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Biochemistry

Imagen de vesículas extracelulares mediante microscopía de fuerza atómica

Published: September 11, 2019 doi: 10.3791/59254
Automatic Translation
1,2, 3,4
1Department of Chemical Engineering, University of Utah, 2The Nano Institute of Utah, University of Utah, 3Center for Photonics and Quantum Materials, Skolkovo Institute of Science and Technology, 4Biopharmaceutical Cluster 'Northern', Moscow Institute of Physics and Technology

Summary

Se describe un procedimiento paso a paso para la inmovilización sin etiquetas de exosomas y vesículas extracelulares a partir de muestras líquidas y sus imágenes mediante microscopía de fuerza atómica (AFM). Las imágenes AFM se utilizan para estimar el tamaño de las vesículas en la solución y caracterizar otras propiedades biofísicas.

Abstract

Los exosomas y otras vesículas extracelulares (EV) son complejos moleculares que consisten en una vesícula de membrana lipídica, su decoración superficial por proteínas de membrana y otras moléculas, y diverso contenido luminal heredado de una célula madre, que incluye ARN, proteínas y los ANN. La caracterización de los tamaños hidrodinámicos de los vehículos eléctricos, que depende del tamaño de la vesícula y su capa coronal formada por decoraciones superficiales, se ha convertido en rutina. Para los exosomas, el más pequeño de los vehículos eléctricos, la diferencia relativa entre los tamaños hidrodinámico y vesícula es significativa. La caracterización de los tamaños de las vesículas mediante la imagen de microscopía electrónica de transmisión criogénica (crio-TEM), una técnica estándar de oro, sigue siendo un desafío debido al costo del instrumento, la experiencia necesaria para realizar la preparación de la muestra, la toma de imágenes y análisis de datos, y un pequeño número de partículas a menudo observadas en las imágenes. Una alternativa ampliamente disponible y accesible es la microscopía de fuerza atómica (AFM), que puede producir datos versátiles sobre geometría tridimensional, tamaño y otras propiedades biofísicas de las vesículas extracelulares. El protocolo desarrollado guía a los usuarios en la utilización de esta herramienta analítica y describe el flujo de trabajo para el análisis de vehículos eléctricos por el AFM, que incluye la preparación de muestras para la toma de imágenes de vehículos eléctricos en forma hidratada o desecada, la inmovilización electrostática de vesículas en un sustrato, adquisición de datos, su análisis e interpretación. Los resultados representativos demuestran que la fijación de los vehículos eléctricos en la superficie de mica modificada es predecible, personalizable y permite al usuario obtener resultados de tamaño para un gran número de vesículas. Se encontró que el tamaño de la vesícula basada en los datos de AFM era consistente con las imágenes crio-TEM.

Introduction

Las vesículas extracelulares (EV) están presentes en todos los fluidos corporales, incluyendo sangre, orina, saliva, leche y el líquido amniótico. Los exosomas forman una clase de distrito de vehículos eléctricos diferenciados de otros vehículos eléctricos por biogénesis endosomal, los marcadores de la vía endosomal y el tamaño más pequeño entre todos los vehículos eléctricos. El tamaño de los exosomas a menudo se notifica con una variabilidad sustancial entre los estudios. Se encontró que los resultados del tamaño dependían del método, lo que refleja la diferencia en los principios físicos empleados por diferentes técnicas analíticas para estimar los tamaños de EV1,2. Por ejemplo, el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA, por sus que la técnica de caracterización de tamaño más utilizada- estima el tamaño de los vehículos eléctricos como sus diámetros hidrodinámicos, que caracterizan la resistencia a la movilidad Browniana de los vehículos eléctricos en la solución. Un mayor diámetro hidrodinámico de una vesícula implica su menor movilidad en líquido. La capa coronal alrededor de las vesículas, que consiste en proteínas superficiales y otras moléculas ancladas o adsorbidas a la superficie de la membrana, impide sustancialmente la movilidad y aumenta el tamaño hidrodinámico de los vehículos eléctricos. En términos relativos, este aumento es particularmente grande para los exosomas3, como se ilustra en la Figura 1.

La microscopía electrónica de transmisión criogénica (crio-TEM) es una técnica definitiva para caracterizar tamaños de vesículas y morfología en sus estados hidratados. Sin embargo, el alto costo de la instrumentación y la experiencia especializada necesaria para utilizarla motivan correctamente la exploración de técnicas alternativas que pueden crear imágenes de vehículos eléctricos hidratados. Un número relativamente pequeño de vehículos eléctricos observados o caracterizados en las imágenes crio-TEM adquiridas es otra desventaja notable de esta técnica.

La microscopía de fuerza atómica (AFM) visualiza la topografía tridimensional de los vehículos eléctricos hidratados o desecados4,5,6 mediante el escaneo de una sonda a través del sustrato para rasterar la imagen de las partículas en la superficie. En este estudio se describen los pasos esenciales del protocolo para caracterizar los vehículos eléctricos de AFM. Antes de tomar imágenes de las vesículas en líquido, deben ser inmovilizadas sobre un sustrato, ya sea amarre a una superficie funcionalizada, atrapando en un filtro, o por atracción electrostática7. La fijación electrostática en un sustrato cargado positivamente es una opción particularmente conveniente para la inmovilización de exosomas conocidos por tener un potencial zeta negativo. Sin embargo, las mismas fuerzas electrostáticas que inmovilizan las vesículas extracelulares en la superficie también distorsionan su forma, lo que hace que el análisis de datos post-imágenes sea esencial. Elaboramos este punto describiendo el algoritmo que estima el tamaño de las vesículas globulares en la solución basada en los datos de AFM sobre la forma distorsionada de los exosomas inmovilizados en la superficie.

En el protocolo desarrollado, se presenta el procedimiento para la robusta inmovilización electrostática de vesículas y seguido de los pasos necesarios para realizar imágenes de fuerza atómica en los estados hidratados o desecados. Se identifican los factores que influyen en la concentración superficial de las vesículas inmovilizadas. La guía se da sobre cómo realizar la inmovilización electrostática para muestras con diferentes concentraciones de vehículos eléctricos en la solución. Se discute la selección de condiciones experimentales que permiten la estimación de distribuciones de probabilidad empírica de diferentes propiedades biofísicas basadas en un número suficientemente grande de vesículas inmovilizadas. Se proporcionan ejemplos de análisis post-imagen de los datos de AFM. Específicamente, se describe un algoritmo para determinar el tamaño de las vesículas en la solución basada en la caracterización AFM de los vehículos eléctricos inmovilizados. Los resultados representativos muestran la consistencia del tamaño de la vesícula por AFM con los resultados de la imagen crio-TEM.

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Protocol

1. Aislamiento de los vehículos eléctricos de un biofluido

  1. Aísle los vehículos eléctricos mediante uno de los métodos establecidos, como la ultracentrifugación diferencial8, la precipitación o la cromatografía de exclusión de tamaño9.
  2. Confirmar la presencia de biomarcadores superficiales y luminales esperados y la ausencia de biomarcadores que indiquen la contaminación cruzada del preparado. Confirmar la morfología bicapa lipídica de las partículas aisladas mediante microscopía electrónica.
    NOTA: Al aislar los exosomas, la distribución del tamaño hidrodinámico medida por el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) o la dispersión dinámica de la luz debe estar en el rango esperado. Los detalles del EV y el aislamiento exososa están fuera del alcance de este protocolo. El método seleccionado dependerá de las preguntas experimentales y del objetivo del estudio10. Los siguientes pasos proporcionan una ilustración concreta del procedimiento para enriquecer los exosomas por precipitación desde el medio de crecimiento de las células de cáncer de mama MCF-7 utilizando un kit de precipitación disponible comercialmente(Tabla de materiales).
  3. Antes de la expansión del cultivo celular, almacene las células de cáncer de mama MCF-7 en nitrógeno líquido. Descongelar las células de la subcultura.
  4. Siguiendo prácticas asépticas, realice el revestimiento celular en placas de 150 mm. Utilice el medio de crecimiento compuesto por el medio esencial mínimo deláguila,0,01 mg/ml de insulina recombinante humana y suero bovino fetal 10% libre de exosomas.
  5. Airear el cultivo en un 95% de aire y 5% de CO2 e incubar a 37oC.
  6. Después de que las celdas se aplanen (aproximadamente 24 h después del revestimiento), cambie el medio. Divida la placa en proporción 1:10 y el cultivo diez placas, cada una con 20 ml de medios.
  7. Medios de cosecha y piscina de 9 de estas placas (180 ml) a un 70oun 80 % de confluencia cuando las células aún están en fase de crecimiento.
  8. Divida el medio en 60 ml y 120 ml, se divida aún más en 30 ml/tubo y centrífuga a 3.000 x g durante 15 min.
  9. Transfiera el sobrenadante de cada tubo a un nuevo tubo estéril de 50 ml y realice el aislamiento exosoma.
  10. Aísle los exosomas por precipitación de acuerdo con los protocolos publicados (véase, por ejemplo, la referencia11)o siga las instruccionesdelfabricante si se utiliza un kit de aislamiento comercial(Tabla de materiales). Como primer paso en este último caso, el medio celular centrífugo a 3.000 x g durante 15 minutos.
  11. Agregue la solución de precipitación (relación de volumen 1:5) al sobrenadante, mezcle y refrigere durante la noche.
  12. Centrífuga a 1.500 x g durante 30 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante después de la centrifugación.
  13. Gire el pellet de exosoma restante durante otros 5 min a 1.500 x g. Sin perturbar el pellet, eliminar la solución de precipitación restante por aspiración.
  14. Resuspenda el pellet en 100a500 ml de 1 tampón de solución salina con fosfato (PBS) y divídalo en múltiples alícuotas según sea necesario para el análisis posterior.
  15. Proceder inmediatamente a la inmovilización superficial de los exosomas aislados para la toma de imágenes AFM. Si es necesario, congele las alícuotas a -80oCpara su uso posterior mientras toma precauciones para evitar daños a la muestra durante el ciclo de congelación-descongelación.

2. Fijación superficial de vesículas extracelulares

  1. Utilice cinta fuerte de doble cara, epoxi o un adhesivo alternativo para conectar firmemente un disco de mica a un disco de muestra de acero inoxidable magnético (STM) de un microscopio de túnel AFM/escaneo.
  2. Corte el disco de mica con una maquinilla de afeitar afilada o un cuchillo utilitario, o colocando una cinta adhesiva en la superficie superior y luego pealing hacia fuera para eliminar una capa de material.
    NOTA: Cualquier método debe revelar una superficie virgen eliminando una capa delgada de mica previamente expuesta al entorno. Después del procedimiento, la unión de mica al disco de muestra de metal AFM/STM debe permanecer firme.
  3. A temperatura ambiente, tratar la superficie superior de la mica durante 10 s con 100 s de solución de 10 mM NiCl2, que modifica la carga de la superficie de negativa a positiva.
  4. Blot NiCl2 solución con una toallita o papel hinchado sin pelusas. Lavar la superficie de mica 3x con agua desionizada (DI) y secarla con una corriente de nitrógeno seco.
    NOTA: Es una buena práctica escanear la superficie modificada con AFM para confirmar que está libre de contaminantes.
  5. Coloque el disco de muestra AFM con la mica modificada en superficie conectada en una placa de petri.
  6. Diluir la muestra de exosomas del paso 1.14 con 1x PBS para obtener una concentración entre 4,0 x 109 y 4,0 x 1010 partículas por ml de solución. Valide la concentración de partículas diluidas utilizando NTA.
  7. Forme una gota sésil en la superficie de la mica vaciando 100 sl de la solución de exososoma diluido de una pipeta.
  8. Coloque la tapa en la placa de petri y séllela con una película de parafina para reducir la evaporación de la muestra. Incubar la muestra durante 12x18 h a 4oC.
    NOTA: La densidad superficial de los exosomas inmovilizados aumentará con el tiempo de incubación y la concentración de vehículos eléctricos en el líquido. Puede ser necesario un tiempo de incubación más largo si hay exosomas presentes en la muestra a concentraciones más bajas.
  9. Después de la incubación, aspirar 80a90% de la muestra sin perturbar la superficie. En este punto, los exosomas serán electrostáticamente inmovilizados en el sustrato de mica.
  10. Antes de tomar imágenes de vehículos eléctricos hidratados, enjuague la superficie con 1 PBS. Repita 3x. Tenga cuidado de mantener la muestra hidratada durante todo el proceso de acuñación.
  11. Después de lavar la superficie de la mica con 1pbS, retire 80%a90% de líquido, y pipeta de 40 ol de PBS fresco 1x para cubrir la muestra.
  12. Cuando tome imágenes de los vehículos eléctricos desecados, enjuague el sustrato con agua DI. Repita 3x.
    NOTA: El enrredado con agua DI evitará la formación de cristales de sal y la deposición de solutos en la superficie a medida que el sustrato se seca.
  13. Antes de tomar imágenes desecados los vehículos eléctricos, aspirar tanto líquido como sea posible sin tocar la superficie y secar el resto con una corriente de nitrógeno seco.

3. Imágenes AFM

  1. Para crear una imagen de los vehículos eléctricos desecados, seleccione un voladizo diseñado para escanear en el aire en los modos de toma de imágenes de roscado y sin contacto y móntelo en el soporte de la sonda.
    NOTA: Las características de un voladizo de ejemplo enumeradas en la Tabla de materiales (123 m de longitud, 40 m de ancho, radio de punta de 7 nm y constante de resorte de 37 N/m) se pueden utilizar como guía al seleccionar una sonda compatible con la instrumentación AFM disponible.
    1. Coloque la preparación del paso 2.13 en la etapa AFM. El disco magnético de la muestra de acero inoxidable inmovilizará la muestra en el escenario. Deje tiempo para la preparación y la etapa para equilibrar térmicamente.
    2. Utilice el modo de roscado para escanear un área suficientemente grande de la superficiedela mica. Por ejemplo, elija un área de 5 x 5 m, rasterizada en 512 líneas a una velocidad de escaneo de 1 Hz. Adquiera las imágenes de altura y fase, ya que proporcionan información complementaria sobre la topografía y las propiedades de superficie de la muestra.
      NOTA: El tiempo de escaneo aumentará con el área de imagen y el número de líneas seleccionadas para formar la imagen, pero disminuirá con la velocidad de escaneo definida como el número de líneas escaneadas por segundo. Las velocidades de escaneo rápido pueden afectar la calidad de la imagen. Por lo tanto, la velocidad de la rastering debe equilibrar judicialmente el equilibrio entre el tiempo de adquisición y la calidad de la imagen.
  2. Para obtener imágenes de vesículas hidratadas, seleccione un voladizo adecuado para escanear muestras blandas e hidratadas y monte el voladizo en un soporte de sonda diseñado para escanear en líquidos.
    NOTA: Al seleccionar una sonda compatible con la instrumentación AFM disponible, las especificaciones de la sonda enumeradas en la Tabla de Materiales (voladizo triangular con longitud nominal de 175 m, ancho de 22 m, radio de punta de 20 nm, constante de resorte de 0,07 N/m y optimizado para imágenes con la frecuencia de accionamiento en el rango entre 4 y 8 kHz) puede utilizarse como guía.
    1. Humedezca la punta del voladizo con 1pbS para reducir la probabilidad de introducir burbujas de aire en el líquido durante el escaneo.
    2. Coloque la preparación del paso 2.11 en la etapa AFM. El disco magnético de la muestra de acero inoxidable inmovilizará la mica conectada que contiene vehículos eléctricos inmovilizados en su superficie.
    3. Deje tiempo para la preparación y la etapa AFM para equilibrar térmicamente.
    4. Imagen de la superficie de mica hidratada en el modo de roscado. Adquiere las imágenes de altura y fase.
      NOTA: La calidad de la imagen se ve influenciada por la instrumentación, la sonda seleccionada y los parámetros de escaneado. Al optimizar las condiciones de escaneado, se pueden utilizar las siguientes opciones como punto de partida: 5 x 5 ám de área escaneada en 512 líneas con velocidad de escaneo de 0,8 a 1,0 Hz y frecuencia de accionamiento entre 4 y 8 kHz.

4. Análisis de imágenes

NOTA: Los siguientes pasos de procesamiento y análisis de datos se aplican a las imágenes de altura adquiridas. Un procedimiento similar puede adaptarse para analizar los datos de fase. La descripción a continuación es específica de Gwyddion12,un software libre y de código abierto disponible bajo GNU General Public License. Capacidades similares están disponibles en herramientas de software alternativas.

  1. Vaya a Procesode datos , Modos SPM, Consejo y elija Consejo del modelo (Figura 2). Seleccione la geometría y las dimensiones de la punta utilizada para escanear la muestra y haga clic en Aceptar.
  2. Corrija los artefactos de erosión de la punta realizando la reconstrucción de la superficie. Abra la imagen. En el menú, seleccione Procesosde datos , Modos SPM, Consejoy, a continuación, elija Reconstrucción de superficie y haga clic en Aceptar (figura 3).
  3. Alinee el plano de imagen para que coincida con el plano XY de laboratorio eliminando la inclinación en el sustrato de los datos de escaneado. Para realizar esta tarea, seleccione Proceso de datos, Nivel y elija Nivel de plano (figura 4).
  4. Alinee las filas de la imagen seleccionando Proceso de datos, Corregir datos y, a continuación, elija Alinear filas. Hay varias opciones de alineación disponibles (Figura 5). Por ejemplo, Mediana es un algoritmo que encuentra una altura media de cada línea de exploración y la resta de los datos.
  5. Vaya a Procesode datos , Corregir datos y elija Eliminar cicatrices (Figura 6), que elimina los errores de análisis comunes conocidos como cicatrices.
  6. Alinee la superficie de mica a la altura cero, Z a 0, seleccionando Aplanar base en el menú desplegable Nivel accesible desde Proceso de datos (Figura 7).
  7. Identifique los vehículos eléctricos en la superficie escaneada mediante el menú desplegable Marcar por umbral en granos (figura 8A). Este algoritmo identifica los exosomas inmovilizados en superficie como partículas que sobresalen del sustrato de superficie cero por la altura por encima del umbral seleccionado por el usuario. Seleccione un umbral en el rango entre 1 y 3 nm, lo que eliminará la mayor parte de la interferencia de fondo. Los umbrales más pequeños se utilizan con un fondo más limpio.
    NOTA: El umbral en la Figura 8A es 1.767 nm. El resultado de la identificación de exosomas MCF-7 con este umbral se muestra en la Figura 8B. Gwyddion ofrece varias alternativas al umbral como algoritmo para identificar automáticamente las vesículas en la imagen, incluido el umbral automatizado (método de Otsu), la detección de bordes y el algoritmo de cuenca hidrográfica.
    NOTA: Los aglomerados de partículas, si están presentes en la imagen AFM, pueden enmascararse y excluirse del análisis.
  8. Realice la caracterización geométrica y dimensional de los vehículos eléctricos identificados utilizando los algoritmos distributorios disponibles accesibles desde el menú Granos.
    NOTA: Gwyddion proporciona herramientas para evaluar la distribución de las propiedades escalares, areales, volumétricas y otras propiedades de los vehículos eléctricos inmovilizados en estado hidratado o dessilado. Un ejemplo de una propiedad de valores escalares se muestra en la Figura 9, que proporciona la distribución de alturas máximas dentro de la huella de cada exosoma identificado.
  9. Exporte los datos AFM de Gwyddion para su análisis especializado por otras herramientas computacionales y programas informáticos personalizados.

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Representative Results

La fijación superficial de los vehículos eléctricos es un paso crítico en la secuencia de imágenes. La inmovilización electrostática de la superficie de los exosomas, que se sabe que tiene un potencial zeta negativo, se producirá de forma robusta después de que el sustrato de la mica se modifique para tener una carga superficial positiva. Sin el tratamiento con NiCl2 para impartir cambios positivos en la superficie, se encontró que la inmovilización de los vehículos eléctricos en el sustrato era ineficaz. La imagen de altura en la Figura 10A, adquirida en el aire después de que la muestra de exosomas MCF-7 que contiene 2,59 x 1010 vesículas por mL de PBS fue incubada durante 12 horas en una superficie no modificada de mica recién laminada, muestra muy pocas vesículas restantes en el superficie después de limpiarse con agua DI. Las vesículas visibles en la Figura 10A son, muy probablemente, el resultado de la aspiración incompleta de agua DI, que resuspendió las vesículas no fijadas a la superficie y luego las depuso en el sustrato a medida que se evaporaba.

Después de modificar la carga superficial con cloruro de níquel, es aconsejable confirmar que la superficie permanece libre de contaminantes después del tratamiento. La imagen de altura en la Figura 10B (obtenida en el aire) da un ejemplo de una superficie limpia después de que fue tratada con NiCl2 y luego lavada tres veces con agua DI. La rugosidad de la superficie cationada fue inferior a 0,3 nm, lo que es coherente con el informe anterior13.

El dramático impacto positivo de la modificación de la carga superficial en la eficiencia de la fijación de los exosomas MCF-7 se ilustra en la Figura 10C,D. Estos dos paneles muestran los escaneos de altura adquiridos en el aire después de que la muestra, previamente imagenizada en la Figura 10A,fue incubada durante 24 h y 12 h, respectivamente, en la superficie tratada con cloruro de níquel.

El tiempo en que se incuba una muestra dada en la superficie tratada determina la concentración superficial (vesículas por área) de los vehículos eléctricos inmovilizados. La imagen de altura de la Figura 10C ilustra el caso de cobertura superficial excesivamente densa por las vesículas de inmovilización obtenidas después de la muestra de exosoma MCF-7 descrita fue incubada durante 24 horas. Varios algoritmos se basan en tener suficiente sustrato desocupado entre los granos para realizar la corrección de la imagen y el análisis de datos. Por ejemplo, la nivelación y el desplazamiento del sustrato al plano cero, la corrección de línea y la estimación del volumen de los granos necesitan la superficie plana que interviene para realizar cálculos precisos. Cuando la concentración de las vesículas inmovilizadas es tan alta como en la Figura 10C,estos algoritmos no funcionarán de forma fiable. Un ejemplo de una concentración superficial adecuada de vesículas inmovilizadas a partir de la misma muestra MCF-7 se muestra en la imagen de altura de la Figura 10D,que se obtuvo después de una incubación más corta (12 h).
 
El post-procesamiento de los datos AFM sin procesar adquiridos es necesario para corregir los errores de análisis comunes. La siguiente descripción es específica de Gwyddion. Funcionalidad similar está disponible en otras herramientas de análisis de datos AFM/SPM.

Dentro de Gwyddion, la función Deplano se utiliza para corregir una inclinación en el sustrato. Dicha corrección de fondo se logra primero encontrando el plano del sustrato utilizando todos los puntos de datos de la imagen y luego restándolo de los datos sin procesar. La corrección a lo largo de las líneas de escaneo se realiza mediante la función Alinear filas. Por ejemplo, uno de los algoritmos implementados realiza la alineación calculando la altura mediana de cada línea de exploración y, a continuación, restando el resultado de la fila correspondiente de datos de imagen. La contribución de las fallas locales en el bucle de retroalimentación se puede eliminar aplicando la función Eliminar cicatrices, que rellena los huecos en los datos alineados y elimina las cicatrices comparando los datos en las líneas de exploración adyacentes. El desplazamiento del sustrato a la elevación Z - 0 se puede lograr mediante una combinación de una faceta y nivelación polinómica de la superficie después de enmascarar granos y otras características. La herramienta Aplanar base de Gwyddion realiza esta tarea de forma autónoma o con una máscara especificada por el usuario. Después de las correcciones de fondo y línea descritas, las vesículas fijadas electrostáticamente se pueden identificar en el sustrato mediante la ejecución de la función Mark Grains.

La Figura 11A y la Figura 11B muestran imágenes de altura y fase de exosomas MCF-7 hidratados inmovilizados en una superficie de mica y adquiridos en PBS mediante el modo de roscado. Se identificaron un total de 561 vesículas hidratadas en el área escaneada utilizando el algoritmo Umbral de la función Mark Grains con el valor de umbral establecido en 20%. El desfase de la respuesta de la sonda en la frecuencia de la unidad es sensible a las variaciones de rigidez localizadas en muestras blandas. La consistencia entre las imágenes de altura y fase, vista en la Figura 11A,B,es, por lo tanto, una importante confirmación de que los granos de imagen son, de hecho, vesículas suaves inmovilizadas en el sustrato.
 
La Figura 11C muestra la sección transversal de la imagen de altura a través de exosomas situados en la línea blanca de la Figura 11A. Mientras que los exosomas en un biofluido tienen una geometría globular1,14,15,16, su forma en el sustrato está severamente distorsionada por la atracción electrostática a la carga positiva Superficie. La geometría oblata de las vesículas electrostáticamente inmovilizadas se ilustra en la Figura 11D por la imagen de altura de primer plano (y su sección transversal) de un exosoma en caja en la Figura 11A. La imagen de fase correspondiente se muestra en la Figura 11E. La función de densidad de probabilidad empírica (pdf) de las alturas máximas por encima de la superficie para las 561 vesículas hidratadas identificadas en la exploración AFM se muestra en la Figura 12A. El valor medio para esta distribución es de 7,9 nm, que es aproximadamente igual al doble del espesor de una bicapa de fosfolípidos17 en ausencia de fuerzas de deformación.
 
El área en el sustrato ocupada por un exosoma inmovilizado se aproxidó como un círculo con el diámetro igual a la distancia media desde el "centro de masa" de la vesícula hasta su límite en la superficie de la mica. La distribución de estos diámetros de proyección se muestra en la Figura 12A y tiene la media igual a 69,6 nm. La altura obtenida y las distribuciones de diámetro cuantifican aún más el impacto significativo de la inmovilización de la superficie electrostática en la forma distorsionada de los exosomas inmovilizados.
 
La robustez y repetibilidad de los procedimientos de protocolo se confirmó mediante el reanálisis de la misma muestra MCF-7 tres veces, desde la preparación de la muestra hasta la creación de imágenes, y cada repetición producía resultados estadísticamente similares a los mostrados en la Figura 12.

La deformación de las vesículas inmovilizadas causada por fuerzas electrostáticas puede ser compensada o interpretada para proporcionar una visión de las propiedades de los vehículos eléctricos con imágenes. Por ejemplo, los datos de AFM se pueden utilizar para estimar el tamaño globular de las vesículas de la solución. Como punto de partida, podemos calcular el volumen encapsulado por las envolventes de membrana de vesículas inmovilizadas. El volumen se encuentra integrando la diferencia entre el nivel de superficie de las vesículas identificadas y la elevación del sustrato debajo de ellas. El nivel de sustrato bajo las vesículas no es directamente accesible, pero se puede estimar mediante el Laplace o interpolación alternativa de puntos de datos para el sustrato desocupado que rodea las vesículas. Dentro de Gwyddion, dicho cálculo de volumen se realiza utilizando la función Distribución de varias características de grano. El resultado exportado desde Gwyddion se puede asignar a los diámetros de las esferas equivalentes al volumen.

La aplicación del algoritmo descrito a los datos AFM para 561 vesículas MCF-7 hidratadas analizadas produjo la distribución de los diámetros de las esferas equivalentes al volumen que se muestran en la Figura 12B. Esta distribución estima el tamaño de las vesículas de membrana en su forma globular innata en un biofluido antes de su fijación electrostática en la superficie de la mica. El tamaño de la vesícula obtenido del análisis de los datos de AFM se comparó con los resultados de la toma de imágenes crio-TEM de la misma muestra y se encontró que estaba en estrecho acuerdo3 (Figura 12B). La comparación de los diámetros hidrodinámicos medidos por la NTA con los tamaños de vesículas obtenidos(Figura 1) indica que la movilidad de los exosomas es mucho menor de lo que se esperaría del tamaño de sus vesículas determinado a partir del AFM y el crio-TEM Medidas. La diferencia entre los tamaños hidrodinámico y vesícula caracteriza el grosor de la capa coronal que rodea las vesículas exosomales.

Figure 1
Figura 1: Comparación de diámetros hidrodinámicos y geométricos de los vehículos eléctricos. El tamaño geométrico de la vesícula exosomal es sustancialmente menor que su tamaño hidrodinámico determinado a partir de su difusión en un líquido. La diferencia es la capa coronal formada por moléculas conjugadas por membrana y adsorbidas que impiden la movilidad de los vehículos eléctricos. Esta figura se modifica de la referencia3 y se vuelve a imprimir con permiso.

Figure 2
Figura 2: Propiedades de la sonda AFM. La geometría y las dimensiones de la sonda AFM se pueden especificar mediante la función Punta del modelo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Corrección del artefacto de imagen causado por la convolución de la muestra de punta. Al realizar la reconstrucciónde superficie , los datos de AFM adquiridos se pueden corregir para los artefactos de punta.  Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Corrección de una inclinación en el sustrato. Nivel de plano determina el plano del sustrato y lo resta de los datos AFM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Corrección de desalineaciones en filas de análisis. Un algoritmo convencional para alinear los datos de escaneado es encontrar una altura media a lo largo de cada línea de escaneo y resta el resultado de la fila correspondiente de puntos de datos en la imagen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Corrección de las brechas en los datos alineados. Los errores de análisis comunes, conocidos como cicatrices, se pueden eliminar de los datos de AFM aplicando la función Eliminar cicatrices.  Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Alineación de un sustrato a elevación cero. La opción Aplanar base en el menú Nivel permite al usuario colocar la superficie del sustrato en el nivel base correspondiente a la altura cero.  Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: Identificación de vesículas inmovilizadas en la superficie escaneada. (A) Los exosomas inmovilizados en superficie se identifican como granos que sobresalen por encima del sustrato por un umbral de altura seleccionado por el usuario especificado en Marcar por umbral. (B) El resultado de la identificación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 9
Figura 9: Análisis de los datos de AFM. La distribución de las alturas máximas por encima del sustrato dentro del área ocupada por los exosomas identificados se muestra como compilada por la herramienta Distribuciones de granos.  Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 10
Figura 10: Impacto de la modificación de la superficie y concentración de EV de la densidad superficial de las vesículas inmovilizadas. (A) La imagen de altura AFM del sustrato de mica recién lantilado después de 12 h de incubación con muestra de exosoma MCF-7 seguida de limpieza con agua DI y secado. La inmovilización de los vehículos eléctricos desde el líquido hasta el sustrato es ineficiente sin impartir una carga positiva a la superficie de la mica. Pocas partículas que se ven en la exploración son probablemente el resultado de la eliminación incompleta de la muestra MCF-7 antes de que el sustrato se secara. (B) La exploración de altura de la superficie de la mica en el aire después del tratamiento con cloruro de níquel muestra el sustrato libre de contaminaciones. Los paneles (C) y (D) muestran los escaneos de altura AFM obtenidos después de la modificación de la carga superficial y la incubación con la misma muestra MCF-7 que en el panel (A) para 24 h y 12 h, respectivamente. La concentración superficial de vesículas inmovilizadas es excesivamente densa después de 24 h de incubación. La incubación de 12 h conduce a menos exosomas inmovilizados en la superficie y los datos de escaneo que son más fáciles de analizar con precisión.  Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 11
Figura 11: Imágenes AFM de exosomas MCF-7 hidratados electrostáticamente inmovilizados en la superficie de mica modificada. (A) La imagen de altura. (B) La imagen de fase AFM correspondiente confirma que los granos en la imagen de altura son nanopartículas blandas, como debe esperarse para las vesículas de membrana. (C) Los datos de altura de las tres vesículas cruzadas por la línea mostrada en el panel (A) ilustran una forma aplanada causada por la atracción electrostática de exosomas a la superficie cargada positivamente de la mica modificada. ( D ) La distorsióndela forma es evidente en una vista ampliada de la vesícula inmovilizada en caja en el panel (A) y su sección transversal. La imagen de fase de la misma vesícula se muestra en (E). Esta figura se modifica de la referencia3 y se vuelve a imprimir con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 12
Figura 12: Caracterización dimensional de vesículas hidratadas inmovilizadas en la superficie y la estimación de su tamaño globular en la solución. (A) La distribución de las alturas máximas por encima de la superficie (curva roja) tiene la media igual a 7,9 nm. El área ocupada por exosomas inmovilizados tiene 69,6 nm de diámetro medio (curva azul). (B) La imagen de altura AFM para uno de los exosomas inmovilizados ilustra su forma altamente oblata causada por las fuerzas electrostáticas. El tamaño globular de las vesículas exosomales en la solución se puede estimar haciendo coincidir volúmenes encerrados por envolventes de membrana esféricas y inmovilizadas en superficie. (C) La distribución del tamaño de las vesículas globulares en la solución (curva roja) se determinó a partir de los datos de AFM de 561 vesículas inmovilizadas. Los tamaños de vesículas en imágenes crio-TEM (curva azul) son consistentes con los resultados de AFM. Esta figura se modifica de la referencia3 y se vuelve a imprimir con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 13
Figura 13: Artefactos de concentración de superficie y segregación de tamaño durante la deposición pasiva de vehículos eléctricos de líquido evaporante. (A) La imagen de microscopía electrónica de barrido (SEM) muestra que la concentración superficial de exosomas depositados pasivamente a partir de un líquido de secado es espacialmente variable cuando no se realiza la inmovilización superficial de un biofluido de suspensión. (B) La deposición pasiva de vehículos eléctricos de una muestra de secado provoca la segregación del tamaño de las vesículas. La variabilidad de tamaño sustancial se cuantifica mediante las funciones de densidad de probabilidad (pdf) para las vesículas en diferentes regiones de la imagen (A) definidas por líneas diagonales blancas. Esta figura se modifica de la referencia1 y se vuelve a imprimir con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 14
Figura 14: Geometría en forma de copa de vesículas desecadas depositadas pasivamente en la superficie durante la evaporación líquida. Se sabe que la desecación superficial de vesículas que no fueron inmovilizadas por fuerzas electrostáticas da lugar a una apariencia en forma de copa que se observa a menudo en imágenes SEM de vehículos eléctricos. Esta figura se modifica de la referencia1 y se vuelve a imprimir con permiso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

La inmovilización de los vehículos eléctricos de un fluido biológico, el escaneo de superficies y el análisis de imágenes son los pasos esenciales del protocolo desarrollado para la caracterización AFM de los vehículos eléctricos en líquido. El número de vesículas susceptibles a las escalas de imágenes AFM con el área de superficie de la imagen y la concentración superficial de las vesículas inmovilizadas en el sustrato. Dado un potencial zeta negativo de vehículos eléctricos y exosomas18,abogamos por la fijación electrostática de los vehículos eléctricos de muestras líquidas al sustrato de AFM. La inmovilización es efectiva cuando la superficie se carga positivamente. Antes de la inmovilización del EV, la carga superficial positiva puede necesitar ser impartida al sustrato, como en el caso de la mica - un mineral de silicato en capas con fórmula general KAl2(AlSi3O10)(OH)2. La superficie de la mica recién lanteada es casi plana, lo que es ideal para la toma de imágenes de nanopartículas por el AFM, pero su carga superficial es negativa y, por lo tanto, debe ser modificada. El protocolo describe el procedimiento para impartir un cambio positivo de superficie al sustrato de AFM. Los resultados representativos muestran una notable mejora en la fijación de EV de un biofluido al sustrato de mica modificado.
 
Cuando se imaginan vesículas hidratadas, es importante minimizar la evaporación de la muestra que causa los artefactos de deposición superficial y los flujos convectivos y aumenta la concentración líquida de las vesículas con el tiempo, lo que conduce a una mayor concentración superficial de vehículos eléctricos inmovilizados de lo esperado, especialmente durante incubaciones prolongadas. Los soportes de sonda diseñados explícitamente para muestras líquidas eliminan o ralentizan la evaporación y deben utilizarse para crear imágenes de vehículos eléctricos hidratados. Las fijaciones inespecíficas a la sonda de exploración se reducen en presencia de especies iónicas. Por lo tanto, cuando se toma imágenes de vehículos eléctricos hidratados, es preferible cubrir el sustrato con un medio tamponado, como PBS, en lugar de agua DI.

Importancia de la inmovilización superficial
La inmovilización consistente y predecible de los vehículos eléctricos en el sustrato modificado elimina la fuente primaria de variabilidad en los resultados de la AFM. Todos los pasos posteriores, desde el escaneo hasta el análisis de datos, se controlan más fácilmente mediante la selección de instrumentación, sondas, parámetros de escaneo y la secuencia de análisis de datos y algoritmos. El usuario debe ser consciente de la variabilidad ascendente en muestras biológicas y protocolos de aislamiento EV, que son cuestiones importantes fuera del alcance de este trabajo.

Recomendamos realizar la inmovilización superficial de EV en la superficie de la mica modificada a partir de muestras líquidas incluso cuando el objetivo es caracterizar las vesículas desecadas en el aire — la necesidad es menos evidente ya que las vesículas inevitablemente se depositarán en cualquier sustrato como el líquido se evapora. De hecho, los resultados de la FMA para el vehículo eléctrico desecado obtenido sin modificar las cargas superficiales de la mica, que es un paso previo para la inmovilización electrostática de los vehículos eléctricos de un líquido, se han notificado en los últimos19,20,21 . Sin embargo, cuando los vehículos eléctricos no se fijan a la superficie a partir de la muestra líquida, su deposición pasiva por evaporación producirá artefactos conocidos colectivamente como efecto de anillo de café22. Dos de estos artefactos, que ocurren como un líquido de secado retrocede, se ilustran en la imagen SEM(Figura 13A) de exosomas séricos depositados por evaporación en una superficie de vidrio cargada negativamente. Variaciones significativas en la concentración superficial de vesículas precipitadas son inmediatamente evidentes. El segundo artefacto, cuantificado en la Figura 13B,es la considerable variabilidad en tamaños de vesículas en diferentes áreas dentro del perímetro de la muestra seca. Dados estos artefactos, la caracterización de AFM de vesículas depositadas pasivamente a partir de un líquido de secado puede producir resultados sesgados o inconsistentes a menos que se escanee toda la superficie ocupada inicialmente por una muestra líquida ahora seca.

Se deben considerar dos problemas adicionales al tomar imágenes de las muestras desecadas obtenidas sin una inmovilización firme de vesículas en el sustrato. Recuerde que nuestro protocolo instruye a los usuarios a lavar a fondo la superficie con agua DI después de que las vesículas se inmovilicen de una muestra líquida. Este paso pretende evitar que los solutos iónicos y otros solutos no vesiculares formen depósitos superficiales durante la evaporación de biofluidos complejos con considerable osmolaridad. Si no se fijan los vehículos eléctricos, el lavado a fondo separará un gran número de vesículas de la superficie, lo que podría sesgar los resultados y dejar muy pocas partículas para el análisis. Otra dificultad común, reducida por la inmovilización de los vehículos eléctricos en la superficie de mica modificada antes de la toma de imágenes AFM, es la adhesión de partículas a la sonda23 y los artefactos engañosos causados por este fenómeno.
 
Control de la densidad superficial de los vehículos eléctricos inmovilizados
Los dos factores fácilmente controlables identificados en el protocolo permiten al usuario personalizar la concentración superficial de los vehículos eléctricos inmovilizados en el sustrato de mica modificado: la concentración de las vesículas en la muestra líquida y el momento en que se incuba la muestra en el sustrato. Una alta densidad de vesículas inmovilizadas, lograda con tiempos de incubación más largos y mayor concentración de vehículos eléctricos en el líquido, aumenta el número de vesículas analizadas durante el escaneo y el poder estadístico de las conclusiones llegadas por el análisis de la AFM Datos. Al mismo tiempo, una concentración superficial excesivamente densa, como en el caso mostrado en la Figura 10C donde las partículas cubren firmemente toda la superficie sin áreas intervinientes del sustrato, complica el análisis de la imagen y la interpretación de los resultados y puede conducir a artefactos de escaneo causados por la interacción entre partículas estrechamente espaciadas.

Influencia del cribado electrostático y la movilidad hidrodinámica de los vehículos eléctricos
El control transparente sobre la concentración superficial de los vehículos eléctricos inmovilizados en función de los factores que influyen en él permite al usuario personalizar las condiciones experimentales para satisfacer las necesidades específicas de un estudio. Al realizar la personalización, es importante reconocer que la inmovilización de la superficie electrostática es un proceso limitado por el transporte influenciado por la fuerza iónica del biofluido.

La concentración de especies iónicas y cargadas positivamente impacta inversamente en la longitud de Debye sobre la cual se examinan las cargas de superficie y vesícula. Más allá de esta longitud, las fuerzas electrostáticas son insignificantes. La capa límite de la atracción electrostática del sustrato será mucho más pequeña en PBS rica en ioníaca que en agua DI. Esta diferencia implica que, después de una breve incubación correspondiente al tiempo necesario para agotar la capa de líquido donde se sienten las atracciones electrostáticas, una densidad superficial de vehículos eléctricos inmovilizados de la suspensión en agua DI será mayor que de PBS la concentración de vehículos eléctricos es la misma en ambos líquidos. Dicho de otra manera, más vesículas deben ser inmovilizadas para agotar una capa de atracción más gruesa en agua DI que en PBS en condiciones idénticas.

Después de que las vesículas se agotan de la capa límite, la inmovilización se convierte en un proceso completamente limitado por el transporte. En este régimen, la tasa de la deposición no dependerá del medio de suspensión (por ejemplo, agua DI o PBS) siempre que la viscosidad sea la misma y el transporte sea totalmente difuso. Sin embargo, el transporte de vesículas a la capa límite de atracción puede no ser del todo difusivo. Por ejemplo, si la muestra en una gota sésil en el sustrato de AFM se evapora parcialmente durante la incubación, el líquido dentro de la gota se someterá al flujo impulsado por evaporación, y el transporte de las vesículas hacia el sustrato tendrá, contribuciones difusas y convectivas. Cuando la evaporación no esté adecuadamente controlada, la contribución de un transporte convectivo será considerable, y la tasa de inmovilización será mayor de lo esperado. El impacto del transporte convectivo cambiará con el espesor de la capa de atracción, que a su vez depende del contenido iónico del líquido. Además, la evaporación mejorará la inmovilización vesícula en el sustrato mediante la concentración de vehículos eléctricos en la solución. A concentraciones más altas de EV, el gradiente de concentración entre la capa de atracción y el líquido adyacente aumentará, creando una fuerza motriz termodinámica más grande a la migración de vesículas hacia el sustrato.

Las vesículas inmovilizadas pueden representar una muestra líquida con un sesgo. Para el caso cuando la tasa de inmovilización está limitada por difusión, las vesículas con tamaños hidrodinámicos más pequeños, determinadas por la combinación del tamaño de la vesícula y el espesor de la capa coronal que la rodea(Figura 1), son más propensas a entrar en el atracciones debido a su mayor movilidad. En consecuencia, después del período de agotamiento inicial, los vehículos eléctricos hidrodinámicos pequeños estarán sobrerrepresentados en el sustrato en comparación con su contribución a la población de vehículos eléctricos en la muestra líquida. Tenga en cuenta que un tamaño hidrodinámico más pequeño no apunta automáticamente a los vehículos eléctricos con tamaños de vesícula más pequeños debido a la heterogeneidad en el espesor de la capa coronal3. La representación sesgada se evita con largas incubaciones que agotan toda la población de vehículos eléctricos en el líquido por su inmovilización en el sustrato. Cuando un usuario tiene como objetivo inmovilizar todos los vehículos eléctricos del biofluido, para evitar una cobertura excesivamente densa de la superficie con las vesículas inmovilizadas, puede ser necesario reducir la concentración de EV en el líquido por debajo del rango sugerido en el protocolo.

Deformación de vehículos eléctricos en el sustrato
Las vesículas extracelulares en su estado hidratado nativo y después de la desecación se pueden caracterizar por el AFM, como se describe en el protocolo. Las fuerzas electrostáticas24 que inmovilizan los vehículos eléctricos en la superficie de la mica también distorsionan su forma a partir de la geometría globular en la que existen en la solución. El impacto de la desecación en el tamaño y la morfología de los vehículos eléctricos inmovilizados se puede analizar mediante el reescaneo de la misma superficie antes y después de que se permita que la muestra se seque.

Es instructivo examinar el impacto de la preparación de la muestra en la forma de los vehículos eléctricos desecados. Los vehículos eléctricos electrostáticamente inmovilizados mantienen la geometría altamente oblata después del secado, pero son aplanados aún más por la desecación. La altura sobre la superficie de las vesículas desecadas se vuelve más pequeña que en la Figura 12A,mientras que su área de huella aumenta (datos no mostrados). Por otro lado, cuando las vesículas se depositan pasivamente durante la evaporación líquida y sin inmovilización previa en la superficie, tienden a alcanzar una geometría en forma de copa tras la desecación, como se ha observado durante mucho tiempo en las imágenes SEM y, más recientemente, en AFM Escaneos. Esta forma recortada ahora se reconoce como un artefacto de preparación de muestra25 causado por la no uniformidad en las fuerzas capilares durante la desecación superficial, como se explica mecanicísticamente en la Figura 141.
 
Análisis e interpretación de imágenes de datos AFM
Las respuestas a las fuerzas electrostáticas y capilares que actúan para distorsionar la forma de los vehículos eléctricos proporcionan información valiosa sobre las propiedades estructurales y compositivas de los vehículos eléctricos. Por ejemplo, un conjunto multidimensional de características biofísicas, como el tamaño deformado y la forma extraídos de los datos de AFM, se utilizaron recientemente para demostrar la viabilidad de diferenciar entre exosomas secretados por diferentes células huésped5. Las distorsiones también pueden tenerse en cuenta y compensarse. Por ejemplo, mostramos cómo utilizar los datos de AFM para caracterizar el tamaño globular de las vesículas en la solución estimando los diámetros de las esferas que encapsulan el mismo volumen que los exososmos inmovilizados3.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores reconocen el apoyo financiero de la National Science Foundation (número de premio IGERT-0903715), la Universidad de Utah (Departamento de Ingeniería Química Y el Premio de Becas de Investigación de Posgrado), y el Instituto de Ciencias de Skolkovo tecnología (Beca Skoltech).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AFM/STM Controller  Bruker Multimode Nanoscope V This AFM controller supports imaging of biological samples in liquid and air. 
AFM/STM metal specimen discs (10 mm) TedPella 16207 Metal specimen disc on which a mica disk is attached by a double-sided tape or other means.
AFM/STM Mica discs (10 mm) TedPella 50 Highest quality grade V1 mica, 0.21mm (0.0085”) thick. Interleaved, in packages of 10. Can be mounted on AFM/STM discs. Available in four diameters
AFM probe for imaging in the air Bruker TESP-V2 High quality etched silicon probes for tapping mode and non-contact mode for scanning in the air.
AFM probe for soft sample imaging in liquid Bruker MLCT Soft silicon nitride cantilevers with silicon nitride tips, which are well-suited for liquid operation.  The range in force constants enables users to image extremely soft samples in contact mode as well as high load vs distance spectroscopy.
Double sided tape Spectrum 360-77705 Used to fix the mica disk on the metal specimen disc.
ExoQuick-TC System Biosciences EXOTC50A-1 ExoQuick-TC is a proprietary polymer-based kit designed for exosome isolation from tissue culture media. 
Glass probe AFM holder for imaging in liquid Bruker  MTFML-V2 This glass probe holder is designed for scanning in fluid with the MultiMode AFM.  The holder can be used in peak force tapping mode, contact mode, tapping mode, and force modulation.  The probe is acoustically driven by a separate piezo oscillator for larger amplitude modulation.  The holder is supplied with two ports, required fittings, and accessories kit for adding and removing fluids.
Gwyddion Czech Metrology Institute. Version 2.52 Open Source software for visualization and analysis of data fields obtained by scanning probe microscopy techniques.
Lint-free blotting paper GE Healthcare Whatman  Grade GB003 Blotting Paper Use this blotting paper to remove NiCl2 after the modification of the mica's substrate.  
Lint-free cleanroom wipes Texwipe AlphaWipe TX1004 Use these polyester wipes for surface cleaning. 
Nickel(II) chloride (NiCl2) Sigma-Aldrich 339350 Powder used to make 10 mM NiCl2 in DI water
Phosphate Buffered Saline (1x) Gibco 10010023 PBS, pH 7.4

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References

  1. Chernyshev, V. S., et al. Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407, 3285-3301 (2015).
  2. Ramirez, M. I., et al. Technical challenges of working with extracellular vesicles. Nanoscale. 10, 881-906 (2018).
  3. Skliar, M., et al. Membrane proteins significantly restrict exosome mobility. Biochemical and Biophysical Research Communications. 501, 1055-1059 (2018).
  4. Parisse, P., et al. Atomic force microscopy analysis of extracellular vesicles. European Biophysics Journal. 46, 813-820 (2017).
  5. Ito, K., et al. Host Cell Prediction of Exosomes Using Morphological Features on Solid Surfaces Analyzed by Machine Learning. Journal of Physical Chemistry B. 122, 6224-6235 (2018).
  6. Sharma, S., LeClaire, M., Gimzewski, J. K. Ascent of atomic force microscopy as a nanoanalytical tool for exosomes and other extracellular vesicles. Nanotechnology. 29, 132001 (2018).
  7. Meyer, R. L. Immobilisation of living bacteria for AFM imaging under physiological conditions. Ultramicroscopy. 110, 1349-1357 (2010).
  8. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A., et al. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current protocols in cell biology. Chapter 3 (Unit 3.22), (2006).
  9. Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling. Methods in Molecular Biology. 728, 235-246 (2011).
  10. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1535750 (2019).
  11. Weng, Y., et al. Effective isolation of exosomes with polyethylene glycol from cell culture supernatant for in-depth proteome profiling. The Analyst. 141, 4640-4646 (2016).
  12. Nečas, D., Klapetek, P. Gwyddion: an open-source software for SPM data analysis. Open Physics. 10, 181-188 (2012).
  13. Hsueh, C., Chen, H., Gimzewski, J. K., Reed, J., Abdel-Fattah, T. M. Localized nanoscopic surface measurements of nickel-modified Mica for single-molecule DNA sequence sampling. ACS Applied Materials and Interfaces. 2, 3249-3256 (2010).
  14. Conde-Vancells, J., et al. Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes. Journal of Proteome Research. 7, 5157-5166 (2008).
  15. Zhou, Y., et al. Exosomes released by human umbilical cord mesenchymal stem cells protect against cisplatin-induced renal oxidative stress and apoptosis in vivo and in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 4, 34 (2013).
  16. Coleman, B. M., Hanssen, E., Lawson, V. A., Hill, A. F. Prion-infected cells regulate the release of exosomes with distinct ultrastructural features. FASEB Journal. 26, 4160-4173 (2012).
  17. Briegel, A., et al. Universal architecture of bacterial chemoreceptor arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 17181-17186 (2009).
  18. Akagi, T., et al. On-Chip Immunoelectrophoresis of Extracellular Vesicles Released from Human Breast Cancer Cells. PLOS ONE. 10, e0123603 (2015).
  19. Sharma, S., et al. Structural-mechanical characterization of nanoparticle exosomes in human saliva, using correlative AFM, FESEM, and force spectroscopy. ACS Nano. 4, 1921-1926 (2010).
  20. Radeghieri, A., et al. Cultured human amniocytes express hTERT, which is distributed between nucleus and cytoplasm and is secreted in extracellular vesicles. Biochemical and Biophysical Research Communications. 483, 706-711 (2017).
  21. Woo, J., Sharma, S., Gimzewski, J. The Role of Isolation Methods on a Nanoscale Surface Structure and Its Effect on the Size of Exosomes. Journal of Circulating Biomarkers. 5, 11 (2016).
  22. Deegan, R. D., et al. Capillary flow as the cause of ring stains from dried liquid drops. Nature. 389, 827-829 (1997).
  23. Johnson, C. A., Lenhoff, A. M. Adsorption of Charged Latex Particles on Mica Studied by Atomic Force Microscopy. Journal of Colloid and Interface Science. 179, 587-599 (1996).
  24. Pastré, D., et al. Adsorption of DNA to Mica Mediated by Divalent Counterions: A Theoretical and Experimental Study. Biophysical Journal. 85, 2507-2518 (2003).
  25. van der Pol, E., Böing, A. N., Harrison, P., Sturk, A., Nieuwland, R. Classification, functions, and clinical relevance of extracellular vesicles. Pharmacological Reviews. 64, 676-705 (2012).

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Bioquímica Número 151 microscopía de fuerza atómica exosomas e vesículas extracelulares inmovilización superficial caracterización dimensional caracterización morfológica caracterización biofísica tamaño de las vesículas de membrana hidratadas y muestras desecadas análisis de imágenes
Imagen de vesículas extracelulares mediante microscopía de fuerza atómica
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Skliar, M., Chernyshev, V. S. Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (151), e59254, doi:10.3791/59254 (2019).

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