Summary
Viene descritta una procedura passo-passo per l'immobilizzazione senza etichette di esosomi e vescicoli extracellulari da campioni liquidi e la loro imaging mediante microscopia a forza atomica (AFM). Le immagini AFM vengono utilizzate per stimare le dimensioni delle vesciche nella soluzione e caratterizzare altre proprietà biofisiche.
Abstract
Gli esosomi e altre vesciche extracellulari (EV) sono complessi molecolari costituiti da una vescica della membrana lipidica, la sua decorazione superficiale da proteine della membrana e altre molecole, e diversi contenuti luminali ereditati da una cellula madre, che include RNA, proteine e DNA. La caratterizzazione delle dimensioni idrodinamiche dei VE, che dipende dalle dimensioni della vescica e dal suo strato coronale formato da decorazioni superficiali, è diventata di routine. Per gli esosomi, il più piccolo dei VE, la differenza relativa tra le dimensioni idrodinamiche e vescicle è significativa. La caratterizzazione delle dimensioni delle vesciche mediante l'imaging criogenico elettronico (crio-TEM), una tecnica gold standard, rimane una sfida a causa del costo dello strumento, delle competenze necessarie per eseguire la preparazione del campione, l'imaging e analisi dei dati, e un piccolo numero di particelle spesso osservate nelle immagini. Un'alternativa ampiamente disponibile e accessibile è la microscopia a forza atomica (AFM), in grado di produrre dati versatili sulla geometria tridimensionale, le dimensioni e altre proprietà biofisiche delle vesciche extracellulari. Il protocollo sviluppato guida gli utenti nell'utilizzare questo strumento analitico e delinea il flusso di lavoro per l'analisi dei veicoli elettrici da parte dell'AFM, che include la preparazione del campione per l'imaging dei vee EV in forma idratata o desiccata, l'immobilizzazione elettrostatica su un substrato, l'acquisizione dei dati, la sua analisi e interpretazione. I risultati rappresentativi dimostrano che la fissazione dei verisulla superficie mica modificata è prevedibile, personalizzabile e consente all'utente di ottenere risultati di dimensionamento per un gran numero di vesciche. Il dimensionamento della vescica basato sui dati AFM è risultato coerente con l'imaging crio-TEM.
Introduction
Le vesciche extracellulari (EV) sono presenti in tutti i fluidi corporei, tra cui sangue, urina, saliva, latte e liquido amniotico. Gli esosomiti formano una classe distrettuale di veicoli elettrici differenziati dagli altri VE dalla biogenesi endosomica, dai marcatori del percorso endosomico e dalla dimensione più piccola tra tutti i veicoli elettrici. La dimensione degli esosomi è spesso riportata con una sostanziale variabilità tra gli studi. I risultati del dimensionamento sono risultati dipendenti dal metodo, riflettendo la differenza nei principi fisici impiegati da diverse tecniche analitiche per stimare le dimensioni EV1,2. Ad esempio, l'analisi del tracciamento delle nanoparticelle (NTA), la tecnica di caratterizzazione delle dimensioni più utilizzata, stima la dimensione degli EV come diametri idrodinamici, che caratterizzano la resistenza alla mobilità browniana dei veicoli elettrici nella soluzione. Un diametro idrodinamico maggiore di una vescica implica la sua minore mobilità in liquido. Lo strato coronale intorno alle vesciche, costituito da proteine superficiali e altre molecole ancorate o adsorbite alla superficie della membrana, ostacola sostanzialmente la mobilità e aumenta le dimensioni idrodinamiche degli EV. In termini relativi, questo aumento è particolarmente elevato per gli esosomi3, come illustrato nella Figura 1.
La microscopia criogenica degli elettroni a trasmissione (crio-TEM) è una tecnica definitiva nella caratterizzazione delle dimensioni delle vescicole e della morfologia nei loro stati idratati. Tuttavia, l'elevato costo della strumentazione e le competenze specialistiche necessarie per utilizzarla motivano correttamente l'esplorazione di tecniche alternative in grado di identificare i veicoli elettrici idratati. Un numero relativamente ridotto di veicoli elettrici osservati o caratterizzati nelle immagini crio-TEM acquisite è un altro notevole svantaggio di questa tecnica.
La microscopia a forza atomica (AFM) visualizza la topografia tridimensionale degli EV idratati o desiccati4,5,6 mediante la scansione di una sonda sul substrato per raster l'immagine delle particelle sulla superficie. Le fasi essenziali del protocollo per caratterizzare i veicoli elettrici da aFM sono descritte in questo studio. Prima di imaging delle vesciche in liquido, devono essere immobilizzate su un substrato legandosi a una superficie funzionalizzata, intrappolando in un filtro o per attrazione elettrostatica7. La fissazione elettrostatica su un substrato caricato positivamente è un'opzione particolarmente conveniente per l'immobilizzazione degli esosomi noti per avere un potenziale zeta negativo. Tuttavia, anche le stesse forze elettrostatiche che immobilizzano le vesciche extracellulari sulla superficie distorcono la loro forma, il che rende essenziale l'analisi dei dati post-imaging. Elaboriamo questo punto descrivendo l'algoritmo che stima la dimensione delle vescicoli globulari nella soluzione sulla base dei dati AFM sulla forma distorta degli esosomi immobilizzati sulla superficie.
Nel protocollo sviluppato, viene presentata la procedura per la robusta immobilizzazione elettrostatica delle vescicole e seguita dai passaggi necessari per eseguire l'imaging della forza atomica negli stati idratati o desiclati. Vengono identificati i fattori che influenzano la concentrazione superficiale delle vesciche immobilizzate. La guida è fornita su come eseguire l'immobilizzazione elettrostatica per campioni con diverse concentrazioni di EV nella soluzione. Viene discussa la selezione di condizioni sperimentali che consentano la stima delle distribuzioni di probabilità empiriche di diverse proprietà biofisiche sulla base di un numero sufficientemente elevato di vesciche immobilizzate. Vengono forniti esempi di analisi post-imaging dei dati AFM. In particolare, viene descritto un algoritmo per determinare la dimensione delle vesciche nella soluzione in base alla caratterizzazione AFM degli EV immobilizzati. I risultati rappresentativi mostrano la consistenza del dimensionamento della vescica da parte dell'AFM con i risultati dell'imaging crio-TEM.
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Protocol
1. Isolamento dei veicoli elettrici da un biofluido
- Isolare gli EV con uno dei metodi stabiliti, come l'ultracentrifugazione differenziale8, precipitazioni o cromatografia di esclusione di dimensioni9.
- Confermare la presenza di biomarcatori superficiali e luminali previsti e l'assenza di biomarcatori che indicano la contaminazione incrociata della preparazione. Confermare la morfologia del bistrato lipidico delle particelle isolate mediante microscopia elettronica.
NOTA: quando si isolano gli esosomi, la distribuzione delle dimensioni idrodinamiche misurata dall'analisi del tracciamento delle nanoparticelle (NTA) o dalla dispersione dinamica della luce deve essere compresa nell'intervallo previsto. I dettagli di EV e l'isolamento esosomiso esulano dall'ambito di questo protocollo. Il metodo selezionato dipenderà da questioni sperimentali e dall'obiettivo dello studio10. I passaggi seguenti forniscono un'illustrazione concreta della procedura per arricchire gli esosomi mediante precipitazioni dal mezzo di crescita delle cellule di cancro al seno MCF-7 utilizzando un kit di precipitazione disponibile in commercio (Tabella dei materiali). - Prima dell'espansione della coltura cellulare, conservare le cellule MCF-7 del cancro al seno in azoto liquido. Scongelare le cellule alla sottocoltura.
- Seguendo pratiche asettiche, eseguire placcatura cellulare su piastre da 150 mm. Utilizzare il mezzo dicrescita composto dal mezzo essenziale minimo dell'Aquila, dall'insulina ricombinante umana da 0,01 mg/mL e dal 10% di siero bovino fetale privo di esosomi.
- Aerare la coltura del 95% aria e del 5% di CO2 e incubare a 37 .
- Dopo aver sistemato le cellule (circa 24 h dopo la placcatura), modificare il supporto. Dividere la piastra a 1:10 rapporto e cultura dieci piastre, ciascuno contenente 20 mL di supporti.
- Raccogliere e mettere in comune i supporti da 9 di queste piastre (180 mL) a una confluenza di 70x80% quando le cellule sono ancora in fase di crescita.
- Dividere il supporto in 60 mL e 120 mL, ulteriormente suddivisi in 30 mL/tubo, e centrifugare a 3.000 x g per 15 min.
- Trasferire il supernatante da ogni tubo in un nuovo tubo sterile da 50 mL ed eseguire l'isolamento esosoma.
- Isolare gli esosomi per precipitazioni in base ai protocolli pubblicati (vedere, ad esempio, il riferimento11)o seguire le istruzionidelproduttore se viene utilizzato un kit di isolamento commerciale (Tabella dei materiali). Come primo passo in quest'ultimo caso, centrifugare il mezzo cellulare a 3.000 x g per 15 min. Ritirare supernatali e scartare le cellule e detriti cellulari.
- Aggiungere la soluzione di precipitazione (rapporto di volume 1:5) al supernatante, mescolare e conservare in frigorifero durante la notte.
- Centrifuga a 1.500 x g per 30 min a temperatura ambiente. Scartare il super-natante dopo la centrifugazione.
- Girare il restante pellet esosoma per altri 5 min a 1.500 x g. Senza disturbare il pellet, rimuovere la soluzione di precipitazione rimanente per aspirazione.
- Risospendere il pellet in 100x500 ll di 1x buffer salina con buffer fosfato (PBS) e dividerlo in più aliquote in base alle esigenze per l'analisi a valle.
- Procedere immediatamente all'immobilizzazione superficiale degli esosomi isolati per l'imaging AFM. Se necessario, congelare gli aliquote a -80 gradi centigradiper un uso successivo mentre si prendono precauzioni per evitare danni al campione durante il ciclo di congelamento-disgelo.
2. Fissazione superficiale delle vesciche extracellulari
- Utilizzare un forte nastro doppio lato, resina epossidica o un adesivo alternativo per collegare saldamente un disco mica a un disco di propulsore in acciaio inossidabile (STM) AFM/scanning.
- Cleave mica disco utilizzando un rasoio affilato o un coltello di utilità, o attaccando un nastro adesivo alla superficie superiore e poi scandagliandolo per rimuovere uno strato di materiale.
NOTA: Entrambi i metodi dovrebbero rivelare una superficie vergine rimuovendo un sottile strato di mica precedentemente esposto all'ambiente. Dopo la procedura, l'attaccamento della mica al disco campione metallico AFM/STM deve rimanere fermo. - A temperatura ambiente, trattare la superficie superiore della mica per 10 s con 100 luna di 10 mM Soluzione NiCl2, che modifica la carica superficiale da negativa a positiva.
- Soluzione Blot NiCl2 con salvietta o carta assorbenti. Lavare la superficie mica 3x con acqua deionizzata (DI) e asciugarla con un flusso di azoto secco.
NOTA: È buona norma eseguire la scansione della superficie modificata con AFM per verificare che sia priva di contaminanti. - Posizionare il disco campione AFM con la mica modificata in superficie collegata in una piastra di Petri.
- Diluire il campione di esosoma dal punto 1.14 con 1x PBS per ottenere una concentrazione compresa tra 4,0 x 109 e 4,0 x 1010 particelle per mL di soluzione. Convalidare la concentrazione di particelle diluite utilizzando NTA.
- Formare una goccia sessile sulla superficie della mica svuotando 100 l della soluzione esosomica diluita da una pipetta.
- Posizionare il coperchio sulla piastra di Petri e sigillarlo con una pellicola di paraffina per ridurre l'evaporazione del campione. Incubare il campione per 12,18 h a 4 gradi centigradi.
NOTA: La densità superficiale degli esosomi immobilizzati aumenterà con il tempo di incubazione e la concentrazione di EV nel liquido. Un tempo di incubazione più lungo può essere necessario se gli esosomi sono presenti nel campione a concentrazioni inferiori. - Dopo l'incubazione, aspirare l'80-90% del campione senza disturbare la superficie. A questo punto, gli esosomi saranno immobilizzati elettrostaticamente sul substrato mica.
- Prima di imaging Tv idratate, sciacquare la superficie con 1x PBS. Ripetere 3x. Fare attenzione a mantenere il campione idratato per tutto il processo di risciacquo.
- Dopo aver lavato la superficie mica con 1x PBS, rimuovere l'80%del90% di liquido e la pipetta 40 - L di 1x PBS fresco per coprire il campione.
- Quando si immagina gli EV desiccati, risciacquare il substrato con acqua DI. Ripetere 3x.
NOTA: Il risciacquo con acqua DI impedirà la formazione di cristalli di sale e la deposizione di soluti sulla superficie man mano che il substrato si asciuga. - Prima di imaging desiccato EV, aspirare il più liquido possibile senza toccare la superficie e asciugare il resto con un flusso di azoto secco.
3. Imaging AFM
- Per creare un'immagine dei veli desiccati, selezionare un cantilever progettato per la scansione nell'aria nelle modalità di imaging di maschiatura e non contatto e montarlo sul supporto della sonda.
NOTA: le caratteristiche di un esempio di cantilever elencato in Tabella dei materiali (lunghezza 123 m, larghezza di 40 m, raggio della punta di 7 nm e costante a molla di 3/m) possono essere utilizzate come guida quando si seleziona una sonda compatibile con la strumentazione AFM disponibile.- Posizionare la preparazione dal punto 2.13 sullo stadio AFM. Il disco magnetico campione in acciaio inossidabile immobilizzerà il campione sullo stage. Lasciare il tempo per la preparazione e la fase per equilibrato termicamente.
- Utilizzare la modalità di maschiatura per eseguire la scansione di un'area sufficientemente ampia della superficiedellamica. Ad esempio, scegliete un'area di 5 x 5 m, rastered in 512 linee ad una velocità di scansione di 1 Hz. Acquisire sia l'altezza che le immagini di fase in quanto forniscono informazioni complementari sulla topografia e le proprietà della superficie del campione.
NOTA: il tempo di scansione aumenterà con l'area dell'immagine e il numero di linee selezionate per formare l'immagine, ma diminuirà con la velocità di scansione definita come il numero di linee scansionate al secondo. Velocità di scansione rapida possono influire sulla qualità dell'immagine. Pertanto, la velocità di rastering dovrebbe bilanciare giudizialmente il compromesso tra il tempo di acquisizione e la qualità dell'immagine.
- Per creare immagini di vesciboli idratati, selezionare un sbalzo appropriato per la scansione di campioni morbidi e idratati e montare il cantilever su un supporto della sonda progettato per la scansione in liquidi.
NOTA: Quando si seleziona una sonda compatibile con la strumentazione AFM disponibile, le specifiche della sonda elencata in Tabella dei materiali (sbalzo triangolare con lunghezza nominale di 175 m, larghezza 22 m, raggio della punta di 20 nm, costante a molla di 0,07 N/m, e ottimizzata per l'imaging con la frequenza di trasmissione compresa tra 4 e 8 kHz) può essere utilizzata come guida.- Bagna la punta del cantilever con 1x PBS per ridurre la probabilità di introdurre bolle d'aria nel liquido durante la scansione.
- Posizionare la preparazione dal punto 2.11 sullo stage AFM. Il disco magnetico di campioni in acciaio inossidabile immobilizzerà la mica collegata contenente eV immobilizzati sulla sua superficie.
- Lasciare il tempo per la preparazione e lo stadio AFM equilibrate termicamente.
- Immagine della superficie mica idratata nella modalità di maschiatura. Acquisire sia l'altezza che le immagini di fase.
NOTA: la qualità dell'immagine è influenzata dalla strumentazione, dalla sonda selezionata e dai parametri di scansione. Quando si ottimizzano le condizioni di scansione, è possibile utilizzare le seguenti opzioni come punto di partenza: 5 x 5 m di area scansionata in 512 linee con velocità di scansione da 0,8 a 1,0 Hz e frequenza di trasmissione compresa tra 4 e 8 kHz.
4. Analisi dell'immagine
NOTA: le seguenti fasi di elaborazione e analisi dei dati vengono applicate alle immagini di altezza acquisite. Una procedura simile può essere adattata per analizzare i dati di fase. La descrizione qui sotto è specifica per Gwyddion12, un software libero e open source disponibile sotto GNU General Public License. Funzionalità simili sono disponibili in strumenti software alternativi.
- Passare a Processo dati, Modalità SPM, Suggerimento e scegliere Suggerimento modello ( Figura2). Selezionare la geometria e le quote della punta utilizzata per eseguire la scansione del campione e fare clic su OK.
- Correggere i manufatti di erosione della punta eseguendo la ricostruzione della superficie. Aprire l'immagine. Dal menu, selezionare Processo dati, Modalità SPM, Suggerimento, quindi scegliere Ricostruzione superficie e fare clic su OK (Figura 3).
- Allineare il piano di imaging in modo che corrisponda al piano XY di laboratorio rimuovendo l'inclinazione nel substrato dai dati di scansione. Per eseguire questa attività, selezionare Processo dati, Livella e scegliere Piano a livello ( Figura4).
- Allineare le righe dell'immagine selezionando Elabora dati, Correggi dati e quindi scegliere Allinea righe. Sono disponibili diverse opzioni di allineamento (Figura 5). Ad esempio, Mediana è un algoritmo che trova un'altezza media di ogni linea di scansione e la sottrae dai dati.
- Passare a Processo dati, Correggi dati e scegliere Rimuovi cicatrici (Figura 6), che rimuove gli errori di scansione comuni noti come cicatrici.
- Allineare la superficie di mica all'altezza zero, s 0, selezionando Appiattisci base nel menu a discesa Livello accessibile da Processo dati ( Figura7).
- Identificare i veicoli elettrici sulla superficie scansionata utilizzando il menu a discesa Contrassegna per soglia in grani (Figura 8A). Questo algoritmo identifica gli esosomi immobilizzati sulla superficie come particelle sporgenti dal substrato di superficie zero per l'altezza al di sopra della soglia selezionata dall'utente. Selezionare una soglia compresa tra 1 e 3 nm, in modo da eliminare la maggior parte delle interferenze di sfondo. Soglie più piccole vengono utilizzate con uno sfondo più pulito.
NOTA: la soglia nella figura 8A è 1.767 nm. Il risultato dell'identificazione dell'esosoma MCF-7 con questa soglia è illustrato nella figura 8B. Gwyddion offre diverse alternative alla soglia come l'algoritmo per identificare automaticamente le vesciche nell'immagine, tra cui la soglia automatica (metodo di Otsu), il rilevamento dei bordi e l'algoritmo dello spartiacque.
NOTA: gli agglomerati di particelle, se presenti nell'immagine AFM, possono essere mascherati ed esclusi dall'analisi. - Eseguire la caratterizzazione geometrica e dimensionale dei veicoli elettrici identificati utilizzando gli algoritmi di distribuzione disponibili accessibili dal menu Grani.
NOTA: Gwyddion fornisce strumenti per valutare la distribuzione di proprietà scalari, arieti, volumetriche e di altre proprietà di veli immobilizzati in uno stato idratato o dessicato. Un esempio di una proprietà dei valori scalari è illustrato nella Figura 9, che fornisce la distribuzione delle altezze massime all'interno dell'impronta di ogni esoma identificato. - Esportare i dati AFM da Gwyddion per l'analisi specializzata da altri strumenti di calcolo e programmi per computer personalizzati.
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Representative Results
La fissazione superficiale dei veicoli elettrici è un passaggio fondamentale nella sequenza di imaging. L'immobilizzazione elettrostatica della superficie degli esosomi, nota per avere un potenziale zeta negativo, si verificherà in modo robusto dopo che il substrato della mica viene modificato per avere una carica superficiale positiva. Senza il trattamento con NiCl2 per impartire cambiamenti positivi di superficie, l'immobilizzazione dei veli sul substrato è risultata inefficace. L'immagine dell'altezza in Figura 10A, acquisita in aria dopo che il campione di esoma MCF-7 contenente 2,59 x 1010 vescicle per mL di PBS è stato incubato per 12 h su superficie non modificata di mica appena fessurata, mostra pochissime vesciche rimaste sul dopo che è stato pulito con acqua DI. Le vesciche visibili nella Figura 10A sono, molto probabilmente, il risultato di un'aspirazione incompleta di acqua DI, che ha risospeso le vesciche non fissate alla superficie e poi deposte sul substrato mentre evaporava.
Dopo aver modificato la carica superficiale con cloruro di nichel, si consiglia di confermare che la superficie rimane priva di contaminanti dopo il trattamento. L'immagine di altezza in Figura 10B (ottenuto in aria) dà un esempio di una superficie pulita dopo che è stato trattato con NiCl2 e poi lavato tre volte con acqua DI. La rugosità della superficie derivata da cation era inferiore a 0,3 nm, il che è coerente con il report precedente13.
L'impatto positivo drammatico della modifica della carica superficiale sull'efficienza della fissazione degli esosomi MCF-7 è illustrato dalla Figura 10C,D. Questi due pannelli mostrano le scansioni dell'altezza acquisite nell'aria dopo che il campione, precedentemente immaginato nella Figura 10A,è stato incubato rispettivamente per 24 h e 12 h sulla superficie trattata con cloruro di nichel.
Il tempo in cui un dato campione viene incubato sulla superficie trattata determina la concentrazione superficiale (vescibole per area) dei VE immobilizzati. L'immagine dell'altezza nella figura 10C illustra il caso di copertura superficiale eccessivamente densa dalle vesciche di immobilizzazione ottenute dopo che il campione di esosoma MCF-7 descritto è stato incubato per 24 h. Un certo numero di algoritmi si basano sulla disponibilità di un substrato non occupato sufficiente tra i grani per eseguire la correzione dell'immagine e l'analisi dei dati. Ad esempio, il livellamento e lo spostamento del substrato al piano zero, la correzione della linea e la stima del volume dei grani devono essere eseguiti dalla superficie piana che interviene per eseguire calcoli accurati. Quando la concentrazione delle vesciche immobilizzate è alta come nella figura 10C, questi algoritmi non funzioneranno in modo affidabile. Un esempio di un'adeguata concentrazione superficiale di vesciche immobilizzate dallo stesso campione MCF-7 è mostrato nell'immagine di altezza nella figura 10D, ottenuta dopo un'incubazione più breve (12 h).
La post-elaborazione dei dati AFM grezzi acquisiti è necessaria per correggere gli errori di scansione comuni. La seguente descrizione è specifica di Gwyddion. Funzionalità simili sono disponibili in altri strumenti di analisi dei dati AFM/SPM.
All'interno di Gwyddion, la funzione Livello piano viene utilizzata per correggere un'inclinazione nel substrato. Tale correzione dello sfondo viene eseguita prima trovando il piano del substrato utilizzando tutti i punti dati nell'immagine e quindi sottraendoli dai dati grezzi. La correzione lungo le linee di scansione viene eseguita dalla funzione Allinea righe. Ad esempio, uno degli algoritmi implementati esegue l'allineamento calcolando l'altezza mediana di ogni linea di scansione e quindi sottraendo il risultato dalla riga corrispondente di dati immagine. Il contributo dei guasti locali nel circuito di feedback può essere rimosso applicando la funzione Rimuovi cicatrici, che riempie le lacune nei dati allineati ed elimina le cicatrici confrontando i dati nelle linee di scansione adiacenti. Lo spostamento del substrato verso l'elevazione s 0 può essere eseguito combinando una sfaccettatura e il livellamento polinomiale della superficie dopo la mascheratura dei grani e di altre funzioni. Lo strumento Flatten Base di Gwyddion esegue questa attività in modo autonomo o con una maschera specificata dall'utente. Dopo le correzioni di sfondo e di linea descritte, le vesciche fissati elettrostaticamente possono essere identificate sul substrato eseguendo la funzione Mark Grains.
La figura 11A e la figura 11B mostrano l'altezza e le immagini di fase di esomischeletri MCF-7 idratati immobilizzati su una superficie mica e acquisiti in PBS utilizzando la modalità di maschiatura. Un totale di 561 vesciche idratate sono state identificate nell'area scansionata utilizzando l'algoritmo Soglia della funzione Mark Grains con il valore di soglia impostato su 20%. Il ritardo di fase della risposta della sonda alla frequenza di trasmissione è sensibile alle variazioni di rigidità localizzate nei campioni morbidi. La coerenza tra le immagini di altezza e di fase, vista nella Figura 11A,B, è quindi una conferma importante che i grani immagine sono, infatti, vesciche morbide immobilizzate sul substrato.
Figura 11C Mostra la sezione trasversale dell'immagine altezza attraverso esosomi situati sulla linea bianca in Figura 11A. Mentre gli esosomi in un biofluido hanno una geometria globulare1,14,15,16, la loro forma sul substrato è gravemente distorta dall'attrazione elettrostatica alla carica positiva superficie. La geometria oblate pancake-come di vescicoli elettrostaticamente immobilizzati è ulteriormente illustrata in Figura 11D dall'immagine di altezza ravvicinata (e la sua sezione trasversale) di un esosoma inscatolato in Figura 11A. L'immagine di fase corrispondente è illustrata nella figura 11E. La funzione di densità di probabilità empirica (pdf) delle altezze di picco sopra la superficie per tutte le 561 vesciche idratate identificate nella scansione AFM è illustrata nella Figura 12A. Il valore medio per questa distribuzione è di 7,9 nm, che è approssimativamente pari al doppio dello spessore di un bistrato fosforicolo17 in assenza di forze di deformazione.
L'area sul substrato occupata da un esososcheletro immobilizzato è stata approssimata come un cerchio con il diametro pari alla distanza media dal "centro di massa" della vescica al suo confine sulla superficie della mica. La distribuzione di questi diametri di proiezione è illustrata nella figura 12A e ha la media pari a 69,6 nm. L'altezza ottenuta e le distribuzioni del diametro quantificano ulteriormente l'impatto significativo dell'immobilizzazione della superficie elettrostatica sulla forma distorta degli esosomi immobilizzati.
La robustezza e la ripetibilità delle procedure di protocollo sono state confermate rianalizzando lo stesso campione MCF-7 tre volte, dalla preparazione del campione all'imaging, con ogni ripetizione che produce risultati statisticamente simili a quelli illustrati nella Figura 12.
La deformazione delle vesciche immobilizzate causate da forze elettrostatiche può essere compensata o interpretata per fornire una visione delle proprietà dei VE. Ad esempio, i dati AFM possono essere utilizzati per stimare la dimensione globulare delle vesciche nella soluzione. Come punto di partenza, possiamo calcolare il volume incapsulato dagli inviluppi di membrana delle vescibole immobilizzate. Il volume si trova integrando la differenza tra il livello superficiale delle vesciche identificate e l'elevazione del substrato sottostante. Il livello del substrato sotto le vesciche non è direttamente accessibile, ma può essere stimato dal Laplace o dall'interpolazione alternativa di punti dati per il substrato non occupato che circonda le vesciche. All'interno di Gwyddion, tale calcolo del volume viene eseguito utilizzando la funzione Distribuzione di varie caratteristiche del grano. Il risultato esportato da Gwyddion può quindi essere mappato nei diametri delle sfere equivalenti al volume.
L'applicazione dell'algoritmo descritto ai dati AFM per 561 vesciche MCF-7 idratate ha prodotto la distribuzione dei diametri delle sfere equivalenti al volume mostrato Figura 12B. Questa distribuzione stima la dimensione delle vesciche di membrana nella loro forma globulare innata in un biofluido prima della loro fissazione elettrostatica sulla superficie della mica. Il dimensionamento delle vesciche ottenuto dall'analisi dei dati AFM è stato confrontato con i risultati dell'imaging crio-TEM dello stesso campione ed è risultato essere in stretto accordo3 (Figura 12B). Il confronto dei diametri idrodinamici misurati dalla NTA con le dimensioni delle vesciche ottenute (Figura 1) indica che la mobilità degli esosomi è molto più piccola di quanto ci si aspetterebbe dalle dimensioni delle loro vesciche determinate dall'AFM e dal crio-TEM Misure. La differenza tra le dimensioni idrodinamiche e vescicane caratterizza lo spessore dello strato coronale che circonda le vesciche esosomiche.
Figura 1: Confronto dei diametri idrodinamici e geometrici dei veicoli elettrici. La dimensione geometrica della vescica esosomica è sostanzialmente più piccola della sua dimensione idrodinamica determinata dalla sua diffusione in un liquido. La differenza è lo strato coronale formato da molecole coniugate e adsorbite a membrana che impediscano la mobilità degli EVi. Questa cifra viene modificata dal riferimento3 e ristampata con autorizzazione.
Figura 2: Proprietà della sonda AFM. La geometria e le dimensioni della sonda AFM possono essere specificate utilizzando la funzione Punta modello. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Correzione dell'artefatto di imaging causato dalla convoluzione del campione di punta. Eseguendo la ricostruzionedella superficie , i dati AFM acquisiti possono essere corretti per gli artefatti della punta. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Correzione per un'inclinazione nel substrato. Livello piano determina il piano del substrato e lo sottrae dai dati AFM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Correzione dei disallineamenti nelle righe di scansione. Un algoritmo convenzionale per allineare i dati di scansione consiste nel trovare un'altezza media lungo ogni linea di scansione e sottrae il risultato dalla riga corrispondente di punti dati nell'immagine. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Correzione degli spazi vuoti nei dati allineati. Errori di scansione comuni, noti come cicatrici, possono essere rimossi dai dati AFM applicando la funzione Rimuovi cicatrici. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Allineamento di un substrato a quota altimetrica zero. L'opzione Appiattisci base nel menu Livello consente all'utente di posizionare la superficie del substrato al livello di base corrispondente all'altezza zero. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Identificazione delle vesciche immobilizzate sulla superficie scansionata. (A) Gli esosomi immobilizzati in superficie sono identificati come grani sporgenti al di sopra del substrato da una soglia di altezza selezionata dall'utente specificata in Contrassegno per soglia. (B) L'esito dell'identificazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 9: Analisi dei dati AFM. La distribuzione delle altezze massime al di sopra del substrato all'interno dell'area occupata dagli esosomi identificati viene mostrata come compilato dallo strumento Grain Distributions. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 10: Impatto della modifica della superficie e concentrazione di eV della densità superficiale delle vescibole immobilizzate. (A) L'immagine dell'altezza AFM del substrato di mica appena fessura dopo 12 h incubazione con il campione di esosoma MCF-7 seguito dalla pulizia con acqua DI e asciugatura. L'immobilizzazione dei veli dal liquido al substrato è inefficiente senza conferire una carica positiva alla superficie della mica. Poche particelle osservate nella scansione sono probabilmente il risultato della rimozione incompleta del campione MCF-7 prima dell'essiccazione del substrato. (B) La scansione dell'altezza della superficie di mica nell'aria dopo il trattamento con cloruro di nichel mostra il substrato privo di contaminazioni. I pannelli (C) e (D) mostrano le scansioni di altezza AFM ottenute dopo la modifica della carica superficiale e l'incubazione con lo stesso campione MCF-7 del pannello (A) rispettivamente per 24 h e 12 h. La concentrazione superficiale delle vesciche immobilizzate è eccessivamente densa dopo 24 h incubazione. L'incubazione di 12 h porta a un minor numero di esosomi immobilizzati sulla superficie e ai dati di scansione più facili da analizzare con precisione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 11: Immagini AFM di esosomi MCF-7 idratati sono statici immobilizzati sulla superficie mica modificata. (A) L'immagine dell'altezza. (B) L'immagine della fase AFM corrispondente conferma che i grani nell'immagine dell'altezza sono nanoparticelle morbide, come ci si dovrebbe aspettare per le vesciche di membrana. (C) I dati di altezza per le tre vesciche attraversate dalla linea indicata nel pannello (A) illustrano una forma appiattita causata dall'attrazione elettrostatica degli esosomi alla superficie caricata positivamente della mica modificata. (D) La distorsione della forma è evidente in una vista ingrandita la vescica immobilizzata in scatola nel pannello (A) e la sua sezione trasversale. L'immagine di fase della stessa vescica è mostrata in (E). Questa cifra viene modificata dal riferimento3 e ristampata con autorizzazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 12: Caratterizzazione dimensionale delle vesciche idratate immobilizzate sulla superficie e stima delle loro dimensioni globulari nella soluzione. (A) La distribuzione delle altezze di picco sopra la superficie (curva rossa) ha la media pari a 7,9 nm. L'area occupata da esosomi immobilizzati ha un diametro medio di 69,6 nm (curva blu). (B) L'immagine dell'altezza AFM per uno degli esosomi immobilizzati illustra la sua forma altamente oblata causata da forze elettrostatiche. La dimensione globulare delle vescicole esosomiche nella soluzione può essere stimata mediante volumi corrispondenti racchiusi da inviluppi di membrana immobilizzati su superficie e sferici. (C) La distribuzione delle dimensioni delle vesciche globulari nella soluzione (curva rossa) è stata determinata dai dati AFM di 561 vesciche immobilizzate. Le dimensioni delle vesciche nelle immagini crio-TEM (curva blu) sono coerenti con i risultati AFM. Questa cifra viene modificata dal riferimento3 e ristampata con autorizzazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 13: Penetrare e dimensionare i manufatti di segregazione durante la deposizione passiva dei VEICOLi da evaporare liquido. (A) L'immagine della microscopia elettronica a scansione (SEM) mostra che la concentrazione superficiale di esosomi depositati passivamente da un liquido di essiccazione è variabile spazialmente quando non viene eseguita l'immobilizzazione superficiale da un biofluido sospendibile. (B) La deposizione passiva dei veicoli elettrici da un campione di essiccazione causa la segregazione delle dimensioni delle vesciche. La variabilità di dimensioni sostanziali è quantificata dalle funzioni di densità di probabilità (pdf) per le vescicole in diverse regioni dell'immagine (A) definite da linee diagonali bianche. Questa figura viene modificata dal riferimento1 e ristampata con autorizzazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 14: Geometria a forma di coppa delle vesciche dissiccate depositate passivamente sulla superficie durante l'evaporazione liquida. La disidratazione superficiale delle vesciche che non sono state immobilizzate dalle forze elettrostatiche è nota per provocare un aspetto a forma di tazza spesso osservato nelle immagini SEM dei VEICOLi elettrici. Questa figura viene modificata dal riferimento1 e ristampata con autorizzazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
L'immobilizzazione dei veicoli elettrici da un fluido biologico, la scansione superficiale e l'analisi delle immagini sono i passi essenziali del protocollo sviluppato per la caratterizzazione AFM dei veicoli elettrici in liquido. Il numero di vesciche suscettibili di imaging AFM scala con la superficie di immagine e la concentrazione superficiale delle vesciche immobilizzate sul substrato. Dato un potenziale zeta negativo di espeeedanti18, sosteniamo la fissazione elettrostatica dei veicoli elettrici da campioni liquidi al substrato AFM. L'immobilizzazione è efficace quando la superficie è caricata positivamente. Prima dell'immobilizzazione di EV, potrebbe essere necessario impartire la carica superficiale positiva al substrato, come nel caso della mica - un minerale di silicato stratificato con formula generale KAl2(AlSi3O10)(OH)2. La superficie di mica appena fessurata è vicina perfettamente piatta, ideale per l'imaging di nanoparticelle da parte dell'AFM, ma la sua carica superficiale è negativa e, quindi, deve essere modificata. Il protocollo descrive la procedura per impartire un cambiamento di superficie positivo al substrato AFM. I risultati rappresentativi mostrano un netto miglioramento della fissazione EV da un biofluido al substrato mica modificato.
Quando si immaginano vesciboli idratate, è importante ridurre al minimo l'evaporazione del campione che causa gli artefatti di deposizione superficiale e i flussi convettivi e aumenta la concentrazione liquida delle vescicle con il tempo, portando ad una maggiore concentrazione superficiale immobilizzati del previsto, soprattutto durante le incubazioni prolungate. I supporti della sonda progettati esplicitamente per i campioni liquidi eliminano o rallentano l'evaporazione e devono essere utilizzati per l'immagine di eV idratati. Gli attacchi non specifici alla sonda di scansione sono ridotti in presenza di specie ioniche. Pertanto, quando si immagina i veicoli elettrici idratati, è preferibile coprire il substrato con un supporto tamponato, ad esempio PBS, anziché acqua DI.
Importanza dell'immobilizzazione della superficie
L'immobilizzazione coerente e prevedibile dei veli sul substrato modificato rimuove la fonte primaria di variabilità nei risultati AFM. Tutte le fasi a valle, dalla scansione all'analisi dei dati, sono più facilmente controllate dalla selezione di strumentazione, sonde, parametri di scansione, sequenza di analisi dei dati e algoritmi. L'utente deve essere consapevole della variabilità a monte nei campioni biologici e nei protocolli di isolamento EV, che sono questioni importanti che esulano dall'ambito di questo lavoro.
Si consiglia di eseguire l'immobilizzazione superficiale dell'EV sulla superficie della mica modificata da campioni liquidi anche quando l'obiettivo è quello di caratterizzare le vesciche disidratate nell'aria - la necessità è meno evidente poiché le vesciche si depositano inevitabilmente su qualsiasi substrato liquido evapora. Infatti, i risultati AFM per EV desiccato ottenuti senza modificare le cariche superficiali di mica, che è un passo prerequisito per l'immobilizzazione elettrostatica degli EV da un liquido, sono stati segnalati negli ultimi19,20,21 . Quando gli EV non sono fissati alla superficie del campione liquido, tuttavia, la loro deposizione passiva per evaporazione produrrà artefatti collettivamente noti come effetto anello di caffè22. Due di questi manufatti, che si verificano come un liquido essiccante si allontanano, sono illustrati nell'immagine SEM (Figura 13A) di esosomi di siero depositati per evaporazione su una superficie di vetro caricata negativamente. Variazioni significative nella concentrazione superficiale delle vesciche precipitate sono immediatamente evidenti. Il secondo artefatto, quantificato nella Figura 13B,è la notevole variabilità nelle dimensioni delle vesciche in diverse aree all'interno del perimetro del campione essiccato. Dati questi manufatti, la caratterizzazione AFM delle vesciche depositate passivamente da un liquido di essiccazione può produrre risultati parziali o incoerenti a meno che l'intera superficie occupata inizialmente da un campione liquido ora essiccato non venga scansionata.
Due ulteriori problemi devono essere presi in considerazione quando si immaginano i campioni differenziati ottenuti senza immobilizzazione ferma delle vesciche sul substrato. Ricordiamo che il nostro protocollo indica agli utenti di lavare a fondo la superficie con acqua DI dopo che le vesciche sono state immobilizzate da un campione liquido. Questo passo intende impedire che ionico e altri soluti non vescicolari formino depositi superficiali durante l'evaporazione di biofluidi complessi con notevole osmolarità. Se gli EV non sono fissi, il lavaggio accurato si staccherà un gran numero di vesciche dalla superficie, potenzialmente disincentivando i risultati e lasciando troppe poche particelle per l'analisi. Un'altra difficoltà comune, ridotta dall'immobilizzazione dei veli sulla superficie mica modificata prima dell'imaging AFM, è l'adesione delle particelle alla sonda23 e gli artefatti fuorvianti causati da questo fenomeno.
Controllo della densità superficiale degli EV immobilizzati
I due fattori facilmente controllabili identificati nel protocollo consentono all'utente di personalizzare la concentrazione superficiale dei VE immobilizzati sul substrato mica modificato: la concentrazione delle vesciche nel campione liquido e il tempo di incubazione del campione il substrato. Un'alta densità di vesciche immobilizzate, ottenuta con tempi di incubazione più lunghi e una maggiore concentrazione di VE nel liquido, aumenta il numero di vesciboli analizzati durante la scansione e la potenza statistica delle conclusioni ottenute dall'analisi dell'AFM dati. Allo stesso tempo, una concentrazione superficiale eccessivamente densa, come nel caso mostrato nella Figura 10C dove le particelle coprono strettamente l'intera superficie senza aree intermedie del substrato, complica l'analisi dell'immagine e l'interpretazione dei risultati e può portare a la scansione di artefatti causati dall'interazione tra particelle ravvicinate.
Influenza dello screening elettrostatico e della mobilità idrodinamica dei veicoli elettrici
Il controllo trasparente sulla concentrazione superficiale dei VE immobilizzati in funzione di fattori che lo influenzano consente all'utente di personalizzare le condizioni sperimentali per soddisfare le esigenze specifiche di uno studio. Quando si esegue la personalizzazione, è importante riconoscere che l'immobilizzazione della superficie elettrostatica è un processo limitato dal trasporto influenzato dalla forza ionica del biofluido.
La concentrazione di specie ioniche e caricate positivamente influisce inversamente sulla lunghezza del Debye su cui vengono sottoposte a screening le cariche della superficie e della vescica. Al di là di questa lunghezza, le forze elettrostatiche sono trascurabili. Lo strato limite dell'attrazione elettrostatica del substrato sarà molto più piccolo nella PBS ricca di ioni rispetto all'acqua DI. Questa differenza implica che, dopo una breve incubazione corrispondente al tempo necessario per esaurire lo strato di liquido in cui si avvertono le attrazioni elettrostatiche, una densità superficiale di veicoli elettrici immobilizzati dalla sospensione nell'acqua DI sarà superiore a quella di PBS sospensione, supponendo che la concentrazione di EV sia la stessa in entrambi i liquidi. In altre parole, più vesciche devono essere immobilizzate per esaurire uno strato di attrazione più spesso nell'acqua DI rispetto alla PBS in condizioni altrimenti identiche.
Dopo che le vesciche sono esaurite dallo strato limite, l'immobilizzazione diventa un processo interamente limitato dal trasporto. In questo regime, il tasso di deposizione non dipenderà dal mezzo di sospensione (ad esempio, DI acqua o PBS) fino a quando la viscosità è la stessa e il trasporto è interamente diffuso. Tuttavia, il trasporto di vesciche nello strato limite di attrazione potrebbe non essere del tutto diffuso. Ad esempio, se il campione in una goccia sessile sul substrato AFM evapora parzialmente durante l'incubazione, il fluido all'interno della goccia sarà sottoposto al flusso azionato dall'evaporazione e il trasporto delle vesciche verso il substrato avrà, entrambi, contributi diffusi e convettivi. Quando l'evaporazione non è adeguatamente controllata, il contributo di un trasporto convettivo sarà considerevole e il tasso di immobilizzazione sarà superiore al previsto. L'impatto del trasporto convettivo cambierà con lo spessore dello strato di attrazione, che a sua volta dipende dal contenuto ionico del liquido. Inoltre, l'evaporazione migliorerà l'immobilizzazione vescica sul substrato concentrando i veli nella soluzione. A concentrazioni di EV più elevate, il gradiente di concentrazione tra lo strato di attrazione e il liquido adiacente aumenterà, creando una maggiore forza motermidale alla migrazione delle vesciche verso il substrato.
Le vesciche immobilizzate possono rappresentare un campione liquido con una distorsione. Nel caso in cui il tasso di immobilizzazione sia limitato dalla diffusione, è più probabile che le vesciche con dimensioni idrodinamiche più piccole, determinati dalla combinazione delle dimensioni della vescica e dallo spessore dello strato coronale che lo circonda (Figura 1) entrino livello di attrazione a causa della loro maggiore mobilità. Di conseguenza, dopo il periodo di esaurimento iniziale, i piccoli VE idrodinamicamente piccoli saranno sovrarappresentati sul substrato rispetto al loro contributo alla popolazione EV nel campione liquido. Si noti che una dimensione idrodinamica più piccola non punta automaticamente a EV con dimensioni vescicane più piccole a causa dell'eterogeneità nello spessore dello strato coronale3. La rappresentazione di parte è evitata con lunghe incubazioni che esauriscono l'intera popolazione di ev nel liquido per la sua immobilizzazione sul substrato. Quando un utente mira a immobilizzare tutti i veicoli elettrici dal biofluido, per evitare una copertura eccessivamente densa della superficie con le vesciche immobilizzate, potrebbe essere necessario ridurre la concentrazione di veicoli elettrici nel liquido al di sotto della gamma suggerita nel protocollo.
Deformazione dei veicoli elettrici sul substrato
Le vesciche extracellulari nel loro stato idratato nativo e dopo la disidratazione possono essere caratterizzate dall'AFM, come descritto nel protocollo. L'elettrostatico forza24 che immobilizzano i veli sulla superficie della mica distorcono anche la loro forma dalla geometria globulare in cui esistono nella soluzione. L'impatto della disidratazione sulle dimensioni e la morfologia dei veicoli elettrici immobilizzati può essere analizzato scansionando nuovamente la stessa superficie prima e dopo che il campione può asciugarsi.
È istruttivo esaminare l'impatto della preparazione del campione sulla forma dei veicoli elettrici desiccati. Gli EV elettrostaticamente immobilizzati mantengono la geometria altamente oblate dopo l'essiccazione, ma sono ulteriormente appiattiti dalla disidratazione. L'altezza sopra la superficie delle vesciche sciacquate diventa inferiore a quella della figura 12A,mentre l'area dell'impronta aumenta (dati non visualizzati). D'altra parte, quando le vesciche vengono depositate passivamente durante l'evaporazione liquida e senza precedenti immobilizzazioni sulla superficie, tendono a raggiungere una geometria a forma di tazza sulla disidratazione, come è stato osservato a lungo nelle immagini SEM e, più recentemente, in AFM Scansioni. Questa forma coppa è ora riconosciuta come un artefatto di preparazione campione25 causata dalla non uniformità nelle forze capillari durante la disidratazione della superficie, come spiegato meccanicamente nella Figura 141.
Analisi delle immagini e interpretazione dei dati AFM
Le risposte alle forze elettrostatiche e capillari che agiscono per distorcere la forma dei veicoli elettrici forniscono preziose informazioni sulle proprietà strutturali e compositive dei veicoli elettrici. Ad esempio, un insieme multidimensionale di caratteristiche biofisiche, come la dimensione deformata e la forma estratta dai dati AFM, sono state recentemente utilizzate per dimostrare la fattibilità per distinguere tra esosomi secreti da celle host diverse5. Le distorsioni possono anche essere prese in considerazione e compensate. Ad esempio, abbiamo mostrato come utilizzare i dati AFM per caratterizzare la dimensione globulare delle vesciche nella soluzione stimando i diametri delle sfere che incapsulano lo stesso volume degli esosomi immobilizzati3.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono il sostegno finanziario della National Science Foundation (numero di premio IGERT-0903715), dell'Università dello Utah (Department of Chemical Engineering Seed Grant e Graduate Research Fellowship Award), e dell'Istituto di Scienza di Skolkovo e dell'Istituto di Scienza di Skolkovo e tecnologia (Skoltech Fellowship).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM/STM Controller | Bruker | Multimode Nanoscope V | This AFM controller supports imaging of biological samples in liquid and air. |
| AFM/STM metal specimen discs (10 mm) | TedPella | 16207 | Metal specimen disc on which a mica disk is attached by a double-sided tape or other means. |
| AFM/STM Mica discs (10 mm) | TedPella | 50 | Highest quality grade V1 mica, 0.21mm (0.0085”) thick. Interleaved, in packages of 10. Can be mounted on AFM/STM discs. Available in four diameters |
| AFM probe for imaging in the air | Bruker | TESP-V2 | High quality etched silicon probes for tapping mode and non-contact mode for scanning in the air. |
| AFM probe for soft sample imaging in liquid | Bruker | MLCT | Soft silicon nitride cantilevers with silicon nitride tips, which are well-suited for liquid operation. The range in force constants enables users to image extremely soft samples in contact mode as well as high load vs distance spectroscopy. |
| Double sided tape | Spectrum | 360-77705 | Used to fix the mica disk on the metal specimen disc. |
| ExoQuick-TC | System Biosciences | EXOTC50A-1 | ExoQuick-TC is a proprietary polymer-based kit designed for exosome isolation from tissue culture media. |
| Glass probe AFM holder for imaging in liquid | Bruker | MTFML-V2 | This glass probe holder is designed for scanning in fluid with the MultiMode AFM. The holder can be used in peak force tapping mode, contact mode, tapping mode, and force modulation. The probe is acoustically driven by a separate piezo oscillator for larger amplitude modulation. The holder is supplied with two ports, required fittings, and accessories kit for adding and removing fluids. |
| Gwyddion | Czech Metrology Institute. | Version 2.52 | Open Source software for visualization and analysis of data fields obtained by scanning probe microscopy techniques. |
| Lint-free blotting paper | GE Healthcare Whatman | Grade GB003 Blotting Paper | Use this blotting paper to remove NiCl2 after the modification of the mica's substrate. |
| Lint-free cleanroom wipes | Texwipe | AlphaWipe TX1004 | Use these polyester wipes for surface cleaning. |
| Nickel(II) chloride (NiCl2) | Sigma-Aldrich | 339350 | Powder used to make 10 mM NiCl2 in DI water |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | Gibco | 10010023 | PBS, pH 7.4 |
References
- Chernyshev, V. S., et al. Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407, 3285-3301 (2015).
- Ramirez, M. I., et al. Technical challenges of working with extracellular vesicles. Nanoscale. 10, 881-906 (2018).
- Skliar, M., et al. Membrane proteins significantly restrict exosome mobility. Biochemical and Biophysical Research Communications. 501, 1055-1059 (2018).
- Parisse, P., et al. Atomic force microscopy analysis of extracellular vesicles. European Biophysics Journal. 46, 813-820 (2017).
- Ito, K., et al. Host Cell Prediction of Exosomes Using Morphological Features on Solid Surfaces Analyzed by Machine Learning. Journal of Physical Chemistry B. 122, 6224-6235 (2018).
- Sharma, S., LeClaire, M., Gimzewski, J. K. Ascent of atomic force microscopy as a nanoanalytical tool for exosomes and other extracellular vesicles. Nanotechnology. 29, 132001 (2018).
- Meyer, R. L. Immobilisation of living bacteria for AFM imaging under physiological conditions. Ultramicroscopy. 110, 1349-1357 (2010).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A., et al. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current protocols in cell biology. Chapter 3 (Unit 3.22), (2006).
- Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling. Methods in Molecular Biology. 728, 235-246 (2011).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1535750 (2019).
- Weng, Y., et al. Effective isolation of exosomes with polyethylene glycol from cell culture supernatant for in-depth proteome profiling. The Analyst. 141, 4640-4646 (2016).
- Nečas, D., Klapetek, P. Gwyddion: an open-source software for SPM data analysis. Open Physics. 10, 181-188 (2012).
- Hsueh, C., Chen, H., Gimzewski, J. K., Reed, J., Abdel-Fattah, T. M. Localized nanoscopic surface measurements of nickel-modified Mica for single-molecule DNA sequence sampling. ACS Applied Materials and Interfaces. 2, 3249-3256 (2010).
- Conde-Vancells, J., et al. Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes. Journal of Proteome Research. 7, 5157-5166 (2008).
- Zhou, Y., et al. Exosomes released by human umbilical cord mesenchymal stem cells protect against cisplatin-induced renal oxidative stress and apoptosis in vivo and in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 4, 34 (2013).
- Coleman, B. M., Hanssen, E., Lawson, V. A., Hill, A. F. Prion-infected cells regulate the release of exosomes with distinct ultrastructural features. FASEB Journal. 26, 4160-4173 (2012).
- Briegel, A., et al. Universal architecture of bacterial chemoreceptor arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 17181-17186 (2009).
- Akagi, T., et al. On-Chip Immunoelectrophoresis of Extracellular Vesicles Released from Human Breast Cancer Cells. PLOS ONE. 10, e0123603 (2015).
- Sharma, S., et al. Structural-mechanical characterization of nanoparticle exosomes in human saliva, using correlative AFM, FESEM, and force spectroscopy. ACS Nano. 4, 1921-1926 (2010).
- Radeghieri, A., et al. Cultured human amniocytes express hTERT, which is distributed between nucleus and cytoplasm and is secreted in extracellular vesicles. Biochemical and Biophysical Research Communications. 483, 706-711 (2017).
- Woo, J., Sharma, S., Gimzewski, J. The Role of Isolation Methods on a Nanoscale Surface Structure and Its Effect on the Size of Exosomes. Journal of Circulating Biomarkers. 5, 11 (2016).
- Deegan, R. D., et al. Capillary flow as the cause of ring stains from dried liquid drops. Nature. 389, 827-829 (1997).
- Johnson, C. A., Lenhoff, A. M. Adsorption of Charged Latex Particles on Mica Studied by Atomic Force Microscopy. Journal of Colloid and Interface Science. 179, 587-599 (1996).
- Pastré, D., et al. Adsorption of DNA to Mica Mediated by Divalent Counterions: A Theoretical and Experimental Study. Biophysical Journal. 85, 2507-2518 (2003).
- van der Pol, E., Böing, A. N., Harrison, P., Sturk, A., Nieuwland, R. Classification, functions, and clinical relevance of extracellular vesicles. Pharmacological Reviews. 64, 676-705 (2012).
