטיפה עם מים די תמנע היווצרות גבישי מלח והפקדת מסיסות על פני השטח כמצע מתייבש. - לפני הדמיה EVs, מייבשים כמו נוזל הרבה ככל האפשר מבלי לגעת במשטח ולייבש את השאר עם זרם של חנקן יבש.
3. AFM הדמיה
- כדי לצלם את EVs התייבשות, בחר מזיז שנועד לסריקת באוויר בהקשה ובמצבי דימות שאינם אנשי קשר והבהר אותו על מחזיק המקדח.
הערה: המאפיינים של שלוחה לדוגמה המפורטים בטבלה של חומרים (123 יקרומטר אורך, 40 יקרומטר רוחב, 7 ברדיוס ננומטר, ו 37 N/m קבוע האביב) עשוי לשמש כמדריך בעת בחירת בדיקה תואם עם מכשור afm זמין.- מניחים את ההכנה משלב 2.13 בשלב AFM. הדיסק המגנטי של פלדת אל-חלד. ישתק את הדגימה על הבמה אפשר זמן להכנה ולשלב למתן שיווי משקל.
- השתמש במצב הקשה כדי לסרוק אזור גדול מספיק של משטחהנציץ. לדוגמה, בחר אזור של 5 x 5 μm, ש512 שורות בקצב סריקה של ~ 1 Hz. לרכוש הן את התמונות בגובה והן בשלב כפי שהם מספקים מידע משלים על הטופוגרפיה ועל מאפייני פני השטח של המדגם.
הערה: זמן הסריקה יגדל עם אזור הדימות ומספר השורות שנבחרו ליצירת התמונה אך הפחתה בקצב הסריקה שהוגדר כמספר השורות שנסרקו לשניה. שיעורי סריקה מהירה עשויים להשפיע על איכות התמונה. לפיכך, על מהירות הטיפול לאזן את העסקת החליפין בין זמן הרכישה לבין איכות התמונה.
- לתמונה שלפוחית הנוזלים, בחר שלוחה המתאימה לסריקת דגימות רכות ומהתייבשות והר הזיז אל בעל המקדח המיועד לסריקת נוזלים.
הערה: בעת בחירת החללית תואם עם מכשור afm זמין, את המפרט של החללית המפורטים בטבלה של חומרים (שלוחה משולשת עם 175 יקרומטר הנומינלי אורך, 22 יקרומטר רוחב, 20 הרדיוס ננומטר, 0.07 N/m קבוע האביב, ו ממוטב לדימות עם תדירות הכונן בטווח בין 4 ל-8 kHz) עשוי לשמש כמדריך.- להרטיב את קצה הזיז עם 1x PBS כדי להפחית את הסבירות של החדרת בועות אוויר לתוך הנוזל במהלך סריקה.
- מניחים את ההכנה משלב 2.11 בשלב AFM. הדיסק מגנטי פלדת אל-חלד יהיה לשתק את נציץ המצורפת המכילה EVs על פני השטח שלה.
- אפשר זמן להכנה ולשלב ה-AFM למתן שיווי משקל.
- התמונה המשטח המים הרטוב ביותר במצב הקשה. לרכוש הן את התמונות בגובה והן בשלב.
הערה: איכות ההדמיה מושפעת מהמכשור, הבדיקה הנבחרת ומפרמטרי הסריקה. בעת אופטימיזציה של תנאי הסריקה, האפשרויות הבאות ניתן להשתמש כנקודת התחלה: 5 x 5 יקרומטר שטח שנסרק ב 512 שורות עם ~ 0.8-1.0 שיעור סריקה הרץ ותדירות כונן בין 4 אל 8 kHz.
4. ניתוח תמונה
הערה: השלבים הבאים של עיבוד וניתוח נתונים מוחלים על תמונות הגובה הנרכש. הליך דומה עשוי להתאים לניתוח נתוני הפאזה. התיאור שלהלן הוא ספציפי לGwyddion12, תוכנת קוד פתוח וחופשית הזמינה תחת הרישיון הציבורי הכללי של GNU. יכולות דומות זמינות בכלי תוכנה חלופיים.
- עבור אל תהליך הנתונים, מצבי spm, עצה ובחר עצה דגם (איור 2). בחרו בגיאומטריה ובממדי העצה המשמשים לסריקת המדגם ולחצו על הלחצן ' אשר'.
- תקן את הפריטים שחיקת הקצה על ידי ביצוע שחזור פני השטח. . פתח את התמונה מהתפריט, בחר תהליך נתונים, מצבי spm, עצה, ואז לבחור שחזור פני השטח ולחץ על אישור (איור 3).
- יישר את מישור ההדמיה כך שיתאים למישור ה-XY של המעבדה על-ידי הסרת ההטיה במצע מנתוני הסריקה. כדי לבצע משימה זו, בחר תהליך נתונים, רמה ובחר רמת מישור (איור 4).
- יישר שורות של התמונה על-ידי בחירת תהליך הנתונים, תקן את הנתונים ולאחר מכן בחר באפשרות ישר שורות. מספר אפשרויות יישור זמינות (איור 5). לדוגמה, חציון הוא אלגוריתם המוצא גובה ממוצע של כל קו סריקה ומסיר אותו מהנתונים.
- עבור אל תהליך הנתונים, תקן את הנתונים ובחר הסר צלקות (איור 6), אשר מסיר שגיאות סריקה נפוצות המכונה צלקות.
- יישר את משטח הנציץ בגובה האפס, Z = 0, על-ידי בחירה באפשרות ' שטח בסיס ברמה ' בתפריט נפתח מתהליך הנתונים (איור 7).
- זיהוי EVs על המשטח שנסרק באמצעות ' סימון לפי סף ' בתפריט הנפתח של גרגירים (איור 8a). אלגוריתם זה מזהה אקסוזומים משטח המשטח כמו חלקיקים בולטות מהמצע אפס פני השטח בגובה מעל הסף שנבחר על-ידי המשתמש. בחר סף בטווח שבין 1 ל-3 ננומטר, דבר שיבטל את רוב ההפרעות ברקע. גדלי סף קטנים משמשים עם רקע נקי יותר.
הערה: הסף באיור 8A הוא 1.767 ננומטר. תוצאת הזיהוי הסף של MCF-7 מופיעה באיור 8B. Gwyddion מציעה מספר חלופות לסף כאלגוריתם לזהות באופן אוטומטי שלפוחיות בתמונה, כולל סף אוטומטי (שיטת Otsu), זיהוי קצוות, ואלגוריתם פרשת הדרכים.
הערה: כאשר מדובר בדימוי החלקיקים, אם קיים בתמונת AFM, עשוי להיות מוסווה ואינו נכלל בניתוח. - בצע אפיון גיאומטרי ומימדי של הEVs המזוהה באמצעות אלגוריתמי ההפצות הזמינים הנגישים מתפריט דגנים .
הערה: Gwyddion מספק כלים כדי להעריך את ההתפלגות של התפלגות שיטתית, בעלי ערך שיטתי, נפחי, ומאפיינים אחרים של קיבוע EVs במצב רטוב או משומנים. דוגמה למאפיין של ערכים סקלריים מוצגת באיור 9, המעניקה את התפלגות הגבהים המרביים בתוך טביעת הרגל של כל אקסומזהה. - יצא את נתוני AFM מGwyddion לניתוח מיוחד של כלים חישוביים אחרים ותוכניות מחשב מותאמות אישית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
קיבוע פני השטח של EVs הוא צעד קריטי ברצף ההדמיה. משטח אלקטרוסטטי של אקסוזומים, ידוע כי יש פוטנציאל זטה שלילי, יהיה מכבש להתרחש לאחר המצע של נציץ הוא שונה כדי לקבל טעינה חיובית משטח. ללא הטיפול עם NiCl2 להקנות שינויים משטח חיובי, השתק של EVs על המצע נמצאה לא יעילה. התמונה גובה באיור 10A, רכשה באוויר לאחר מדגם mcf-7 אקסוזום המכיל 2.59 x 1010 ושלפוחיות לכל mL של PBS היה מודח עבור 12 h על משטח שאינו משנה של נציץ טרי, מראה מעט מאוד שלפוחיות שנותרו ב פני השטח לאחר ניקוי באמצעות מים די. השלפוחיות נראות באיור 10A , ככל הנראה, תוצאה של שאיפה לא מלאה של מים DI, אשר מושעה שלפוחיות לא קבוע לפני השטח ולאחר מכן הודח אותם על מצע כפי שהוא התאדה.
לאחר שינוי המטען עם ניקל כלוריד, רצוי לוודא שפני השטח נותרים ללא מזהמים לאחר הטיפול. תמונת גובה באיור 10B (שהושג באוויר) נותן דוגמה של משטח נקי לאחר שטופל עם nicl2 ולאחר מכן שטף שלוש פעמים עם מים DI. החספוס של משטח הקטיון-ללעג היה מתחת 0.3 ננומטר, אשר תואם את הדו ח הקודם13.
השפעתה החיובית הדרמטית של שינוי הגובה של פני השטח על יעילות הקיבעון של MCF-7 אקסוזומים מומחש על ידי איור 10C,D. אלה שני פאנלים להראות את סריקות גובה רכשה באוויר לאחר המדגם, בעבר התמונה באיור 10A, היתה מודחסת עבור 24 h ו 12 h, בהתאמה, על פני השטח שטופלו ניקל כלוריד.
הזמן מדגם נתון מודמת על פני השטח המטופל קובע את הריכוז פני השטח (שלפוחיות לאזור) של EVs. תמונת הגובה באיור 10C ממחישה את המקרה של כיסוי משטח צפוף מדי על ידי השלפוחיות שהתקבלו לאחר המתואר mcf-7 אקסוזום המדגם היה מודבטים עבור 24 h. מספר אלגוריתמים מסתמכים על המצע מספיק פנוי בין הגרגירים לביצוע תיקון תמונה וניתוח נתונים. לדוגמה, החלקה והעברת המצע למישור האפס, תיקון קו והערכת אמצעי האחסון של הדגנים, זקוקים למשטח השטוח לביצוע חישובים מדויקים. כאשר הריכוז של השלפוחית הקיבוע הוא גבוה כמו באיור 10C, אלגוריתמים אלה לא יפעלו באופן אמין. דוגמה לריכוז משטח הולם של ושלפוחיות מקיבוע מתוך אותו מדגם MCF-7 מוצג בתמונת הגובה באיור 10D, אשר הושג לאחר קצר (12 h) הדגירה.
העיבוד שלאחר הנתונים הגולמיים של AFM הנרכש צריך לתקן שגיאות סריקה נפוצות. התיאור הבא הוא ספציפי לGwyddion. פונקציונליות דומה זמינה בכלי ניתוח נתונים אחרים של AFM/SPM.
בתוך Gwyddion, פונקציה ברמת המישור משמש כדי לתקן להטות במצע. תיקון רקע כזה מושגת על ידי הראשון למצוא את מישור המצע באמצעות כל נקודות הנתונים בתמונה ולאחר מכן הפחתת אותו מהנתונים הגולמיים. התיקון לאורך קווי הסריקה מתבצע באמצעות הפונקציה ' יישר שורות '. לדוגמה, אחד מהאלגוריתמים המיושמים מבצע את היישור על-ידי חישוב הגובה החציוני של כל שורת סריקה ולאחר מכן חיסור התוצאה מהשורה המתאימה של נתוני תמונה. התרומה של התקלות המקומיות בלולאה המשוב ניתן להסיר על ידי החלת להסיר פונקציית צלקות , אשר ממלאת את הפערים בנתונים מיושרים ומבטלת את הצלקות על ידי השוואת הנתונים בקווי הסריקה הסמוכים. המעבר של המצע לגובה Z = 0 יכול להתבצע על-ידי שילוב של פן והחלקה פולינומיאלית של פני השטח לאחר מיסוך דגנים ותכונות אחרות. כלי הבסיס של Gwyddion מבצע משימה זו באופן עצמאי או באמצעות מסיכה שצוינה על-ידי המשתמש. לאחר הרקע המתואר ותיקוני קו, ניתן לזהות את שלפוחיות החשמל המודבקות האלקטרו-סטטית במצע על ידי ביצוע הפונקציה Mark גרגירים .
איור 11a ואיור 11a להראות הגובה והפאזה תמונות של mcf-7 אקסוזומים מנופף על פני משטח נציץ ונרכש ב-PBS באמצעות מצב הקשה. סך של 561 שלפוחיות שלפוחית הנוזלים זוהו בשטח הסרוק באמצעות אלגוריתם הסף של הפונקציה Mark גרגירים עם ערך הסף שנקבע ל ~ 20%. שלב השהיה של התגובה של הבדיקה בתדר הכונן הוא רגיש וריאציות קשיות מקומי בדגימות רכות. העקביות בין תמונות הגובה והפאזה, הנראית באיור 11A,B, היא, לפיכך, אישור חשוב שגרגרי התמונה הם, אכן, רכים ושלפוחיות מרופדות על המצע.
איור 11C מציג את חתך הרוחב של תמונת הגובה באמצעות אקסוזומים הממוקם בקו לבן באיור 11c. בעוד האקסוזומים בביולואיד יש גאומטריה כדורית1,14,15,16, צורתם על המצע מעוותת באופן חמור על ידי האטרקציה האלקטרוסטטית לחיוב חיובי שטח. את הגאומטריה המאובמת, הגיאומטריית האלקטרו-סטטית, מומחש באיור 11D על-ידי התמונה בגובה התקריב (וחתך הרוחב) של מסגרת חיצונית באיור 11 א. תמונת השלב המתאימה מוצגת באיור 11E. פונקציית צפיפות ההסתברות האמפירית (pdf) של שיא הגבהים מעל פני השטח של כל 561 הנוזלים הווטיבים שזוהו בסריקת AFM מוצג באיור 12A. הערך הממוצע עבור התפלגות זו הוא 7.9 ננומטר, אשר שווה בערך פעמיים את העובי של ביליה פוספוליפיד17 בהיעדר כוחות מדיוצרים.
האזור על המצע שנכבש על ידי מחלק מסוים הייתה מתקרבת כמעגל עם קוטר שווה למרחק ממוצע של "מרכז המסה" של הוועית לגבול על פני המים של הנציץ. התפלגות הקטרים הללו מוצגת באיור 12A ויש לו את הממוצע השווה ל 69.6 ננומטר. הגובה המתקבל והפצות הקוטר מכמת את ההשפעה המשמעותית של משטח המשטח האלקטרוסטטי על הצורה המעוותת של האקזומים.
החוסן והחזרה של נוהלי הפרוטוקול אושרו על-ידי ניתוח מחדש של אותו מדגם MCF-7 שלוש פעמים, החל בהכנה לדוגמה להדמיה, כאשר כל תוצאות הפקת חזרה מבחינה סטטיסטית דומות לאלה המוצגות באיור 12.
ניתן לפצות או לפרש את הדפורמציה של שלפוחיות שנגרמו כתוצאה מכוחות אלקטרוסטטית כדי לספק תובנה למאפייני EVs התמונה. לדוגמה, ניתן להשתמש בנתוני AFM כדי לאמוד את הגודל הבין-כדורי של הלוטיבים בפתרון. כנקודת התחלה, אנחנו יכולים לחשב את עוצמת הקול שעברו מעטפות הקרום של הממברנה. אמצעי האחסון נמצא על-ידי שילוב ההפרש בין רמת פני השטח של השילפוחיות המזוהות לבין גובה המצע שמתחתיו. רמת המצע מתחת לשולפוחיות אינה נגישה ישירות, אך ניתן להערכה על ידי האינטרפולציה האלטרנטיבית או החלופית של נקודות הנתונים עבור מצע ריק המקיף את השלפוחיות. בתוך Gwyddion, חישוב נפח כזה מבוצע באמצעות הפצת הפונקציה מאפייני גרעיניות שונים . התוצאה המיוצאת מ-Gwyddion ניתן למפות לקטרים של כדורים שווי-ערך.
היישום של האלגוריתם המתואר לנתוני AFM עבור 561 שנותחו מק MCF-7 ושלפוחיות הפיק את התפלגות הקטרים של נפח שווה ערך המוצג באיור 12B. התפלגות זו מעריכה את הגודל של שלפוחיות קרום בצורת כדורי שלהם מולדים בתוך ביולואיד לפני הקיבעון האלקטרוסטטי שלהם על משטח נציץ. שלפוחית השינוי שהתקבל מניתוח של נתוני AFM הושווה עם התוצאות של הדמיה הקפאה-TEM של מדגם זהה נמצא להיות בהסכם קרוב3 (איור 12b). השוואת קוטר ההידרודינמי הנמדד על-ידי נ. ת. ע עם המידות המתקבלות (איור 1) מצביעה על כך שהניידות של האקסוזומים הרבה יותר קטנה ממה שצפויה מגודל השלפוחיות שלהם שנקבעו מהאפליות וההקפאה דידות. ההבדל בין גודל ההידרודינמי לבין שלפוחית המים מאפיין את העובי של השכבה הקורונלית המקיפה את האקסטיות.
איור 1: השוואת הקטרים ההידרודינמיים והגיאומטריים של EVs. הגודל הגיאומטרי של שלפוחית האקסוזומלית הוא קטן באופן משמעותי מהגודל ההידרודינמי שנקבע מהדיפוזיה שלה בנוזל. ההבדל הוא שכבה ילתית שנוצר על ידי מולקולות מצודת הממצעית ונספחת הפוגעים הניידות של EVs. איור זה משתנה מהפניה3 ומודפסה מודפס בהרשאה.
איור 2: מאפייני הבדיקה של AFM. ניתן לציין את הגיאומטריה ואת הממדים של הגשוש AFM באמצעות הפונקציה Model עצה . אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תיקון של חפץ הדמיה שנגרמו על ידי מקונבולוציה טיפ-לדוגמה. על-ידי ביצוע שחזור פני השטח, ניתן לתקן את נתוני afm שנרכשו עבור ממצאים טיפים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תיקון להטות במצע. רמת המישור קובעת את מישור המצע ומסירה אותה מנתוני AFM. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: תיקון מוטעה בשורות סריקה. אלגוריתם קונבנציונאלי ליישור נתוני הסריקה הוא למצוא גובה ממוצע לאורך כל קו סריקה ומפחית את התוצאה מהשורה המתאימה של נקודות נתונים בתמונה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: תיקון הפערים בנתונים המיושרים. שגיאות סריקה נפוצות, המכונה צלקות, ניתן להסיר מנתוני AFM על ידי החלת הפונקציה Remove צלקות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: יישור מצע בגובה אפס. האפשרות ' שיטוח בסיס ' בתפריט ' רמה ' מאפשרת למשתמש למקם את משטח המצע ברמת הבסיס המתאימה לגובה האפס. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: זיהוי של קיבוע ושלפוחיות על המשטח הנסרק. (א) האקסוזומים מתחת לפני השטח מזוהים כגרגירים בולטות מעל המצע על ידי משתמש-סף גובה נבחר שצוין בסימון על ידי הסף. (ב) תוצאת הזיהוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 9: ניתוח נתוני AFM. התפלגות הגבהים המרביים מעל המצע בתוך האזור שנכבש על ידי האקסוזומים המזוהים מוצגת כפי שנאסף על-ידי כלי הפצות הדגן . אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 10: השפעת שינוי פני השטח וריכוז EV של צפיפות פני השטח של קיבוע שלפוחיות. (א) התמונה גובה afm של המצע מנציץ טרי לאחר 12 h דגירה עם mcf-7 אקסוכמה לדוגמה ואחריו ניקוי עם די מים וייבוש. השתק של EVs מן הנוזל אל המצע הוא לא יעיל מבלי לקיים חיוב חיובי על פני השטח של נציץ. חלקיקים מעטים לראות בסריקה צפויים כתוצאה של הסרת שלם של מדגם MCF-7 לפני המצע היה מיובש. (ב) סריקת גובה של פני השטח של נציץ באוויר לאחר הטיפול עם ניקל כלוריד מראה את המצע חינם של זהום. פאנלים (C) ו-(ד) מציגים סריקות גובה afm שהתקבלו לאחר השינוי של הטעינה על פני השטח ואת הדגירה עם מדגם mcf-7 זהה כמו בפאנל (A) עבור 24 h ו 12 h, בהתאמה. הריכוז על פני השטח של קיבוע ושלפוחיות הוא צפוף מוגזמת לאחר 24 שעות הדגירה. הדגירה 12 h מובילה פחות אקסוזומים מקיבוע על פני השטח ואת נתוני הסריקה קל יותר לנתח במדויק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 11: תמונות AFM של להתייבש MCF-7 אקסוזומים אלקטרוסטטית על משטח נציץ שונה. (א) תמונת הגובה. (ב) תמונת הפאזה התואמת של afm מאשרת כי הדגנים בתמונת הגובה הם ננו-חלקיקים רכים, כפי שצריך לצפות לגבי שלפוחיות קרום. (ג) נתוני הגובה עבור שלושת השולפוחיות החוצים את הקו המוצג בלוח (א) מדגימים צורה משוטחת שנגרמה כתוצאה מהמשיכה האלקטרוסטטית של האקסוזומים למשטח הטעון חיובי של הנציץ ששונתה. (ד) עיוות הצורה ברור בתצוגה מוגדלת את הקופסה שלפוחית הקיבוע בפאנל (א) ומקטע הצלב שלה. תמונת השלב של אותה שלפוחית מוצג ב (E). איור זה משתנה מהפניה3 ומודפסה מודפס בהרשאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 12: אפיון מימדי של שלפוחיות מוטיות על פני השטח ועל הערכה של גודל כדורי הרקיע שלהם בפתרון. (א) התפלגות שיא הגבהים מעל פני השטח (עיקול אדום) יש ממוצע שווה ל 7.9 ננומטר. האזור שנכבש על-ידי מ69.6, בעל קוטר ממוצע (עיקול כחול), הוא השטח הכבוש. (ב) תמונת גובה של afm עבור אחד מהאקזומים המעוט ממחישה את צורתו המואובטית ביותר הנגרמת על-ידי כוחות אלקטרוסטטית. הגודל הכדורי של אקזומטיות ושלפוחיות בפתרון יכול להיות מוערך על ידי התאמת הכרכים המוקפים על ידי משטח-מעטפות ממברנה כדורית. (ג) התפלגות הגודל של כדורי שלפוחיות בתמיסה (עיקול אדום) נקבע מנתוני afm של 561 שלפוחיות ושלפוחית. המידות הכחולות בתמונות ההקפאה (העקומה הכחולה) מתאימות לתוצאות ה-AFM. איור זה משתנה מהפניה3 ומודפסה מודפס בהרשאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 13: ריכוז פני השטח והפרדה בגודל ההפרדה במהלך התצהיר הפסיבי של EVs מפני הנוזל המיאדות. (א) התמונה מיקרוסקופ אלקטרוני סריקה (SEM) מראה כי ריכוז המשטח של אקסוזומים פסיבי הופקד מתוך נוזל ייבוש הוא משתנה בלתי מאוזן כאשר שינומי משטח השעיית ביולואיד אינו מבוצע. (ב) התצהיר פסיבי של EVs מתוך מדגם ייבוש גורם הפרדה בגודל שלפוחיות. השונות בגודל משמעותי מכמת את פונקציות צפיפות ההסתברות (pdf) עבור שלפוחיות באזורים שונים בתמונה (א) המוגדר על ידי קווים אלכסוניים לבנים. איור זה משתנה מהפניה1 ומודפסה מודפס בהרשאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 14: גאומטריה בצורת גביע של שלפוחיות מתייבשות שהופקדו בפסיביות על פני השטח במהלך האידוי הנוזלי. פני השטח התייבשות של שלפוחיות שלא היו מקיבוע על ידי כוחות אלקטרוסטטית ידוע כתוצאה מראה בצורת ספל נצפה לעתים קרובות בתמונות SEM של EVs. איור זה משתנה מהפניה1 ומודפסה מודפס בהרשאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השתק של EVs מתוך נוזל ביולוגי, סריקת פני שטח, וניתוח תמונה הם הצעדים החיוניים של הפרוטוקול המפותח לאפיון AFM של EVs בנוזל. מספר השלפוחיות והקלה על מאזני הדמיה AFM עם שטח התמונה המשטח ואת ריכוז פני השטח של השלפוחיות על המצע. בהינתן פוטנציאל זטה שלילי של EVs ואקסוזומים18, אנו תומכים קיבעון אלקטרוסטטי של EVs מדגימות נוזל למצע afm. השתק יעיל כאשר המשטח טעון בחיוב. לפני הזמן, מטען השטח חיובי צריך להיות הנחילה למצע, כמו במקרה של נציץ-מינרל סיליקט שכבתית עם הנוסחה כללי קל2(alsi3O10) (או)2. פני השטח של נציץ טרי הוא קרוב שטוח לחלוטין, אשר אידיאלי עבור חלקיקים הדמיה על ידי AFM, אבל הטעינה שלה השטח הוא שלילי, ולכן, יש לשנות. הפרוטוקול מתאר את ההליך להקנות שינוי משטח חיובי למצע AFM. תוצאות הנציג מציגות שיפור מסומן בקיבעון EV מתוך ביולואיד למצע נציץ שונה.
כאשר הדמיה שלפוחית העור, חשוב למזער את האידוי לדוגמה הגורמת לפני השטח ממצאים התצהיר הקמימיות ומגבירה את הריכוז הנוזלי של שלפוחיות עם הזמן, המוביל ריכוז משטח גבוה יותר של קיבוע EVs מהצפוי, במיוחד במהלך incubations ממושך. בעלי בדיקה שתוכננו במפורש עבור דגימות נוזלי לסלק או התאיידות איטית, יש להשתמש כדי לקבל התמונה EVs. איגודים לא ספציפיים כדי בדיקה סריקה מופחת בנוכחות של מינים יוניים. לכן, כאשר הדמיה EVs להתייבש, עדיף לכסות את המצע עם בינוני באגירה, כמו PBS, במקום מים DI.
החשיבות של שאיפה משטח
השינוי העקבי והצפוי של EVs על מצע שהשתנה מסיר את המקור העיקרי לשונות בתוצאות AFM. כל שלבי הזרם, החל מסריקה ועד לניתוח נתונים, נשלטים בקלות רבה יותר על-ידי מבחר מכשור, בדיקות, פרמטרים לסריקה ורצף ניתוח נתונים ואלגוריתמים. על המשתמש להיות מודע להבדלים במעלה הזרם בדגימות ביולוגיות ובפרוטוקולי בידוד EV, שהם נושאים חשובים מעבר להיקף העבודה.
אנו ממליצים לבצע שינוי פני השטח של EV על פני השטח של נציץ שונה מדגימות נוזל גם כאשר המטרה היא לאפיין שלפוחיות התייבשות באוויר-הצורך הוא פחות ברור מאז ושלפוחיות יהיה הפקדה בלתי נמנעת על מצע כלשהו כמו נוזל מתאדה. למעשה, תוצאות ה-afm עבור התייבשות שהתקבלו מבלי לשנות את החיובים בפני השטח של נציץ, שהוא צעד מוקדם עבור השתק אלקטרוסטטי של EVs מתוך נוזל, דווחו בעבר19,20,21 . כאשר EVs אינם קבועים על פני השטח מן המדגם נוזל, עם זאת, התצהיר פסיבי שלהם על ידי אידוי יפיק חפצים באופן קולקטיבי הידוע בתור אפקט טבעת הקפה22. שני ממצאים כאלה, המתרחשים באופן התייבשות נוזלי ייבוש, מומחש בתמונת ה-SEM (איור 13A) של סרום אקסוזומים שהופקדו על ידי התאיידות על פני זכוכית טעונה שלילית. וריאציות משמעותיות בריכוז הפני-השטח של שלפוחיות של זירז מתגלים באופן מיידי. החפץ השני, הכמת באיור 13 ב', הוא השונות הניכרת במידות הוולפוחית באזורים שונים בתוך היקף המדגם היבש. בהתחשב בחפצי האמנות הללו, אפיון AFM של הופקד בפסיביות מנוזל ייבוש עלול לגרום לתוצאות מזיקות או לא עקביות, אלא אם כן השטח המלא שנכבש על ידי דגימת נוזל מיובש כעת נסרק.
יש לשקול שתי סוגיות נוספות בעת הדמיה של דגימות התייבשות ללא החזקה של שלפוחיות על המצע. זכור כי הפרוטוקול שלנו מורה למשתמשים לשטוף ביסודיות את המשטח עם מים די לאחר השלפוחיות הם ללא קיבוע ממדגם נוזלי. שלב זה מתכוון למנוע מסיסות שאינן מועלות ואחרות מפני הקרקע להרכיב פיקדונות במהלך האידוי של ביולואידים מורכבים עם מאוד משמעותי. אם EVs אינם קבועים, הכביסה היסודית תנתק מפני השטח מספר גדול של שלפוחיות מהמשטח, העלולים לגרום לתוצאות ולעזיבת חלקיקים מעטים מדי לצורך ניתוח. עוד קושי נפוץ, מופחת על ידי השתק EVs על משטח נציץ שונה לפני הדמיה AFM, הוא הדבקה של חלקיקים כדי בדיקה23 ואת הממצאים מטעה שנגרם על ידי תופעה זו.
השליטה על צפיפות המשטח של קיבוע EVs
שני הגורמים הניתן לשליטה בקלות המזוהים בפרוטוקול מאפשרים למשתמש להתאים אישית את הריכוז של פני השטח של EVs על המצע השתנה נציץ: ריכוז של שלפוחיות במדגם נוזלי ואת הזמן המדגם הוא מודלס על מצע. צפיפות גבוהה של קיבוע ושלפוחיות, מושגת עם זמני דגירה ארוכה יותר ריכוז גבוה יותר של EVs בנוזל, מגביר את מספר השלפוחיות שנותחו במהלך הסריקה ואת הכוח הסטטיסטי של מסקנות הגיע ניתוח של AFM נתונים. במקביל, ריכוז משטח צפוף מוגזמת, כמו במקרה המוצג באיור 10C שבו החלקיקים בחוזקה לכסות את פני השטח כולו ללא אזורים להתערב של המצע, מסבך את ניתוח התמונה ואת הפרשנות של תוצאות ועלול להוביל לסריקת פריטים שנגרמו כתוצאה מהאינטראקציה בין חלקיקים מרווחים.
השפעת הקרנה אלקטרוסטטית וניידות הידרודינמית של EVs
השליטה שקוף על ריכוז פני השטח של קיבוע EVs כפונקציה של גורמים המשפיעים על זה מאפשר למשתמש להתאים את התנאים הניסיוניים כדי לענות על הצרכים הספציפיים של מחקר. כאשר מבצעים התאמה אישית, חשוב להכיר בכך שפני השטח האלקטרוסטטי הם תהליך מוגבל לתחבורה המושפע מהכוח היוני של היולואיד.
ריכוז של מינים יוניים וטעונה באופן חיובי משפיע על אורך דביי שעליו מוקרן משטח הקרקע ושלפוחית המים. מעבר לאורך זה, הכוחות האלקטרוסטטית הם זניחים. שכבת הגבול של האטרקציה האלקטרוסטטית של המצע תהיה קטנה בהרבה ב-PBS בעלת הגוון העשיר ביותר מאשר ב-DI water. הבדל זה מרמז כי, לאחר דגירה קצרה המקבילה הזמן הדרוש כדי לרוקן את שכבת הנוזל שבו האטרקציות האלקטרוסטטית מורגשת, צפיפות פני השטח של EVs מושעה ההשעיה ב-DI מים יהיה גבוה יותר מאשר PBS השעיה, בהנחה הריכוז של EVs הוא זהה בשני הנוזלים. שים אחרת, שלפוחיות יותר חייב להיות מתעבה לרוקן שכבת אטרקציה עבה יותר במים DI מאשר PBS תחת תנאים זהים אחרת.
לאחר שהשלפוחיות מרוקנים את שכבת הגבול, השתק הופך לתהליך מוגבל לחלוטין להובלה. במשטר זה, שיעור התצהיר לא יהיה תלוי באמצעי השעיה (למשל, די מים או PBS) כל עוד הצמיגות זהה והתחבורה מפודלקת לחלוטין. עם זאת, העברת השלפוחית לתוך שכבת הגבול המשיכה לא יכולה להיות מחולקת לחלוטין. למשל, אם המדגם בירידה sessile על המצע AFM חלקית מתאדה במהלך הדגירה, הנוזל בתוך הירידה יהיה נתון לזרימת אידוי מונחה, ואת ההובלה של שלפוחיות לכיוון המצע יהיה, שניהם, תורמים ומפזרים. כאשר האידוי אינו נשלט כראוי, תרומת התחבורה תהיה ניכרת, ושיעור השתק יהיה גבוה מהצפוי. ההשפעה של התחבורה הקמייונית תשתנה בהתאם לעובי שכבת המשיכה, שהיא עצמה תלויה בתכולת הנוזל היונית. יתר על כן, האידוי ישפר את שלפוחית היתר על המצע על ידי ריכוז EVs בפתרון. בריכוזי EV גבוהים יותר, מעבר הריכוז בין שכבת המשיכה לבין הנוזל הסמוך יגדל, וייצור כוח תרמודינמי גדול יותר להעברת שלפוחיות לכיוון המצע.
קיבוע ושלפוחיות עשויות לייצג דגימת נוזל עם הטיה. עבור המקרה כאשר שיעור השתק מוגבל על ידי דיפוזיה, שלפוחיות עם גדלים הידרודינמיים קטנים, נקבע על ידי שילוב של גודל שלפוחית ועובי של השכבה הקורלית המקיפה אותו (איור 1), נוטים יותר להיכנס ל שכבת המשיכה בגלל הניידות הגבוהה שלהם. אפוא, לאחר תקופת המחסור הראשונית, EVs קטן הידרודינמי יהיה מיוצג יתר על המצע לעומת תרומתם לאוכלוסיית EV במדגם נוזלי. לתשומת לבך, גודל הידרודינמי קטן יותר אינו מצביע באופן אוטומטי ב-EVs עם גדלי שלפוחית קטנים יותר בגלל הטרוגניות בעובי השכבה הקורולית3. הייצוג מוטה נמנע עם incubations ארוך כי מרוקן את האוכלוסייה כולה של EVs בנוזל על ידי השתק שלה על המצע. כאשר משתמש מבקש לשתק את כל EVs מן הביולואיד, כדי למנוע כיסוי צפוף מוגזם של המשטח עם שלפוחית מנוע, ייתכן שיהיה צורך להפחית את ריכוז EV בנוזל מתחת לטווח המוצע בפרוטוקול.
דפורמציה של EVs על מצע
שלפוחיות מעיים במצב הטבעי שלהם ולאחר התייבשות ניתן לאפיין על ידי AFM, כפי שמתואר בפרוטוקול. הכוחות האלקטרוסטטית24 שEVs משתק על פני השטח של נציץ גם לעוות את צורתם מפני גאומטריה כדורית שבה הם קיימים בפתרון. ההשפעה של התייבשות על גודל ומורפולוגיה של EVs מקיבוע ניתן לנתח על ידי סריקה מחדש של שטח זהה לפני ואחרי המדגם מותר להתייבש.
זה מאלף כדי לבחון את ההשפעה של ההכנה לדוגמה על הצורה של EVs מיובש. האלקטרו-סטטי של הEVs שומרים על הגיאומטריה המאובלי לאחר ייבוש, אך משוטחים עוד יותר על ידי התייבשות. הגובה מעל פני השטח של השלפוחית התייבשות הופך לקטן יותר מאשר באיור 12A, בעוד שאזור הקרקע שלהם גדל (נתונים לא מוצגים). מצד שני, כאשר השלפוחיות מופנות בפסיביות במהלך האידוי הנוזלי וללא השתק מוקדם על פני השטח, הם נוטים להשיג גאומטריה בצורת ספל על התייבשות, כפי שנצפתה כבר בתמונות SEM ולאחרונה, ב-AFM סריקות. צורה זו מזוהה כעת כפריט הכנה לדוגמא25 הנגרמת על ידי חוסר אחידות בכוחות הקפילר במהלך התייבשות פני השטח, כפי שהוסבר מהמכונה באיור 141.
ניתוח תמונה ופרשנות נתוני AFM
התגובות לכוחות אלקטרוסטטית וקפילר הפועלים כדי לעוות את הצורה של EVs מספקים מידע רב ערך על תכונות מבניות וקוממיות של EVs. לדוגמה, ערכה רב-מימדית של מאפיינים ביופיזיים, כגון גודל וצורה מעוותים שחולצו מנתוני AFM, השתמשו לאחרונה כדי להדגים את הכדאיות להבדיל בין אקסוזומים המופרש על-ידי תאים מארחים שונים5. ניתן גם לקחת את העיוותים בחשבון ולפיצוי. לדוגמה, הצגנו כיצד להשתמש בנתוני AFM כדי לאפיין את הגודל הכדורי של ושלפוחיות בפתרון על-ידי הערכת הקטרים של התחומים הכמס את אותו נפח המכיל את אותו אמצעי האחסון כמושלושהמשתמשים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
המחברים מכירים בתמיכה הפיננסית של הקרן הלאומית למדע (מספר הפרס איגרט-0903715), אוניברסיטת יוטה (המחלקה למענק הנדסת זרעים כימית ופרס המלגות למחקר בוגר), ומכון סקולקובו למדעים וטכנולוגיה (מלגת סקולטק).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM/STM Controller | Bruker | Multimode Nanoscope V | This AFM controller supports imaging of biological samples in liquid and air. |
| AFM/STM metal specimen discs (10 mm) | TedPella | 16207 | Metal specimen disc on which a mica disk is attached by a double-sided tape or other means. |
| AFM/STM Mica discs (10 mm) | TedPella | 50 | Highest quality grade V1 mica, 0.21mm (0.0085”) thick. Interleaved, in packages of 10. Can be mounted on AFM/STM discs. Available in four diameters |
| AFM probe for imaging in the air | Bruker | TESP-V2 | High quality etched silicon probes for tapping mode and non-contact mode for scanning in the air. |
| AFM probe for soft sample imaging in liquid | Bruker | MLCT | Soft silicon nitride cantilevers with silicon nitride tips, which are well-suited for liquid operation. The range in force constants enables users to image extremely soft samples in contact mode as well as high load vs distance spectroscopy. |
| Double sided tape | Spectrum | 360-77705 | Used to fix the mica disk on the metal specimen disc. |
| ExoQuick-TC | System Biosciences | EXOTC50A-1 | ExoQuick-TC is a proprietary polymer-based kit designed for exosome isolation from tissue culture media. |
| Glass probe AFM holder for imaging in liquid | Bruker | MTFML-V2 | This glass probe holder is designed for scanning in fluid with the MultiMode AFM. The holder can be used in peak force tapping mode, contact mode, tapping mode, and force modulation. The probe is acoustically driven by a separate piezo oscillator for larger amplitude modulation. The holder is supplied with two ports, required fittings, and accessories kit for adding and removing fluids. |
| Gwyddion | Czech Metrology Institute. | Version 2.52 | Open Source software for visualization and analysis of data fields obtained by scanning probe microscopy techniques. |
| Lint-free blotting paper | GE Healthcare Whatman | Grade GB003 Blotting Paper | Use this blotting paper to remove NiCl2 after the modification of the mica's substrate. |
| Lint-free cleanroom wipes | Texwipe | AlphaWipe TX1004 | Use these polyester wipes for surface cleaning. |
| Nickel(II) chloride (NiCl2) | Sigma-Aldrich | 339350 | Powder used to make 10 mM NiCl2 in DI water |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | Gibco | 10010023 | PBS, pH 7.4 |
References
- Chernyshev, V. S., et al. Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407, 3285-3301 (2015).
- Ramirez, M. I., et al. Technical challenges of working with extracellular vesicles. Nanoscale. 10, 881-906 (2018).
- Skliar, M., et al. Membrane proteins significantly restrict exosome mobility. Biochemical and Biophysical Research Communications. 501, 1055-1059 (2018).
- Parisse, P., et al. Atomic force microscopy analysis of extracellular vesicles. European Biophysics Journal. 46, 813-820 (2017).
- Ito, K., et al. Host Cell Prediction of Exosomes Using Morphological Features on Solid Surfaces Analyzed by Machine Learning. Journal of Physical Chemistry B. 122, 6224-6235 (2018).
- Sharma, S., LeClaire, M., Gimzewski, J. K. Ascent of atomic force microscopy as a nanoanalytical tool for exosomes and other extracellular vesicles. Nanotechnology. 29, 132001 (2018).
- Meyer, R. L. Immobilisation of living bacteria for AFM imaging under physiological conditions. Ultramicroscopy. 110, 1349-1357 (2010).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A., et al. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current protocols in cell biology. Chapter 3 (Unit 3.22), (2006).
- Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling. Methods in Molecular Biology. 728, 235-246 (2011).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1535750 (2019).
- Weng, Y., et al. Effective isolation of exosomes with polyethylene glycol from cell culture supernatant for in-depth proteome profiling. The Analyst. 141, 4640-4646 (2016).
- Nečas, D., Klapetek, P. Gwyddion: an open-source software for SPM data analysis. Open Physics. 10, 181-188 (2012).
- Hsueh, C., Chen, H., Gimzewski, J. K., Reed, J., Abdel-Fattah, T. M. Localized nanoscopic surface measurements of nickel-modified Mica for single-molecule DNA sequence sampling. ACS Applied Materials and Interfaces. 2, 3249-3256 (2010).
- Conde-Vancells, J., et al. Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes. Journal of Proteome Research. 7, 5157-5166 (2008).
- Zhou, Y., et al. Exosomes released by human umbilical cord mesenchymal stem cells protect against cisplatin-induced renal oxidative stress and apoptosis in vivo and in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 4, 34 (2013).
- Coleman, B. M., Hanssen, E., Lawson, V. A., Hill, A. F. Prion-infected cells regulate the release of exosomes with distinct ultrastructural features. FASEB Journal. 26, 4160-4173 (2012).
- Briegel, A., et al. Universal architecture of bacterial chemoreceptor arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 17181-17186 (2009).
- Akagi, T., et al. On-Chip Immunoelectrophoresis of Extracellular Vesicles Released from Human Breast Cancer Cells. PLOS ONE. 10, e0123603 (2015).
- Sharma, S., et al. Structural-mechanical characterization of nanoparticle exosomes in human saliva, using correlative AFM, FESEM, and force spectroscopy. ACS Nano. 4, 1921-1926 (2010).
- Radeghieri, A., et al. Cultured human amniocytes express hTERT, which is distributed between nucleus and cytoplasm and is secreted in extracellular vesicles. Biochemical and Biophysical Research Communications. 483, 706-711 (2017).
- Woo, J., Sharma, S., Gimzewski, J. The Role of Isolation Methods on a Nanoscale Surface Structure and Its Effect on the Size of Exosomes. Journal of Circulating Biomarkers. 5, 11 (2016).
- Deegan, R. D., et al. Capillary flow as the cause of ring stains from dried liquid drops. Nature. 389, 827-829 (1997).
- Johnson, C. A., Lenhoff, A. M. Adsorption of Charged Latex Particles on Mica Studied by Atomic Force Microscopy. Journal of Colloid and Interface Science. 179, 587-599 (1996).
- Pastré, D., et al. Adsorption of DNA to Mica Mediated by Divalent Counterions: A Theoretical and Experimental Study. Biophysical Journal. 85, 2507-2518 (2003).
- van der Pol, E., Böing, A. N., Harrison, P., Sturk, A., Nieuwland, R. Classification, functions, and clinical relevance of extracellular vesicles. Pharmacological Reviews. 64, 676-705 (2012).
