Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Изображение внеклеточных пузырьков с помощью атомной микроскопии силы

Published: September 11, 2019 doi: 10.3791/59254
Automatic Translation
1,2, 3,4
1Department of Chemical Engineering, University of Utah, 2The Nano Institute of Utah, University of Utah, 3Center for Photonics and Quantum Materials, Skolkovo Institute of Science and Technology, 4Biopharmaceutical Cluster 'Northern', Moscow Institute of Physics and Technology

Summary

Пошаговая процедура описывается для безэтикетки иммобилизации экзосом и внеклеточных пузырьков из жидких образцов и их визуализации с помощью атомной силовой микроскопии (AFM). Изображения AFM используются для оценки размера пузырьков в растворе и характеризуют другие биофизические свойства.

Abstract

Экзосомы и другие внеклеточные пузырьки (EVs) представляют собой молекулярные комплексы, состоящие из липидной мембраны везикулы, ее поверхностного украшения мембранными белками и другими молекулами, а также разнообразное содержание светила, унаследованного от родительской клетки, которая включает РНК, белков и ДНЯ. Характеристика гидродинамических размеров ЭВ, которая зависит от размера везикулы и его коронарного слоя, образованного поверхностными украшениями, стала рутинной. Для экзосомы, самой маленькой из ЭВ, относительная разница между размерами гидродинамических и пузырьков значительна. Характеристика размеров пузырьков криогенной передачей электронной микроскопии (крио-TEM) изображения, золотой стандарт техники, остается проблемой из-за стоимости инструмента, опыт, необходимый для выполнения подготовки образца, изображений и анализа данных, и небольшое количество частиц часто наблюдается в изображениях. Широко доступной и доступной альтернативой является атомная микроскопия силы (AFM), которая может производить универсальные данные о трехмерной геометрии, размерах и других биофизических свойствах внеклеточных пузырьков. Разработанный протокол направляет пользователей в использовании этого аналитического инструмента и излагает рабочий процесс для анализа EVs AFM, который включает в себя подготовку образца для визуализации EVs в гидратированной или высохлой форме, электростатическая иммобилизация пузырьки на субстрате, сбор данных, его анализ и интерпретация. Репрезентативные результаты показывают, что фиксация ЭВ на модифицированной поверхности слюды предсказуема, настраивается и позволяет пользователю получить результаты размеров для большого количества пузырьков. Было установлено, что размер везикула, основанный на данных AFM, согласуется с крио-TEM-изображением.

Introduction

Внеклеточные пузырьки (Эпикулы) присутствуют во всех жидкостях организма, включая кровь, мочу, слюну, молоко и амниотическую жидкость. Экзосомы образуют районный класс EVs, отличаемый от других ЭВ эндосомальным биогенезом, маркерами эндосомного пути и наименьшим размером среди всех ЭВ. Размер экзосом часто сообщается с существенной изменчивостью между исследованиями. Результаты размеров были признаны зависимыми от метода, что отражает разницу в физических принципах, используемых различными аналитическими методами для оценки размеров EV1,2. Например, анализ отслеживания наночастиц (NTA) - наиболее широко используемый метод характеристики размеров - оценивает размер Овв как их гидродинамические диаметры, которые характеризуют устойчивость к броуновской мобильности ЭВ в растворе. Больший гидродинамический диаметр везикулы подразумевает его низкую подвижность в жидкости. Корональный слой вокруг пузырьков, состоящий из поверхностных белков и других молекул, прикрепленных или адсорбированных на поверхность мембраны, существенно препятствует подвижности и увеличивает гидродинамический размер ЭВ. В относительном выражении это увеличение особенно велико для экзосом3,как показано на рисунке 1.

Криогенная электронная микроскопия передачи (крио-TEM) изображение является окончательным методом в характеристике везикул размеров и морфологии в их гидратированных состояний. Тем не менее, высокая стоимость приборов и специализированные знания, необходимые для его правильного использования мотивировать изучение альтернативных методов, которые могут изображения гидратированных EVs. Еще одним заметным недостатком этой техники является относительно небольшое количество ЭВ, наблюдаемых или охарактеризованных в приобретенных крио-TEM-изображениях.

Атомная микроскопия силы (AFM) визуализирует трехмерную топографию гидратированных или высохших ЭВ4,5,6 путем сканирования зонда по субстрату, чтобы провести изображение частиц на поверхности. Основные шаги протокола для характеристики EVs aFM изложены в этом исследовании. Перед визуализацией пузырьков в жидкости, они должны быть обездвижены на субстрате либо привязывая к функционализированной поверхности, захватвая в фильтр, или электростатического притяжения7. Электростатическая фиксация на положительно заряженном субстрате является особенно удобным вариантом для иммобилизации экзосом, которые, как известно, обладают отрицательным потенциалом зеты. Однако те же электростатические силы, которые обездвиживают внеклеточные пузырьки на поверхности, также искажают их форму, что делает анализ данных после визуализации необходимым. Мы разрабатываем этот момент, описывая алгоритм, который оценивает размер шаровых пузырьков в решении на основе данных AFM о искаженной форме экзосомы, обездвиженных на поверхности.

В разработанном протоколе представлена процедура надежной электростатической иммобилизации пузырьков, за которой следуют шаги, необходимые для выполнения изображений атомной силы в гидратированных или высохлых состояниях. Выявлены факторы, влияющие на концентрацию обездвиженные пузырьки. Дано руководство о том, как выполнить электростатическую иммобилизацию образцов с различной концентрацией ЭВ в растворе. Обсуждается выбор экспериментальных условий, позволяющих оценить эмпирические вероятности распределения различных биофизических свойств на основе достаточно большого количества обездвиженных пузырьков. Приведены примеры пост-изображения данных AFM. В частности, описан алгоритм определения размера пузырьков в решении на основе характеристики AFM обездвиженых ЭВ. Репрезентативные результаты показывают последовательность размеров везикула aFM с результатами крио-TEM-изображения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Изоляция ЭВ от биожидкости

  1. Изолировать EVs одним из установленных методов, таких как дифференциальная ультрацентрифугация8, осадки, или размер исключения хроматографии9.
  2. Подтвердите наличие ожидаемых поверхностных и светящихся биомаркеров и отсутствие биомаркеров, указывающих на перекрестное загрязнение препарата. Подтвердите морфологию липидного двухслойного морфологии изолированных частиц с помощью электронной микроскопии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При изоляции экзосом, распределение гидродинамических размеров измеряется анализом отслеживания наночастиц (NTA) или динамическим рассеянием света должно быть в ожидаемом диапазоне. Детали EV и экзосомной изоляции выходят за рамки данного протокола. Выбранный метод будет зависеть от экспериментальных вопросов и цели исследования10. Следующие шаги обеспечивают конкретную иллюстрацию процедуры обогащения экзосом путем осадков от среды роста MCF-7 раковых клеток молочной железы с использованием коммерчески доступного комплекта осадков (Таблица материалов).
  3. Перед расширением клеточной культуры храните mcF-7 раковые клетки молочной железы в жидком азоте. Оттепель клетки для субкультуры.
  4. Следуя асептической практике, выполните клеточное покрытие на 150-мм пластинах. Используйте среду роста,состоящую из минимальной незаменимой среды Орла, 0,01 мг/мл человеческого рекомбинантного инсулина и 10% безэкзосомного сыворотки крупного рогатого скота.
  5. Аэратировать культуру на 95% воздуха и 5% CO2 и инкубировать при 37 с.
  6. После того как клетки установлены (приблизительно 24 h после plating), измените средства. Разделите пластину на 1:10 соотношение и культуры десять пластин, каждая из которых содержит 20 мл средств массовой информации.
  7. Урожай и бассейн средств массовой информации из 9 из этих пластин (180 мл) на 70и80% слияния, когда клетки все еще находятся в фазе роста.
  8. Разделите носители на 60 мл и 120 мл, далее разделите на 30 мл/трубку и центрифугия на 3000 х г в течение 15 мин.
  9. Перенесите супернатант из каждой трубки в новую стерильную трубку 50 мл и выполните экзосомную изоляцию.
  10. Изолировать экзосомы осадков в соответствии с опубликованными протоколами (см., например, ссылка11) или следуйте инструкциямпроизводителя,если используется коммерческий комплект изоляции(Таблица материалов). В качестве первого шага в последнем случае, центрифуга клеточной среды на 3000 х г в течение 15 мин. Снять супернатант и отбросить клетки и мусор клеток.
  11. Добавьте раствор осадков (коэффициент 1:5 объема) в супернатант, перемешайте и поставьте в холодильник на ночь.
  12. Центрифуга при температуре 1500 х г в течение 30 мин при комнатной температуре. Откажитесь от супернатанта после центрифугации.
  13. Спин оставшиеся экзосомы гранулы еще 5 мин на 1500 х г. Не нарушая гранулы, удалить оставшиеся раствор осадки аспирации.
  14. Отстегивайте гранулы в буфере 100и500 л 1x фосфатно-буферного солимного раствора (PBS) и разделите на несколько аликвот по мере необходимости для анализа вниз по течению.
  15. Немедленно приступаем к поверхности иммобилизации изолированных экзосом для визуализации AFM. При необходимости заморозьте аликвоты при -80 с для последующегоиспользования, принимая меры предосторожности, чтобы избежать повреждения образца во время цикла замораживания-оттепели.

2. Поверхностная фиксация внеклеточных пузырьков

  1. Используйте сильную двусторонню ленту, эпоксидную или альтернативную клею, чтобы прочно прикрепить диск слюды к aFM/сканированию туннельного микроскопа (STM) магнитного диска из нержавеющей стали.
  2. Cleave mica диск с помощью резкой бритвой или утилита нож, или путем присоединения клейкой лентой на верхней поверхности, а затем pealing его, чтобы удалить слой материала.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Любой метод должен выявить девственную поверхность, удалив тонкий слой слюды, ранее подвергаемый воздействию окружающей среды. После процедуры присоединение слюды к металлическому диску AFM/STM должно оставаться твердым.
  3. При комнатной температуре обработайте верхнюю поверхность слюды на 10 сраствором NiCl 2, который изменяет поверхностный заряд от отрицательного к положительному.
  4. Blot NiCl2 раствор с без ворса протрите или промотирования бумаги. Вымойте поверхность слюды 3x с деионизированной (DI) воды и высушить его с потоком сухого азота.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это хорошая практика для сканирования измененной поверхности с AFM, чтобы подтвердить, что она свободна от загрязняющих веществ.
  5. Поместите диск образца AFM с прикрепленной поверхностно-модифицированной слюдой в чашку Петри.
  6. Разбавить экзосомный образец со ступени 1.14 с 1x PBS, чтобы получить концентрацию между 4,0 х 109 и 4,0 х 1010 10 частиц на мл раствора. Проверка концентрации разбавленных частиц с помощью NTA.
  7. Сформируйте сессиль капли на поверхности слюды, опорожнение 100 злител разбавленного экзосомного раствора от пипетки.
  8. Поместите крышку на чашку Петри и запечатать его парафинаю пленкой, чтобы уменьшить испарение образца. Инкубировать образец для 12и18 ч при 4 С.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Плотность поверхности обездвиженых экзосом будет увеличиваться с помощью инкубационного времени и концентрации ЭВ в жидкости. Более длительное время инкубации может быть необходимо, если экзосомы присутствуют в образце при более низких концентрациях.
  9. После инкубации, аспир80и90% образца, не нарушая поверхность. В этот момент экзосомы будут электростатически обездвижены на субстрате слюды.
  10. Перед визуализацией гидратированных ЭВ, промыть поверхность 1x PBS. Повторите 3x. Позаботьтесь о том, чтобы увлажнить образец на протяжении всего процесса промывки.
  11. После мытья поверхности слюды с 1x PBS, удалить 80%и90% жидкости, и пипетка 40 л свежих 1x PBS для покрытия образца.
  12. При визуализации высохших ЭВ, промойте субстрат с di воды. Повторите 3x.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Промывка с di воды предотвратит образование кристаллов соли и осаждение solutes на поверхности по мере того как субстрат высыхает.
  13. Перед визуализацией высохнет ЕВ, аспирируй как можно больше жидкости, не касаясь поверхности, и высушите остальное потоком сухого азота.

3. Изображение AFM

  1. Для изображения высохшие EVs, выберите кантилевер, предназначенный для сканирования в воздухе в режиме нажав и бесконтактных режимов изображения и смонтировать его на держатель зонда.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Характеристики примера кантилевера, перечисленные в таблице материалов (123 мкм длина, 40 мкм ширина, радиус кончика 7 нм и 37 Н/м пружинной константы) могут быть использованы в качестве руководства при выборе зонда, совместимого с имеющимися приборами AFM.
    1. Поместите подготовку со ступени 2.13 на этапе AFM. Магнитный диск образца из нержавеющей стали обездвижит образец на сцене. Дайте время для подготовки и этапу уравновесить термически.
    2. Используйте режим касания для сканирования достаточно большойплощадиповерхности слюды. Например, выберите область 5 х 5 мкм, разбитую в 512 линиях со скоростью сканирования 1 Гц. Приобрести как высоту, так и фазовые изображения, поскольку они обеспечивают дополнительную информацию о топографии и поверхностных свойствах образца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время сканирования будет увеличиваться с изображением области и количество строк, выбранных для формирования изображения, но уменьшается с скоростью сканирования определяется как количество линий, отсканированных в секунду. Скорость быстрого сканирования может повлиять на качество изображения. Таким образом, скорость rastering должны в судебном порядке сбалансировать компромисс между временем приобретения и качество изображения.
  2. Для изображения гидратированных пузырьков выберите кантилевер, подходящий для сканирования мягких, увлажненным образцов, и установите кантилевер на держатель зонда, предназначенный для сканирования в жидкостях.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При выборе зонда, совместимого с имеющимися приборами AFM, спецификации зонда, перечисленные в таблице материалов (треугольный кантилевер с номинальной длиной 175 мкм, шириной 22 мкм, радиусом кончика 20 нм, 0,07 Н/м весенним постоянным, и Оптимизированный для визуализации с частотой привода в диапазоне от 4 до 8 кГц) может быть использован в качестве руководства.
    1. Влажный кончик кантилевера с 1x PBS, чтобы уменьшить вероятность введения пузырьков воздуха в жидкость во время сканирования.
    2. Поместите подготовку со ступени 2.11 на этапе AFM. Магнитный диск образца из нержавеющей стали обездвижит прикрепленную слюду, содержащую обездвиженные ЭВ на его поверхности.
    3. Дайте время для подготовки и стадии AFM уравновесить термически.
    4. Изображение гидратированной поверхности слюды в режиме касания. Приобретите изображения высоты и фазы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Качество изображения зависит от приборов, выбранного зонда и параметров сканирования. При оптимизации условий сканирования в качестве отправной точки могут использоваться следующие варианты: область 5 х 5 мкм, отсканированная в 512 линиях с частотой сканирования 0,8-1,0 Гц и частотой привода от 4 до 8 кГц.

4. Анализ изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги обработки и анализа данных применяются к полученным изображениям высоты. Аналогичная процедура может быть адаптирована для анализа фазовых данных. Описание ниже специфично для Gwyddion12, бесплатное программное обеспечение с открытым исходным кодом, доступное под GNU General Public License. Аналогичные возможности доступны в альтернативных программных средствах.

  1. Перейдите к процессу данных, режимы SPM, Совет и выберите Совет модели (рисунок 2). Выберите геометрию и размеры наконечника, используемого для сканирования образца, и нажмите OK.
  2. Исправьте артефакты эрозии наконечника, выполняя реконструкцию поверхности. Откройте изображение. Из меню выберите процесс обработки данных, режимы SPM, Совет,затем выберите Surface Reconstruction и нажмите OK (рисунок 3).
  3. Выровнять плоскость изображения в соответствии с лабораторной плоскостью XY, удалив наклон в подставке из данных сканирования. Для выполнения этой задачи выберите процесс обработки данных, уровень и выберите уровень плоскости (рисунок 4).
  4. Выравнивайте строки изображения, выбирая процесс данных, корректируя данные, а затем выбирайте строки выравнивания. Доступно несколько вариантов выравнивания(рисунок 5). Например, Median — это алгоритм, который находит среднюю высоту каждой линии сканирования и вычитает ее из данных.
  5. Перейдите к процессу данных, исправьте данные и выберите Удалить шрамы (рисунок 6),который удаляет распространенные ошибки сканирования, известные как шрамы.
  6. Выровняйте поверхность слюды на нулевой высоте, No 0, выбрав Flatten Base в меню выпадения уровня, доступном из процесса данных (рисунок 7).
  7. Определите EVs на отсканированной поверхности с помощью Отметки Порога в меню выпадения зерна (рисунок 8A). Этот алгоритм определяет поверхностно-иммобилизованные экзосомы как частицы, выступающие из субстрата нулевой поверхности высотой над выбранным пользователем порогом. Выберите порог в диапазоне от 1 до 3 нм, что устранит большую часть фоновых помех. Меньшие пороги используются с более чистым фоном.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Порог на рисунке 8A составляет 1,767 нм. Результат идентификации экзосомного MCF-7 с этим пороговым значением показан на рисунке 8B. Gwyddion предлагает несколько альтернатив пороговому порогу в качестве алгоритма автоматического определения пузырьков на изображении, включая автоматическое пороговое значение (метод Otsu), обнаружение краев и алгоритм водораздела.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Агломераты частиц, если они присутствуют на изображении AFM, могут быть замаскированы и исключены из анализа.
  8. Выполните геометрические и размерные характеристики идентифицированных EVs с помощью доступных алгоритмов распределения, доступных из меню Grains.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Gwyddion предоставляет инструменты для оценки распределения кальярно-ценных, ареальных, объемных и других свойств обездвиженных ЭВ в гидратированном или бессилином состоянии. Пример свойства скалар-значений показан на рисунке 9, который дает распределение максимальных высот в пределах следа каждой идентифицированной экзосомы.
  9. Экспорт данных AFM из Gwyddion для специализированного анализа с помощью других вычислительных инструментов и пользовательских компьютерных программ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Поверхностная фиксация ЭВ является критическим шагом в последовательности изображений. Электростатическая иммобилизация экзосом, которые, как известно, обладают отрицательным потенциалом зеты, будет надежно происходить после того, как субстрат слюды будет модифицирован, чтобы иметь положительный поверхностный заряд. Без лечения с NiCl2, чтобы придать положительные изменения поверхности, иммобилизация EVs на субстрате было признано неэффективным. Высота изображения на рисунке 10A, приобретенные в воздухе после MCF-7 экзосомный образец, содержащий 2,59 х10 10 пузырьков на мл PBS был инкубирован в течение 12 ч на неизмененной поверхности свежерасщепляющейся слюды, показывает очень мало пузырьков, оставшихся на поверхность после того, как она была очищена с DI воды. Пузырьки, видимые на рисунке 10A, являются, скорее всего, результатом неполного аспирации воды DI, которая повторно пузырьков не крепится к поверхности, а затем смещает их на субстрат, как она испаряется.

После изменения поверхностного заряда с хлоридом никеля, желательно, чтобы подтвердить, что поверхность остается свободной от загрязняющих веществ после лечения. Изображение высоты на рисунке 10B (получено в воздухе) дает пример чистой поверхности после того, как она была обработана NiCl2, а затем промывают три раза с DI воды. Шероховатость катионно-производной поверхности была ниже 0,3 нм, что соответствует предыдущему отчету13.

Драматическое положительное влияние изменения поверхностного заряда на эффективность фиксации экзосом MCF-7 иллюстрируется рисунком 10C,D. Эти две панели показывают высоту сканирования, приобретенные в воздухе после образца, ранее изображены на рисунке 10A, был инкубирован на 24 ч и 12 ч, соответственно, на поверхности, обработанной хлоридом никеля.

Время инкубации данного образца на обработанной поверхности определяет концентрацию поверхности (пузырьки на область) обездвиженного ЭВ. Изображение высоты на рисунке 10C иллюстрирует случай чрезмерно плотного покрытия поверхности иммобилизованными пузырьками, полученными после того, как описанный образец экзосомного MCF-7 был инкубирован на 24 ч. Ряд алгоритмов полагаются на наличие достаточного незанятого субстрата между зернами для выполнения коррекции изображения и анализа данных. Например, выравнивание и перемещение субстрата на нулевую плоскость, коррекция линий и оценка объема зерен нуждаются в промежуточной плоской поверхности для выполнения точных вычислений. Когда концентрация обездвиженых пузырьков так высока, как на рисунке 10C,эти алгоритмы не будут функционировать надежно. Пример адекватной концентрации пузырьков, обездвиженных из того же образца MCF-7, показан на изображении высоты на рисунке 10D,которое было получено после более короткого (12 ч) инкубации.
 
Постобработка приобретенных необработанных данных AFM необходима для исправления распространенных ошибок сканирования. Следующее описание характерно для Gwyddion. Аналогичная функциональность доступна и в других инструментах анализа данных AFM/SPM.

В Gwyddion функция уровня плоскости используется для коррекции наклона в подставке. Такая фоновая коррекция осуществляется путем сначала поиска плоскости субстрата, используя все точки данных на изображении, а затем вычитая его из необработанных данных. Коррекция вдоль линий сканирования выполняется функцией выравнивания строк. Например, один из реализованных алгоритмов выполняет выравнивание, вычисляя среднюю высоту каждой линии сканирования, а затем вычитая результат из соответствующего ряда данных изображения. Вклад локальных сбоев в цикл обратной связи можно удалить, применяя функцию Удаления шрамов, которая заполняет пробелы в выровненных данных и устраняет шрамы, сравнивая данные в смежных линиях сканирования. Смещение субстрата на высоту 0 евро может быть осуществлено путем сочетания граней и полиномального выравнивания поверхности после маскировки зерен и других особенностей. Инструмент Flatten Base Gwyddion выполняет эту задачу автономно или с помощью указанной пользователем маски. После описанной коррекции фона и линии электростатически закрепленные пузырьки могут быть идентифицированы на субстрате, выражая функцию Mark Grains.

На рисунке 11A и рисунке 11B показаны высоты и фазы изображения гидратированных экзосом MCF-7, обездвиженного на поверхности слюды и приобретенных в PBS с помощью режима касания. В общей сложности 561 гидратированных пузырьков были выявлены в отсканированной области с помощью алгоритма Порога функции Mark Grains с пороговым значением, установленным на 20%. Фазовый лаг реакции зонда на частоте привода чувствителен к локализованным вариациям жесткости в мягких образцах. Последовательность между высотой и фазами изображения, видели на рисунке 11A,B, поэтому, является важным подтверждением того, что изображенные зерна, действительно, мягкие пузырьки обездвижены на субстрате.
 
На рисунке 11C показано поперечное сечение изображения высоты через экзосомы, расположенные на белой линии на рисунке 11A. В то время как экзосомы в биожидкости имеют шаровую геометрию1,14,15,16, их форма на субстрате сильно искажена электростатическим притяжением к положительно заряженному Поверхности. Обивка блиноподобной геометрии электростатически обездвиженных пузырьков дополнительно иллюстрируется на рисунке 11D изображением высоты крупным планом (и его сечением) экзосомы, упакованной на рисунке 11A. Соответствующее изображение фазы отображается на рисунке 11E. Функция эмпирической плотности вероятности (pdf) пиковых высот над поверхностью для всех 561 гидратированных пузырьков, определенных в сканировании AFM, показана на рисунке 12A. Среднее значение для этого распределения составляет 7,9 нм, что примерно в два раза превышает толщину фосфолипидного двуслойного17 при отсутствии деформирующих сил.
 
Область на субстрате, занятая обездвиженной экзосомой, была приближена к кругу с диаметром, равным среднему расстоянию от «центра массы везикулы» до его границы на поверхности слюды. Распределение этих диаметров проекции показано на рисунке 12A и имеет среднее среднее, равное 69,6 нм. Полученная высота и распределение диаметра еще больше количественно количественно значительное влияние электростатического иммобилизации поверхности на искаженную форму обездвиженных экзосом.
 
Надежность и повторяемость протокольных процедур были подтверждены путем повторного анализа той же выборки MCF-7 три раза, от подготовки образца до визуализации, при этом каждый повторный результат ы статистически похож на те, которые показаны на рисунке 12.

Деформация обездвиженных пузырьков, вызванных электростатическими силами, может быть компенсирована или интерпретирована, чтобы дать представление о свойствах изображенных ЭВ. Например, данные AFM могут использоваться для оценки шарикового размера пузырьков в растворе. В качестве отправной точки мы можем рассчитать объем, инкапсулированный мембранными оболочками обездвижемых пузырьков. Объем обнаруживается путем интеграции разницы между уровнем поверхности идентифицированных пузырьков и высотой субстрата под ними. Уровень субстрата под пузырьками не доступен напрямую, но может быть оценен путем Лапласа или альтернативной интерполяции точек данных для незанятых субстратов, окружающих пузырьки. В Gwyddion такой расчет объема выполняется с использованием функции распределения различных характеристик зерна. Результат, экспортированный из Gwyddion, затем может быть отображен в диаметры объемных эквивалентных сфер.

Применение описанного алгоритма к данным AFM для 561 проанализированных гидратированных пузырьков MCF-7 привело к распределению диаметров объемно-эквивалентных сфер, показанных на рисунке 12B. Это распределение оценивает размер мембранных пузырьков в их врожденной шаровой форме в биожидкости перед их электростатической фиксацией на поверхности слюды. Размер везикул, полученный в результате анализа данных AFM, был сопоставлен с результатами крио-TEM-изображения той же выборки и был признан в тесном согласии3 (рисунок 12B). Сравнение гидродинамических диаметров, измеренных NTA с полученными размерами везикулы(рисунок 1) показывает, что мобильность экзосом гораздо меньше, чем можно было бы ожидать от размера их пузырьков, определенных из AFM и крио-TEM Измерения. Разница между размерами гидродинамических и везикуловых размеров характеризует толщину коронального слоя, окружающего экзосомальные пузырьки.

Figure 1
Рисунок 1: Сравнение гидродинамических и геометрических диаметров ЭВ. Геометрический размер экзосомального везикля значительно меньше, чем его гидродинамический размер, определяемый от его диффузии в жидкости. Разница заключается в корональном слое, образованном мембранно-конъюгированными и адсорбированными молекулами, которые препятствуют подвижности Экв. Эта цифра изменяется из ссылки3 и перепечатывается с разрешения.

Figure 2
Рисунок 2: Свойства зонда AFM. Геометрия и размеры зонда AFM могут быть определены с помощью функции Model Tip. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Коррекция артефакта изображения, вызванная свертыванием образца наконечника. Выполняя Surface Reconstruction,приобретенные данные AFM могут быть исправлены для артефактов наконечников.  Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Коррекция для наклона в подставке. Уровень плоскости определяет плоскость субстрата и вычитает его из данных AFM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: Исправление несоответствий в строках сканирования. Обычный алгоритм выравнивания данных сканирования заключается в том, чтобы найти среднюю высоту вдоль каждой линии сканирования и вычесть результат из соответствующего ряда точек данных на изображении. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 6
Рисунок 6: Коррекция пробелов в согласованных данных. Общие ошибки сканирования, известные как шрамы, могут быть удалены из данных AFM, применяя функцию Удалить шрамы.  Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 7
Рисунок 7: Выравнивание субстрата на нулевой высоте. Вариант Flatten Base в меню Level позволяет пользователю разместить поверхность субстрата на базовом уровне, соответствующем нулевой высоте.  Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 8
Рисунок 8: Идентификация обездвиженых пузырьков на отсканированной поверхности. (A) Поверхностно-иммобилизованные экзосомы идентифицируются как зерна, выступающие над субстратом по выбранному пользователем порогу высоты, указанному в Марке Порогом. (B) Результат идентификации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 9
Рисунок 9: Анализ данных AFM. Распределение максимальных высот над субстратом в пределах площади, занимаемой идентифицированными экзосомами, показано как составленное инструментом распределения зерна.  Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 10
Рисунок 10: Воздействие поверхностной модификации и концентрация EV плотности поверхности обездвижемых пузырьков. (A) AFM высота изображение свежерасщепляется слюды субстрат после 12 ч инкубации с MCF-7 экзосомный образец с последующим очисткой с DI воды и сушки. Иммобилизация ЭВ из жидкости в субстрат неэффективна, не придавая положительного заряда поверхности слюды. Немногие частицы, замеченные на сканировании, вероятно, являются результатом неполного удаления образца MCF-7 до высыхать субстрата. (B) Сканирование высоты поверхности слюды в воздухе после обработки хлоридом никеля показывает субстрат, свободный от загрязнений. Панели(C)и (D) показывают AFM сканирование высоты, полученные после изменения заряда поверхности и инкубации с той же образца MCF-7, как в панели (A) для 24 ч и 12 ч, соответственно. Концентрация на поверхности обездвиженых пузырьков чрезмерно плотная после 24 ч инкубации. Инкубация 12 ч приводит к меньшему количеству экзосом, обездвижемых на поверхности, и данным сканирования, которые легче анализировать точно.  Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 11
Рисунок 11: AFM изображения гидратированных экзосом MCF-7 электростатически обездвижены на модифицированной поверхности слюды. (A) Изображение высоты. (B) Соответствующее изображение фазы AFM подтверждает, что зерна в изображении высоты являются мягкими наночастицами, как и следовало ожидать для мембранных пузырьков. (C) Данные высоты для трех пузырьков, пересекаемых линией, показанной в панели (A) иллюстрируют уплощенную форму, вызванную электростатическим притяжением экзосом к положительно заряженной поверхности модифицированной слюды. (D) Искажение формы проявляется в увеличенном представлении обездвиженных везикулвв в коробке в панели(A) и его поперечном сечении. Фазовое изображение того же везикля показано в (E). Эта цифра изменяется из ссылки3 и перепечатывается с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 12
Рисунок 12: Размерная характеристика гидратированных пузырьков, обездвиженные на поверхности, и оценка их шарового размера в растворе. (A) Распределение пиковых высот над поверхностью (красная кривая) имеет среднее, равное 7,9 нм. Площадь, занимаемая обездвижеными экзосомами, имеет средний диаметр 69,6 нм (синяя кривая). (B) Изображение высоты AFM для одной из обездвиженых экзосом иллюстрирует его высоко тупую форму, вызванную электростатическими силами. Шаровый размер экзосомальных пузырьков в растворе можно оценить по сопоставлению объемов, оговоренных поверхностными и сферическими мембранными оболочками. (C) Распределение размера шаровых пузырьков в растворе (красная кривая) было определено на данных AFM 561 обездвиженные пузырьки. Размеры везикулы в крио-TEM изображения (синяя кривая) согласуются с результатами AFM. Эта цифра изменяется из ссылки3 и перепечатывается с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 13
Рисунок 13: Артефакты концентрации поверхности и сегрегации размеров при пассивном осаждении ЭВ от испарения жидкости. (A) Сканирование электронной микроскопии (SEM) изображение показывает, что концентрация поверхности экзосомы пассивно откладывается из сушки жидкости пространственно переменной, когда поверхностная иммобилизация от приостановки биожидкости не выполняется. (B) Пассивное осаждение EVs из сушки образца вызывает сегрегацию размера пузырьков. Существенная изменчивость размера количественно определяется функциями плотности вероятности (pdf) для пузырьков в различных областях на изображении(A), определяемых белыми диагональю. Эта цифра изменяется из ссылки1 и перепечатывается с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 14
Рисунок 14: Чашка-образная геометрия высохлых пузырьков, пассивно отложенных на поверхности во время жидкого испарения. Поверхностное высыхание пузырьков, которые не были обездвижены электростатическими силами, как известно, приводит к чашке формы внешний вид часто наблюдается в SEM изображения ЭВ. Эта цифра изменяется из ссылки1 и перепечатывается с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Иммобилизация ЭВ из биологической жидкости, сканирование поверхности и анализ изображений являются основными шагами разработанного протокола для характеристики AFM ВВ в жидкости. Количество пузырьков поддается весы изображения AFM с изображением области поверхности и концентрации поверхности пузырьков обездвижены на субстрате. Учитывая отрицательный потенциал zeta EVs и экзосомы18, мы выступаем за электростатическую фиксацию EVs из жидких образцов к субстрату AFM. Иммобилизация эффективна, когда поверхность положительно заряжена. До иммобилизации EV, положительный заряд поверхности, возможно, должны быть переданы в субстрат, как и в случае слюды и слоистых силикатных минералов с общей формулой KAl2(AlSi3O10)(OH)2. Поверхность свежерасщеленной слюды близка к идеально плоской, что идеально подходит для визуализации наночастиц AFM, но ее поверхностный заряд отрицательный и, таким образом, должен быть изменен. Протокол описывает процедуру привить положительное изменение поверхности субстрату AFM. Репрезентативные результаты показывают заметное улучшение фиксации EV от биожидкости к модифицированному субстрату слюды.
 
При визуализации гидратированных пузырьков важно свести к минимуму испарение образцов, которое вызывает артефакты осаждения поверхности и конвективные потоки и увеличивает со временем жидкую концентрацию пузырьков, что приводит к более высокой концентрации поверхности обездвижение EVs, чем ожидалось, особенно во время длительных инкубаций. Держатели зонда, явно предназначенные для жидких образцов, устраняют или замедляют испарение и должны использоваться для изображения гидратированных ЭВ. Неспецифические привязки к сканирующего зонду уменьшаются в присутствии ионных видов. Поэтому при визуализации гидратированных ЭВ предпочтительнее покрывать субстрат буферизированной средой, такой как PBS, а не водой DI.

Важность поверхностной иммобилизации
Последовательная и предсказуемая иммобилизация ЭВ на модифицированном субстрате устраняет основной источник изменчивости результатов AFM. Все шаги вниз по течению, от сканирования до анализа данных, легче контролировать сяочку с помощью выбора приборов, зондов, параметров сканирования, последовательности анализа данных и алгоритмов. Пользователь должен быть осведомлен о изменчивости биологических образцов и протоколов изоляции EV, которые являются важными вопросами, выходящими за рамки этой работы.

Мы рекомендуем проводить поверхностную иммобилизацию EV на поверхности модифицированной слюды из жидких образцов, даже если цель юристена высохшие пузырьки в воздухе – необходимость менее очевидна, так как пузырьки неизбежно откладываются на любом субстрате как жидкость испаряется. В самом деле, результаты AFM для высыхания EV, полученные без изменения поверхностных зарядов слюды, что является необходимым шагом для электростатической иммобилизации ЭВ из жидкости, были зарегистрированы в последние19,20,21 . Когда EVs не фиксируются на поверхности из жидкого образца, однако, их пассивное осаждение путем испарения будет производить артефакты коллективно известный как эффект кофейного кольца22. Два таких артефакта, происходящие в виде сушки жидкости отступает, иллюстрируются на изображении SEM (Рисунок 13A) экзосом сыворотки, отложенных путем испарения на отрицательно заряженной поверхности стекла. Сразу же проявляются значительные изменения в концентрации поверхностных пузырьков. Второй артефакт, количественный на рисунке 13B,является значительная изменчивость размеров везикулв в различных областях по периметру высушенного образца. Учитывая эти артефакты, характеристика AFM пассивно отложенных пузырьков из сушки жидкости может привести к предвзятым или непоследовательным результатам, если вся площадь поверхности, первоначально занятая ныне высушенным жидким образцом, не будет отсканирована.

При визуализации высохших образцов, полученных без твердой иммобилизации пузырьков на субстрате, следует учитывать две дополнительные проблемы. Напомним, что наш протокол предписывает пользователям тщательно мыть поверхность с помощью воды DI после того, как пузырьки обездвижены из жидкого образца. Этот шаг призван предотвратить ионные и другие невезикулярные растворы от формирования поверхностных отложений во время испарения сложных биожидкости со значительной осмолярной. Если EVs не являются фиксированными, тщательное мытье будет отделить большое количество пузырьков от поверхности, потенциально смещения результатов и оставив слишком мало частиц для анализа. Другой распространенной трудностью, уменьшенной путем иммобилизации ЭВ на модифицированной поверхности слюды перед изображением AFM, является прижавание частиц к зонду23 и вводящие в заблуждение артефакты, вызванные этим явлением.
 
Контроль плотности поверхности обездвижемых ЭВ
Два легко контролируемых фактора, указанные в протоколе, позволяют пользователю настроить концентрацию поверхности обездвиженных ЭВ на модифицированном субстрате слюды: концентрация пузырьков в жидком образце и время инкубации образца субстрат. Высокая плотность обездвиженных пузырьков, достигнутая с более длительным временем инкубации и более высокой концентрацией ЭВ в жидкости, увеличивает количество пузырьков, анализируемых в ходе сканирования, и статистическую силу выводов, полученных в результате анализа AFM Данных. В то же время чрезмерно плотная концентрация поверхности, как в случае с рисунком 10C, где частицы плотно покрывают всю поверхность без промежуточных областей субстрата, усложняет анализ изображения и интерпретацию результатов и может привести к сканированию артефактов, вызванных взаимодействием между близко расположенными частицами.

Влияние электростатического скрининга и гидродинамической мобильности электромобилей
Прозрачный контроль над концентрацией поверхности обездвиженные ЭВ в качестве функции факторов, влияющих на него позволяет пользователю настроить экспериментальные условия для удовлетворения конкретных потребностей исследования. При выполнении настройки важно признать, что электростатическая иммобилизация поверхности является транспортным процессом, на который влияет ионная прочность биожидкости.

Концентрация ионных и положительно заряженных видов обратно влияет на длину Деби, над которой проверяются поверхностные и везикулные заряды. Помимо этой длины, электростатические силы ничтожны. Пограничный слой электростатического притяжения субстрата будет гораздо меньше в ионически богатых PBS, чем в воде DI. Это различие подразумевает, что после короткой инкубации, соответствующей времени, необходимому для истощения слоя жидкости, где ощущаются электростатические достопримечательности, плотность поверхности ЭВ, обездвиженного из подвески в воде DI, будет выше, чем от PBS подвеска, предполагая, что концентрация ЭВ в обеих жидкостях одинакова. Иными словами, больше пузырьков должны быть обездвижены, чтобы истощать более толстый слой притяжения в воде DI, чем в PBS в иных одинаковых условиях.

После того, как пузырьки истощаются из пограничного слоя, иммобилизация становится полностью ограниченным транспортным процессом. В этом режиме скорость осаждения не будет зависеть от приостановивщей среды (например, DI воды или PBS) до тех пор, пока вязкость является той же и транспорт полностью диффузии. Однако перенос пузырьков в пограничный слой притяжения не может быть полностью диффузивным. Например, если образец в сесилей капле на субстрате AFM частично испаряется во время инкубации, жидкость внутри капли будет подвергаться испарению, и транспортировка пузырьков к субстрату будет иметь и то, и другое: диффузный и конвективный вклад. Если испарение не будет должным образом контролироваться, вклад конвективного транспорта будет значительным, а темпы иммобилизации будут выше, чем ожидалось. Воздействие конвективного транспорта будет меняться с толщиной слоя притяжения, что само по себе зависит от ионного содержания жидкости. Кроме того, испарение усилит безимкул нуюм иммобилизацию на субстрате, концентрируя ЭВ в растворе. При более высоких концентрациях EV градиент концентрации между слоем притяжения и прилегающей жидкостью будет увеличиваться, создавая большую термодинамическую движущую силу для миграции пузырьков к субстрату.

Иммобилизованные пузырьки могут представлять собой жидкий образец с уклоном. В случае, когда скорость иммобилизации ограничена диффузией, пузырьки с меньшими гидродинамическими размерами, определяемые сочетанием размера везикулы и толщины окружающего его коронарного слоя(рисунок 1), с большей вероятностью входят в привлекательности слоя из-за их более высокой мобильности. Следовательно, после первоначального периода истощения гидродинамически малые ЭВ будут перепредставлены на субстрате по сравнению с их вкладом в популяцию ЕГэ в жидком образце. Обратите внимание, что меньший гидродинамический размер автоматически не указывает на ЭВ с меньшими размерами везикулы из-за неоднородности в толщине коронарного слоя3. Предвзятое представление избегается с длительными инкубациями, которые истощает все население EVs в жидкости путем его иммобилизации на субстрате. Когда пользователь стремится к обездвиживанию всех ЭВ из биожидкости, чтобы избежать чрезмерно плотного покрытия поверхности с обездвижеными пузырьками, может быть необходимо снизить концентрацию EV в жидкости ниже диапазона, предложенного в протоколе.

Деформация ЭВ на субстрате
Внеклеточные пузырьки в родном гидратированном состоянии и после высыхания могут быть охарактеризованы AFM, как описано в протоколе. Электростатические силы24, которые обездвиживают ЭВ на поверхности слюды, также искажают их форму от шаровой геометрии, в которой они существуют в растворе. Влияние высыхания на размер и морфологию обездвиженных ЭВ может быть проанализировано путем повторного сканирования той же площади поверхности до и после того, как образец может высохнуть.

Поучительно изучить влияние подготовки образца на форму высыхаенных ЭВ. Электростатически обездвиженные ЭВ поддерживают геометрию высокой высыхания, но еще больше сгладываются высыханием. Высота над поверхностью высыхаенных пузырьков становится меньше, чем на рисунке 12A,в то время как площадь их следа увеличивается (данные не показаны). С другой стороны, когда пузырьки откладываются пассивно во время жидкого испарения и без предварительной иммобилизации на поверхности, они, как правило, достигают геометрии чашки формы при высыхании, как это уже давно наблюдается на изображениях SEM и, в последнее время, в AFM Сканирование. Это cupped форма в настоящее время признается в качестве артефакта подготовки образца25 вызвано неравномерность в капиллярных сил во время высыхания поверхности, как механически объяснил на рисунке 141.
 
Анализ изображений и интерпретация данных AFM
Реакции на электростатические и капиллярные силы, действующие для искажения формы ЭВ, дают ценную информацию о структурных и композиционных свойствах ЭВ. Например, многомерный набор биофизических характеристик, таких как деформированный размер и форма, извлеченные из данных AFM, недавно были использованы для демонстрации возможности различать экзосомы, выделяемые различными клетками-хозяинами5. Искажения также могут быть приняты во внимание и компенсированы. Например, мы показали, как использовать данные AFM для характеристики шарового размера пузырьков в растворе, оценивая диаметры сфер, которые инкапсулируют тот же объем, что и обездвиженые экзозосмесы3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Авторы признают финансовую поддержку со стороны Национального научного фонда (номер премии IGERT-0903715), Университета штата и технологии (стипендий Сколтеха).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AFM/STM Controller  Bruker Multimode Nanoscope V This AFM controller supports imaging of biological samples in liquid and air. 
AFM/STM metal specimen discs (10 mm) TedPella 16207 Metal specimen disc on which a mica disk is attached by a double-sided tape or other means.
AFM/STM Mica discs (10 mm) TedPella 50 Highest quality grade V1 mica, 0.21mm (0.0085”) thick. Interleaved, in packages of 10. Can be mounted on AFM/STM discs. Available in four diameters
AFM probe for imaging in the air Bruker TESP-V2 High quality etched silicon probes for tapping mode and non-contact mode for scanning in the air.
AFM probe for soft sample imaging in liquid Bruker MLCT Soft silicon nitride cantilevers with silicon nitride tips, which are well-suited for liquid operation.  The range in force constants enables users to image extremely soft samples in contact mode as well as high load vs distance spectroscopy.
Double sided tape Spectrum 360-77705 Used to fix the mica disk on the metal specimen disc.
ExoQuick-TC System Biosciences EXOTC50A-1 ExoQuick-TC is a proprietary polymer-based kit designed for exosome isolation from tissue culture media. 
Glass probe AFM holder for imaging in liquid Bruker  MTFML-V2 This glass probe holder is designed for scanning in fluid with the MultiMode AFM.  The holder can be used in peak force tapping mode, contact mode, tapping mode, and force modulation.  The probe is acoustically driven by a separate piezo oscillator for larger amplitude modulation.  The holder is supplied with two ports, required fittings, and accessories kit for adding and removing fluids.
Gwyddion Czech Metrology Institute. Version 2.52 Open Source software for visualization and analysis of data fields obtained by scanning probe microscopy techniques.
Lint-free blotting paper GE Healthcare Whatman  Grade GB003 Blotting Paper Use this blotting paper to remove NiCl2 after the modification of the mica's substrate.  
Lint-free cleanroom wipes Texwipe AlphaWipe TX1004 Use these polyester wipes for surface cleaning. 
Nickel(II) chloride (NiCl2) Sigma-Aldrich 339350 Powder used to make 10 mM NiCl2 in DI water
Phosphate Buffered Saline (1x) Gibco 10010023 PBS, pH 7.4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chernyshev, V. S., et al. Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407, 3285-3301 (2015).
  2. Ramirez, M. I., et al. Technical challenges of working with extracellular vesicles. Nanoscale. 10, 881-906 (2018).
  3. Skliar, M., et al. Membrane proteins significantly restrict exosome mobility. Biochemical and Biophysical Research Communications. 501, 1055-1059 (2018).
  4. Parisse, P., et al. Atomic force microscopy analysis of extracellular vesicles. European Biophysics Journal. 46, 813-820 (2017).
  5. Ito, K., et al. Host Cell Prediction of Exosomes Using Morphological Features on Solid Surfaces Analyzed by Machine Learning. Journal of Physical Chemistry B. 122, 6224-6235 (2018).
  6. Sharma, S., LeClaire, M., Gimzewski, J. K. Ascent of atomic force microscopy as a nanoanalytical tool for exosomes and other extracellular vesicles. Nanotechnology. 29, 132001 (2018).
  7. Meyer, R. L. Immobilisation of living bacteria for AFM imaging under physiological conditions. Ultramicroscopy. 110, 1349-1357 (2010).
  8. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A., et al. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current protocols in cell biology. Chapter 3 (Unit 3.22), (2006).
  9. Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling. Methods in Molecular Biology. 728, 235-246 (2011).
  10. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1535750 (2019).
  11. Weng, Y., et al. Effective isolation of exosomes with polyethylene glycol from cell culture supernatant for in-depth proteome profiling. The Analyst. 141, 4640-4646 (2016).
  12. Nečas, D., Klapetek, P. Gwyddion: an open-source software for SPM data analysis. Open Physics. 10, 181-188 (2012).
  13. Hsueh, C., Chen, H., Gimzewski, J. K., Reed, J., Abdel-Fattah, T. M. Localized nanoscopic surface measurements of nickel-modified Mica for single-molecule DNA sequence sampling. ACS Applied Materials and Interfaces. 2, 3249-3256 (2010).
  14. Conde-Vancells, J., et al. Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes. Journal of Proteome Research. 7, 5157-5166 (2008).
  15. Zhou, Y., et al. Exosomes released by human umbilical cord mesenchymal stem cells protect against cisplatin-induced renal oxidative stress and apoptosis in vivo and in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 4, 34 (2013).
  16. Coleman, B. M., Hanssen, E., Lawson, V. A., Hill, A. F. Prion-infected cells regulate the release of exosomes with distinct ultrastructural features. FASEB Journal. 26, 4160-4173 (2012).
  17. Briegel, A., et al. Universal architecture of bacterial chemoreceptor arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 17181-17186 (2009).
  18. Akagi, T., et al. On-Chip Immunoelectrophoresis of Extracellular Vesicles Released from Human Breast Cancer Cells. PLOS ONE. 10, e0123603 (2015).
  19. Sharma, S., et al. Structural-mechanical characterization of nanoparticle exosomes in human saliva, using correlative AFM, FESEM, and force spectroscopy. ACS Nano. 4, 1921-1926 (2010).
  20. Radeghieri, A., et al. Cultured human amniocytes express hTERT, which is distributed between nucleus and cytoplasm and is secreted in extracellular vesicles. Biochemical and Biophysical Research Communications. 483, 706-711 (2017).
  21. Woo, J., Sharma, S., Gimzewski, J. The Role of Isolation Methods on a Nanoscale Surface Structure and Its Effect on the Size of Exosomes. Journal of Circulating Biomarkers. 5, 11 (2016).
  22. Deegan, R. D., et al. Capillary flow as the cause of ring stains from dried liquid drops. Nature. 389, 827-829 (1997).
  23. Johnson, C. A., Lenhoff, A. M. Adsorption of Charged Latex Particles on Mica Studied by Atomic Force Microscopy. Journal of Colloid and Interface Science. 179, 587-599 (1996).
  24. Pastré, D., et al. Adsorption of DNA to Mica Mediated by Divalent Counterions: A Theoretical and Experimental Study. Biophysical Journal. 85, 2507-2518 (2003).
  25. van der Pol, E., Böing, A. N., Harrison, P., Sturk, A., Nieuwland, R. Classification, functions, and clinical relevance of extracellular vesicles. Pharmacological Reviews. 64, 676-705 (2012).

Tags

Биохимия выпуск 151 атомная силовая микроскопия экзосомы и внеклеточные пузырьки поверхностная иммобилизация размерная характеристика морфологическая характеристика биофизическая характеристика размер мембранных пузырьков гидратированных и высохшие образцы анализ изображений
Изображение внеклеточных пузырьков с помощью атомной микроскопии силы
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Skliar, M., Chernyshev, V. S.… More

Skliar, M., Chernyshev, V. S. Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (151), e59254, doi:10.3791/59254 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter