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Biochemistry

परमाणु बल माइक्रोस्कोपी द्वारा extracellular Vesicles की इमेजिंग

Published: September 11, 2019 doi: 10.3791/59254
Automatic Translation
1,2, 3,4
1Department of Chemical Engineering, University of Utah, 2The Nano Institute of Utah, University of Utah, 3Center for Photonics and Quantum Materials, Skolkovo Institute of Science and Technology, 4Biopharmaceutical Cluster 'Northern', Moscow Institute of Physics and Technology

Summary

एक कदम दर कदम प्रक्रिया तरल नमूनों और परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) द्वारा उनके इमेजिंग से एक्सोसोम और extracellular vesicles के लेबल मुक्त अचलीकरण के लिए वर्णित है. AFM छवियों समाधान में vesicles के आकार का अनुमान है और अन्य biophysical गुणों की विशेषता के लिए उपयोग किया जाता है.

Abstract

Exosomes और अन्य extracellular vesicles (EVs) आणविक एक लिपिड झिल्ली vesicle से मिलकर परिसरों रहे हैं, झिल्ली प्रोटीन और अन्य अणुओं द्वारा इसकी सतह सजावट, और विविध luminal सामग्री एक माता पिता की कोशिका से विरासत में मिला है, जो आरएनए शामिल हैं, प्रोटीन, और डी.एन.ए. ईवीएस के हाइड्रोडायनामिक आकार की विशेषता, जो आशय के आकार और सतह सजावट द्वारा बनाई गई कोरोनल परत पर निर्भर करती है, दिनचर्या बन गई है। एक्सोसोम के लिए, ईवीएस का सबसे छोटा, हाइड्रोडायनामिक और vesicles आकार के बीच सापेक्ष अंतर महत्वपूर्ण है। क्रायोजेनिक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-टीईएम) इमेजिंग, एक सोने के मानक तकनीक द्वारा vesicles आकार की विशेषता, साधन की लागत के कारण एक चुनौती बनी हुई है, नमूना तैयारी करने के लिए आवश्यक विशेषज्ञता, इमेजिंग और डेटा विश्लेषण, और कणों की एक छोटी संख्या अक्सर छवियों में मनाया. एक व्यापक रूप से उपलब्ध है और सुलभ विकल्प परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (AFM), जो तीन आयामी ज्यामिति, आकार, और extracellular vesicles के अन्य biophysical गुणों पर बहुमुखी डेटा का उत्पादन कर सकते हैं. विकसित प्रोटोकॉल इस विश्लेषणात्मक उपकरण का उपयोग करने में उपयोगकर्ताओं गाइड और AFM द्वारा EVs के विश्लेषण के लिए कार्यप्रवाह की रूपरेखा, जो हाइड्रेटेड या desicated रूप में इमेजिंग EVs के लिए नमूना तैयारी भी शामिल है, इलेक्ट्रोस्टैटिक स्थिरीकरण के एक सब्सट्रेट पर vesicles, डेटा अधिग्रहण, इसके विश्लेषण, और व्याख्या. प्रतिनिधि परिणाम संशोधित अभ्रक सतह पर EVs के निर्धारण उम्मीद के मुताबिक, अनुकूलन है कि प्रदर्शन, और vesicles की एक बड़ी संख्या के लिए आकार परिणाम प्राप्त करने के लिए उपयोगकर्ता की अनुमति देता है. एएफएम डेटा के आधार पर आशय आकार कया-टीईएम इमेजिंग के अनुरूप पाया गया।

Introduction

बाह्य कोशिकीय vesicles (EVs) रक्त, मूत्र, लार, दूध, और amniotic तरल पदार्थ सहित शरीर के सभी तरल पदार्थ में मौजूद हैं. Exosomes endosomal biogenesis द्वारा अन्य EVs से विभेदित EVs के एक जिला वर्ग के रूप में, endosomal मार्ग के मार्करों, और सभी EVs के बीच सबसे छोटा आकार. एक्सोसोम का आकार अक्सर अध्ययनों के बीच पर्याप्त परिवर्तनशीलता के साथ सूचित किया जाता है। आकार देने के परिणाम विधि पर निर्भर पाए गए, जो ईवी आकार1,2का अनुमान लगाने के लिए विभिन्न विश्लेषणात्मक तकनीकों द्वारा नियोजित भौतिक सिद्धांतों में अंतर को दर्शाता है। उदाहरण के लिए, नैनोकण ट्रैकिंग विश्लेषण (NTA) - सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया आकार लक्षण ीकरण तकनीक - उनके द्रवगतिक व्यास है, जो समाधान में EVs के ब्राउनियन गतिशीलता के लिए प्रतिरोध की विशेषता के रूप में EVs के आकार का अनुमान है. एक vesicle का एक बड़ा द्रवगतिक व्यास तरल में अपनी कम गतिशीलता का तात्पर्य है. vesicles के चारों ओर कोरोनल परत, सतह प्रोटीन और अन्य अणुओं से मिलकर लंगर या झिल्ली की सतह के लिए adsorbed, काफी गतिशीलता में बाधा और EVs के hydrodynamic आकार बढ़ जाती है. सापेक्ष संदर्भ में, यह वृद्धि विशेष रूप से एक्सोसोम3के लिए बहुत अधिक है, जैसा कि चित्र 1में दिखाया गया है।

क्रायोजेनिक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो-टीईएम) इमेजिंग उनके हाइड्रेटेड राज्यों में vesicle आकार और आकृति विज्ञान की विशेषता में एक निश्चित तकनीक है। हालांकि, इंस्ट्रूमेंटेशन की उच्च लागत और विशेष विशेषज्ञता का उपयोग करने के लिए इसे सही ढंग से वैकल्पिक तकनीक है कि छवि हाइड्रेटेड EVs कर सकते हैं की खोज को प्रेरित करने की जरूरत है. प्राप्त क्रायो-टीईएम छवियों में देखी गई या विशेषता वाली ईवीएस की अपेक्षाकृत छोटी संख्या इस तकनीक का एक और उल्लेखनीय नुकसान है।

परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) सतह पर कणों की छवि को रद करने के लिए सब्सट्रेट भर में एक जांच स्कैन करके हाइड्रेटेड या desicated EVs4,5,6 के तीन आयामी स्थलाकृति कल्पना करता है। AFM द्वारा EVs की विशेषता के लिए प्रोटोकॉल के आवश्यक कदम इस अध्ययन में उल्लिखित हैं. तरल में vesicles इमेजिंग से पहले, वे या तो एक कार्यात्मक सतह के लिए tethering द्वारा एक सब्सट्रेट पर स्थिर किया जाना चाहिए, एक फिल्टर में फँसाने, या इलेक्ट्रोस्टैटिक आकर्षणद्वारा 7. धनावेशित सब्सट्रेट पर स्थिर वैद्युत निर्धारण एक विशेष रूप से सुविधाजनक विकल्प है जो एक ऋणात्मक जीटा संभाव्यता के ज्ञात एक्सोसोमों को स्थिर करने का एक विशेष रूप से सुविधाजनक विकल्प है। तथापि, वही स्थिर वैद्युत बल जो सतह पर बाह्यकोशिकीय vesicles को स्थिर करते हैं, उनके आकार को भी विकृत कर देते हैं, जो पोस्ट-इमेजिंग डेटा विश्लेषण को आवश्यक बनाता है। हम सतह पर स्थिर एक्सोसोम के विकृत आकार पर AFM डेटा के आधार पर समाधान में गोलाकार vesicles के आकार का अनुमान है कि एल्गोरिथ्म का वर्णन करके इस बिंदु विस्तृत.

विकसित प्रोटोकॉल में, vesicles के मजबूत स्थिर वैद्युत स्थिरीकरण के लिए प्रक्रिया प्रस्तुत की है और हाइड्रेटेड या desicated राज्यों में परमाणु बल इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक कदम के बाद. स्थिर vesicles की सतह एकाग्रता को प्रभावित करने वाले कारकों की पहचान की जाती है। मार्गदर्शन कैसे समाधान में EVs के विभिन्न सांद्रता के साथ नमूने के लिए इलेक्ट्रोस्टैटिक immobilization प्रदर्शन करने के लिए पर दिया जाता है. अकर्मण्यता वाले vesicles की पर्याप्त बड़ी संख्या के आधार पर विभिन्न जैवभौतिक गुणों के अनुभवजन्य प्रायिकता वितरण के आकलन की अनुमति देने वाली प्रयोगात्मक स्थितियों के चयन पर चर्चा की जाती है। AFM डेटा के बाद-इमेजिंग विश्लेषण के उदाहरण दिए गए हैं. विशेष रूप से, एक एल्गोरिथ्म immobilized EVs के AFM विशेषता के आधार पर समाधान में vesicles के आकार का निर्धारण करने के लिए वर्णित है. प्रतिनिधि परिणाम क्रायो-टीईएम इमेजिंग के परिणामों के साथ AFM द्वारा vesicle आकार की स्थिरता दिखाते हैं.

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Protocol

1. एक biofluid से EVs के अलगाव

  1. एक स्थापित विधियों में से एक द्वारा ईवीएस को अलग करें, जैसे कि अंतर अल्ट्रासेंट्रीफ्यूगेशन8, वर्षा, या आकार-निष्कर्ष वर्णलेख9.
  2. अपेक्षित सतह और luminal biomarkers की उपस्थिति और biomarkers की अनुपस्थिति की पुष्टि की तैयारी के पार संदूषण का संकेत. इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा पृथक कणों के लिपिड द्वि परत आकारिकी की पुष्टि करें।
    नोट: जब exosomes अलग, हाइड्रोडायनामिक आकार वितरण नैनोकण ट्रैकिंग विश्लेषण (NTA) या गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन द्वारा मापा अपेक्षित श्रेणी में होना चाहिए। EV और एक्सोसोम अलगाव का विवरण इस प्रोटोकॉल के दायरे से बाहर हैं। चयनित विधि प्रयोगात्मक प्रश्नों और अध्ययन के लक्ष्य10पर निर्भर करेगी . निम्नलिखित कदम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध वर्षण किट(सामग्रीतालिका ) का उपयोग करके एमसीएफ-7 स्तन कैंसर कोशिकाओं के विकास माध्यम से वर्षा द्वारा बाह्य रोगों को समृद्ध करने के लिए प्रक्रिया का एक ठोस उदाहरण प्रदान करते हैं।
  3. सेल संस्कृति के विस्तार से पहले, तरल नाइट्रोजन में MCF-7 स्तन कैंसर कोशिकाओं की दुकान. उपसंस्कृति के लिए कक्ष।
  4. aseptic प्रथाओं के बाद, 150 मिमी प्लेटों पर सेल चढ़ाना प्रदर्शन करते हैं। ईगलके न्यूनतम आवश्यक माध्यम से बना विकास माध्यम का प्रयोग करें , 0.01 mg/mL मानव पुनः संयोजक इंसुलिन, और 10% exsome मुक्त भ्रूण गोजातीय सीरम.
  5. 95% हवा और 5% सीओ2 और 37 डिग्रीसेल्सियस पर इनक्यूबेट द्वारा संस्कृति को ऐरेट करें।
  6. कोशिकाओं के निपटान के बाद (लगभग 24 एच चढ़ाना के बाद), मीडिया बदल जाते हैं। 1:10 अनुपात और संस्कृति दस प्लेटें, प्रत्येक मीडिया के 20 एमएल युक्त प्रत्येक पर थाली विभाजित.
  7. इन प्लेटों में से 9 से हार्वेस्ट और पूल मीडिया (180 एमएल) $ 70-80% संगम पर जब कोशिकाओं के विकास के चरण में अब भी कर रहे हैं.
  8. मीडिया को 60 एमएल और 120 एमएल में विभाजित करें, आगे 30 एमएल/ट्यूब में विभाजित करें, और 15 मिनट के लिए 3,000 x ग्राम पर अपकेंद्रण।
  9. प्रत्येक ट्यूब से supernatant एक नया बाँझ 50 एमएल ट्यूब के लिए स्थानांतरण और extosome अलगाव प्रदर्शन करते हैं।
  10. प्रकाशित प्रोटोकॉल के अनुसार वर्षा द्वारा अलग-अलग एक्सोसोम (उदाहरण के लिए, संदर्भ11) यायदिवाणिज्यिक अलगाव किट ( सामग्रीकी तालिका) काउपयोग किया जाता है तो निर्माता के निर्देशों का पालन करें . बाद के मामले में पहला कदम के रूप में, 15 मिनट के लिए 3,000 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज सेल माध्यम, सुपरनेंट को वापस ले लें और कोशिकाओं और सेल मलबे को त्याग दें।
  11. वर्षण समाधान (1:5 मात्रा अनुपात) supernatant, मिश्रण करने के लिए जोड़ें, और रात भर फ्रिज में.
  12. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 1,500 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज। अपकेंद्रण के बाद महादलित को त्याग दें।
  13. 1500 x ग्रामपर एक और 5 मिनट के लिए शेष एक्सोसोम गोली स्पिन . गोली परेशान किए बिना, आकांक्षा द्वारा शेष वर्षा समाधान को हटा दें।
  14. 100 में गोली को पुन: असाइनकरें -500 $L 1x फॉस्फेट-बफरेड लवण (पीबीएस) बफर और डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए आवश्यक के रूप में कई alicots में विभाजित।
  15. तुरंत AFM इमेजिंग के लिए अलग एक्सोसोम की सतह अचलीकरण के लिए आगे बढ़ना. यदि आवश्यक हो, तो फ्रीज-थॉव चक्र के दौरान नमूने को नुकसान से बचने के लिए सावधानी बरतते हुए बाद में उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियसपर एलिकोट्स को फ्रीज करें।

2. extracellular vesicles की सतह निर्धारण

  1. मजबूत डबल पक्षीय टेप, epoxy, या मजबूती से एक AFM / स्कैनिंग सुरंग माइक्रोस्कोप (एसटीएम) चुंबकीय स्टेनलेस स्टील नमूना डिस्क के लिए एक अभ्रक डिस्क संलग्न करने के लिए एक वैकल्पिक चिपकने वाला का प्रयोग करें।
  2. एक तेज उस्तरा या उपयोगिता चाकू का उपयोग करके, या शीर्ष सतह के लिए एक चिपकने वाला टेप संलग्न है और फिर सामग्री की एक परत को दूर करने के लिए इसे बंद peling द्वारा अभ्रक डिस्क छोड़ दें।
    नोट: या तो विधि पहले पर्यावरण को उजागर अभ्रक की एक पतली परत को हटाने के द्वारा एक कुंवारी सतह प्रकट करना चाहिए. प्रक्रिया के बाद, AFM/STM धातु नमूना डिस्क के लिए अभ्रक की कुर्की फर्म रहना चाहिए.
  3. कमरे के तापमान पर, 10 उम निक्क2 विलयन के 100 उउ के साथ 10 े े के लिए अभ्रक की शीर्ष सतह का उपचार कीजिए, जो पृष्ठ आवेश को ऋणात्मक से सकारात्मक को संशोधित करता है।
  4. एक लिंट मुक्त पोंछे या blotting कागज के साथ Blot NiCl2 समाधान. अभ्रक की सतह 3x को डाइऑनीकृत (डीआई) जल से धो लें और इसे शुष्क नाइट्रोजन की धारा से सुखा लें।
    नोट: यह यह contaminants से मुक्त है की पुष्टि करने के लिए AFM के साथ संशोधित सतह को स्कैन करने के लिए एक अच्छा अभ्यास है.
  5. एक पेट्री डिश में संलग्न सतह संशोधित अभ्रक के साथ AFM नमूना डिस्क प्लेस.
  6. समाधान के प्रति एमएल पर 4ण्0 x 109 और 4ण्0 x 10 1010 कणों के बीच सांद्रता प्राप्त करने के लिए 1x PBS के साथ चरण 1.14 से बाह्य नमूना को दूर करें। NTA का उपयोग कर पतला कण एकाग्रता मान्य करें।
  7. एक पिपेट से पतला एक्सोसोम समाधान के 100 डिग्री सेल्सियस को खाली करके अभ्रक की सतह पर एक सेसाइल ड्रॉप का निर्माण करें।
  8. पेट्री डिश पर ढक्कन रखें और नमूना वाष्पीकरण को कम करने के लिए एक पैराफिन फिल्म के साथ इसे सील करें। 4 डिग्रीसेल्सियस पर 12-18 ज के लिए नमूने को इनक्यूबेट करें।
    नोट: immobilized extosomes की सतह घनत्व ऊष्मायन समय और तरल में EVs की एकाग्रता के साथ वृद्धि होगी. यदि एक्सोसोम कम सांद्रता पर नमूने में मौजूद हैं तो लंबे समय तक ऊष्मायन समय आवश्यक हो सकता है।
  9. ऊष्मायन के बाद, सतह को परेशान किए बिना नमूने का 80-90% aspirate. इस बिंदु पर, एक्सोसोम, अभ्रक सब्सट्रेट पर स्थिर स्थिर रूप से स्थिर हो जाएगा।
  10. हाइड्रेटेड ईवीएस इमेजिंग से पहले, 1x पीबीएस के साथ सतह कुल्ला। 3x दोहराएँ. rinsing प्रक्रिया के दौरान नमूना हाइड्रेटेड रखने के लिए ध्यान रखें।
  11. 1x पीबीएस के साथ अभ्रक सतहधोने के बाद, 80% - तरल का 90% निकालें, और ताजा 1x पीबीएस के pipette $ 40 $L नमूना कवर करने के लिए।
  12. जब desicated EVs इमेजिंग, DI पानी के साथ सब्सट्रेट कुल्ला. 3x दोहराएँ.
    नोट: DI पानी के साथ rinsing नमक क्रिस्टल के गठन और सब्सट्रेट dries के रूप में सतह पर विलेय के जमाव को रोकने जाएगा।
  13. इमेजिंग desicated EVs से पहले, सतह को छूने के बिना संभव के रूप में ज्यादा तरल के रूप में aspirate और सूखी नाइट्रोजन की एक धारा के साथ बाकी सूखी.

3. एएफएम इमेजिंग

  1. desicated EVs छवि के लिए, दोहन और गैर संपर्क इमेजिंग मोड में हवा में स्कैनिंग के लिए बनाया गया एक cantilver का चयन करें और यह जांच धारक पर माउंट.
    नोट: सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध एक उदाहरण cantilever की विशेषताओं (123 डिग्री मीटर लंबाई, 40 डिग्री मीटर चौड़ाई, 7 एनएम टिप त्रिज्या, और 37 N/m वसंत स्थिरांक) एक गाइड के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है जब उपलब्ध AFM इंस्ट्रूमेंटेशन के साथ संगत एक जांच का चयन.
    1. AFM चरण पर चरण 2.13 से तैयारी प्लेस. चुंबकीय स्टेनलेस स्टील नमूना डिस्क मंच पर नमूना स्थिर होगा. तैयारी और मंच के लिए समय की अनुमति दें थर्मल बराबर करने के लिए.
    2. अभ्रक की सतह के पर्याप्त रूप से बड़े क्षेत्र को स्कैन करने के लिए टैपिंग मोडकाउपयोग करें. उदाहरण के लिए, 5 x 5 डिग्री उ का क्षेत्र चुनें, जो 512 रेखाओं में $1 भ्भ् की स्कैन दर पर रैस्टर किया गया है। ऊँचाई और प्रावस्था छवियों दोनों को प्राप्त करें क्योंकि वे स्थलाकृति और नमूने के सतह गुण पर पूरक जानकारी प्रदान करते हैं.
      नोट: स्कैन समय छवि क्षेत्र और छवि बनाने के लिए चयनित लाइनों की संख्या के साथ वृद्धि होगी, लेकिन प्रति सेकंड स्कैन लाइनों की संख्या के रूप में परिभाषित स्कैन दर के साथ कमी. फास्ट स्कैन दरों छवि गुणवत्ता को प्रभावित कर सकते हैं. इसलिए, रैस्टरिंग की गति को अधिग्रहण समय और छवि गुणवत्ता के बीच व्यापार को न्यायिक रूप से संतुलित करना चाहिए।
  2. हाइड्रेटेड vesicles छवि के लिए, नरम, हाइड्रेटेड नमूने स्कैनिंग के लिए उपयुक्त एक cantilver का चयन करें और तरल पदार्थ में स्कैनिंग के लिए डिज़ाइन किया गया एक जांच धारक पर cantilver माउंट।
    नोट: उपलब्ध AFM इंस्ट्रूमेंटेशन के साथ संगत एक जांच का चयन करते समय, सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध जांच के विनिर्देशों (त्रिकोणीय cantilver के साथ 175 $m नाममात्र लंबाई, 22 डिग्री मीटर चौड़ाई, 20 एनएम टिप त्रिज्या, 0.07 N/ 4 से 8 kHz के बीच की सीमा में ड्राइव आवृत्ति के साथ इमेजिंग के लिए अनुकूलित एक गाइड के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.
    1. स्कैनिंग के दौरान तरल में हवा के बुलबुले शुरू करने की संभावना को कम करने के लिए 1x पीबीएस के साथ कैंटिलवर की नोक गीला करें।
    2. AFM चरण पर चरण 2.11 से तैयारी प्लेस. चुंबकीय स्टेनलेस स्टील नमूना डिस्क अपनी सतह पर स्थिर EVs युक्त संलग्न अभ्रक स्थिर होगा.
    3. तैयारी और AFM चरण के लिए समय की अनुमति के लिए थर्मल बराबर.
    4. दोहन मोड में हाइड्रेटेड अभ्रक सतह छवि। ऊंचाई और चरण छवियों दोनों प्राप्त करें.
      नोट: इमेजिंग गुणवत्ता इंस्ट्रूमेंटेशन, चयनित जांच, और स्कैन मापदंडों से प्रभावित है। स्कैनिंग शर्तों का अनुकूलन करते समय, निम्न विकल्प एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में उपयोग किया जा सकता है: 5 x 5 डिग्री क्षेत्र के साथ 512 लाइनों में स्कैन $0.8-1.0 हर्ट्ज स्कैन दर और ड्राइव आवृत्ति के बीच 4 से 8 kHz.

4. छवि विश्लेषण

नोट: निम्न डेटा संसाधन और विश्लेषण चरण अधिग्रहीत ऊंचाई छवियों के लिए लागू होते हैं। इसी तरह की प्रक्रिया चरण डेटा का विश्लेषण करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। नीचे दिए गए विवरण Gwyddion12के लिए विशिष्ट है, एक स्वतंत्र और खुला स्रोत सॉफ्टवेयर GNU जनरल पब्लिक लाइसेंस के तहत उपलब्ध है. इसी तरह की क्षमताओं वैकल्पिक सॉफ्टवेयर उपकरणों में उपलब्ध हैं.

  1. डेटा प्रक्रिया, एसपीएम मोड, युक्ति पर जाएँ और मॉडल युक्ति चुनें ( चित्र2) . ज्यामिति और नमूने को स्कैन करने के लिए उपयोग किया गया टिप के आयामों का चयन करें और ठीकक्लिक करें.
  2. सतह पुनर्निर्माण प्रदर्शन करके टिप कटाव कलाकृतियों को सही करें। छवि खोलें. मेनू से, डेटा प्रक्रिया, SPM मोड, युक्तिका चयन करें, फिर सतह पुनर्निर्माण चुनें और ठीक क्लिक करें (चित्र 3).
  3. स्कैन डेटा से सब्सट्रेट में झुकाव को हटाने के द्वारा प्रयोगशाला XY विमान मैच के लिए इमेजिंग विमान संरेखित करें। इस कार्य को पूरा करने के लिए, डेटा प्रक्रिया, स्तर का चयन करें और समतल स्तर चुनें (चित्र 4).
  4. डेटा प्रक्रियाका चयन करके छवि की पंक्तियाँ संरेखित करें, डेटा को सही करें और फिर पंक्तियाँ संरेखित करेंचुनें. कई संरेखण विकल्प उपलब्ध हैं (चित्र 5) . उदाहरण के लिए, माध्य एक एल्गोरिथ्म है जो प्रत्येक स्कैन लाइन की औसत ऊँचाई ढूँढता है और उसे डेटा से घटाता है.
  5. डेटा प्रक्रिया पर जाएँ, डेटा सही करें और निशान निकालें चुनें (चित्र 6),जो निशान के रूप में जाना जाने वाला सामान्य स्कैनिंग त्रुटियों को निकालता है.
  6. डेटा प्रक्रिया से पहुँच योग्य स्तर ड्रॉप-डाउन मेनू में समतल आधार का चयन करके अभ्रक की सतह को शून्य ऊँचाई पर संरेखित करें(चित्र 7).
  7. अनाज ड्रॉप-डाउन मेनू में थ्रेशहोल्ड द्वारा चिह्नित करके स्कैन की गई सतह पर ईवीएस की पहचान करें (चित्र 8क)। यह एल्गोरिथ्म उपयोगकर्ता-चयनित सीमा के ऊपर की ऊंचाई से शून्य सतह सब्सट्रेट से बाहर निकलते कणों के रूप में सतह immobilized extosomes की पहचान करता है। 1 और 3 एनएम के बीच की सीमा में एक सीमा का चयन करें, जो पृष्ठभूमि हस्तक्षेप के अधिकांश को खत्म कर देगा. छोटे दहलीज क्लीनर पृष्ठभूमि के साथ उपयोग किया जाता है।
    नोट: चित्र 8A में थ्रेशोल्ड 1.767 एनएम है। इस सीमा के साथ MCF-7 एक्सोसोम पहचान का परिणाम चित्र 8खमें दर्शाया गया है। Gwyddion स्वचालित दहलीज (Otsu की विधि), बढ़त का पता लगाने, और वाटरशेड एल्गोरिथ्म सहित छवि में vesicles की पहचान करने के लिए एल्गोरिथ्म के रूप में दहलीज करने के लिए कई विकल्प प्रदान करता है।
    नोट: कण agglomerates, अगर AFM छवि में मौजूद, नकाबपोश और विश्लेषण से बाहर रखा जा सकता है.
  8. अनाज मेनू से सुलभ उपलब्ध वितरण एल्गोरिदम का उपयोग कर की पहचान EVs के ज्यामितीय और आयामी विशेषता प्रदर्शन.
    नोट: Gwyddion एक हाइड्रेटेड या desicated राज्य में अदिश मूल्य, क्षेत्रीय, volumetric, और स्थिर EVs के अन्य गुणों के वितरण का आकलन करने के लिए उपकरण प्रदान करता है। एक अदिश-मूल्यों गुण का एक उदाहरण चित्र 9 में दिखाया गया है, जो प्रत्येक पहचान े गए एक्सोसोम के पदचिह्न के भीतर अधिकतम ऊँचाई का वितरण देता है।
  9. अन्य कम्प्यूटेशनल उपकरण और कस्टम कंप्यूटर प्रोग्राम द्वारा विशेष विश्लेषण के लिए Gwyddion से AFM डेटा निर्यात.

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Representative Results

EVs की सतह निर्धारण इमेजिंग अनुक्रम में एक महत्वपूर्ण कदम है. एक्सोसोम की इलेक्ट्रोस्टैटिक सतह स्थिरीकरण, एक नकारात्मक जीटा क्षमता के लिए जाना जाता है, सूक्ष्मता के सब्सट्रेट एक सकारात्मक सतह प्रभारी है करने के लिए संशोधित किया गया है के बाद मजबूती से हो जाएगा। NiCl2 के साथ उपचार के बिना सकारात्मक सतह परिवर्तन प्रदान करने के लिए, सब्सट्रेट पर EVs के स्थिरीकरण अप्रभावी होना पाया गया. चित्रा 10Aमें ऊंचाई छवि, MCF-7 एक्सोसोम नमूना पीबीएस के प्रति एमएल 2.59 x 1010 vesicles युक्त के बाद हवा में प्राप्त ताजा cleaved अभ्रक की असंशोधित सतह पर 12 एच के लिए incubated किया गया था, बहुत कुछ vesicles पर शेष से पता चलता है सतह के बाद यह DI पानी के साथ साफ किया गया था. चित्र 10क में दिखाई देने वाले vesicles हैं, सबसे अधिक संभावना है, DI पानी की अधूरी आकांक्षा का परिणाम है, जो vesicles resuspended सतह के लिए तय नहीं है और फिर उन्हें सब्सट्रेट पर deposed के रूप में यह लुप्त हो गई.

निकल क्लोराइड के साथ सतह के आरोप को संशोधित करने के बाद, यह पुष्टि करने के लिए सलाह दी जाती है कि उपचार के बाद सतह संदूषकों से मुक्त रहती है। चित्र 10ख में ऊंचाई छवि (हवा में प्राप्त) एक साफ सतह का एक उदाहरण देता है के बाद यह NiCl2 के साथ इलाज किया गया था और फिर DI पानी के साथ तीन बार धोया. धनायन-derivatized सतह की खुरदरापन 0.3 एनएम से नीचे था, जो पिछले रिपोर्ट13के अनुरूप है।

एमसीएफ-7 एक्सोसोम के निर्धारण की दक्षता पर पृष्ठीय आवेश संशोधन के नाटकीय सकारात्मक प्रभाव को चित्र 10ब्, छ द्वारा सचित्र 10ब् ,डद्वारा सचित्र है। इन दो पैनलों से पता चलता है कि नमूने के बाद हवा में प्राप्त ऊंचाई स्कैन, जो पहले चित्र 10Aमें छवि बनाई गई थी, को निकल क्लोराइड के साथ इलाज की गई सतह पर क्रमशः 24 एच और 12 एच के लिए इनक्यूबेट किया गया था।

समय किसी दिए गए नमूने का इलाज सतह पर incubated है स्थिर EVs की सतह एकाग्रता (प्रति क्षेत्र vesicles) निर्धारित करता है. चित्र 10C में ऊंचाई छवि वर्णित MCF-7 एक्सोसोम नमूने के बाद प्राप्त immobilize vesicles द्वारा अत्यधिक घने सतह कवरेज के मामले को दिखाता है 24 एच के लिए incubated किया गया था. एल्गोरिथ्म की एक संख्या छवि सुधार और डेटा विश्लेषण करने के लिए अनाज के बीच पर्याप्त खाली सब्सट्रेट होने पर भरोसा करते हैं। उदाहरण के लिए, समतल और शून्य विमान, लाइन सुधार, और अनाज की मात्रा का आकलन करने के लिए सब्सट्रेट स्थानांतरण सही गणना करने के लिए मध्यवर्ती फ्लैट सतह की जरूरत है। जब स्थिर vesicles की एकाग्रता चित्र 10Cमें के रूप में उच्च है, इन एल्गोरिदम मज़बूती से कार्य नहीं करेगा. एक ही MCF-7 नमूने से स्थिर vesicles की एक पर्याप्त सतह एकाग्रता का एक उदाहरण चित्र 10Dमें ऊंचाई छवि में दिखाया गया है, जो कम (12 एच) ऊष्मायन के बाद प्राप्त किया गया था.
 
प्राप्त कच्चे AFM डेटा के बाद प्रसंस्करण के लिए आम स्कैनिंग त्रुटियों के लिए सही की जरूरत है. निम्नलिखित वर्णन Gwyddion के लिए विशिष्ट है. इसी तरह की कार्यक्षमता अन्य AFM/SPM डेटा विश्लेषण उपकरणों में उपलब्ध है.

Gwyddion के भीतर, विमान स्तर समारोह सब्सट्रेट में एक झुकाव के लिए सही करने के लिए प्रयोग किया जाता है। इस तरह की पृष्ठभूमि सुधार पहले छवि में सभी डेटा अंक का उपयोग कर सब्सट्रेट के विमान खोजने और फिर कच्चे डेटा से घटाना द्वारा पूरा किया है. स्कैन लाइनों के साथ सुधार संरेखित पंक्तियाँ फ़ंक्शन द्वारा पूरा किया है। उदाहरण के लिए, लागू किए गए एल्गोरिदम में से एक संरेखण प्रत्येक स्कैन लाइन की औसत ऊँचाई कंप्यूटिंग और फिर छवि डेटा की इसी पंक्ति से परिणाम घटाना द्वारा करता है। प्रतिक्रिया लूप में स्थानीय दोषों का योगदान निकालें निशान फ़ंक्शन लागू करके निकाला जा सकता है, जो संरेखित डेटा में अंतराल को भरता है और सन्निकट स्कैन लाइनों में डेटा की तुलना करके निशान को समाप्त करता है। ऊंचाई के लिए सब्सट्रेट के बदलाव - 0 अनाज और अन्य सुविधाओं मास्किंग के बाद सतह के एक पहलू और बहुपद समतल के संयोजन से पूरा किया जा सकता है। Gwyddion के समतल आधार उपकरण इस कार्य को स्वायत्त रूप से या उपयोगकर्ता-निर्दिष्ट मास्क के साथ निष्पादित करता है. वर्णित पृष्ठभूमि और लाइन सुधार के बाद, स्थिर statically fixated vesicles मार्क अनाज समारोह को क्रियान्वित करके सब्सट्रेट पर पहचाना जा सकता है.

चित्र ाााल 11क तथा चित्र ा11ख्य ंे े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े े स्कैन किए गए क्षेत्र में कुल 561 हाइड्रेटेड vesicles की पहचान की गई थी जिसमें मार्क ग्रेन्स फ़ंक्शन के थ्रेशहोल्ड एल्गोरिथ्म का उपयोग करके $20% के लिए निर्धारित थ्रेशहोल्ड मान था। ड्राइव आवृत्ति पर जांच की प्रतिक्रिया के चरण अंतराल नरम नमूनों में स्थानीयकृत कठोरता विविधताओं के प्रति संवेदनशील है। चित्र 11क,बीमें दिखाई गई ऊँचाई और प्रावस्था छवियों के बीच संगति, इसलिए, एक महत्वपूर्ण पुष्टि है कि छवि वाले अनाज वास्तव में, मुलायम vesicles सब्सट्रेट पर स्थिर हैं।
 
चित्र 11ण् चित्र 11क चित्र 11कमें श्वेत रेखा पर स्थित बाह्यसमों के माध्यम से ऊँचाई प्रतिबिंब के अनुप्रस्थ अनुभाग को दर्शाता है। जबकि एक बायोफ्लूइड में एक्सोसम में गोलाकार ज्यामिति1,14,15,16होती है , लेकिन सब्सट्रेट पर उनका आकार धनावेशित आवेशित इलेक्ट्रोस्टैटिक आकर्षण द्वारा बुरी तरह विकृत हो जाता है। सतह. स्थिर वैद्युत गतिहीन vesicles की अस्पष्ट पैनकेक जैसी ज्यामिति को चित्र 11क में बॉक्स्ड एक्सोसोम की क्लोज-अप हाइट छवि (और इसके क्रॉस सेक्शन) द्वारा चित्र 11Dमें और सचित्र में दिखाया गया है। संगत प्रावस्था प्रतिबिंब चित्र 11Eमें दर्शाया गया है। एएफएम स्कैन में पहचाने गए सभी 561 हाइड्रेटेड vesicles के लिए सतह से ऊपर शिखर ऊँचाई का अनुभवजन्य प्रायिकता घनत्व फ़ंक्शन (pdf) चित्र 12Aमें दर्शाया गया है। इस वितरण के लिए औसत मान 7.9 दउ है, जो विकृत बलों के अभाव में फॉस्फोलिपिड द्विपरत17 की मोटाई से लगभग दो बार बराबर है।
 
एक स्थिर एक्सोसोम द्वारा कब्जा कर लिया सब्सट्रेट पर क्षेत्र अभ्रक की सतह पर अपनी सीमा के लिए vesicle के "जन के केंद्र" से मतलब दूरी के बराबर व्यास के साथ एक चक्र के रूप में अनुमानित किया गया था। इन प्रक्षेप व्यासों का वितरण चित्र 12क में दर्शाया गया है तथा इसका माध्य 69ण्6 दउ है। प्राप्त ऊंचाई और व्यास वितरण स्थिर एक्सोसोम के विकृत आकार पर स्थिर वैद्युत सतह स्थिरीकरण के महत्वपूर्ण प्रभाव को और अधिक परिमाणित करते हैं।
 
प्रोटोकॉल प्रक्रियाओं की मजबूती और पुनरावृत्तिता की पुष्टि उसी एमसीएफ-7 नमूने को तीन बार, नमूना तैयारी से लेकर इमेजिंग तक, प्रत्येक दोहराने के परिणामों के साथ की पुष्टि की गई जो चित्र 12में दर्शाए गए परिणामों के समान हैं।

स्थिर वैद्युत बलों के कारण स्थिर vesicles के विरूपण मुआवजा या छविEEd EVs के गुणों में एक अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए व्याख्या की जा सकती है. उदाहरण के लिए, AFM डेटा समाधान में vesicles के गोलाकार आकार का अनुमान लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में, हम immobilized vesicles की झिल्ली लिफाफे द्वारा encapsulated मात्रा की गणना कर सकते हैं. मात्रा की पहचान vesicles की सतह स्तर और उनके नीचे सब्सट्रेट ऊंचाई के बीच अंतर को एकीकृत करके पाया जाता है. vesicles के तहत सब्सट्रेट स्तर सीधे सुलभ नहीं है, लेकिन vesicles आसपास खाली सब्सट्रेट के लिए डेटा अंक के Laplace या वैकल्पिक प्रक्षेपद्वारा अनुमान लगाया जा सकता है. Gwyddion के भीतर, इस तरह की मात्रा गणना विभिन्न अनाज विशेषताओं समारोह के वितरण का उपयोग कर किया जाता है. Gwyddion से निर्यात परिणाम तो मात्रा के व्यास में मैप किया जा सकता बराबर क्षेत्रों.

561 विश्लेषणित एम सी एफ -7 vesicles के लिए एएफएम डेटा के लिए वर्णित एल्गोरिथ्म के आवेदन चित्र 12Bमें दिखाया मात्रा-तुल्य क्षेत्रों के व्यास के वितरण का उत्पादन किया। इस वितरण में अभ्रक की सतह पर अपने स्थिर वैद्युत स्थिरीकरण से पहले जैव प्रवाह में अपने सहज गोलाकार रूप में झिल्ली vesicles के आकार का अनुमान लगाया गया है। एएफएम डेटा के विश्लेषण से प्राप्त आशय आकार की तुलना उसी नमूने के क्रायो-टीईएम इमेजिंग के परिणामों से की गई थी और यह निकट करार3 (चित्र 12ख) में पाया गया था। एनटीए द्वारा प्राप्त आशय आकार के साथ मापे गए हाइड्रोडायनामिक व्यासों की तुलनायहइंगित करती है कि एक्सोसोम की गतिशीलता एएफएम और क्रायो-टीईएम से निर्धारित उनके vesicles के आकार से अपेक्षित से बहुत कम होती है माप. हाइड्रोडायनामिक और vesicle आकार के बीच अंतर एक्सोसोमल vesicles आसपास के कोरोनल परत की मोटाई की विशेषता है।

Figure 1
चित्र 1: ईवीएस के हाइड्रोडायनामिक और ज्यामितीय व्यास की तुलना। बाह्य मूल आशय का ज्यामितीय आकार द्रव में इसके प्रसार से निर्धारित हाइड्रोडायनामिक आकार से काफी छोटा होता है। अंतर झिल्ली-संयुग्मी और अधिशोषित अणुओं द्वारा बनाई गई कोरोनल परत है जो ईवीएस की गतिशीलता में बाधा डालती है। यह आंकड़ा संदर्भ3 से संशोधित किया गया है और अनुमति के साथ पुनर्मुद्रण किया गया है।

Figure 2
चित्र 2: AFM जांच के गुण. ज्यामिति और AFM जांच के आयाम मॉडल टिप समारोह का उपयोग कर निर्दिष्ट किया जा सकता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: टिप नमूना कनवल्शन के कारण इमेजिंग आर्टीफैक्ट का सुधार। सतह पुनर्निर्माणप्रदर्शन करके, अधिग्रहीत AFM डेटा टिप कलाकृतियों के लिए सही किया जा सकता है.  कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: सब्सट्रेट में एक झुकाव के लिए सुधार। विमान स्तर सब्सट्रेट के विमान निर्धारित करता है और यह AFM डेटा से subtracts. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: स्कैन पंक्तियों में misalignations का सुधार। स्कैन डेटा को संरेखित करने के लिए एक पारंपरिक एल्गोरिथ्म प्रत्येक स्कैन लाइन के साथ एक औसत ऊँचाई ढूँढने के लिए और छवि में डेटा बिंदुओं की इसी पंक्ति से परिणाम घटाता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6: संरेखित डेटा में अंतराल के लिए सुधार. आम स्कैनिंग त्रुटियों, निशान के रूप में जाना जाता है, AFM डेटा से निशान निकालें समारोह को लागू करने से हटाया जा सकता है.  कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्र 7: शून्य ऊंचाई पर एक सब्सट्रेट के संरेखण। समतल आधार विकल्प स्तर मेनू में उपयोगकर्ता शून्य ऊंचाई के लिए इसी आधार स्तर पर सब्सट्रेट सतह जगह करने के लिए अनुमति देता है।  कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 8
चित्र 8: स्कैन की गई सतह पर स्थिर vesicles की पहचान. (क)सतह पर स्थिर बाह्य बाह्यों की पहचान थ्रेसहोल्ड द्वारा मार्कमें निर्दिष्ट प्रयोक्ता द्वारा चयनित ऊँचाई थ्रेशोल्ड द्वारा सब्सट्रेट के ऊपर बाहर आने वाले अनाज ों के रूप में की जाती है . (ख) पहचान का परिणाम। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 9
चित्र 9: AFM डेटा का विश्लेषण. पहचान किए गए एक्सोसोम द्वारा कब्जा किए गए क्षेत्र के भीतर सब्सट्रेट के ऊपर अधिकतम ऊंचाई का वितरण अनाज वितरण उपकरण द्वारा संकलित के रूप में दिखाया गया है।  कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 10
चित्र 10: सतह संशोधन और स्थिर vesicles की सतह घनत्व के EV एकाग्रता का प्रभाव. (ए)एम सी एफ -7 एक्सोसोम नमूने के साथ 12 एच इनक्यूबेशन के बाद ताजा क्लीवेज अभ्रक सब्सट्रेट की एएफएम ऊंचाई छवि जिसके बाद डीआई पानी और सुखाने के साथ सफाई की जाती है। तरल से सब्सट्रेट करने के लिए EVs के स्थिरीकरण अभ्रक की सतह के लिए एक सकारात्मक आरोप प्रदान किए बिना अक्षम है. स्कैन में देखा कुछ कणों की संभावना सब्सट्रेट सूख गया था इससे पहले कि MCF-7 नमूना के अपूर्ण हटाने का परिणाम है। (बी)निकल क्लोराइड के साथ उपचार के बाद हवा में अभ्रक की सतह की ऊंचाई स्कैन संदूषण से मुक्त सब्सट्रेट को दर्शाता है। पैनलों (सी) और (डी) दिखाएँ AFM ऊंचाई स्कैन सतह प्रभारी के संशोधन के बाद प्राप्त की और एक ही MCF-7 नमूना के साथ ऊष्मायन के रूप में पैनल में (ए) 24 ज और 12 एच के लिए, क्रमशः. स्थिर vesicles की सतह एकाग्रता 24 एच ऊष्मायन के बाद जरूरत से ज्यादा घने है. 12 एच ऊष्मायन सतह और स्कैन डेटा है कि सही विश्लेषण करने के लिए आसान कर रहे हैं पर स्थिर कम exosomes की ओर जाता है।  कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 11
चित्र 11: हाइड्रेटेड MCF-7 एक्सोसोम के एएफएम छवियों इलेक्ट्रोस्टैटिक रूप से संशोधित अभ्रक सतह पर स्थिर. (ए) ऊंचाई छवि. (बी)इसी AFM चरण छवि पुष्टि करता है कि ऊंचाई छवि में अनाज नरम नैनोकणों रहे हैं, के रूप में झिल्ली vesicles के लिए उम्मीद की जानी चाहिए. (ग)पैनल में दर्शाई गई रेखा से क्रॉस किएगए तीन आशयों के ऊँचाई के आंकड़े संशोधित अभ्रक की धनात्मक आवेशित सतह पर एक्सोसोम के वैद्युत आकर्षण के कारण चपटा आकार दर्शाते हैं। (घ) आकार विरूपण एक बढ़े हुए दृश्य में स्पष्ट होता है कि पैनल (ए) और इसके क्रॉस सेक्शन में स्थिर आशय बॉक्स किया जाता है . एक ही आशय की प्रावस्था छवि (ई) में दिखाई जाती है। यह आंकड़ा संदर्भ3 से संशोधित किया गया है और अनुमति के साथ पुनर्मुद्रण किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 12
चित्र 12: हाइड्रेटेड vesicles के आयामी लक्षण सतह पर स्थिर और समाधान में उनके गोलाकार आकार का आकलन. (अ)पृष्ठ (लाल वक्र) से ऊपर शिखर ऊँचाई का वितरण 7ण्9 दउ के बराबर होता है। स्थिर एक्सोसोम द्वारा कब्जा किए गए क्षेत्र में 69.6 एनएम औसत व्यास (नीले वक्र) है। (ख)स्थिर बाह्य शक्तियों में से एक के लिए एएफएम ऊँचाई प्रतिबिंब वैद्युत बलों के कारण होने वाले अत्यधिक अद्यतित आकार को दर्शाता है। समाधान में एक्सोसोमल vesicles के गोलाकार आकार सतह-immobilized और गोलाकार झिल्ली लिफाफे से संलग्न मात्रा मिलान द्वारा अनुमान लगाया जा सकता है। (ग)विलयन (लाल वक्र) में गोलाकार आशयों का आकार वितरण 561 स्थिर आशयों के एएफएम डेटा से निर्धारित किया गया था। क्रायो-टीईएम छवियों (नीले वक्र) में vesicle आकार AFM परिणामों के साथ संगत कर रहे हैं. यह आंकड़ा संदर्भ3 से संशोधित किया गया है और अनुमति के साथ पुनर्मुद्रण किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 13
चित्र 13: सतह एकाग्रता और आकार पृथक्करण कलाकृतियों तरल वाष्पीकरण से EVs के निष्क्रिय बयान के दौरान. (ए)स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) छवि से पता चलता है कि एक सुखाने तरल से निष्क्रिय रूप से जमा एक्सोसोम की सतह एकाग्रता स्थानिक चर है जब सतह एक निलंबित biofluid से स्थिरीकरण नहीं किया जाता है. (बी) सुखाने के नमूने से ईवीएस का निष्क्रिय जमाव vesicles आकार अलगाव का कारण बनता है। पर्याप्त आकार परिवर्तनशीलता प्रायिकता घनत्व कार्यों द्वारा मात्रा निर्धारित है (pdf) छवि में विभिन्न क्षेत्रों में vesicles के लिए (ए) सफेद विकर्ण लाइनों द्वारा परिभाषित. यह आंकड़ा संदर्भ1 से संशोधित किया गया है और अनुमति के साथ पुनर्मुद्रण किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 14
चित्र 14: तरल वाष्पीकरण के दौरान सतह पर निष्क्रिय रूप से जमा किए गए शुष्क vesicles के कप के आकार की ज्यामिति। वेस्क्यूल की सतह शुष्कता, जो स्थिर वैद्युत बलों द्वारा स्थिर नहीं थे, के परिणामस्वरूप ईवी के SEM छवियों में अक्सर एक कप के आकार का रूप देखा जाता है। यह आंकड़ा संदर्भ1 से संशोधित किया गया है और अनुमति के साथ पुनर्मुद्रण किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

एक जैविक तरल पदार्थ से EVs के स्थिरीकरण, सतह स्कैनिंग, और छवि विश्लेषण तरल में EVs के AFM विशेषता के लिए विकसित प्रोटोकॉल के आवश्यक कदम हैं. vesicles की संख्या छविसतह सतह क्षेत्र और vesicles की सतह एकाग्रता सब्सट्रेट पर स्थिर के साथ AFM इमेजिंग तराजू के लिए अनुकूल है. EVs और exosomes18की एक नकारात्मक जीटा क्षमता को देखते हुए, हम द्रव नमूनों से AFM सब्सट्रेट करने के लिए EVs के इलेक्ट्रोस्टैटिक निर्धारण की वकालत करते हैं। जब सतह पर धनावेशित होता है तो स्थिरीकरण प्रभावी होता है। ईवी स्थिरीकरण से पहले, सकारात्मक सतह आवेश को सब्सट्रेट को प्रदान करने की आवश्यकता हो सकती है, जैसे अभ्रक के मामले में - सामान्य सूत्र काल2(अल्सी3ओ10)(OH)2के साथ एक स्तरित सिलिकेट खनिज। ताजा cleaved अभ्रक की सतह पूरी तरह से फ्लैट है, जो AFM द्वारा इमेजिंग नैनोकणों के लिए आदर्श है के करीब है, लेकिन इसकी सतह प्रभारी नकारात्मक है और, इस प्रकार, संशोधित किया जाना चाहिए. प्रोटोकॉल AFM सब्सट्रेट करने के लिए एक सकारात्मक सतह परिवर्तन प्रदान करने के लिए प्रक्रिया का वर्णन करता है. प्रतिनिधि परिणाम संशोधित अभ्रक सब्सट्रेट करने के लिए एक biofluid से EV निर्धारण में उल्लेखनीय सुधार दिखा.
 
जब इमेजिंग हाइड्रेटेड vesicles, यह नमूना वाष्पीकरण जो सतह जमा कलाकृतियों और संवहनी प्रवाह का कारण बनता है और समय के साथ vesicles के तरल एकाग्रता बढ़ जाती है कम से कम करने के लिए महत्वपूर्ण है, उच्च सतह एकाग्रता के लिए अग्रणी उम्मीद से स्थिर EVs, विशेष रूप से लंबे समय तक ऊष्मायन के दौरान. जांच धारकों स्पष्ट रूप से तरल नमूने को खत्म करने या धीमी वाष्पीकरण के लिए डिजाइन और छवि हाइड्रेटेड EVs के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. स्कैनिंग जांच के लिए गैर विशिष्ट बाइंडिंग आयनिक प्रजातियों की उपस्थिति में कम कर रहे हैं। इसलिए, जब इमेजिंग हाइड्रेटेड EVs, यह एक बफर मध्यम के साथ सब्सट्रेट को कवर करने के लिए बेहतर है, जैसे PBS, DI पानी के बजाय.

सतह स्थिरीकरण का महत्व
संशोधित सब्सट्रेट पर EVs के अनुरूप और उम्मीद के मुताबिक immobilization AFM परिणामों में परिवर्तनशीलता के प्राथमिक स्रोत को हटा. सभी बहाव कदम, स्कैनिंग से डेटा विश्लेषण करने के लिए, और अधिक आसानी से इंस्ट्रूमेंटेशन, जांच, स्कैनिंग मापदंडों, और डेटा विश्लेषण अनुक्रम और एल्गोरिदम के चयन के द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं। उपयोगकर्ता जैविक नमूने और EV आइसोलेशन प्रोटोकॉल, जो इस काम के दायरे से परे महत्वपूर्ण मुद्दे हैं में upstream परिवर्तनशीलता के बारे में पता होना चाहिए.

हम तरल नमूनों से संशोधित अभ्रक की सतह पर EV की सतह immobilization प्रदर्शन की सलाह देते हैं, यहां तक कि जब लक्ष्य हवा में desicated vesicles की विशेषता है - जरूरत के बाद से vesicles unavoidably किसी भी सब्सट्रेट पर जमा होगा कम स्पष्ट है द्रव वाष्पित हो जाता है। वास्तव में, mica की सतह के आरोपों को संशोधित किए बिना प्राप्त desicated EV के लिए एएफएम परिणाम, जो एक तरल से ईवीएस के इलेक्ट्रोस्टैटिक स्थिरीकरण के लिए एक शर्त कदम है, पिछले19में सूचित किया गया है,20,21 . जब ईवीएस तरल नमूने से सतह के लिए तय नहीं कर रहे हैं, तथापि, वाष्पीकरण द्वारा उनके निष्क्रिय बयान सामूहिक रूप से एक कॉफी की अंगूठी प्रभाव22के रूप में जाना कलाकृतियों का उत्पादन होगा. ऐसी दो कलाकृतियों, एक सुखाने तरल recedes के रूप में होने वाली, SEM छवि में सचित्र हैं (चित्र 13A) सीरम एक्सोसोम के एक नकारात्मक आरोप कांच की सतह पर वाष्पीकरण द्वारा जमा. वेगित vesicles की सतह एकाग्रता में महत्वपूर्ण भिन्नताएं तुरंत स्पष्ट होती हैं। दूसरी कलाकृति, चित्र 13Bमें परिमाणित, सूखे नमूने की परिधि के भीतर विभिन्न क्षेत्रों में vesicle आकार में काफी परिवर्तनशीलता है. इन कलाकृतियों को देखते हुए, एक सुखाने तरल से निष्क्रिय जमा vesicles के AFM विशेषता पक्षपाती या असंगत परिणाम का उत्पादन कर सकते हैं जब तक कि पूरे सतह क्षेत्र शुरू में एक अब सूखा तरल नमूना द्वारा कब्जा कर लिया स्कैन किया है.

दो अतिरिक्त मुद्दों पर विचार किया जाना चाहिए जब substrate पर vesicles की फर्म स्थिरीकरण के बिना प्राप्त desicated नमूनों इमेजिंग. याद रखें कि हमारे प्रोटोकॉल उपयोगकर्ताओं को अच्छी तरह से डीआई पानी के साथ सतह धोने के बाद vesicles एक तरल नमूने से स्थिर कर रहे हैं निर्देश. यह कदम काफी osmolarity के साथ जटिल biofluids के वाष्पीकरण के दौरान सतह जमा बनाने से आयनिक और अन्य गैर vesicular solutes को रोकने का इरादा रखता है. यदि EVs तय नहीं कर रहे हैं, पूरी तरह से धोने सतह से vesicles की एक बड़ी संख्या अलग होगा, संभावित परिणाम ों पूर्वाग्रह और विश्लेषण के लिए बहुत कुछ कणों छोड़ने. एक और आम कठिनाई, AFM इमेजिंग से पहले संशोधित अभ्रक सतह पर EVs immobilizing द्वारा कम, जांच23 और भ्रामक कलाकृतियों इस घटना की वजह से करने के लिए कणों के आसंजन है.
 
स्थिर ईवीएस के सतह घनत्व का नियंत्रण
प्रोटोकॉल में पहचाने गए दो आसानी से नियंत्रणीय कारक उपयोगकर्ता को संशोधित अभ्रक सब्सट्रेट पर स्थिर ईवीएस की सतह एकाग्रता को अनुकूलित करने की अनुमति देते हैं: तरल नमूने में vesicles की एकाग्रता और नमूना पर incubated है समय सब्सट्रेट. immobilized vesicles के एक उच्च घनत्व, लंबे समय तक ऊष्मायन समय और तरल में EVs के उच्च एकाग्रता के साथ हासिल की, स्कैनिंग के दौरान विश्लेषण vesicles की संख्या बढ़ जाती है और निष्कर्ष के सांख्यिकीय शक्ति AFM के विश्लेषण से पहुंचे डेटा. एक ही समय में, एक अत्यधिक घने सतह एकाग्रता, चित्रा 10C में दिखाए गए मामले में के रूप में जहां कणों कसकर सब्सट्रेट का कोई हस्तक्षेप क्षेत्रों के साथ पूरी सतह को कवर, छवि विश्लेषण और परिणामों की व्याख्या पेचीदा और बारीकी से अंतरिक्ष कणों के बीच बातचीत की वजह से कलाकृतियों स्कैनिंग करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं।

ईवीएस की इलेक्ट्रोस्टैटिक स्क्रीनिंग और हाइड्रोडायनामिक गतिशीलता का प्रभाव
यह एक उपयोगकर्ता एक अध्ययन की विशिष्ट जरूरतों को पूरा करने के लिए प्रयोगात्मक शर्तों को अनुकूलित करने के लिए अनुमति देता है को प्रभावित करने वाले कारकों के एक समारोह के रूप में immobilized EVs की सतह एकाग्रता पर पारदर्शी नियंत्रण. अनुकूलन करते समय, यह समझना महत्वपूर्ण है कि स्थिर वैद्युत सतह स्थिरीकरण एक परिवहन-सीमित प्रक्रिया है जो जैव प्रवाह की आयनिक शक्ति से प्रभावित होती है।

आयनिक और धनावेशित प्रजातियों की सांद्रता व्युत्क्रमरूप डेबाई लंबाई को प्रभावित करती है जिस पर सतह और आशय के आरोपों की जांच की जाती है। इस लंबाई के अलावा, स्थिर वैद्युत बल नगण्य हैं। सब्सट्रेट के इलेक्ट्रोस्टैटिक आकर्षण की सीमा परत DI पानी की तुलना में आयनात्मक रूप से समृद्ध पीबीएस में बहुत छोटी होगी। इस अंतर का अर्थ है कि, तरल की परत को कम करने के लिए आवश्यक समय के अनुरूप एक छोटी ऊष्मायन के बाद जहां इलेक्ट्रोस्टैटिक आकर्षण महसूस किए जाते हैं, डीआई जल में निलंबन से स्थिर ईवीएस का सतह घनत्व पीबीएस से अधिक होगा। निलंबन, EVs की एकाग्रता संभालने दोनों तरल पदार्थ में एक ही है. अलग ढंग से रखो, अधिक vesicles अन्यथा समान परिस्थितियों के तहत पीबीएस की तुलना में DI पानी में एक मोटा आकर्षण परत को कम करने के लिए स्थिर किया जाना चाहिए।

vesicles सीमा परत से समाप्त हो रहे हैं के बाद, स्थिरीकरण एक पूरी तरह से परिवहन सीमित प्रक्रिया बन जाता है. इस शासन में, जमा की दर निलंबित माध्यम (जैसे, डीआई पानी या पीबीएस) पर निर्भर नहीं करेगी, जब तक चिपचिपापन एक ही है और परिवहन पूरी तरह से diffusive है। हालांकि, आकर्षण सीमा परत में vesicles के परिवहन पूरी तरह से diffusive नहीं हो सकता है. उदाहरण के लिए, यदि AFM सब्सट्रेट पर एक सेसिले ड्रॉप में नमूना आंशिक रूप से ऊष्मायन के दौरान वाष्पित हो जाता है, ड्रॉप के अंदर तरल पदार्थ वाष्पीकरण-चालित प्रवाह के अधीन होगा, और सब्सट्रेट की ओर vesicles के परिवहन होगा, दोनों, विसरणऔर संवहनी योगदान. जब वाष्पीकरण को पर्याप्त रूप से नियंत्रित नहीं किया जाता है, तो संवहनी परिवहन का योगदान काफी होगा, और स्थिरीकरण की दर अपेक्षा से अधिक होगी। संवहनी परिवहन का प्रभाव आकर्षण परत की मोटाई के साथ बदल जाएगा, जो स्वयं तरल की आयनिक सामग्री पर निर्भर करता है। इसके अलावा, वाष्पीकरण समाधान में EVs ध्यान केंद्रित करके सब्सट्रेट पर vesicle अचलीकरण में वृद्धि होगी. उच्च EV सांद्रता पर, आकर्षण परत और आसन्न तरल के बीच एकाग्रता ढाल में वृद्धि होगी, सब्सट्रेट की ओर vesicles के प्रवास के लिए एक बड़ा ऊष्मागतिक ड्राइविंग बल बनाने.

Immobilized vesicles एक पूर्वाग्रह के साथ एक तरल नमूना का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं. इस मामले के लिए जब स्थिरीकरण की दर प्रसार द्वारा सीमित है, छोटे हाइड्रोडायनामिक आकार के साथ vesicles, vesicle आकार के संयोजन और यह आसपास के कोरोनल परत की मोटाई द्वारा निर्धारित (चित्र 1),अधिक प्रवेश करने की संभावना है उनके उच्च गतिशीलता की वजह से आकर्षण परत. परिणामस्वरूप, प्रारंभिक अवक्षय अवधि के बाद, हाइड्रोडायनामिकरूपी छोटे ईवीएस को तरल नमूने में ईवी जनसंख्या में उनके योगदान की तुलना में सब्सट्रेट पर अधिक प्रतिनिधित्व किया जाएगा। ध्यान दीजिए कि एक छोटा हाइड्रोडायनामिक आकार कोरोनल परत3की मोटाई में विषमता के कारण छोटे आशय के आकार के साथ ईवीएस पर स्वचालित रूप से इंगित नहीं करता है। पक्षपाती प्रतिनिधित्व लंबे ऊष्मायन ों के साथ बचा जाता है जो सब्सट्रेट पर अपनी अचलीकरण द्वारा तरल में ईवीएस की पूरी आबादी को कम कर देते हैं। जब एक उपयोगकर्ता biofluid से सभी EVs immobilizing करना है, immobilized vesicles के साथ सतह की जरूरत से ज्यादा घने कवरेज से बचने के लिए, यह प्रोटोकॉल में सुझाव दिया सीमा के नीचे तरल में EV एकाग्रता को कम करने के लिए आवश्यक हो सकता है.

सब्सट्रेट पर ईवीएस की विकृति
उनके मूल हाइड्रेटेड राज्य में extracellular vesicles और शुष्कता के बाद AFM द्वारा विशेषता जा सकता है, प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में. स्थिर वैद्युत बल24 जो अभ्रक की सतह पर ईवी को स्थिर करते हैं, वे भी गोलाकार ज्यामिति से अपने आकार को विकृत कर देते हैं जिसमें वे विलयन में मौजूद होते हैं। स्थिर ईवीएस के आकार और आकारिकी पर शुष्कता के प्रभाव से पहले और बाद में नमूना शुष्क करने के लिए अनुमति दी जाती है एक ही सतह क्षेत्र rescanस्कैन द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है।

यह desicated EVs के आकार पर नमूना तैयारी के प्रभाव की जांच करने के लिए शिक्षाप्रद है. स्थिर स्थिर रूप से स्थिर ईवीएस सुखाने के बाद अत्यधिक अस्पष्ट ज्यामिति को बनाए रखता है लेकिन शुष्कता द्वारा इसे और चपटा कर दिया जाता है। शुष्कीकृत vesicles की सतह के ऊपर की ऊँचाई चित्र 12ककी तुलना में छोटी हो जाती है, जबकि उनके पदचिह्न क्षेत्र में वृद्धि होती है (डेटा नहीं दिखाया गया है)। दूसरी ओर, जब vesicles निष्क्रिय तरल वाष्पीकरण के दौरान और सतह पर पूर्व immobilization के बिना जमा कर रहे हैं, वे शुष्कता पर एक कप आकार ज्यामिति प्राप्त करते हैं, के रूप में लंबे समय से SEM छवियों में मनाया गया है और, और हाल ही में, AFM में स्कैन. इस कपाणित आकार को अब सतह शुष्कता के दौरान केशिका बलों में असमानता के कारण नमूना तैयारी कलाकृति25 के रूप में मान्यता प्राप्त है, जैसा कि चित्र 141में यंत्रीकृत रूप से समझाया गया है।
 
छवि विश्लेषण और AFM डेटा की व्याख्या
इलेक्ट्रोस्टैटिक और केशिका बलों के लिए प्रतिक्रियाओं EVs के संरचनात्मक और compositional गुण पर मूल्यवान जानकारी प्रदान करते हैं EVs के आकार को विकृत करने के लिए अभिनय. उदाहरण के लिए, जैवभौतिक विशेषताओं का एक बहुआयामी समूह, जैसे विकृत आकार और AFM डेटा से निकाले गए आकार, हाल ही में विभिन्न मेजबान कोशिकाओं द्वारा स्रावित एक्सोसोम के बीच अंतर करने की व्यवहार्यता प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया गया5. विकृतियों को भी ध्यान में रखा जा सकता है और मुआवजा दिया जा सकता है। उदाहरण के लिए, हमने दिखाया कि एएफएम डेटा का उपयोग करने के लिए क्षेत्रों के व्यास का आकलन करके समाधान में vesicles के गोलाकार आकार की विशेषता है कि immobilized exososmes3के रूप में एक ही मात्रा encapsulate.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखकराष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (पुरस्कार संख्या IGERT-0903715), यूटा विश्वविद्यालय (रासायनिक इंजीनियरिंग बीज अनुदान और स्नातक अनुसंधान फैलोशिप पुरस्कार के विभाग) से वित्तीय सहायता स्वीकार करते हैं, और विज्ञान के Skolkovo संस्थान और प्रौद्योगिकी (स्कोलटेक फैलोशिप).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AFM/STM Controller  Bruker Multimode Nanoscope V This AFM controller supports imaging of biological samples in liquid and air. 
AFM/STM metal specimen discs (10 mm) TedPella 16207 Metal specimen disc on which a mica disk is attached by a double-sided tape or other means.
AFM/STM Mica discs (10 mm) TedPella 50 Highest quality grade V1 mica, 0.21mm (0.0085”) thick. Interleaved, in packages of 10. Can be mounted on AFM/STM discs. Available in four diameters
AFM probe for imaging in the air Bruker TESP-V2 High quality etched silicon probes for tapping mode and non-contact mode for scanning in the air.
AFM probe for soft sample imaging in liquid Bruker MLCT Soft silicon nitride cantilevers with silicon nitride tips, which are well-suited for liquid operation.  The range in force constants enables users to image extremely soft samples in contact mode as well as high load vs distance spectroscopy.
Double sided tape Spectrum 360-77705 Used to fix the mica disk on the metal specimen disc.
ExoQuick-TC System Biosciences EXOTC50A-1 ExoQuick-TC is a proprietary polymer-based kit designed for exosome isolation from tissue culture media. 
Glass probe AFM holder for imaging in liquid Bruker  MTFML-V2 This glass probe holder is designed for scanning in fluid with the MultiMode AFM.  The holder can be used in peak force tapping mode, contact mode, tapping mode, and force modulation.  The probe is acoustically driven by a separate piezo oscillator for larger amplitude modulation.  The holder is supplied with two ports, required fittings, and accessories kit for adding and removing fluids.
Gwyddion Czech Metrology Institute. Version 2.52 Open Source software for visualization and analysis of data fields obtained by scanning probe microscopy techniques.
Lint-free blotting paper GE Healthcare Whatman  Grade GB003 Blotting Paper Use this blotting paper to remove NiCl2 after the modification of the mica's substrate.  
Lint-free cleanroom wipes Texwipe AlphaWipe TX1004 Use these polyester wipes for surface cleaning. 
Nickel(II) chloride (NiCl2) Sigma-Aldrich 339350 Powder used to make 10 mM NiCl2 in DI water
Phosphate Buffered Saline (1x) Gibco 10010023 PBS, pH 7.4

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जैव रसायन अंक 151 परमाणु बल माइक्रोस्कोपी एक्सोसोम और एक्स्ट्रासेलुलर vesicles सतह अचलीकरण आयामी लक्षणीकरण आकृतिक लक्षणीकरण जैवभौतिक लक्षणीकरण झिल्ली vesicles के आकार हाइड्रेटेड और शुष्क नमूने छवि विश्लेषण
परमाणु बल माइक्रोस्कोपी द्वारा extracellular Vesicles की इमेजिंग
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Skliar, M., Chernyshev, V. S.… More

Skliar, M., Chernyshev, V. S. Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (151), e59254, doi:10.3791/59254 (2019).

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