Summary
Um procedimento passo a passo é descrito para a imobilização sem rótulo de exosomas e vesículas extracelulares de amostras líquidas e sua imagem por microscopia de força atômica (AFM). As imagens de AFM são usadas para estimar o tamanho das vesículas na solução e caracterizar outras propriedades biofísicas.
Abstract
Os exosomas e outras vesículas extracelulares (EVs) são complexos moleculares constituídos por uma vesícula de membrana lipídica, sua decoração superficial por proteínas de membrana e outras moléculas, e conteúdo Luminal diverso herdado de uma célula-mãe, que inclui RNAs, proteínas e DNAs. A caracterização dos tamanhos hidrodinâmicos de EVs, que depende do tamanho da vesícula e da sua camada coronal formada por decorações superficiais, tornou-se rotineira. Para os exosomas, o menor dos EVs, a diferença relativa entre os tamanhos hidrodinâmico e vesículas é significativa. A caracterização de tamanhos de vesículas pela imagem de microscopia eletrônica de transmissão criogênica (Cryo-TEM), uma técnica de padrão-ouro, continua sendo um desafio devido ao custo do instrumento, a expertise necessária para realizar a preparação da amostra, a imagem e análise de dados, e um pequeno número de partículas muitas vezes observadas em imagens. Uma alternativa amplamente disponível e acessível é a microscopia de força atômica (AFM), que pode produzir dados versáteis sobre geometria tridimensional, tamanho e outras propriedades biofísicas de vesículas extracelulares. O protocolo desenvolvido orienta os usuários na utilização desta ferramenta analítica e delineia o fluxo de trabalho para a análise de EVs pelo AFM, que inclui a preparação da amostra para exames de imagem em forma hidratada ou desictada, a imobilização eletrostática de vesículas em um substrato, aquisição de dados, sua análise e interpretação. Os resultados representativos demonstram que a fixação de EVs na superfície modificada da mica é previsível, customizável, e permite que o usuário obtenha resultados da cola para um grande número vesículas. O dimensionamento de vesículas com base nos dados de AFM foi encontrado para ser consistente com a imagem latente de Cryo-TEM.
Introduction
Vesículas extracelulares (EVs) estão presentes em todos os fluidos corporais, incluindo sangue, urina, saliva, leite e o líquido amniótico. Os exosomas formam uma classe distrital de EVs diferenciada de outros EVs por biogênese endossômica, os marcadores da via endossômica e o menor tamanho entre todos os EVs. O tamanho dos exosomas é relatado frequentemente com variabilidade substancial entre estudos. Os resultados de dimensionamento foram encontrados como dependentes do método, refletindo a diferença nos princípios físicos empregados por diferentes técnicas analíticas para estimar ostamanhos de EV1,2. Por exemplo, a análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) ― a técnica de caracterização de tamanho mais amplamente utilizada ― estima o tamanho dos EVs como seus diâmetros hidrodinâmicos, que caracterizam a resistência à mobilidade browniana de EVs na solução. Um diâmetro hidrodinâmico maior de uma vesícula implica sua menor mobilidade em líquido. A camada coronal em torno das vesículas, consistindo de proteínas superficiais e outras moléculas ancoradas ou adsortas à superfície da membrana, impede substancialmente a mobilidade e aumenta o tamanho hidrodinâmico dos EVs. Em termos relativos, esse aumento é particularmente grande para os exosomas3, como ilustrado na Figura 1.
A imagem latente da microscopia de elétron de transmissão criogênica (Cryo-tem) é uma técnica definitiva em caracterizar tamanhos e morfologia do vesícula em seus Estados hidratados. No entanto, o alto custo da instrumentação e a expertise especializada necessária para utilizá-lo motivam corretamente a exploração de técnicas alternativas que podem ser imagens hidratadas. Um número relativamente pequeno de EVs observado ou caracterizado nas imagens adquiridas de Cryo-TEM é uma outra desvantagem notável desta técnica.
A microscopia da força atômica (AFM) visualiza a topografia tridimensional de EVS hidratados ou Desiccated4,5,6escaneando uma ponta deprova através da carcaça para rasterear a imagem das partículas na superfície. Os passos essenciais do protocolo para caracterizar os EVs por AFM estão descritos neste estudo. Antes de imagem as vesículas em líquido, eles devem ser imobilizados em um substrato, quer amarrar a uma superfície funcionalizada, aprisionamento em um filtro, ou por atração eletrostática7. A fixação eletrostática em um substrato positivamente carregado é uma opção particularmente conveniente para a imobilização de exosomas conhecidas por ter um potencial zeta negativo. No entanto, as mesmas forças eletrostáticas que imobilizam as vesículas extracelulares na superfície também distorcem sua forma, o que torna essencial a análise de dados pós-imagem. Elaboramos este ponto descrevendo o algoritmo que estima o tamanho das vesículas globulares na solução com base nos dados da AFM sobre a forma distorcida dos exosomas imobilizados na superfície.
No protocolo desenvolvido, o procedimento para a imobilização eletrostática robusta de vesículas é apresentado e seguido pelas etapas necessárias para a realização de imagens de força atômica nos Estados hidratados ou desictados. Os fatores que influenciam a concentração superficial das vesículas imobilizadas são identificados. A orientação é dada sobre como realizar a imobilização eletrostática para amostras com diferentes concentrações de EVs na solução. Discute-se a seleção de condições experimentais que permitam estimar as distribuições de probabilidades empíricas de diferentes propriedades biofísicas com base em um número suficientemente grande de vesículas imobilizadas. Exemplos de análise pós-imagem dos dados do AFM são fornecidos. Especificamente, um algoritmo é descrito para determinar o tamanho das vesículas na solução com base na caracterização AFM de EVs imobilizados. Os resultados representativos mostram a consistência do dimensionamento de vesículas por AFM com os resultados da imagem latente de Cryo-TEM.
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Protocol
1. isolamento de EVs de um biofluide
- Isole EVs por um dos métodos estabelecidos, tais como a ultracentlee diferencial8, a precipitação, ou a cromatografia do tamanho-exclusão9.
- Confirme a presença de biomarcadores de superfície e luminal esperados e a ausência de biomarcadores que indiquem a contaminação cruzada da preparação. Confirme a morfologia do BICAMADA do lipido das partículas isoladas pela microscopia de elétron.
Nota: ao isolar os exosomas, a distribuição de tamanho hidrodinâmico medida pela análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) ou dispersão de luz dinâmica deve estar no intervalo esperado. Os detalhes de EV e isolamento exossomo estão além do escopo deste protocolo. O método selecionado dependerá das questões experimentais e do objetivo do estudo10. As seguintes etapas fornecem uma ilustração concreta do procedimento para enriquecer os exossomos pela precipitação do meio de crescimento de pilhas de cancro da mama MCF-7 usando um jogo comercialmente disponível da precipitação (tabela dos materiais). - Antes da expansão da cultura celular, armazene as células de câncer de mama MCF-7 em nitrogênio líquido. Descongelar as células para a subcultura.
- Após práticas assépticas, realize o chapeamento de células em placas de 150 mm. Use o meio de crescimento composto pelo meio mínimo essencialde Eagle,0, 1 mg/ml de insulina recombinante humana e 10% de soro bovino fetal livre de exosome.
- Aerar a cultura em 95% ar e 5% CO2 e incubar a 37 °C.
- Depois que as células são liquidadas (aproximadamente 24 h após o chapeamento), altere a mídia. Dividir a placa em 1:10 proporção e cultura dez placas, cada uma contendo 20 mL de mídia.
- Os meios da colheita e da Associação de 9 destas placas (180 mL) em ~ 70−80% confluência quando as pilhas estão ainda na fase do crescimento.
- Divida a mídia em 60 mL e 120 mL, divida mais em 30 mL/tubo e Centrifugue a 3.000 x g por 15 min.
- Transfira o sobrenadante de cada tubo para um novo tubo estéril de 50 ml e realize o isolamento de exossomo.
- Isole os exosomas por precipitação de acordo com os protocolos publicados (ver, por exemplo, referência11) ou siga as instruçõesdo fabricante sefor utilizado um kit de isolamento comercial (tabela de materiais). Como um primeiro passo no último caso, o meio de célula centrífuga em 3.000 x g por 15 min. retirar sobrenadante e descartar células e restos de células.
- Adicione a solução da precipitação (relação do volume 1:5) ao sobrenadante, misture, e leve à geladeira durante a noite.
- Centrifugar a 1.500 x g durante 30 min à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante após a centrifugação.
- Gire a pelota exossomo restante por mais 5 min em 1.500 x g. Sem perturbar a pelota, remova a solução restante da precipitação pela aspiração.
- Ressuscite o pellet em 100−500 μL de tampão de soro fisiológico com tampão de fosfato 1x (PBS) e divida em múltiplas alíquotas, conforme necessário para a análise a jusante.
- Proceder imediatamente à imobilização da superfície dos exosomas isolados para a imagem latente de AFM. Se necessário, congele as alíquotas em-80 °C para uso posterior enquanto toma precauções para evitar danos na amostra durante o ciclo de congelamento-descongelação.
2. fixação superficial de vesículas extracelulares
- Use fita dupla face forte, epóxi ou um adesivo alternativo para anexar firmemente um disco de mica a um disco de amostra de aço inoxidável magnético AFM/scanning tunneling microscópio (STM).
- Cleave mica disco usando uma navalha afiada ou faca de utilidade, ou anexando uma fita adesiva para a superfície superior e, em seguida, pealing-lo para remover uma camada de material.
Nota: um ou outro método deve revelar uma superfície virgem removendo uma camada fina de mica expor previamente ao ambiente. Após o procedimento, o acessório de mica para o disco de amostra de metal AFM/STM deve permanecer firme. - À temperatura ambiente, trate a superfície superior de mica para 10 s com 100 μL de solução de NiCl2 de 10 mm, que modifica a carga superficial de negativa para positiva.
- Blot NiCl2 solução com uma limpeza sem fiapos ou papel blotting. Lave a superfície mica 3x com água deionizada (DI) e seque-a com um fluxo de azoto seco.
Nota: é uma boa prática digitalizar a superfície modificada com AFM para confirmar que está livre de contaminantes. - Coloque o disco de amostra AFM com a mica modificada de superfície anexada em uma placa de Petri.
- Diluir a amostra de exossomo do passo 1,14 com 1X PBS para obter uma concentração entre 4,0 x 109 e 4,0 x 1010 partículas por ml de solução. Validar a concentração de partículas diluídas utilizando NTA.
- Formar uma gota sésseis na superfície da mica, esvaziando 100 μl da solução de exossomo diluída de uma pipeta.
- Coloque a tampa na placa de Petri e sele-a com uma película de parafina para reduzir a evaporação da amostra. Incubar a amostra para 12−18 h a 4 °C.
Nota: a densidade superficial dos exosomas imobilizados aumentará com o tempo de incubação e a concentração de EVs no líquido. O tempo de incubação mais longo pode ser necessário se os exosomas estiverem presentes na amostra em concentrações mais baixas. - Após a incubação, aspirar 80−90% da amostra sem perturbar a superfície. Neste ponto, os exosomas serão imobilizados eletrostaticamente no substrato de mica.
- Antes de imagens hidratadas EVs, enxague a superfície com 1X PBS. Repita 3x. Tome cuidado para manter a amostra hidratada durante todo o processo de enxaguadela.
- Depois de lavar a superfície mica com 1X PBS, remover 80%−90% de líquido, e pipeta ~ 40 μL de fresco 1X PBS para cobrir a amostra.
- Quando a imagem latente os EVs Desiccated, enxague o substrato com água DI. Repita 3x.
Nota: enxágue com água DI impedirá a formação de cristais de sal e a deposição de solutos na superfície à medida que o substrato secar. - Antes da imagem latente EVs Desiccated, aspirar tanto quanto líquido como possível sem tocar na superfície e secar o descanso com um córrego do nitrogênio seco.
3. imagem latente de AFM
- Para a imagem dos EVs dessecados, selecione um cantilever projetado para digitalizar no ar em modos de imagem de toque e sem contato e montá-lo no suporte da sonda.
Nota: as características de um exemplo de cantilever listado na tabela de materiais (comprimento de 123 μm, largura de 40 μm, raio de ponta de 7 nm e 37 constante de mola N/m) podem ser usadas como um guia ao selecionar uma sonda compatível com a instrumentação AFM disponível.- Coloque a preparação da etapa 2,13 no estágio AFM. O disco magnético do espécime do aço inoxidável imobilizará a amostra no estágio. Reserve tempo para a preparação e o estágio para equilibrar termicamente.
- Utilize o modo de toque para digitalizar uma área suficientemente grande da superfícieda mica. Por exemplo, escolha uma área de 5 x 5 μm, rastered em 512 linhas a uma taxa de digitalização de ~ 1 Hz. adquira as imagens de altura e de fase, pois elas fornecem informações complementares sobre a topografia e as propriedades superficiais da amostra.
Nota: o tempo de digitalização aumentará com a área imaged e o número de linhas selecionadas para formar a imagem, mas diminuirá com a taxa de digitalização definida como o número de linhas digitalizadas por segundo. As taxas de digitalização rápidas podem afetar a qualidade da imagem. Portanto, a velocidade de motorizado deve equilibrar judicialmente a compensação entre o tempo de aquisição e a qualidade da imagem.
- Para a imagem de vesículas hidratadas, selecione um cantilever apropriado para a digitalização de amostras suaves e hidratadas e monte o cantilever em um suporte de sonda projetado para a digitalização em líquidos.
Nota: ao selecionar uma sonda compatível com a instrumentação AFM disponível, as especificações da sonda listada na tabela de materiais (cantilever triangular com 175 μm de comprimento nominal, 22 μm de largura, 20 nm ponta de raio, 0, 7 N/m mola constante, e otimizado para imagens com a frequência da unidade no intervalo entre 4 a 8 kHz) pode ser usado como um guia.- Molhe a ponta do cantilever com 1X PBS para reduzir a probabilidade de introduzir bolhas de ar no líquido durante a exploração.
- Coloque a preparação da etapa 2,11 no estágio AFM. O disco magnético do espécime do aço inoxidável imobilizará a mica unida que contem EVs imobilizados em sua superfície.
- Reserve tempo para a preparação e a fase AFM para equilibrar termicamente.
- Imagem a superfície de mica hidratada no modo de toque. Adquira as imagens de altura e de fase.
Nota: a qualidade de imagem é influenciada pela Instrumentação, sonda selecionada e parâmetros de digitalização. Ao otimizar as condições de digitalização, as seguintes opções podem ser usadas como ponto de partida: área de 5 x 5 μm escaneada em 512 linhas com taxa de digitalização de ~ 0,8-1,0 Hz e frequência de acionamento entre 4 a 8 kHz.
4. análise de imagem
Observação: as seguintes etapas de processamento e análise de dados são aplicadas às imagens de altura adquiridas. Um procedimento semelhante pode ser adaptado para analisar os dados da fase. A descrição abaixo é específica para Gwyddion12, um software livre e de código aberto disponível GNU General Public License. Recursos semelhantes estão disponíveis em ferramentas de software alternativas.
- Acesse processo de dados, modos SPM, dica e escolha dica de modelo (Figura 2). Selecione a geometria e as dimensões da dica usada para digitalizar a amostra e clique em OK.
- Corrija os artefatos de erosão da ponta realizando a reconstrução da superfície. Abra a imagem. No menu, selecione processo de dados, modos SPM, dicae, em seguida, escolha reconstrução de superfície e clique em OK (Figura 3).
- Alinhe o plano de imagem para coincidir com o plano XY do laboratório, removendo a inclinação do substrato dos dados de digitalização. Para realizar essa tarefa, selecione processo de dados, nível e escolha nível de plano (Figura 4).
- Alinhe linhas da imagem selecionando processo de dados, dados corretos e escolha alinhar linhas. Várias opções de alinhamento estão disponíveis (Figura 5). Por exemplo, Median é um algoritmo que localiza uma altura média de cada linha de digitalização e o subtrai dos dados.
- Vá para processo de dados, Corrija dados e escolha remover cicatrizes (Figura 6), que remove erros comuns de digitalização conhecidos como cicatrizes.
- Alinhe a superfície de mica na altura zero, Z = 0, selecionando o menu suspenso nivelar base no nível acessível a partir do processo de dados (Figura 7).
- Identifique os EVs na superfície digitalizada usando o menu suspenso marcar por limite em grãos (figura 8a). Este algoritmo identifica exosomas superfície-imobilizados como partículas salientes do substrato de superfície zero pela altura acima do limiar selecionado pelo usuário. Selecione um limite no intervalo entre 1 e 3 Nm, que eliminará a maior parte da interferência de fundo. Os limiares menores são usados com fundo mais limpo.
Nota: o limiar na figura 8a é 1,767 nm. O resultado da identificação do exossomo MCF-7 com este limiarização é mostrado na Figura 8B. Gwyddion oferece várias alternativas para limiarização como o algoritmo para identificar automaticamente vesículas na imagem, incluindo limiarização automatizado (método de Otsu), detecção de borda, e o algoritmo de bacias hidrográficas.
Nota: aglomerados de partículas, se presentes na imagem AFM, podem ser mascaradas e excluídas da análise. - Realize a caracterização geométrica e dimensional dos EVs identificados usando os algoritmos de distribuições disponíveis acessíveis a partir do menu grãos .
Nota: gwyddion fornece ferramentas para avaliar a distribuição de propriedades escalar-valorizadas, areal, volumétrica, e outras de EVS imobilizados em um estado hidratado ou dessecadas. Um exemplo de uma propriedade de valores escalares é mostrado na Figura 9, que dá a distribuição de alturas máximas dentro da pegada de cada exosome identificado. - Exporte os dados do AFM da Gwyddion para análise especializada por outras ferramentas computacionais e programas de computador personalizados.
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Representative Results
A fixação de superfície de EVs é uma etapa crítica na seqüência da imagem latente. A imobilização de superfície eletrostática de exosomas, conhecida por ter um potencial zeta negativo, ocorrerá de forma robusta após a modificação do substrato da mica para ter uma carga superficial positiva. Sem o tratamento com NiCl2 para transmitir mudanças de superfície positivas, a imobilização de EVS no substrato foi encontrada para ser ineficaz. A imagem de altura na Figura 10A, adquirida no ar após a amostra de exossomo MCF-7 contendo 2,59 x 1010 vesículas por ml de PBS foi incubada por 12 h em superfície não modificada de mica recém-clivada, mostra muito poucas vesículas remanescentes no superfície após a limpeza com água DI. As vesículas visíveis na Figura 10A são, provavelmente, o resultado da aspiração incompleta da água de di, que as vesículas ressuscitados não foram fixadas à superfície e depois as deposto no substrato à medida que evaporou.
Depois de modificar a carga superficial com cloreto de níquel, é aconselhável confirmar que a superfície permanece livre de contaminantes após o tratamento. A imagem da altura na Figura 10B (obtida no ar) dá um exemplo de uma superfície limpa depois que foi tratada com o nicl2 e lavado então três vezes com água de di. A aspereza da superfície cation-derivatized era abaixo de 0,3 nanômetro, que é consistente com o relatório precedente13.
O impacto positivo dramático da modificação de carga superficial na eficiência da fixação de exosomas MCF-7 é ilustrado pela Figura 10C,D. Estes dois painéis mostram as varreduras da altura adquiridas no ar depois que a amostra, previamente imaged na Figura 10A, foi incubada para 24 h e 12 h, respectivamente, na superfície tratada com o cloreto niquelar.
O tempo que uma determinada amostra é incubada na superfície tratada determina a concentração superficial (vesículas por área) dos EVs imobilizados. A imagem de altura na Figura 10C ilustra o caso de cobertura superficial excessivamente densa pelas vesículas imobilizadas obtidas após a amostra de exossomo descrita MCF-7 ser incubada por 24 h. Um número de algoritmos dependem de ter substrato desocupado suficiente entre os grãos para executar a correção de imagem e análise de dados. Por exemplo, nivelando e deslocando o substrato para o plano zero, a correção de linha e a estimativa do volume dos grãos precisam da superfície plana interveniante para realizar cálculos precisos. Quando a concentração das vesículas imobilizadas é tão alta quanto na Figura 10C, esses algoritmos não funcionarão de forma confiável. Um exemplo de uma concentração superficial adequada de vesículas imobilizadas a partir da mesma amostra de MCF-7 é mostrado na imagem de altura na Figura 10D, que foi obtida após a incubação mais curta (12 h).
O pós-processamento dos dados de AFM brutos adquiridos é necessário para corrigir erros comuns de digitalização. A descrição a seguir é específica para Gwyddion. A funcionalidade semelhante está disponível em outras ferramentas de análise de dados AFM/SPM.
Dentro de Gwyddion, a função de nível de plano é usada para corrigir uma inclinação no substrato. Tal correção de fundo é realizada pela primeira encontrando o plano do substrato usando todos os pontos de dados na imagem e, em seguida, subtraindo-o dos dados brutos. A correção ao longo das linhas de digitalização é realizada pela função alinhar linhas . Por exemplo, um dos algoritmos implementados executa o alinhamento calculando a altura mediana de cada linha de digitalização e, em seguida, subtraindo o resultado da linha correspondente de dados de imagem. A contribuição das falhas locais no ciclo de feedback pode ser removida aplicando a função remover cicatrizes , que preenche as lacunas nos dados alinhados e elimina as cicatrizes comparando os dados nas linhas de digitalização adjacentes. A mudança do substrato para a elevação Z = 0 pode ser realizada por uma combinação de uma faceta e nivelamento polinomial da superfície após a mascaramento de grãos e outras características. A ferramenta base Flatten da gwyddion executa esta tarefa autonomamente ou com uma máscara especificada pelo usuário. Após as correções de fundo e linha descritas, as vesículas fixadas eletrostaticamente podem ser identificadas no substrato executando a função de grãos de marca .
A Figura 11a e a Figura 11b mostram imagens de altura e fase de exosomas hidratados de MCF-7 imobilizadas em uma superfície de mica e adquiridas em PBS usando o modo de rosqueamento. Um total de 561 vesículas hidratadas foram identificados na área digitalizada usando o algoritmo limiar da função de grãos de marca com o valor limiar definido para ~ 20%. O retardo de fase da resposta da sonda na frequência da unidade é sensível às variações localizadas de rigidez em amostras macias. A consistência entre as imagens de altura e de fase, observada na Figura 11a,B, é, portanto, uma importante confirmação de que os grãos imaged são, de fato, vesículas macias imobilizadas no substrato.
A Figura 11C mostra a seção transversal da imagem de altura por meio de exosomas localizados na linha branca na Figura 11a. Quando os exossomos em um mecânicos tiverem uma geometria globular1,14,15,16, sua forma na carcaça é distorcida severamente pela atração eletrostática ao carregado positivamente Superfície. O oblato de panqueca-como a geometria de vesículas eletrostaticamente imobilizadas é mais ilustrado na Figura 11D pela imagem de altura de close-up (e sua seção transversal) de um exossomo encaixotado na Figura 11a. A imagem de fase correspondente é mostrada na Figura 11E. A função de densidade de probabilidade empírica (PDF) de alturas de pico acima da superfície para todas as 561 vesículas hidratadas identificadas na varredura do AFM é mostrada na Figura 12A. O valor médio para esta distribuição é de 7,9 nm, que é aproximadamente igual a duas vezes a espessura de uma BICAMADA fosfolipídica17 na ausência de forças deformantes.
A área na carcaça ocupada por um exossomo imobilizado foi aproximada como um círculo com o diâmetro igual à distância média do "centro de massa" do vesicle a seu limite na superfície do mica. A distribuição desses diâmetros de projeção é mostrada na Figura 12A e tem a média igual a 69,6 Nm. A altura obtida e as distribuições de diâmetro quantificam ainda mais o impacto significativo da imobilização da superfície eletrostática na forma distorcida dos exosomas imobilizados.
A robustez e repetibilidade dos procedimentos protocolados foram confirmadas reanalisando a mesma amostra de MCF-7 três vezes, desde a preparação da amostra até a imagem, com cada repetição produzindo resultados estatisticamente semelhantes aos mostrados na Figura 12.
A deformação de vesículas imobilizadas causadas por forças eletrostáticas pode ser compensada ou interpretada para fornecer uma introspecção nas propriedades dos EVs imaged. Por exemplo, os dados de AFM podem ser usados para estimar o tamanho globular das vesículas na solução. Como ponto de partida, podemos calcular o volume encapsulado pelos envelopes de membrana de vesículas imobilizadas. O volume é encontrado integrando a diferença entre o nível de superfície das vesículas identificadas e a elevação do substrato embaixo delas. O nível de substrato as vesículas não é diretamente acessível, mas pode ser estimado pelo Laplace ou interpolação alternativa de pontos de dados para substrato desocupado em torno das vesículas. Dentro de Gwyddion, tal cálculo do volume é executado usando a distribuição da vária função das características de grão . O resultado exportado de Gwyddion pode então ser traçado nos diâmetros de esferas volume-equivalentes.
A aplicação do algoritmo descrito aos dados do AFM para 561 analisou vesículas hidratadas MCF-7 produziu a distribuição dos diâmetros das esferas equivalentes ao volume mostradas na Figura 12B. Esta distribuição estima o tamanho de vesículas da membrana em sua forma globular inata em um mecânicos antes de sua fixação eletrostática na superfície de mica. O dimensionamento de vesículas obtido a partir da análise dos dados do AFM foi comparado com os resultados da imagem de Cryo-TEM da mesma amostra e encontrou-se em concordância estreita3 (Figura 12B). A comparação dos diâmetros hidrodinâmicos medidos pelo NTA com os tamanhos de vesículas obtidos (Figura 1) indica que a mobilidade dos exosomas é muito menor do que seria esperado a partir do tamanho de suas vesículas determinadas a partir do AFM e do Cryo-tem Medidas. A diferença entre os tamanhos hidrodinâmico e vesícula caracteriza a espessura da camada coronal em torno das vesículas exosomáticas.
Figura 1: comparação de diâmetros hidrodinâmicos e geométricos de EVs. O tamanho geométrico do vesícula exosomal é substancialmente menor do que seu tamanho hidrodinâmico determinado de sua difusão em um líquido. A diferença é a camada coronal formada por moléculas de membrana conjugadas e adsorvedas que impedem a mobilidade dos EVs. Essa figura é modificada da referência3 e reimpressa com permissão.
Figura 2: Propriedades da sonda AFM. A geometria e as dimensões da sonda AFM podem ser especificadas usando a função de dica de modelo . Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: correção do artefato de imagem causado por convolução de amostra de ponta. Ao realizar a reconstrução de superfície, os dados de AFM adquiridos podem ser corrigidos para artefatos de ponta. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: correção para uma inclinação no substrato. Plano de nível determina o plano do substrato e subtrai-lo dos dados AFM. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: correção de desalinhamentos em linhas de digitalização. Um algoritmo convencional para alinhar os dados de digitalização é encontrar uma altura média ao longo de cada linha de digitalização e subtrai o resultado da linha correspondente de pontos de dados na imagem. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: correção para as lacunas nos dados alinhados. Erros de digitalização comuns, conhecidos como cicatrizes, podem ser removidos dos dados do AFM aplicando a função remover cicatrizes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: alinhamento de um substrato na elevação zero. A opção Flatten base no menu nível permite que o usuário Coloque a superfície do substrato no nível base correspondente à altura zero. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: identificação de vesículas imobilizadas na superfície digitalizada. (A) os exosomas de superfície imobilizados são identificados como grãos salientes acima do substrato por um limiar de altura selecionado pelo usuário especificado em Mark by Threshold. B) o resultado da identificação. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: análise dos dados do AFM. A distribuição das alturas máximas acima do substrato dentro da área ocupada pelos exosomas identificados é mostrada como compilada pela ferramenta de distribuições de grãos . Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 10: impacto da modificação da superfície e da concentração de EV da densidade superficial das vesículas imobilizadas. (A) a imagem da altura de AFM do substrato recentemente clivada da mica após a incubação de 12 h com a amostra de MCF-7 exossomo seguida limpando com água e secagem do di. A imobilização de EVs do líquido ao substrato é ineficiente sem transmitir uma carga positiva à superfície de mica. Poucas partículas observadas na varredura são provavelmente o resultado da remoção incompleta da amostra MCF-7 antes que o substrato foi seco. (B) a varredura da altura da superfície de mica no ar depois que o tratamento com cloreto niquelar mostra o substrato livre de contaminações. Os painéis (C) e (D) mostram as varreduras da altura de AFM obtidas após a modificação da carga de superfície e a incubação com a mesma amostra MCF-7 como no painel (a) para 24 h e 12 h, respectivamente. A concentração superficial de vesículas imobilizadas é excessivamente densa após 24 h de incubação. A incubação de 12 h leva a menos exosomas imobilizados na superfície e os dados de varredura que são mais fáceis de analisar com precisão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 11: imagens AFM de exosomas hidratados MCF-7 eletrostaticamente imobilizadas na superfície de mica modificada. (A) aimagem de altura. (B) a imagem da fase AFM correspondente confirma que os grãos na imagem de altura são nanopartículas moles, como deve ser esperado para vesículas de membrana. (C) os dados de altura para as três vesículas cruzadas pela linha mostrada no painel (a) ilustram uma forma achatado causada pela atração eletrostática de exosomas à superfície positivamente carregada da mica modificada. (D) a distorção da forma é aparente em uma vista ampliada o vesícula imobilizado encaixotado no painel (A) e em sua seção transversal. A imagem de fase do mesmo vesícula é mostrada em (E). Essa figura é modificada da referência3 e reimpressa com permissão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 12: caracterização dimensional de vesículas hidratadas imobilizado na superfície e estimativa de seu tamanho globular na solução. (A) adistribuição das alturas de pico acima da superfície (curva vermelha) tem a média igual a 7,9 nm. A área ocupada por exosomas imobilizados tem 69,6 Nm de diâmetro médio (curva azul). (B) a imagem da altura de AFM para um dos exossomos imobilizados ilustra sua forma altamente oblato causada por forças eletrostáticas. O tamanho globular de vesículas exosomáticas na solução pode ser estimado por volumes correspondentes delimitados por envelopes de membrana esférica e imobilizadas na superfície. (C) a distribuição do tamanho de vesículas globulares na solução (curva vermelha) foi determinada a partir dos dados do afm de 561 vesículas imobilizadas. Os tamanhos das vesículas nas imagens Cryo-TEM (curva azul) são consistentes com os resultados do AFM. Essa figura é modificada da referência3 e reimpressa com permissão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 13: artefatos de segregação de tamanho e concentração de superfície durante a deposição passiva de EVs de líquido evaporador. (A) a imagem de microscopia eletrônica de varredura (MEV) mostra que a concentração superficial de exosomas depositados passivamente de um líquido de secagem é espacialmente variável quando a imobilização superficial de um biofluide suspendendo não é realizada. (B) a deposição passiva de EVS de uma amostra de secagem causa a segregação do tamanho das vesículas. A variabilidade substancial do tamanho é quantificada pelas funções de densidade de probabilidade (PDF) para as vesículas em diferentes regiões da imagem (a) definidas por linhas diagonais brancas. Essa figura é modificada da referência1 e reimpressa com permissão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 14: geometria em forma de taça de vesículas dessecadas passivamente depositadas na superfície durante a evaporação líquida. A dessecação superficial de vesículas que não foram imobilizadas por forças eletrostáticas é conhecida por resultar em uma aparência em forma de xícara, muitas vezes observada em imagens de SEM de EVs. Essa figura é modificada da referência1 e reimpressa com permissão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A imobilização de EVs de um líquido biológico, de uma exploração de superfície, e de uma análise da imagem é as etapas essenciais do protocolo desenvolvido para a caracterização de AFM dos EVs no líquido. O número de vesículas em escalas de imagem AFM com a área de superfície imaged e a concentração superficial das vesículas imobilizadas no substrato. Dado um potencial zeta negativo de EVS e de exossomos18, nós advogamos a fixação eletrostática dos EVS das amostras líquidas ao substrato AFM. A imobilização é eficaz quando a superfície é carregada positivamente. Antes da imobilização do EV, a carga superficial positiva pode precisar ser transmitida ao substrato, como no caso de mica ― um mineral de silicato em camadas com a fórmula geral KAl2(alsi3O10) (Oh)2. A superfície de mica recentemente clivada está perto de perfeitamente plana, que é ideal para nanopartículas de imagem pelo AFM, mas sua carga superficial é negativa e, portanto, deve ser modificada. O protocolo descreve o procedimento para transmitir uma mudança de superfície positiva para o substrato AFM. Os resultados representativos mostram a melhoria marcada na fixação do EV de um mecânicos ao substrato modificado de mica.
Quando as vesículas hidratadas por imagem, é importante minimizar a evaporação da amostra que faz com que os artefatos de deposição de superfície e fluxos convectivos e aumenta a concentração líquida das vesículas com o tempo, levando a maior concentração superficial de imobilizado do que o esperado, especialmente durante as incubações prolongadas. Os suportes da sonda explicitamente projetados para amostras líquidas eliminam ou retardam a evaporação e devem ser usados para a imagem de EVs hidratado. As ligações inespecíficas à sonda de varredura são reduzidas na presença de espécies iônicas. Conseqüentemente, quando os EVs hidratados da imagem latente, é preferível cobrir o substrato com um meio tamponado, tal como PBS, em vez da água do DI.
Importância da imobilização superficial
A imobilização consistente e previsível de EVs no substrato modificado remove a principal fonte de variabilidade nos resultados do AFM. Todas as etapas downstream, da digitalização à análise de dados, são mais facilmente controladas pela seleção de instrumentação, sondas, parâmetros de digitalização e a sequência de análise de dados e algoritmos. O usuário deve estar atento à variabilidade de upstream em amostras biológicas e protocolos de isolamento de EV, que são questões importantes além do escopo deste trabalho.
Recomendamos a realização de imobilização superficial de EV na superfície da mica modificada a partir de amostras líquidas, mesmo quando o objetivo é caracterizar vesículas dessecadas no ar — a necessidade é menos evidente, uma vez que as vesículas vão inevitavelmente depositar em qualquer substrato como o evaporates líquidos. De fato, os resultados de AFM para EV dessecado obtidos sem modificar as cargas superficiais de mica, que é um passo de pré-requisito para a imobilização eletrostática de EVS de um líquido, têm sido relatados nos últimos19,20,21 . Quando os EVs não são fixados à superfície da amostra líquida, entretanto, sua deposição passiva por evaporação produzirá artefatos coletivamente conhecidos como um efeito de anel de café22. Dois desses artefatos, que ocorrem como um líquido de secagem recedes, são ilustrados na imagem de SEM (Figura 13a) de exosomas séricos depositados por evaporação em uma superfície de vidro negativamente carregada. As variações significativas na concentração de superfície de vesículas precipitadas são imediatamente aparentes. O segundo artefato, quantificado na Figura 13B, é a variabilidade considerável em tamanhos de vesículas em diferentes áreas dentro do perímetro da amostra seca. Diante desses artefatos, a caracterização do AFM de vesículas depositadas passivamente de um líquido de secagem pode produzir resultados tendenciosos ou inconsistentes, a menos que toda a área de superfície inicialmente ocupada por uma amostra líquida agora seca seja escaneada.
Duas questões adicionais devem ser consideradas na imagem das amostras dessecadas obtidas sem imobilização firme de vesículas no substrato. Lembre-se que o nosso protocolo instrui os usuários a lavar completamente a superfície com água DI depois que as vesículas são imobilizadas a partir de uma amostra líquida. Esta etapa pretende impedir que os solutos iônicos e outros não-vesiculares formem depósitos de superfície durante a evaporação de biofluídos complexos com osmolaridade considerável. Se os EVS não forem fixos, a lavagem completa desanexará um grande número de vesículas da superfície, potencialmente polarização os resultados e deixando poucas partículas para análise. Outra dificuldade comum, reduzida pela imobilização de EVs na superfície de mica modificada antes da imagem de AFM, é a aderência de partículas à sonda23 e os artefatos enganosos causados por esse fenômeno.
Controle da densidade superficial de EVs imobilizados
Os dois fatores facilmente verificáveis identificados no protocolo permitem que o usuário personalize a concentração superficial dos EVs imobilizados no substrato de mica modificada: a concentração das vesículas na amostra líquida e o tempo em que a amostra é incubada em o substrato. Uma alta densidade de vesículas imobilizadas, conseguida com tempos de incubação mais longos e maior concentração de EVs no líquido, aumenta o número de vesículas analisadas durante a varredura e o poder estatístico das conclusões chegou pela análise do AFM Dados. Ao mesmo tempo, uma concentração superficial excessivamente densa, como no caso mostrado na Figura 10C , onde as partículas cobrem firmemente toda a superfície sem áreas intervenientes do substrato, complica a análise da imagem e a interpretação dos resultados e pode levar a artefatos de digitalização causados pela interação entre partículas estreitamente espaçadas.
Influência da triagem eletrostática e da mobilidade hidrodinâmica de EVs
O controle transparente sobre a concentração superficial de EVs imobilizados em função dos fatores que a influenciam permite que um usuário personalize condições experimentais para atender às necessidades específicas de um estudo. Ao realizar a personalização, é importante reconhecer que a imobilização de superfície eletrostática é um processo de transporte limitado influenciado pela força iônica do biofluide.
A concentração de espécies iónicas e positivamente carregadas impacta inversamente o comprimento de Debye sobre que as cargas da superfície e do vesícula são examinadas. Além desse comprimento, as forças eletrostáticas são desprezíveis. A camada limite da atração eletrostática do substrato será muito menor em PBS ionicamente rico do que em água DI. Essa diferença implica que, após uma curta incubação correspondente ao tempo necessário para esgotar a camada de líquido onde as atrações eletrostáticas são sentidas, uma densidade superficial de EVs imobilizada da suspensão em água DI será maior do que a da PBS suspensão, assumindo que a concentração de EVs é a mesma em ambos os líquidos. Põr diferentemente, mais vesículas devem ser imobilizadas para esgotar uma camada mais grossa da atração na água de DI do que em PBS circunstâncias de outra maneira idênticas.
Depois que as vesículas são esgotadas da camada limite, a imobilização torna-se um processo totalmente limitado ao transporte. Neste regime, a taxa de deposição não dependerá do meio de suspensão (por exemplo, água DI ou PBS), desde que a viscosidade seja a mesma e o transporte seja inteiramente difuso. No entanto, o transporte de vesículas para a camada limite de atração pode não ser inteiramente diffusivo. Por exemplo, se a amostra em uma gota sésseis na carcaça de AFM evapora parcialmente durante a incubação, o líquido dentro da gota estará sujeitado ao fluxo evaporação-conduzido, e o transporte das vesículas para o substrato terá, ambos, contribuições diffusivas e convectivas. Quando a evaporação não é adequadamente controlada, a contribuição de um transporte convectivo será considerável, e a taxa de imobilização será maior do que o esperado. O impacto do transporte convectivo mudará com a espessura da camada de atração, que depende do conteúdo iônico do líquido. Além disso, a evaporação irá aumentar a imobilização vesícula no substrato, concentrando EVS na solução. Em concentrações mais elevadas de EV, o gradiente de concentração entre a camada de atração e o líquido adjacente aumentará, criando uma força motriz termodinâmico maior para a migração de vesículas em direção ao substrato.
As vesículas imobilizadas podem representar uma amostra líquida com um viés. Para o caso em que a taxa de imobilização é limitada pela difusão, as vesículas com tamanhos hidrodinâmicos menores, determinadas pela combinação do tamanho da vesícula e da espessura da camada coronal que o rodeia (Figura 1), têm maior probabilidade de entrar no camada de atração por causa de sua maior mobilidade. Consequentemente, após o período de depleção inicial, os EVs hidrodinamicamente pequenos serão superrepresentados no substrato em comparação com sua contribuição para a população de EV na amostra líquida. Observe que um tamanho hidrodinâmico menor não aponta automaticamente para EVs com tamanhos menores de vesículas devido à heterogeneidade na espessura da camada coronal3. A representação tendenciosa é evitada com incubações longas que empobrecem toda a população de EVs no líquido por sua imobilização no substrato. Quando um usuário visa imobilizar todos os EVs do biofluide, para evitar a cobertura excessivamente densa da superfície com as vesículas imobilizadas, pode ser necessário reduzir a concentração de EV no líquido abaixo da faixa sugerida no protocolo.
Deformação de EVs no substrato
Vesículas extracelulares em seu estado nativo hidratado e após a dessecação podem ser caracterizadas pelo AFM, conforme descrito no protocolo. As forças eletrostáticas24 que imobilizam na superfície de mica também distorcem sua forma da geometria globular em que existem na solução. O impacto da dessecação sobre o tamanho e a morfologia dos EVS imobilizados pode ser analisado por varredura a mesma área de superfície antes e depois que a amostra é permitida para secar.
É instrutivo examinar o impacto da preparação da amostra na forma dos EVs dessecados. Os EVs eletrostaticamente imobilizados mantêm a geometria altamente Oblada após a secagem, mas são ainda mais achatado pela dessecação. A altura acima da superfície das vesículas dessecadas torna-se menor do que na Figura 12A, enquanto sua área de pegada aumenta (dados não mostrados). Por outro lado, quando as vesículas são depositadas passivamente durante a evaporação líquida e sem imobilização prévia na superfície, elas tendem a atingir uma geometria em forma de xícara sobre a dessecação, como há muito observado nas imagens de SEM e, mais recentemente, no AFM Exames. Esta forma mãos colocadas é reconhecida agora como um artefato25 da preparação da amostra causado pela não-uniformidade em forças capilares durante a dessecação de superfície, como explicado mecanìstica em Figura 141.
Análise e interpretação de imagens de dados AFM
As respostas às forças eletrostáticas e capilares agindo para distorcer a forma de EVs fornecem informações valiosas sobre as propriedades estruturais e composicional dos EVs. Por exemplo, um conjunto multidimensional de características biofísicas, como o tamanho e a forma deformados extraídos dos dados do AFM, foram recentemente utilizados para demonstrar a viabilidade de diferenciar entre os exosomas secretados por diferentes células hospedeiras5. As distorções também podem ser tidas em conta e compensadas. Por exemplo, mostramos como utilizar os dados do AFM para caracterizar o tamanho globular das vesículas na solução, estimando-se os diâmetros das esferas que encapsulam o mesmo volume que as exosopmes imobilizadas3.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores reconhecem o apoio financeiro da National Science Foundation (número de prêmio IGERT-0903715), da Universidade de Utah (departamento de engenharia química Seed Grant e do prêmio de bolsa de estudos de pós-graduação), e Skolkovo Institute of Science e tecnologia (Skoltech Fellowship).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM/STM Controller | Bruker | Multimode Nanoscope V | This AFM controller supports imaging of biological samples in liquid and air. |
| AFM/STM metal specimen discs (10 mm) | TedPella | 16207 | Metal specimen disc on which a mica disk is attached by a double-sided tape or other means. |
| AFM/STM Mica discs (10 mm) | TedPella | 50 | Highest quality grade V1 mica, 0.21mm (0.0085”) thick. Interleaved, in packages of 10. Can be mounted on AFM/STM discs. Available in four diameters |
| AFM probe for imaging in the air | Bruker | TESP-V2 | High quality etched silicon probes for tapping mode and non-contact mode for scanning in the air. |
| AFM probe for soft sample imaging in liquid | Bruker | MLCT | Soft silicon nitride cantilevers with silicon nitride tips, which are well-suited for liquid operation. The range in force constants enables users to image extremely soft samples in contact mode as well as high load vs distance spectroscopy. |
| Double sided tape | Spectrum | 360-77705 | Used to fix the mica disk on the metal specimen disc. |
| ExoQuick-TC | System Biosciences | EXOTC50A-1 | ExoQuick-TC is a proprietary polymer-based kit designed for exosome isolation from tissue culture media. |
| Glass probe AFM holder for imaging in liquid | Bruker | MTFML-V2 | This glass probe holder is designed for scanning in fluid with the MultiMode AFM. The holder can be used in peak force tapping mode, contact mode, tapping mode, and force modulation. The probe is acoustically driven by a separate piezo oscillator for larger amplitude modulation. The holder is supplied with two ports, required fittings, and accessories kit for adding and removing fluids. |
| Gwyddion | Czech Metrology Institute. | Version 2.52 | Open Source software for visualization and analysis of data fields obtained by scanning probe microscopy techniques. |
| Lint-free blotting paper | GE Healthcare Whatman | Grade GB003 Blotting Paper | Use this blotting paper to remove NiCl2 after the modification of the mica's substrate. |
| Lint-free cleanroom wipes | Texwipe | AlphaWipe TX1004 | Use these polyester wipes for surface cleaning. |
| Nickel(II) chloride (NiCl2) | Sigma-Aldrich | 339350 | Powder used to make 10 mM NiCl2 in DI water |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | Gibco | 10010023 | PBS, pH 7.4 |
References
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