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Biochemistry

원자력 현미경 검사법에 의한 세포 외 소포의 화상 진찰

Published: September 11, 2019 doi: 10.3791/59254

Summary

단계별 절차는 액체 견본에서 엑소좀 및 세포외 소포의 표지 자유로운 고정을 위해 기술되고 원자력 현미경 검사법 (AFM)에 의하여 그들의 화상 진찰. AFM 이미지는 용액에서 소포의 크기를 추정하고 다른 생물 물리학적 특성을 특성화하는 데 사용됩니다.

Abstract

엑소좀 및 기타 세포외 소포(EV)는 지질막 소포, 막 단백질 및 기타 분자에 의한 표면 장식, RNA를 포함하는 모세포로부터 상속된 다양한 발광 량으로 구성된 분자 복합체이며, 단백질, 및 DNA. 소포의 크기와 표면 장식에 의해 형성된 관상 층의 크기에 따라 달라지는 전기 자동차의 유체 역학적 크기의 특성화는 일상화되었습니다. 엑소좀, 전기 의 가장 작은, 유체 역학 과 소포 크기 사이의 상대적 차이는 중요하다. 극저온 투과 전자 현미경(cryo-TEM) 이미징에 의한 소포 크기의 특성화는 금 본위제 기술인 금본위제 기술로 인해 기기 의 비용, 시료 준비, 이미징 및 이미지에서 관찰되는 소수의 입자를 분석합니다. 널리 이용가능하고 접근 가능한 대안은 3차원 기하학, 크기 및 세포외 소포의 그밖 생물물리학적 특성에 대한 다양한 데이터를 생성할 수 있는 원자력 현미경 검사법(AFM)입니다. 개발된 프로토콜은 사용자가 이 분석 도구를 활용하게 하는 데 지침이 되며, AFM에 의한 전기자동차 분석을 위한 워크플로우를 간략하게 설명하며, 여기에는 수화 또는 건조 형태로 이미징 EV를 위한 샘플 준비, 정전기 적 고정화 고정화 기판, 데이터 수집, 분석 및 해석에 대한 소포. 대표적인 결과는 수정된 운소 표면에 전기 를 고정하는 것이 예측 가능하고 사용자 정의 가능하며 사용자가 많은 수의 소포에 대한 크기 조정 결과를 얻을 수 있음을 보여줍니다. AFM 데이터에 기초한 소포 크기 조정은 저온-TEM 이미징과 일치하는 것으로 나타났다.

Introduction

세포밖 소포 (EV)는 혈액, 소변, 타액, 우유 및 양수를 포함하여 모든 체액에서 존재합니다. 엑소좀은 내생 생물발생, 내생 통로의 마커, 모든 EV 중 가장 작은 크기로 다른 EV와 차별화된 지역 형 EV 클래스를 형성합니다. 엑소좀의 크기는 종종 연구 사이 상당한 가변성으로 보고됩니다. 상기 크기 조정 결과는 EV 크기를 추정하기 위해 상이한 분석 기법에 의해 채택된 물리적 원리의 차이를 반영하여 EV 크기1,2를반영하는 방법에 의존하는 것으로 나타났다. 예를 들어, 가장 널리 사용되는 크기 특성 화 기법인 나노 입자 추적 분석(NTA)은 용액에서 EV의 브라운 이동성에 대한 저항성을 특징짓는 유체역학적 직경으로 EV의 크기를 추정합니다. 소포의 더 큰 유체 역학 직경은 액체에서 낮은 이동성을 의미합니다. 표면 단백질 및 멤브레인 표면에 고정되거나 흡착된 다른 분자로 구성된 소포 주위의 관상 층은 이동성을 실질적으로 방해하고 전기 EV의 유체 역학적 크기를 증가시킵니다. 상대적인 측면에서, 이러한 증가는 그림 1에도시된 바와 같이 엑소좀3에대해 특히 크다.

극저온 투과 전자 현미경 검사법 (cryo-TEM) 화상 진찰은 그들의 수화한 상태에서 소포 크기 및 형태를 특성화하는 결정적인 기술입니다. 그러나 계측기의 높은 비용과 이를 사용하는 데 필요한 전문 지식은 수화된 전기 를 이미지화할 수 있는 대체 기술의 탐구에 정확하게 동기를 부여합니다. 획득된 극저온-TEM 이미지에서 관찰되거나 특징지어지는 비교적 적은 수의 EV는 이 기술의 또 다른 주목할 만한 단점이다.

원자력 현미경 검사법(AFM)은 표면에 입자의 이미지를 래스터하기 위해 기판을 가로질러 프로브를 스캐닝함으로써 수화 또는 건조된 EV4,5,6의 3차원 지형을 시각화한다. AFM에 의해 전기 를 특성화하는 프로토콜의 필수 단계는이 연구에서 설명되어 있습니다. 액체에 소포를 이미징하기 전에, 그들은 기능화 된 표면에 테더링, 필터에 트래핑, 또는 정전기 인력7에의해 기판에 고정되어야한다. 양전하 기판상정전기 고정은 음의 제타 전위를 가지는 것으로 알려진 엑소좀의 고정화를 위한 특히 편리한 옵션이다. 그러나 표면에 세포외 소포를 고정시키는 동일한 정전기력도 모양을 왜곡하여 이미징 후 데이터 분석이 필수적입니다. 우리는 표면에 고정 된 엑소좀의 왜곡 된 모양에 AFM 데이터를 기반으로 솔루션의 구형 소포의 크기를 추정하는 알고리즘을 설명하여이 점을 정교하게.

개발 된 프로토콜에서 소포의 강력한 정전기 고정을위한 절차가 제시되고 수화 또는 건조 된 상태에서 원자력 이미징을 수행하는 데 필요한 단계가 뒤따릅니다. 고정된 소포의 표면 농도에 영향을 미치는 요인이 확인됩니다. 이 지침은 용액에서 서로 다른 농도의 EV를 가진 시료에 대한 정전기 고정을 수행하는 방법에 대해 설명합니다. 충분히 많은 수의 고정된 소포에 기초하여 상이한 생물물리학적 성질의 경험적 확률 분포의 추정을 허용하는 실험 조건의 선택이 논의된다. AFM 데이터의 사후 이미징 분석의 예가 제공됩니다. 구체적으로, 고정화 EV의 AFM 특성화에 기초하여 용액내 소포의 크기를 결정하기 위한 알고리즘이 설명된다. 대표적인 결과는 극저온-TEM 이미징의 결과와 AFM에 의한 소포 크기 조정의 일관성을 보여준다.

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Protocol

1. 바이오 유체로부터 전기 자동차 분리

  1. 차등 초원심분리8,강수량 또는 크기 배제 크로마토그래피 와 같은 확립된 방법 중 하나에 의해 EV를분리한다.
  2. 예상 표면 및 발광 바이오마커의 존재와 제제의 교차 오염을 나타내는 바이오마커의 부재를 확인합니다. 전자 현미경검사법에 의해 단리된 입자의 지질 이중층 형태를 확인한다.
    참고: 엑소좀을 분리할 때 나노입자 추적 분석(NTA) 또는 동적 광 산란으로 측정된 유체역학적 크기 분포는 예상 범위에 있어야 합니다. EV 및 엑소좀 격리의 세부 사항은 이 프로토콜의 범위를 벗어납니다. 선택된 방법은 실험적인 질문과 연구10의목표에 따라 달라집니다. 다음 단계는 시판되는 침전키트(표 오브 머티리얼)를이용하여 MCF-7 유방암 세포의 성장 배지로부터의 침전에 의해 엑소좀을 풍부하게 하는 절차의 구체적인 그림을 제공한다.
  3. 세포 배양 확장 전에 MCF-7 유방암 세포를 액체 질소에 저장하십시오. 서브 배양에 세포를 해동.
  4. 무균 관행에 따라 150mm 플레이트에서 셀 도금을 수행하십시오. 이글의최소 필수 배지, 0.01 mg/mL 인간 재조합 인슐린, 및 10% 엑소좀프리 태아 소 혈청으로 구성된 성장 배지를 사용한다.
  5. 배양을 95% 공기 및 5%CO2로 축하하고 37°C에서배양한다.
  6. 세포가 정착 된 후 (도금 후 약 24 시간), 매체를 변경하십시오. 플레이트를 1:10 비율로 분할하고 각각 20 mL의 배지를 함유하는 배양 10개의 플레이트를 배양한다.
  7. 수확 및 풀 미디어 에서 9 이러한 플레이트 (180mL) ~70- 80% 합류 세포는 성장 단계에 여전히 있을 때.
  8. 미디어를 60 mL 및 120 mL로 나누고 30 mL / 튜브로 나누고 15 분 동안 3,000 x g의 원심 분리기를 넣습니다.
  9. 각 튜브에서 상온을 새로운 멸균 50 mL 튜브로 옮기고 엑소좀 절연을 수행합니다.
  10. 게시된 프로토콜에 따라 침전으로 엑소좀을 분리(참조11참조 참조) 또는 상업적 격리 키트(표 오브머티리얼)가사용되는 경우제조사의지침을 따르십시오. 후자의 경우의 첫 번째 단계로, 원심분리기 세포 배지를 3,000 x g에서 15 분 동안. 상류를 철회하고 세포 및 세포 파편을 폐기한다.
  11. 침전 용액(1:5 부피비)을 상류에 넣고 밤새 혼합하고 냉장보관합니다.
  12. 실온에서 30 분 동안 1,500 x g의 원심 분리기. 원심 분리 후 상급체를 폐기하십시오.
  13. 1,500 x g에서 나머지 엑소좀 펠릿을 5 분 더 돌릴 수 있습니다. 펠릿을 방해하지 않고, 포부로 나머지 침전 용액을 제거하십시오.
  14. 100-1x 인산완식염수(PBS) 완충액의 500 μL에서 펠릿을 다시 중단하고 다운스트림 분석에 필요한 여러 개의 aliquots로 나눕니다.
  15. 즉시 AFM 이미징을 위한 단리된 엑소좀의 표면 고정으로 진행한다. 필요한 경우 동결 해동 주기 동안 시료의 손상을 방지하기 위해 예방 조치를 취하는 동안 나중에 사용하기 위해 -80 °C에서 알리쿼트를 동결하십시오.

2. 세포외 소포의 표면 고정

  1. 강력한 양면 테이프, 에폭시 또는 대체 접착제를 사용하여 AFM/스캐닝 터널링 현미경(STM) 자기 스테인리스 스틸 시편 디스크에 운모 디스크를 단단히 부착하십시오.
  2. 날카로운 면도기 나 유틸리티 나이프를 사용하거나 상단 표면에 접착제 테이프를 부착한 다음 그것을 엿보워서 재료 층을 제거하여 운모 디스크를 절단하십시오.
    참고 : 어느 방법이든 이전에 환경에 노출 된 운모의 얇은 층을 제거하여 처녀 표면을 공개해야합니다. 시술 후 AFM/STM 금속 시편 디스크에 운모를 부착하는 것은 확고하게 유지되어야 합니다.
  3. 실온에서 100 μL의 100 μL의 100 μL의 운모 표면을 10mM NiCl2 용액으로 처리하여 표면 전하를 음수에서 양성으로 수정합니다.
  4. 보풀이없는 물티슈 또는 블로팅 용지로 NiCl2 용액을 얼룩. 탈이온화(DI) 물로 운모 표면을 3배 세척하고 건조한 질소로 건조시다.
    참고: AFM으로 수정된 표면을 스캔하여 오염물질이 없는지 확인하는 것이 좋습니다.
  5. AFM 시편 디스크를 부착된 표면 수정 운도를 페트리 접시에 놓습니다.
  6. 1.14 단계에서 엑소좀 샘플을 1x PBS로 희석하여 용액의 mL당 4.0 x 109 및 4.0 x10 입자 사이의 농도를 얻었다. NTA를 사용하여 희석된 입자 농도를 검증합니다.
  7. 파이펫으로부터 희석된 엑소좀 용액의 100 μL을 비우고 운우의 표면에 sessile 드롭을 형성한다.
  8. 페트리 접시에 뚜껑을 놓고 파라핀 필름으로 밀봉하여 시료 증발을 줄입니다. 4 °C에서 18 시간-12 에 대한 샘플을 배양.
    참고 : 고정 된 엑소좀의 표면 밀도는 인큐베이션 시간과 액체 내의 전기 EV의 농도에 따라 증가합니다. 엑소좀이 더 낮은 농도로 시료에 존재하는 경우 더 긴 배양 시간이 필요할 수 있습니다.
  9. 배양 후, 흡인 80-표면을 방해하지 않고 샘플의 90 %. 이 시점에서, 엑소좀은 정전기적으로 운모 기판 상에 고정될 것이다.
  10. 수화 된 전기 를 이미징하기 전에 1 x PBS로 표면을 헹구하십시오. 3회 반복합니다. 헹구는 과정 전반에 걸쳐 샘플을 수화상태로 유지하도록 주의하십시오.
  11. 1x PBS로 운도 표면을 세척 한 후, 80 % 제거-액체의 90 %, 피펫 ~ 40 신선한 1x PBS의 40 μL 샘플을 커버합니다.
  12. 건조 된 전기 를 이미징 할 때, DI 물로 기판을 헹구. 3회 반복합니다.
    참고 : DI 물로 헹구면 염결정이 형성되고 기판이 건조할 때 표면에 용질의 침착을 방지 할 수 있습니다.
  13. 건조 된 전기 를 이미징하기 전에 표면을 건드리지 않고 가능한 한 많은 액체를 흡입하고 건조한 질소 스트림으로 나머지를 건조시다.

3. AFM 이미징

  1. 건조된 전기 를 이미지화하려면 탭 및 비접촉 이미징 모드에서 공중에서 스캔하도록 설계된 캔틸레버를 선택하고 프로브 홀더에 장착하십시오.
    참고: 재료 표에 나열된 예의 캔틸레버(길이 123μm, 너비 40μm, 7nm 팁 반경 및 37 N/m 스프링 상수)의 특성은 사용 가능한 AFM 계측과 호환되는 프로브를 선택할 때 가이드로 사용할 수 있습니다.
    1. AFM 스테이지에서 2.13단계에서 준비를 합니다. 자기 스테인레스 스틸 표본 디스크는 무대에서 샘플을 고정합니다. 준비하고 무대가 열적으로 평형화될 때까지 시간을 두어 보라고 합니다.
    2. 태핑 모드를 사용하여운모표면의 충분히 넓은 영역을 스캔합니다. 예를 들어~ 1Hz의 스캔 속도로 512선으로 래스터된 5 x 5 μm의 영역을 선택합니다.
      참고: 이미지 영역과 이미지를 형성하기 위해 선택한 선 수에 따라 스캔 시간이 증가하지만 초당 스캔한 선 수로 정의된 스캔 속도에 따라 검색 시간이 줄어듭니다. 빠른 스캔 속도는 이미지 품질에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 래스터링 속도는 획득 시간과 이미지 품질 간의 균형을 사법적으로 조정해야 합니다.
  2. 수화 소포를 이미지화하려면 부드럽고 수화된 샘플을 스캔하는 데 적합한 캔틸레버를 선택하고 캔틸레버를 액체스캔용으로 설계된 프로브 홀더에 장착합니다.
    참고: 사용 가능한 AFM 계측기와 호환되는 프로브를 선택할 때 재료 표에 나열된 프로브의 사양(공칭 길이 175μm, 폭 22m, 팁 반경 20nm, 0.07 N/m 스프링 상수, 및 4~8kHz 범위의 구동 주파수로 이미징에 최적화되어 있습니다.
    1. 캔틸레버 끝을 1x PBS로 적시면 스캔 중에 액체에 기포가 유입될 가능성을 줄입니다.
    2. AFM 단계에서 2.11 단계에서 준비를 합니다. 자기 스테인레스 스틸 시편 디스크는 표면에 고정 된 전기 를 포함하는 부착 된 운모를 고정합니다.
    3. 준비 시간과 AFM 단계가 열적으로 평형화될 수 있도록 합니다.
    4. 태핑 모드에서 수화 된 운모 표면을 이미지화하십시오. 높이 와 위상 이미지를 모두 획득합니다.
      참고: 이미징 품질은 계측, 선택한 프로브 및 스캔 매개변수의 영향을 받습니다. 스캐닝 조건을 최적화할 때, ~0.8-1.0Hz 스캔 속도와 4~8kHz 사이의 구동 주파수로 512라인에서 스캔한 5 x 5 μm 영역을 시작점으로 사용할 수 있습니다.

4. 이미지 분석

참고: 수집된 높이 이미지에는 다음 데이터 처리 및 분석 단계가 적용됩니다. 유사한 절차가 위상 데이터를 분석하도록 조정될 수 있다. 아래 설명은 GNU 일반 공공 라이센스에 따라 제공되는 무료 및 오픈 소스 소프트웨어인 Gwyddion12에만표되어 있습니다. 대체 소프트웨어 도구에서도 유사한 기능을 사용할 수 있습니다.

  1. 데이터 프로세스, SPM 모드, 팁으로 이동하여 모델 팁(그림 2)을 선택합니다. 샘플을 스캔하는 데 사용되는 팁의 형상과 치수를 선택하고 확인을클릭합니다.
  2. 표면 재구성을 수행하여 팁 침식 아티팩트를 수정합니다. 이미지를 엽니다. 메뉴에서 데이터 프로세스, SPM 모드, 팁을선택한 다음 표면 재구성을 선택하고 확인을 클릭합니다(그림3).
  3. 스캔 데이터에서 기판의 기울기를 제거하여 이미징 평면을 실험실 XY 평면과 일치하도록 정렬합니다. 이 작업을 수행하려면 데이터 프로세스, 수준을 선택하고 평면 수준(그림 4)을선택합니다.
  4. 데이터 프로세스, 데이터 수정을 선택한 다음 행 정렬을선택하여 이미지행을 정렬합니다. 여러 정렬 옵션을 사용할 수있습니다(그림 5). 예를 들어 Median은 각 검색 선의 평균 높이를 찾아 데이터에서 빼는 알고리즘입니다.
  5. 데이터 프로세스로이동하여 데이터를 수정하고 흉터 제거(그림 6)를선택하여 흉터로 알려진 일반적인 스캔 오류를 제거합니다.
  6. 데이터 프로세스에서 액세스할 수 있는 레벨 드롭다운 메뉴에서 평평한 베이스를 선택하여 0 높이인 Z = 0으로 운모 표면을 정렬합니다(그림7).
  7. 그레인 드롭다운메뉴(그림 8A)에서 임계값별 표시를 사용하여 스캔한 표면에서 EV를 식별합니다. 이 알고리즘은 사용자가 선택한 임계값 이상의 높이에 의해 제로 표면 기판에서 돌출된 입자로 표면 고정된 엑소좀을 식별합니다. 1nm에서 3nm 사이의 범위에서 임계값을 선택하면 대부분의 배경 간섭이 제거됩니다. 더 작은 임계값은 더 깨끗한 배경에서 사용됩니다.
    참고: 그림 8A의 임계값은 1.767 nm입니다. 이 임계값을 가진 MCF-7 엑소좀 식별의 결과는 도 8B에도시되어 있다. Gwyddion은 자동 임계값(Otsu의 방법), 에지 감지 및 유역 알고리즘을 포함하여 이미지의 소포를 자동으로 식별하는 알고리즘으로서 임계값에 대한 몇 가지 대안을 제공합니다.
    참고: AFM 이미지에 있는 입자 응집체는 마스처되고 분석에서 제외될 수 있습니다.
  8. 그레인 스 메뉴에서 액세스할 수 있는 사용 가능한 분포 알고리즘을 사용하여 식별된 EV의 기하학적 및 차원 특성화를 수행합니다.
    참고: Gwyddion은 수화 또는 탈기 상태에서 비늘 값, 비상, 체적 및 기타 고정화 EV의 분포를 평가하는 도구를 제공합니다. 스칼라-값 속성의 예는 그림 9에 나와 있으며, 이는 식별된 각 엑소좀의 외곽공간 내에서 최대 높이의 분포를 제공합니다.
  9. 다른 계산 도구 및 사용자 지정 컴퓨터 프로그램에서 전문 분석을 위해 Gwyddion에서 AFM 데이터를 내보냅니다.

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Representative Results

전기 자동차의 표면 고정은 이미징 시퀀스에서 중요한 단계입니다. 음의 제타 전위를 가진 것으로 알려진 엑소좀의 정전기 표면 고정은 운모의 기질이 양극성 표면 전하를 갖도록 변형된 후에 강력하게 발생합니다. NiCl2를 사용하여 양성 표면 변화를 부여하지 않으면 기판 상에서 의 전추가 비효율적인 것으로 나타났습니다. 도 10A의높이 이미지는, PBS의 mL당 2.59 x 1010 소포를 포함하는 MCF-7 엑소좀 샘플 후 공기중에서 획득한 것으로, 갓 갈라진 운모의 수정되지 않은 표면에서 12시간 동안 배양되었고, DI 물로 세척한 후 표면에 담습니다. 도 10A에서 볼 수 있는 소포는, 대부분, DI 물의 불완전한 포부의 결과이며, 이는 표면에 고정되지 않은 소포를 다시 매달아 증발함에 따라 기판 상에 그(것)들을 놓습니다.

염화 니켈로 표면 전하를 수정한 후 처리 후 표면이 오염 물질이 없는지 확인하는 것이 좋습니다. 도 10B(공중에서 얻어진)의 높이 이미지는 NiCl2로 처리한 후 DI 물로 3회 세척한 후 깨끗한 표면의 예를 제공한다. 양이온 유도표면의 거칠기는 0.3 nm 미만이었으며, 이는 이전 보고서13과일치한다.

MCF-7 엑소좀의 고정 효율에 대한 표면 전하 변형의 극적인 긍정적 인 영향은 도 10C,D에의해 예시된다. 이들 두 패널은 도 10A에서이전에 이미지된 샘플 후 공기 중에서 획득된 높이 스캔을 나타내고, 각각 24시간 및 12시간 동안 배양하였고, 염화니켈로 처리된 표면상에서 각각 배양하였다.

주어진 시료가 처리된 표면에서 배양되는 시간은 고정화 된 EV의 표면 농도 (면적당 소포)를 결정합니다. 도 10C의 높이 영상은 설명된 MCF-7 엑소좀 샘플을 24시간 동안 배양한 후 얻어진 고정화 소포에 의한 과도하게 조밀한 표면 커버리지의 경우를 도시한다. 많은 알고리즘은 이미지 보정 및 데이터 분석을 수행하기 위해 입자 사이에 충분한 빈 기판을 갖는 데 의존합니다. 예를 들어, 기판을 0 평면으로 평준화하고 이동하면 입자 체적의 선 보정 및 추정이 정확한 계산을 수행하기 위해 중간 평평한 표면이 필요합니다. 고정화 소포의 농도가 도 10C와같이 높으면 이러한 알고리즘은 안정적으로 작동하지 않습니다. 동일한 MCF-7 샘플로부터 고정화된 소포의 적절한 표면 농도의 예는 도 10D의높이 이미지에 나타내었으며, 이는 더 짧은(12h) 배양 후에 수득되었다.
 
일반적인 스캔 오류를 수정하려면 획득한 원시 AFM 데이터의 사후 처리가 필요합니다. 다음 설명은 Gwydion에만 해당됩니다. 유사한 기능은 다른 AFM/SPM 데이터 분석 도구에서 사용할 수 있습니다.

Gwyddion 내에서 평면 레벨 함수는 기판의 기울기를 보정하는 데 사용됩니다. 이러한 배경 보정은 먼저 이미지의 모든 데이터 포인트를 사용하여 기판의 평면을 찾은 다음 원시 데이터에서 빼서 수행됩니다. 스캔 라인을 따라 보정은 행 정렬 함수에 의해 수행됩니다. 예를 들어 구현된 알고리즘 중 하나는 각 스캔 선의 중앙높이를 계산한 다음 해당 이미지 데이터 행에서 결과를 빼서 정렬을 수행합니다. 피드백 루프에서 로컬 오류의 기여도는 정렬된 데이터의 간격을 채우고 인접한 스캔 라인의 데이터를 비교하여 흉터를 제거하는 흉터 제거 기능을 적용하여 제거할 수 있습니다. 기판의 이동은 입자 및 기타 피쳐를 마스킹한 후 표면의 면과 다항식 평준화의 조합에 의해 달성될 수 있다. Gwyddion의 플랫텐 베이스 도구는 이 작업을 자율적으로 또는 사용자가 지정한 마스크로 수행합니다. 기재된 배경 및 라인 보정 후, 정전기적으로 고정된 소포는 Mark Grains 기능을 실행하여 기판상에서 식별될 수 있다.

도 11A도 11B는 운모 표면에 고정된 수화된 MCF-7 엑소좀의 높이 및 위상 이미지를 보여주고 태핑 모드를 사용하여 PBS에서 획득했다. 총 561개의 수화 소포가 마크 그레인스 함수의 임계값 알고리즘을 사용하여 스캔된 영역에서 ~20%로 설정된 임계값으로 확인되었습니다. 구동 주파수에서 프로브의 반응의 위상 지연은 소프트 샘플의 국부적인 강성 변화에 민감합니다. 도 11A,B에서볼 수 있는 높이와 위상 이미지 사이의 일관성은, 따라서, 이미지된 입자가 실제로, 기판 상에 고정된 연약한 소포라는 중요한 확인이다.
 
도 11C는 도 11A에서백색선상에 위치한 엑소좀을 통해 높이 이미지의 단면을 나타낸다. 생체 유체의 외아체는 구형 기하학1,14,15,16을가지지만, 기판 상에서의 모양은 양전하에 정전기 적 매력에 의해 심하게 왜곡된다. 표면. 정전기적으로 고정된 소포의 상각 팬케이크 형상은 도 11A에 박스된 엑소좀의 클로즈업 높이 이미지(및 그 단면)에 의해 도 11D에더 도시되어 있다. 해당 위상 이미지는 그림 11E에표시됩니다. AFM 스캔에서 확인된 모든 561개의 수화 소포에 대해 표면 위의 피크 높이의 경험적 확률 밀도 함수(pdf)는 도 12A에도시되어 있다. 이 분포에 대한 평균 값은 7.9 nm이며, 이는 변형력이 없는 경우 인지질이중층(17)의 두께의 약 2배에 해당한다.
 
고정된 엑소좀이 차지하는 기판의 영역은 소포의 "질량 중심"에서 운모 표면의 경계까지의 평균 거리와 동일한 직경을 가진 원으로 근사화되었다. 이러한 투영 직경의 분포는 도 12A에 도시되어 있으며 평균은 69.6 nm와 같습니다. 얻어진 높이 및 직경 분포는 고정화 표면의 고정화 표면 고정이 고정화 된 엑소좀의 왜곡 된 형상에 미치는 상당한 영향을 더욱 정량화한다.
 
프로토콜 절차의 견고성 및 반복성은 샘플 준비로부터 이미징에 이르기까지 동일한 MCF-7 샘플을 3회 재분석하여 확인되었으며, 각 반복 생산 결과는 도 12에나타난 것과 통계적으로 유사합니다.

정전기력에 의한 고정소포의 변형은 보정되거나 해석되어 이미지형 EV의 특성에 대한 통찰력을 제공할 수 있다. 예를 들어, AFM 데이터는 용액 내의 소포의 구형 크기를 추정하기 위해 사용될 수 있다. 시작점으로, 우리는 고정 된 소포의 막 봉투에 의해 캡슐화 된 부피를 계산할 수 있습니다. 체적은 식별된 소포의 표면 수준과 그 아래에 있는 기판 표고 사이의 차이를 통합하여 발견됩니다. 소포 하의 기판 수준은 직접적으로 접근할 수 없지만 소포를 둘러싼 비어 있는 기판에 대한 데이터 포인트의 Laplace 또는 대체 보간에 의해 추정될 수 있다. Gwyddion 내에서 이러한 체적 계산은 다양한 입자 특성 함수의 분포를 사용하여 수행됩니다. 그런 다음 Gwydion에서 내보낸 결과를 체적 에 상응하는 구의 지름에 매핑할 수 있습니다.

561개의 분석된 MCF-7 소포에 대해 AFM 데이터에 기재된 알고리즘의 적용은 도 12B에도시된 부피 등가 구체의 직경의 분포를 생성했다. 이 분포는 운모 표면에 정전기 고정하기 전에 생체 유체에서 자신의 타고난 구형 형태의 막 소포의 크기를 추정한다. AFM 데이터의 분석으로부터 얻은 소포 크기는 동일한 샘플의 저온-TEM 이미징의 결과와 비교하였고, 가까운합의3(도 12B)에있는 것으로 나타났다. NTA에 의해 측정된 유체역학적 직경과 얻어진 소포크기(그림 1)의비교는 엑소좀의 이동성이 AFM 및 극저온-TEM에서 결정된 소포의 크기에서 예상되는 것보다 훨씬 작다는 것을 나타냅니다. 측정. 유체 역학과 소포 크기의 차이는 외형 소포를 둘러싼 관상 층의 두께를 특징으로합니다.

Figure 1
그림 1: 전기 EV의 유체역학 및 기하학적 직경 비교. 외아체 소포의 기하학적 크기는 액체에서의 확산에서 결정되는 유체 역학적 크기보다 실질적으로 작습니다. 차이점은 EV의 이동성을 방해하는 멤브레인 컨쥬게이스 및 흡착 분자에 의해 형성된 관상 층입니다. 이 그림은 참조3에서 수정되고 사용 권한으로 재인쇄됩니다.

Figure 2
그림 2: AFM 프로브의 특성입니다. 모델 팁 기능을 사용하여 AFM 프로브의 형상과 치수를 지정할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 팁 샘플 컨볼루션으로 인한 이미징 아티팩트 보정. 표면 재구성을수행하면 획득한 AFM 데이터를 팁 아티팩트에 대해 수정할 수 있습니다.  이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 기판의 기울기를 보정합니다. 평면 레벨은 기판의 평면을 결정하고 AFM 데이터에서 뺍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: 스캔 행의 정렬 불량 보정. 스캔 데이터를 정렬하는 종래의 알고리즘은 각 스캔 라인을 따라 평균 높이를 찾아 이미지의 해당 데이터 포인트 행에서 결과를 뺍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
그림 6: 정렬된 데이터의 간격을 수정합니다. 흉터로 알려진 일반적인 스캔 오류는 흉터 제거 기능을 적용하여 AFM 데이터에서 제거할 수 있습니다.  이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 7
그림 7: 0표에서 기판의 정렬. 레벨 메뉴의 고정 베이스 옵션을 사용하면 기판 표면을 0 높이에 해당하는 기준 레벨에 배치할 수 있습니다.  이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 8
그림 8: 스캔된 표면에서 고정된 소포의 식별. (a)표면 고정된 엑소좀은 임계값에 의해 마크에 지정된 사용자 선택 높이 임계값에 의해 기판 위로 돌출된 입자로식별된다. (B)식별의 결과. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 9
그림 9: AFM 데이터 분석. 식별된 엑소좀이 차지하는 영역 내의 기판 위의 최대 높이의 분포는 그레인 분포 도구에 의해 컴파일된 것으로 표시됩니다.  이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 10
그림 10: 고정화 소포의 표면 밀도의 표면 변형 및 EV 농도의 영향. (A)MCF-7 엑소좀 시료로 12시간 배양 후 갓 절단된 운모 기판의 AFM 높이 이미지를 DI 물로 세척하고 건조하였다. 액체에서 기판으로 의 전기 를 고정하는 것은 운모의 표면에 양전하를 부여하지 않고 비효율적입니다. 스캔에서 보이는 입자는 기판이 건조되기 전에 MCF-7 샘플을 불완전하게 제거한 결과일 가능성이 높습니다. (B)염화니켈로 처리한 후 공기 중의 운모 표면의 높이 스캔은 기판에 오염이 없는 것을 나타낸다. 패널(C) 및(D)는패널(A)에서와동일한 MCF-7 시료로 표면 전하 및 인큐베이션을 각각 24시간 및 12시간 동안 개량한 후 얻어진 AFM 높이 스캔을 보여준다. 고정화 소포의 표면 농도는 24 시간 배양 후 지나치게 조밀합니다. 12시간 배양은 표면에 고정된 엑소좀의 감소와 정확하게 분석하기 쉬운 스캔 데이터를 유도합니다.  이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 11
도 11: 수정된 운모 표면에 정전기적으로 고정화된 수화 된 MCF-7 엑소좀의 AFM 이미지. (A)높이 이미지입니다. (b)상응하는 AFM 상 이미지는 멤브레인 소포에 대해 예상되는 바와 같이 높이 이미지의 입자가 연나노입자임을 확인한다. (C)패널(A)에도시된 선에 의해 교차된 3개의 소포에 대한 높이 데이터는 변형된 운모의 양전하 표면에 엑소좀의 정전기 적인 매력에 의한 평평한 형상을 나타낸다. (D)패널(A)과그 단면에 박스 고정 된 소포가 확대된 뷰에서 모양 왜곡이 명백하다. 동일한 소포의 위상 이미지는(E)에도시된다. 이 그림은 참조3에서 수정되고 사용 권한으로 재인쇄됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 12
그림 12: 표면에 고정화된 수화 소포의 치수 특성 및 용액내의 구형 크기의 추정. (A)표면(빨간색 곡선) 위의 피크 높이의 분포는 평균이 7.9nm에 해당합니다. 고정화 엑소좀이 차지하는 면적은 평균 직경이 69.6nm(청색 곡선)입니다. (B)고정화 엑소좀 중 하나에 대한 AFM 높이 이미지는 정전기력에 의한 고도로 침단한 형상을 나타남을 예시한다. 용액내의 외아소포의 구형 크기는 표면 고정 및 구형 멤브레인 봉투에 의해 둘러싸인 부피를 일치시킴으로써 추정될 수 있다. (C)용액(적색 곡선)에서 구형 소포의 크기 분포는 561개의 고정화 소포의 AFM 데이터로부터 결정되었다. 저온-TEM 이미지(파란색 곡선)의 소포 크기는 AFM 결과와 일치합니다. 이 그림은 참조3에서 수정되고 사용 권한으로 재인쇄됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 13
그림 13: 증발액체로부터 EV를 수동적으로 증착하는 동안 표면 농도 및 크기 분리 아티팩트. (a)스캐닝 전자 현미경(SEM) 이미지는 건조액으로부터 수동적으로 증착된 외아체의 표면 농도가 현탁액으로부터의 표면 고정이 수행되지 않을 때 공간적으로 가변적임을 보여준다. (B)건조 시료로부터 의 전기자동차의 수동증착은 소포 크기 분리를 일으킨다. 실질적인 크기 가변성은 흰색 대각선으로 정의된이미지(A)의상이한 영역에서 소포에 대한 확률 밀도 함수(pdf)에 의해 정량화됩니다. 이 그림은 참조1에서 수정되고 사용 권한으로 다시 인쇄됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 14
그림 14: 액체 증발 동안 표면에 수동적으로 증착된 건조된 소포의 컵 형상. 정전기력에 의해 고정되지 않은 소포의 표면 탈수는 EV의 SEM 이미지에서 종종 관찰되는 컵 모양의 외관을 초래하는 것으로 알려져 있다. 이 그림은 참조1에서 수정되고 사용 권한으로 다시 인쇄됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

생물학적 유체, 표면 스캐닝 및 이미지 분석에서 전기 EV의 고정은 액체에서 EV의 AFM 특성화를 위한 개발된 프로토콜의 필수 단계입니다. AFM 이미징 스케일에 대한 소포의 수는 기판 상에 고정된 소포의 표면적 및 표면 농도를 갖는다. 전기 자동차및 엑소좀18의부정적인 제타 전위를 감안할 때, 우리는 액체 샘플에서 AFM 기판에 이르기까지 전기 전기 적 고정을 옹호합니다. 고정은 표면이 양전하일 때 효과적입니다. EV 고정화 에 앞서, 양성 표면 전하가 운모의 경우와 같이 기판에 부여되어야 할 수도 있다―일반적인 식 KAl 2(AlSi3O10)(OH)2를가진 층화된 규산염 미네랄. 갓 갈라진 운우의 표면은 완벽하게 평평한 표면에 가깝기 때문에 AFM에 의해 나노 입자를 이미징하는 데 이상적이지만 표면 전하가 음수이므로 수정해야합니다. 프로토콜은 AFM 기판에 양성 표면 변화를 부여하는 절차를 설명합니다. 대표적인 결과는 바이오유체에서 변형된 운모 기판으로의 EV 고정이 현저히 개선된 것으로 나타났습니다.
 
수화 소포를 이미징할 때 표면 증착 아티팩트와 대류 흐름을 유발하는 시료 증발을 최소화하고 시간이 지남에 따라 소포의 액체 농도를 증가시켜 표면 농도가 높아지는 것이 중요합니다. 예상보다 고정화 된 전기 자동차, 특히 장기간 인큐베이션 동안. 액체 시료를 위해 명시적으로 설계된 프로브 홀더는 증발을 제거하거나 느리게 하며 수화 된 전기 를 이미지화하는 데 사용해야합니다. 스캐닝 프로브에 대한 비특이적 결합은 이온 종의 존재에서 감소된다. 따라서, 수화된 EV를 이미징할 때, DI 물 대신에 PBS와 같은 완충배지로 기판을 덮는 것이 바람직하다.

표면 고정의 중요성
수정된 기판상에서 일관되고 예측 가능한 전기 자동차 의 고정은 AFM 결과의 주요 변동성 을 제거합니다. 스캐닝에서 데이터 분석에 이르는 모든 다운스트림 단계는 계측, 프로브, 스캐닝 매개변수, 데이터 분석 시퀀스 및 알고리즘을 선택하여 보다 쉽게 제어할 수 있습니다. 사용자는 생물학적 샘플 및 EV 격리 프로토콜의 업스트림 변동성을 알고 있어야 하며, 이는 이 작업의 범위를 벗어난 중요한 문제입니다.

액체 샘플에서 수정된 운모 표면에 EV의 표면 고정을 수행하는 것이 좋습니다. 액체가 증발합니다. 사실, 액체에서 전기 EV의 정전기 고정을위한 전제 단계인 운모의 표면 전하를 수정하지 않고 얻은 건조 된 EV에 대한 AFM 결과는 지난19,20,21에서보고되었습니다. . 그러나 전기전기가 액체 샘플로부터 표면에 고정되지 않을 경우, 증발에 의한 그들의 수동 증착은 커피 링효과(22)로통칭되는 아티팩트를 생성한다. 건조액 후퇴로서 발생하는 두 개의 아티팩트는 음전하 유리 표면에 증발하여 증착된 혈청 엑소좀의 SEM이미지(그림 13A)에도시되어 있다. 침전된 소포의 표면 농도에 있는 중요한 변이는 즉시 명백합니다. 도 13B에서정량화된 두 번째 아티팩트는 건조된 샘플의 둘레 내의 상이한 영역에서 소포 크기에서 상당한 가변성을 이다. 이러한 유물을 감안할 때, 건조 액에서 수동적으로 증착된 소포의 AFM 특성은 처음에 건조된 액체 샘플이 점유한 전체 표면적을 스캔하지 않는 한 편향되거나 일치하지 않는 결과를 생성할 수 있습니다.

기판에 소포의 단단한 고정없이 얻어진 건조된 견본을 화상 진찰할 때 2개의 추가 문제점은 고려되어야 합니다. 우리의 프로토콜은 소포가 액체 샘플에서 고정 된 후 DI 물로 표면을 철저히 세척하도록 사용자에게 지시한다는 것을 기억하십시오. 이 단계는 상당한 삼투압을 가진 복잡한 생물유체의 증발 도중 표면 침전물을 형성에서 이온 성 및 그밖 비 소포 용질을 방지하기 위한 것입니다. 전기 를 고정하지 않으면 철저한 세척이 표면에서 많은 수의 소포를 분리하여 결과를 편향시키고 분석을 위해 너무 적은 입자를 남깁니다. AFM 이미징 전에 수정된 운모 표면에 전기를 고정시킴으로써 감소된 또 다른 일반적인 어려움은프로브(23)에 입자의 부착과 이 현상으로 인한 오해의 소지가 있는 아티팩트이다.
 
고정화 EV의 표면 밀도 제어
프로토콜에서 확인된 두 가지 쉽게 제어 가능한 인자는 사용자가 변형된 운모 기판상에서 고정화된 EV의 표면 농도를 사용자 정의할 수 있습니다: 액체 샘플내의 소포의 농도 및 시료가 배양되는 시간 기판에. 액체에 있는 EV의 더 긴 배양 시간 및 더 높은 농도로 달성된 고고정소포의 고밀도는, AFM의 분석에 의해 도달된 결론의 스캐닝 및 통계적인 힘 도중 분석된 소포의 수를 증가시킵니다 데이터. 동시에, 입자가 기판의 중간 영역없이 전체 표면을 단단히 덮는 그림 10C에 표시된 경우와 같이 지나치게 조밀한 표면 농도는 이미지 분석 및 결과 해석을 복잡하게 합니다. 밀접한 간격의 입자 간의 상호 작용으로 인해 발생하는 스캐닝 아티팩트가 발생할 수 있습니다.

전기 검사의 영향 및 전기 EV의 유체 역학적 이동성
고정화 된 전기 자동차의 표면 농도에 대한 투명한 제어는 사용자가 연구의 특정 요구를 충족시키기 위해 실험 조건을 사용자 정의 할 수 있습니다 영향을 미치는 요인의 함수로. 사용자 정의를 수행할 때, 정전기 표면 고정은 바이오 유체의 이온 강도에 의해 영향을 받는 수송 제한 공정임을 인식하는 것이 중요합니다.

이온 및 양전하 종의 농도는 표면과 소포 전하가 스크리미는 데비 길이에 반비례합니다. 이 길이를 넘어서면 정전기력은 무시할 수 있습니다. 기판의 정전기 인력의 경계층은 DI 물보다 이온이 풍부한 PBS에서 훨씬 작을 것이다. 이러한 차이는 정전기 적 매력이 느껴지는 액체 층을 고갈시키는 데 필요한 시간에 해당하는 짧은 인큐베이션 후 DI 물의 현탁액에서 고정 된 전기 의 표면 밀도가 PBS보다 높을 것임을 의미합니다. 전기 자동차의 농도가 두 액체에서 동일하다고 가정합니다. 다르게 말하면, 더 많은 소포는 그렇지 않으면 동일한 조건에서 PBS에서보다 DI 물에서 두꺼운 매력 층을 고갈하기 위해 고정되어야한다.

소포가 경계 층에서 고갈 된 후, 고정은 완전히 수송 제한된 과정이된다. 이 정권에서, 증착의 속도는 점도가 동일하고 수송이 완전히 확산되는 한 중단 배지(예를 들어, DI 물 또는 PBS)에 의존하지 않을 것이다. 그러나, 어트랙션 경계층으로 소포의 수송은 완전히 확산되지 않을 수 있다. 예를 들어, AFM 기판상의 시료가 인큐베이션 중에 부분적으로 증발하는 경우, 드롭 내부의 유체는 증발 구동 흐름을 받게 되며, 기판을 향한 소포의 수송은 둘 다, 둘 다, 확산 및 대류 기여. 증발이 적절히 제어되지 않을 때, 대류 수송의 기여도는 상당할 것이고, 고정의 비율은 예상보다 높을 것이다. 대류 수송의 영향은 그 자체가 액체의 이온 함량에 따라 매력 층의 두께에 따라 변경됩니다. 또한, 증발은 용액에 EV를 집중시킴으로써 기판상소포의 고정화를 향상시킬 것이다. 높은 EV 농도에서, 매력 층과 인접한 액체 사이의 농도 구배가 증가하여, 기판을 향한 소포의 이동에 더 큰 열역학적 추진력을 생성한다.

고정화 소포는 바이어스를 가진 액체 샘플을 나타낼 수 있다. 상기 고정화의 속도가 확산에 의해 제한되는 경우, 소역학적 크기가 작은 소포는, 이를 둘러싼 코로나층의 크기와 두께의 조합에 의해 결정된다(도1). 높은 이동성 때문에 매력 층. 따라서, 초기 고갈 기간 이후에, 유체역학적으로 작은 전기 자동차는 액체 샘플에서 EV 집단에 대한 그들의 기여와 비교하여 기판상에 과대 대표될 것이다. 더 작은 유체역학적 크기는 관상 층3의두께의 이질성 때문에 소포 크기가 작은 EV를 자동으로 가리키지 않습니다. 편향된 표현은 기판에 그것의 고정에 의해 액체에 있는 EV의 전체 인구를 고갈하는 긴 인큐베이션으로 피할 수 있습니다. 사용자가 생체 유체로부터 모든 EV를 고정화하는 것을 목표로 할 때, 고정화 소포로 표면의 지나치게 조밀한 커버리지를 피하기 위해 프로토콜에서 제안된 범위 이하의 액체에서 EV 농도를 감소시킬 필요가 있을 수 있다.

기판에 전기 EV의 변형
그들의 기본 수화 상태 및 탈수 후의 세포외 소포는 프로토콜에 기재된 바와 같이 AFM을 특징으로 할 수 있다. 운모 표면에 전기 를 고정 하는 정전기 힘(24)는 또한 그들이 솔루션에 존재 하는 구형 기하학에서 그들의 모양을 왜곡. 고정화 된 전기 EV의 크기 및 형태에 대한 건조의 영향은 시료가 건조되기 전과 후에 동일한 표면적을 재스캔하여 분석 될 수있다.

건조 된 전기 EV의 모양에 샘플 준비의 영향을 검사 하는 것이 유익하다. 정전기적으로 고정된 전기 자동차는 건조 후 매우 높은 하강 형상을 유지하지만 건조에 의해 더 평평해져 있습니다. 건조된 소포의 표면 위의 높이는 그림 12A보다작아지며 발자국 영역은 증가합니다(데이터는 표시되지 않음). 다른 한편으로는, 소포가 액체 증발 도중 그리고 표면에 사전 고정없이 수동적으로 증착될 때, 그(것)들은 SEM 심상에서 오래 관찰된 것과 같이, 건조시 컵 모양 기하학을 달성하는 경향이 있고, 최근에는 AFM에서, 스캔. 이러한 컵드프름 형상은 이제 도 141에설명된 바와 같이 표면 탈수 동안 모세관력의 불균일성에 의해 야기된 샘플 제제 아티팩트(25)로 인식된다.
 
AFM 데이터의 이미지 분석 및 해석
전기 자동차의 모양을 왜곡하는 정전기 및 모세관 힘에 대한 반응은 전기 EV의 구조적 및 구성적 특성에 대한 귀중한 정보를 제공합니다. 예를 들어, AFM 데이터로부터 추출된 변형된 크기 및 형상과 같은 다차원 생물물리학적 특성 세트는, 최근에 상이한 숙주 세포에 의해 분비된 엑소좀을 분화하는 타당성을 입증하기 위해 사용되었다5. 왜곡도 고려하고 보정할 수 있습니다. 예를 들어, 고정화 된 외아오스와 동일한 부피를 캡슐화하는 구체의 직경을 추정하여 용액에서 소포의 구형 크기를 특성화하기 위해 AFM 데이터를 사용하는 방법을 보여 주었다3.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgments

저자는 국립 과학 재단 (수상 번호 IGERT-0903715), 유타 대학 (화학 공학 종자 보조금 및 대학원 연구 펠로우십 상), 그리고 과학의 스콜코보 연구소의 재정 지원을 인정 기술 (스콜테크 펠로우십).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AFM/STM Controller  Bruker Multimode Nanoscope V This AFM controller supports imaging of biological samples in liquid and air. 
AFM/STM metal specimen discs (10 mm) TedPella 16207 Metal specimen disc on which a mica disk is attached by a double-sided tape or other means.
AFM/STM Mica discs (10 mm) TedPella 50 Highest quality grade V1 mica, 0.21mm (0.0085”) thick. Interleaved, in packages of 10. Can be mounted on AFM/STM discs. Available in four diameters
AFM probe for imaging in the air Bruker TESP-V2 High quality etched silicon probes for tapping mode and non-contact mode for scanning in the air.
AFM probe for soft sample imaging in liquid Bruker MLCT Soft silicon nitride cantilevers with silicon nitride tips, which are well-suited for liquid operation.  The range in force constants enables users to image extremely soft samples in contact mode as well as high load vs distance spectroscopy.
Double sided tape Spectrum 360-77705 Used to fix the mica disk on the metal specimen disc.
ExoQuick-TC System Biosciences EXOTC50A-1 ExoQuick-TC is a proprietary polymer-based kit designed for exosome isolation from tissue culture media. 
Glass probe AFM holder for imaging in liquid Bruker  MTFML-V2 This glass probe holder is designed for scanning in fluid with the MultiMode AFM.  The holder can be used in peak force tapping mode, contact mode, tapping mode, and force modulation.  The probe is acoustically driven by a separate piezo oscillator for larger amplitude modulation.  The holder is supplied with two ports, required fittings, and accessories kit for adding and removing fluids.
Gwyddion Czech Metrology Institute. Version 2.52 Open Source software for visualization and analysis of data fields obtained by scanning probe microscopy techniques.
Lint-free blotting paper GE Healthcare Whatman  Grade GB003 Blotting Paper Use this blotting paper to remove NiCl2 after the modification of the mica's substrate.  
Lint-free cleanroom wipes Texwipe AlphaWipe TX1004 Use these polyester wipes for surface cleaning. 
Nickel(II) chloride (NiCl2) Sigma-Aldrich 339350 Powder used to make 10 mM NiCl2 in DI water
Phosphate Buffered Saline (1x) Gibco 10010023 PBS, pH 7.4

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References

  1. Chernyshev, V. S., et al. Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407, 3285-3301 (2015).
  2. Ramirez, M. I., et al. Technical challenges of working with extracellular vesicles. Nanoscale. 10, 881-906 (2018).
  3. Skliar, M., et al. Membrane proteins significantly restrict exosome mobility. Biochemical and Biophysical Research Communications. 501, 1055-1059 (2018).
  4. Parisse, P., et al. Atomic force microscopy analysis of extracellular vesicles. European Biophysics Journal. 46, 813-820 (2017).
  5. Ito, K., et al. Host Cell Prediction of Exosomes Using Morphological Features on Solid Surfaces Analyzed by Machine Learning. Journal of Physical Chemistry B. 122, 6224-6235 (2018).
  6. Sharma, S., LeClaire, M., Gimzewski, J. K. Ascent of atomic force microscopy as a nanoanalytical tool for exosomes and other extracellular vesicles. Nanotechnology. 29, 132001 (2018).
  7. Meyer, R. L. Immobilisation of living bacteria for AFM imaging under physiological conditions. Ultramicroscopy. 110, 1349-1357 (2010).
  8. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A., et al. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current protocols in cell biology. Chapter 3 (Unit 3.22), (2006).
  9. Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling. Methods in Molecular Biology. 728, 235-246 (2011).
  10. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1535750 (2019).
  11. Weng, Y., et al. Effective isolation of exosomes with polyethylene glycol from cell culture supernatant for in-depth proteome profiling. The Analyst. 141, 4640-4646 (2016).
  12. Nečas, D., Klapetek, P. Gwyddion: an open-source software for SPM data analysis. Open Physics. 10, 181-188 (2012).
  13. Hsueh, C., Chen, H., Gimzewski, J. K., Reed, J., Abdel-Fattah, T. M. Localized nanoscopic surface measurements of nickel-modified Mica for single-molecule DNA sequence sampling. ACS Applied Materials and Interfaces. 2, 3249-3256 (2010).
  14. Conde-Vancells, J., et al. Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes. Journal of Proteome Research. 7, 5157-5166 (2008).
  15. Zhou, Y., et al. Exosomes released by human umbilical cord mesenchymal stem cells protect against cisplatin-induced renal oxidative stress and apoptosis in vivo and in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 4, 34 (2013).
  16. Coleman, B. M., Hanssen, E., Lawson, V. A., Hill, A. F. Prion-infected cells regulate the release of exosomes with distinct ultrastructural features. FASEB Journal. 26, 4160-4173 (2012).
  17. Briegel, A., et al. Universal architecture of bacterial chemoreceptor arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 17181-17186 (2009).
  18. Akagi, T., et al. On-Chip Immunoelectrophoresis of Extracellular Vesicles Released from Human Breast Cancer Cells. PLOS ONE. 10, e0123603 (2015).
  19. Sharma, S., et al. Structural-mechanical characterization of nanoparticle exosomes in human saliva, using correlative AFM, FESEM, and force spectroscopy. ACS Nano. 4, 1921-1926 (2010).
  20. Radeghieri, A., et al. Cultured human amniocytes express hTERT, which is distributed between nucleus and cytoplasm and is secreted in extracellular vesicles. Biochemical and Biophysical Research Communications. 483, 706-711 (2017).
  21. Woo, J., Sharma, S., Gimzewski, J. The Role of Isolation Methods on a Nanoscale Surface Structure and Its Effect on the Size of Exosomes. Journal of Circulating Biomarkers. 5, 11 (2016).
  22. Deegan, R. D., et al. Capillary flow as the cause of ring stains from dried liquid drops. Nature. 389, 827-829 (1997).
  23. Johnson, C. A., Lenhoff, A. M. Adsorption of Charged Latex Particles on Mica Studied by Atomic Force Microscopy. Journal of Colloid and Interface Science. 179, 587-599 (1996).
  24. Pastré, D., et al. Adsorption of DNA to Mica Mediated by Divalent Counterions: A Theoretical and Experimental Study. Biophysical Journal. 85, 2507-2518 (2003).
  25. van der Pol, E., Böing, A. N., Harrison, P., Sturk, A., Nieuwland, R. Classification, functions, and clinical relevance of extracellular vesicles. Pharmacological Reviews. 64, 676-705 (2012).

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생화학 문제 151 원자력 현미경 검사법 외래 성 및 세포 외 소포 표면 고정 치수 특성 형태 학적 특성 생물 물리학 특성 막 소포의 크기 수화 및 건조 샘플 이미지 분석
원자력 현미경 검사법에 의한 세포 외 소포의 화상 진찰
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Skliar, M., Chernyshev, V. S. Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (151), e59254, doi:10.3791/59254 (2019).

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