Summary
Ett steg-för-steg-förfarande beskrivs för etikett fri immobilisering av exosomer och extracellulära blåsor från vätskeprover och deras avbildning med atomkraft mikroskopi (AFM). AFM-bilderna används för att uppskatta storleken på vesiklarna i lösningen och karakterisera andra biofysiska egenskaper.
Abstract
Exosomes och andra extracellulära blåsor (EVs) är molekylära komplex bestående av en lipid membran vesikel, dess yta dekoration av membranproteiner och andra molekyler, och varierande luminala innehåll ärvs från en förälder cell, som omfattar RNAs, proteiner och DNAs. Karakteriseringen av de hydrodynamiska storlekarna av EVs, som beror på storleken på vesikeln och dess koronala skikt som bildas av ytdekorationer, har blivit rutin. För exosomer, den minsta av EVs, är den relativa skillnaden mellan de hydrodynamiska och vesikler storlekar betydande. Karakterisering av vesikler storlekar av kryogen transmission elektronmikroskopi (cryo-TEM) avbildning, en guld standardteknik, är fortfarande en utmaning på grund av kostnaden för instrumentet, den expertis som krävs för att utföra provet beredning, avbildning och dataanalys och ett litet antal partiklar som ofta observeras i bilder. Ett allmänt tillgängligt och lättillgängligt alternativ är Atom kraftens mikroskopi (AFM), som kan producera mångsidiga data om tredimensionell geometri, storlek och andra biofysiska egenskaper hos extracellulära blåsor. Det utvecklade protokollet vägleder användarna i utnyttjandet av detta analysverktyg och beskriver arbetsflödet för analys av EVs av AFM, vilket inkluderar prov preparationen för avbildning av EVs i hydrerad eller Desiccated form, elektrostatisk immobilisering av substrat, datainsamling, analys och tolkning. De representativa resultaten visar att fixering av EVs på den modifierade glimmer ytan är förutsägbar, anpassningsbar, och tillåter användaren att få dimensionerings resultat för ett stort antal blåsor. Vesikeldimensionering baserad på AFM-data konstaterades överensstämma med cryo-TEM Imaging.
Introduction
Extracellulära blåsor (EVs) är närvarande i alla kroppsvätskor, inklusive blod, urin, saliv, mjölk, och fostervattnet. Exosomes bildar en distrikts klass av EVs åtskilda från andra EVs av endosomalt biogenes, markörer för den endosomala vägen, och den minsta storleken bland alla EVs. Exosomernas storlek rapporteras ofta med stor variation mellan studierna. Storleks resultaten befanns vara metod beroende, vilket återspeglar skillnaden i fysikaliska principer som används av olika analytiska tekniker för att uppskatta EV-storlekarna1,2. Till exempel, nanopartiklar spårningsanalys (NTA) ― den mest använda storleks karakterisering teknik ― uppskattar storleken på EVS som deras hydrodynamiska diametrar, som kännetecknar motståndet mot den Brownian rörligheten för EVS i lösningen. En större hydrodynamisk diameter av en vesikel innebär dess lägre rörlighet i vätska. Det koronala skiktet runt vesikler, bestående av ytproteiner och andra molekyler som är förankrade eller adsorberade till membranytan, försvårar väsentligen rörligheten och ökar den hydrodynamiska storleken på EVs. I relativa termer är denna ökning särskilt stor för undanflykt3, vilket illustreras i figur 1.
Den kryogena transmissionselektronmikroskopi (cryo-TEM) Imaging är en definitiv teknik för att karakterisera vesikelstorlekar och morfologi i deras hydrerade tillstånd. Men den höga kostnaden för instrumenteringen och den specialiserade expertis som behövs för att använda den på rätt sätt motivera utforskning av alternativa tekniker som kan bilden hydratiserade EVs. Ett relativt litet antal EVs observeras eller kännetecknas i den förvärvade cryo-TEM bilder är en annan anmärkningsvärd nackdel med denna teknik.
Atomkraft mikroskopi (AFM) visualiserar den tredimensionella topografin av hydratiserade eller Desiccated EVS4,5,6 genom att skanna en sond över underlaget till rasterbilden av partiklarna på ytan. De väsentliga stegen i protokollet för att karakterisera EVs av AFM beskrivs i denna studie. Före avbildning av vesiklarna i vätska, måste de immobiliseras på ett substrat genom att antingen tjudra till en funktionaliserad yta, svällning i ett filter, eller av elektrostatisk attraktion7. Den elektrostatiska fixering på ett positivt laddat substrat är ett särskilt bekvämt alternativ för immobilisering av undanflykt kända för att ha en negativ Zeta potential. Men samma elektrostatiska krafter som immobiliserar de extracellulära vesiklarna på ytan förvränger också deras form, vilket gör post-Imaging dataanalys viktigt. Vi utvecklar denna punkt genom att beskriva den algoritm som uppskattar storleken på de globulära vesiklarna i lösningen baserat på AFM data på den förvrängda formen av exosomer immobiliserade på ytan.
I det utvecklade protokollet presenteras förfarandet för den robusta elektrostatiska immobiliseringen av vesikler och följs av de steg som behövs för att utföra Atom krafts avbildning i de hydrerade eller uttorkade tillstånden. De faktorer som påverkar ytkoncentrationen hos de immobiliserade vesiklarna identifieras. Vägledningen ges om hur man utför elektrostatisk immobilisering för prover med olika koncentrationer av EVs i lösningen. Urvalet av experimentella tillstånd som möjliggör uppskattning av empiriska sannolikhetsfördelningar av olika biofysiska egenskaper som baseras på ett tillräckligt stort antal immobiliserade blåsor diskuteras. Exempel på analys efter avbildning av AFM-data ges. Specifikt beskrivs en algoritm för bestämning av storleken på vesikler i lösningen baserad på AFM-karakteriseringen av immobiliserade EVs. De representativa resultaten visar att vesikeln dimensionering av AFM överensstämmer med resultaten av cryo-TEM Imaging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. isolering av EVS från en kroppsvätskemetabolomik
- Isolera EVS med en av de etablerade metoderna, som differential ultracentrifugering8, nederbörd eller storleks uteslutnings kromatografi9.
- Bekräfta närvaron av förväntade yt-och luminala-biomarkörer och frånvaron av biomarkörer som indikerar korskontaminering av preparatet. Bekräfta lipidbilayer morfologin av isolerade partiklar med elektronmikroskopi.
Anmärkning: vid isolering av exosomer bör den hydrodynamiska storleksfördelningen mätt med nanopartikel spårningsanalys (NTA) eller dynamisk ljusspridning ske inom det förväntade intervallet. Detaljerna i EV och exosome isolering är utanför tillämpningsområdet för detta protokoll. Den valda metoden kommer att bero på experimentella frågor och målet för studien10. Följande steg ger en konkret illustration av förfarandet för att berika exosomerna genom nederbörd från tillväxt mediet av MCF-7 bröstcancerceller med hjälp av en kommersiellt tillgänglig nederbörd Kit (tabell över material). - Innan cellodling expansion, lagra MCF-7 bröstcancerceller i flytande kväve. Tina celler till subkultur.
- Efter aseptiska metoder, utför cellplätering på 150 mm plattor. Använd odlingsmediet som består av Eagle's minsta essentiella medium, 0,01 mg/ml humant rekombinant insulin, och 10% exosome-fritt foster bovint serum.
- Lufta kulturen med 95% luft och 5% CO2 och inkubera vid 37 °C.
- Efter att cellerna har lösts (ca 24 h efter plätering), ändra media. Dela plattan på 1:10 förhållande och kultur tio plattor, vardera innehållande 20 mL media.
- Harvest och pool media från 9 av dessa plattor (180 ml) vid ~ 70−80% sammanflödet när cellerna är fortfarande i tillväxtfasen.
- Dela upp mediet i 60 mL och 120 mL, ytterligare uppdelat i 30 mL/rör, och centrifugera vid 3 000 x g i 15 min.
- Överför supernatanten från varje tub till ett nytt sterilt 50 mL-rör och utför exosome-isoleringen.
- Isolera exosomer genom nederbörd enligt publicerade protokoll (se exempelvis referens11) ellerfölj tillverkarens anvisningarom en kommersiell isolerings sats (tabell över material) används. Som ett första steg i det senare fallet, Centrifugera cell medium på 3 000 x g för 15 min. Dra supernatanten och kassera celler och cellfragment.
- Tillsätt nederbördslösningen (1:5 volym förhållande) till supernatanten, blanda och kylskåp över natten.
- Centrifugera vid 1 500 x g i 30 minuter vid rumstemperatur. Kassera supernatanten efter centrifugering.
- Snurra resterande exosome pellet för ytterligare 5 min vid 1 500 x g. Utan att störa pelleten, ta bort den återstående nederbördslösningen genom aspiration.
- Omsuspendera pelleten i 100−500 μl 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och dela upp i flera alikvoter efter behov för efterföljande analys.
- Fortsätt omedelbart till ytimmobiliseringen av de isolerade exosomerna för AFM-avbildning. Om det behövs, frysa alikvoter vid-80 °C för senare användning medan du vidtar försiktighetsåtgärder för att undvika skador på provet under frys-Tina cykeln.
2. ytfixering av extracellulära blåsor
- Använd stark dubbelhäftande tejp, epoxi, eller ett alternativt lim för att ordentligt fästa en glimmer disk till en AFM/scanning Tunneling Mikroskop (STM) magnetiska rostfrittstål prov skiva.
- Cleave glimmer skiva med hjälp av en vass rakhyvel eller brukskniv, eller genom att fästa en tejp till den övre ytan och sedan vande bort det för att avlägsna ett lager av material.
Anmärkning: endera metoden bör avslöja en jungfru yta genom att ta bort ett tunt lager av glimmer som tidigare utsatts för miljön. Efter ingreppet måste fastsättning av Mica till AFM/STM metall preparatskiva förbli fast. - Vid rumstemperatur, behandla den övre ytan av glimmer för 10 s med 100 μL av 10 mM NiCl2 lösning, som ändrar ytan laddningen från negativa till positiva.
- Blot NiCl2 lösning med en luddfri torka eller blotting papper. Tvätta glimmerytan 3x med avjoniserat (DI) vatten och torka det med en ström av torrt kväve.
Obs: det är en god vana att scanna den modifierade ytan med AFM för att bekräfta att den är fri från föroreningar. - Placera AFM-Preparatskivan med den bifogade ytan modifierade glimmer i en petriskål.
- Späd ut exosome-provet från steg 1,14 med 1x PBS för att få en koncentration mellan 4,0 x 109 och 4,0 x 1010 partiklar per ml lösning. Validera den utspädda partikelkoncentrationen med hjälp av NTA.
- Bildar en oskaftade droppe på ytan av glimmer genom att tömma 100 μl av utspädd exosome lösning från en pipett.
- Placera locket på petriskål och täta den med en paraffin film för att minska prov avdunstning. Inkubera provet i 12−18 timmar vid 4 °C.
Obs: ytdensiteten hos de immobiliserade exosomerna kommer att öka med inkubationstiden och koncentrationen av EVs i vätskan. Längre inkubationstid kan behövas om exosomer förekommer i provet vid lägre koncentrationer. - Efter inkubering, aspirera 80−90% av provet utan att störa ytan. Vid denna punkt, exosomerna kommer att elektrostatiskt immobiliseras på glimmer substrat.
- Före avbildning hydrerad EVs, skölj ytan med 1x PBS. Upprepa 3x. Var noga med att hålla provet hydrerat under sköljprocessen.
- Efter tvättning av glimmerytan med 1x PBS, ta bort 80%−90% av vätskan och Pipettera ~ 40 μl av färsk 1x PBS för att täcka provet.
- Vid avbildning av den Desiccated EVs, skölj substratet med DI vatten. Upprepa 3x.
Obs: sköljning med di vatten kommer att förhindra bildandet av saltkristaller och avsättning av lösta ämnen på ytan som underlaget torkar. - Före avbildning Desiccated EVs, aspirera så mycket vätska som möjligt utan att röra ytan och torka resten med en ström av torrt kväve.
3. AFM-avbildning
- För att avbilda den Desiccated EVS, Välj en grenställ avsedd för skanning i luften i knacka och icke-kontakt Imaging lägen och montera den på sondhållaren.
Anmärkning: egenskaperna hos ett exempel grenställ anges i tabell över material (123 μm längd, 40 μm bredd, 7 nm spets radie, och 37 N/m fjäder konstant) kan användas som en guide när du väljer en sond kompatibel med tillgängliga AFM instrumentering.- Placera preparatet från steg 2,13 på AFM-stadiet. Den magnetiska rostfria prov skivan kommer att immobilisera provet på scenen. Ge tid för beredning och scenen för att jämvikt termiskt.
- Använd knacknings läget för att skanna ett tillräckligt stort områdeav glimmerytansyta. Välj till exempel en yta på 5 x 5 μm, rastered i 512 linjer med en skanningshastighet på ~ 1 Hz. förvärva både höjd och fas bilder eftersom de ger kompletterande information om topografi och ytan egenskaper av provet.
Obs: skanningstiden kommer att öka med det avbildade området och antalet rader som valts för att bilda bilden men minska med den skanningshastighet som definieras som antalet linjer som skannas per sekund. Snabba skannings hastigheter kan påverka bildkvaliteten. Därför bör hastigheten för rastering juridiskt balansera avvägningen mellan förvärvs tiden och bildkvaliteten.
- För att avbilda hydrerade blåsor, Välj en grenställ lämplig för skanning av mjuka, hydratiserade prover och montera grenställ på en sondhållare avsedd för skanning i vätskor.
Anmärkning: när du väljer en sond som är kompatibel med det tillgängliga AFM-instrumenteringen, specifikationerna för sonden i tabell över material (trekantig grenställ med 175 μm nominell längd, 22 μm bredd, 20 nm spets radie, 0,07 N/m fjäderkonstant, och optimerad för avbildning med frekvensomriktare i intervallet mellan 4 till 8 kHz) kan användas som en guide.- Fukta spetsen på grenställ med 1x PBS för att minska sannolikheten för att införa luftbubblor i vätskan under skanning.
- Placera preparatet från steg 2,11 på AFM-stadiet. Den magnetiska rostfria prov skivan kommer att immobilisera den bifogade glimmer som innehåller immobiliserade EVs på dess yta.
- Ge tid för beredning och AFM skede att jämvikt termiskt.
- Bild den hydratiserade glimmerytan i gäng läget. Hämta både höjd och fas bilder.
Obs: bildkvaliteten påverkas av instrumenteringen, den valda sonden och skannings parametrarna. Vid optimering av skannings förhållandena kan följande val användas som utgångspunkt: 5 x 5 μm inskannade i 512 linjer med ~ 0,8-1,0 Hz skanningshastighet och frekvensomriktare mellan 4 till 8 kHz.
4. bildanalys
Anmärkning: följande databearbetning och analys steg tillämpas på de förvärvade höjd bilderna. Ett liknande förfarande kan anpassas för att analysera fas data. Beskrivningen nedan är specifik för gwyddion12, en fri och öppen källkodsprogramvara tillgänglig under GNU General Public License. Liknande funktioner finns i alternativa mjukvaruverktyg.
- Gå till data process, SPM lägen, tips och välj modell tips (figur 2). Välj geometri och mått för tipset som används för att skanna provet och klicka på OK.
- Korrigera spetsen erosion artefakter genom att utföra ytan rekonstruktion. Öppna bilden. I menyn väljer du data process, SPM-lägen, tips, väljer sedan Surface-rekonstruktion och klickar på OK (bild 3).
- Justera bildplanet så att det matchar laboratoriet XY-planet genom att ta bort lutningen i underlaget från skannings data. För att utföra denna uppgift, Välj data process, nivå och välj plan nivå (figur 4).
- Justera rader i bilden genom att välja data process, korrigera data och välj sedan Justera rader. Det finns flera justeringsalternativ (figur 5). Median är till exempel en algoritm som hittar en genomsnittlig höjd för varje skannings linje och drar ifrån data.
- Gå till data process, korrigera data och välj ta bort ärr (figur 6), som tar bort vanliga skanningsfel som kallas ärr.
- Justera glimmerytan vid nollhöjd, Z = 0, genom att välja platta till bas i nivå rullgardinsmenyn tillgänglig från data processen (figur 7).
- Identifiera EVs på den skannade ytan genom att använda mark för tröskel i listrutan korn (figur 8a). Denna algoritm identifierar ytan immobiliserade exosomer som partiklar som sticker ut från noll-ytan substrat med höjden över den valda användaren tröskeln. Välj ett tröskelvärde i intervallet mellan 1 och 3 nm, vilket kommer att eliminera de flesta av bakgrundsinterferensen. Mindre trösklar används med renare bakgrund.
Anmärkning: tröskelvärdet i figur 8a är 1,767 nm. Resultatet av MCF-7 exosome-identifieringen med detta tröskelvärde visas i figur 8b. Gwyddion erbjuder flera alternativ till tröskelvärde som algoritmen för att automatiskt identifiera blåsor i bilden, inklusive automatiserad tröskelvärde (Ōtsu metod), kant detektering, och vattendelare algoritmen.
Anmärkning: partikel agglomerat, om det finns i AFM-bilden, kan maskeras och uteslutas från analysen. - Utför geometrisk och dimensionell karakterisering av identifierade EVs med hjälp av tillgängliga fördelningsalgoritmer tillgängliga från korn -menyn.
Obs: gwyddion ger verktyg för att bedöma fördelningen av skalärvärderade, areal, volumetriska och andra egenskaper immobiliserade EVs i en hydrerad eller dessicated tillstånd. Ett exempel på en scalar-Values-egenskap visas i figur 9, vilket ger fördelningen av maximala höjder inom varje identifierad exosome-fotavtryck. - Exportera AFM data från gwyddion för specialiserad analys av andra beräkningsverktyg och anpassade datorprogram.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ytfixering av EVs är ett kritiskt steg i bildsekvensen. Elektrostatisk ytimmobilisering av exosomer, kända för att ha en negativ Zeta-potential, kommer att uppstå kraftigt efter att glimmerets substrat har modifierats för att ha en positiv ytladdning. Utan behandling med NiCl2 för att ge positiva ytförändringar visade sig immobiliseringen av EVS på underlaget vara ineffektiv. Höjd bilden i figur 10a, förvärvad i luften efter att MCF-7 exosome-provet med 2,59 x 1010 blåsor per ml PBS inkuberades i 12 timmar på oförändrad yta av nyklyvad glimmer, visar mycket få blåsor kvar på ytan efter att den rengjorts med DI-vatten. Vesiklarna synliga i figur 10a är, troligen, resultatet av ofullständig ASPIRATION av di vatten, som återsuspenderade blåsor inte fast på ytan och sedan avsatte dem på underlaget som det avdunsta.
Efter att ha ändrat ytan laddningen med nickel klorid, är det lämpligt att bekräfta att ytan förblir fri från föroreningar efter behandlingen. Höjd bilden i figur 10B (erhålls i luften) ger ett exempel på en ren yta efter att den behandlats med nicl2 och sedan tvättades tre gånger med di-vatten. Ojämnheten i katjon-derivatiserad yta var under 0,3 nm, vilket är förenligt med den tidigare rapporten13.
Den dramatiska positiva effekten av ytladdingsmodifieringen på effektiviteten av fixering av MCF-7-exosomer illustreras av figur 10C,D. Dessa två paneler visar de höjd skanningar som erhållits i luften efter provet, som tidigare avbildats i figur 10a, inkuberades för 24 h respektive 12 timmar på den yta som behandlades med nickelklorid.
Den tid ett givet prov inkuberas på den behandlade ytan bestämmer ytkoncentrationen (vesikler per område) av den immobiliserade EVs. Höjden bilden i figur 10c illustrerar fallet med överdrivet tät yta täckning av immobilisera vesikler erhålls efter den beskrivna MCF-7 exosome provet inkuberades för 24 h. Ett antal algoritmer förlitar sig på att ha tillräckligt med oockuperade substrat mellan kornen för att utföra bildkorrigering och dataanalys. Till exempel, utjämning och förskjutning av underlaget till nollplanet, linje korrigering och uppskattning av korn volymen behöver den mellanliggande plana ytan för att utföra noggranna beräkningar. När koncentrationen av de immobiliserade vesiklarna är så hög som i figur 10C, kommer dessa algoritmer inte fungera tillförlitligt. Ett exempel på en adekvat ytkoncentration av vesikler immobiliserade från samma MCF-7 prov visas i höjd bilden i figur 10D, som erhölls efter kortare (12 h) inkubation.
Efter bearbetningen av de förvärvade rå AFM data behövs för att korrigera för vanliga scanning fel. Följande beskrivning är specifik för gwyddion. Liknande funktioner finns i andra AFM/SPM dataanalysverktyg.
Inom gwyddion används plan nivå funktion för att korrigera för en lutning i underlaget. Sådan bakgrundskorrigering åstadkoms genom att först hitta planet av underlaget med hjälp av alla datapunkter i bilden och sedan subtrahera den från rådata. Korrigeringen längs skannings linjerna åstadkoms genom att Justera rader funktion. En av de implementerade algoritmerna utför till exempel justeringen genom att beräkna median höjden för varje skannings linje och sedan Subtrahera resultatet från motsvarande rad med bilddata. Bidraget från de lokala felen i feedbackslingan kan tas bort genom att använda ta bort ärr funktion, som fyller luckorna i de justerade data och eliminerar ärr genom att jämföra data i intilliggande skanningslinjer. Förskjutningen av underlaget till höjden Z = 0 kan åstadkommas genom en kombination av en fasett och polynom utjämning av ytan efter maskering korn och andra funktioner. Gwyddion ' s flatten Base verktyget utför den här uppgiften självständigt eller med en användarspecificerad mask. Efter de beskrivna bakgrunds-och linje korrigeringarna kan de elektrostatiskt fixerade vesiklarna identifieras på underlaget genom att utföra funktionen mark korn .
Figur 11a och figur 11b visar höjd-och fas bilder av hydrerade MCF-7-exosomer immobiliserade på en glimmeryta och förvärvas i PBS med knacknings läget. Totalt 561 hydrerade blåsor identifierades i det skannade området med tröskel algoritm av mark korn funktion med tröskelvärdet inställt på ~ 20%. Fasförskjutningen av sondens respons vid frekvensomriktare är känslig för lokaliserade styvhets variationer i mjuka prover. Överensstämmelsen mellan höjd och fas bilder, sett i figur 11a,B, är därför en viktig bekräftelse på att de avbildade kornen är, faktiskt, mjuka blåsor immobiliserade på underlaget.
Figur 11C visar tvärsnittet av höjd bilden genom exosomer som finns på den vita linjen i figur 11a. Medan exosomerna i en kroppsvätskemetabolomik har en globulära geometri1,14,15,16, är deras form på underlaget allvarligt förvrängd av den elektrostatiska attraktionen till positivt laddade Ytan. Den ovala pannkaka-liknande geometri av elektrostatiskt immobiliserade blåsor illustreras ytterligare i figur 11D av närbild höjd bild (och dess tvärsnitt) av en exosome boxed i figur 11a. Motsvarande fas bild visas i figur 11E. Den empiriska sannolikhetsfunktionen (PDF) av topphöjder över ytan för alla 561 hydrerade blåsor som identifierats i AFM-skanningen visas i figur 12A. Medelvärdet för denna fördelning är 7,9 nm, vilket är ungefär lika med dubbelt så tjockt som en fosfolipid-lipidens17 i avsaknad av deformeringskrafter.
Området på substratet upptas av en immobiliserad exosome approximerades som en cirkel med diametern lika med medelvärdet avstånd från vesikeln ' s "masscentrum" till dess gräns på glimmer yta. Fördelningen av dessa projektions diametrar visas i figur 12A och har medelvärdet lika med 69,6 Nm. Den erhållna höjden och diametern fördelningarna ytterligare kvantifiera den betydande effekten av den elektrostatiska ytan immobilisering på förvrängd form av immobiliserade exosomes.
Protokollets robusthet och repeterbarhet bekräftades genom en omanalys av samma MCF-7-prov tre gånger, från provberedning till avbildning, med varje upprepning som ger resultat som statistiskt liknar dem som visas i figur 12.
Deformationen av immobiliserade blåsor orsakade av elektrostatiska krafter kan kompenseras eller tolkas för att ge en inblick i egenskaperna hos den avbildade EVs. Till exempel kan AFM data användas för att uppskatta den globulära storleken på vesiklarna i lösningen. Som utgångspunkt kan vi beräkna volymen inkapslad av membran kuverten av immobiliserade blåsor. Volymen hittas genom att man integrerar skillnaden mellan de identifierade vesiklarna och substrat höjden under dem. Substrat nivån under vesiklarna är inte direkt åtkomlig utan kan uppskattas av Laplace eller alternativ interpolering av datapunkter för obesatta substrat som omger vesiklarna. Inom gwyddion utförs sådan volymberäkning med hjälp av fördelning av olika korn egenskaper funktion. Resultatet som exporteras från gwyddion kan sedan kartläggas i diametrarna på volymlikvärdiga sfärer.
Tillämpningen av den beskrivna algoritmen till AFM data för 561 analyserade hydrerade MCF-7 blåsor producerade fördelningen av diametrarna av volym motsvarande sfärer som visas i figur 12B. Denna fördelning uppskattar storleken på membranvesikler i deras medfödda klotformig form i en kroppsvätskemetabolomik innan deras elektrostatisk fixering på glimmer ytan. Den vesikeldimensionering som erhålls vid analysen av AFM-data jämfördes med resultaten av cryo-TEM-avbildning av samma prov och konstaterades vara i nära överenskommelse3 (figur 12b). Jämförelsen av de hydrodynamiska diametrarna som mäts med de erhållna vesikelstorlekarna (figur 1) indikerar att exosomernas rörlighet är mycket mindre än vad som förväntas av storleken på deras vesikler som bestäms av AFM och cryo-TEM. Mätningar. Skillnaden mellan de hydrodynamiska och vesikelformade storlekarna karakteriserar tjockleken på det koronala skiktet kring exosomala blåsor.
Figur 1: jämförelse av hydrodynamiska och geometriska diametrar för EVs. Den geometriska storleken på exosomal vesikel är betydligt mindre än dess hydrodynamiska storlek bestäms från dess diffusion i en vätska. Skillnaden är det koronala skiktet som bildas av membran-konjugerade och adsorberade molekyler som hämmar rörligheten för EVs. Denna siffra är modifierad från referens3 och omtryckt med tillstånd.
Figur 2: AFM-probens egenskaper. Geometrin och dimensionerna för AFM-sonden kan specificeras med hjälp av modell tips funktionen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 3: korrigering av Imaging artefakt orsakad av Tip-Sample faltning. Genom att utföra ytan rekonstruktion, kan de förvärvade AFM data korrigeras för spets artefakter. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: korrigering för en lutning i underlaget. Plan nivå bestämmer substratets plan och drar ifrån AFM-data. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: korrigering av feljusteringar i skannings rader. En konventionell algoritm för att justera skannings data är att hitta en genomsnittlig höjd längs varje skannings linje och subtraeera resultatet från motsvarande rad med datapunkter i bilden. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: korrigering för luckorna i de justerade data. Vanliga scanning fel, kallas ärr, kan tas bort från AFM data genom att tillämpa ta bort ärr funktion. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: justering av ett substrat vid noll höjd. Flatten Base alternativ i nivå menyn tillåter användaren att placera underlaget ytan på basnivå som motsvarar noll höjd. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: identifiering av immobiliserade blåsor på den skannade ytan. A) deutanpåliggande exosomerna identifieras som korn som sticker ut över underlaget genom ett användarvalt höjd tröskelvärde som anges i mark för tröskel. B) resultatet av identifieringen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9: analys av AFM-data. Fördelningen av maximihöjder över underlaget inom det område som upptas av de identifierade exosomerna visas som sammanställts av spannmåls fördelnings verktyget. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 10: påverkan av ytmodifiering och ev-koncentration av yttätheten hos immobiliserade blåsor. (A) AFM höjd bild av färskt klyvt glimmer substrat efter 12 h inkubering med MCF-7 exosome prov följt av rengöring med di vatten och torkning. Immobiliseringen av EVs från vätskan till underlaget är ineffektiv utan att ge en positiv laddning till glimmer yta. Få partiklar som ses i genomsökningen är sannolikt resultatet av ofullständig borttagning av MCF-7 provet innan underlaget torkades. (B) höjd skanning av glimmer yta i luften efter behandling med nickel klorid visar underlaget fritt från föroreningar. Paneler (C) och (D) visar AFM höjd skanningar erhålls efter ändring av ytladdning och inkubation med samma MCF-7 prov som i panel (a) för 24 h respektive 12 h. Ytkoncentrationen av immobiliserade blåsor är överdrivet tät efter 24 h inkubation. Den 12 h inkuberingen leder till färre undanflykt immobiliserade på ytan och skannings data som är lättare att analysera exakt. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 11: AFM-bilder av hydrerade MCF-7-exosomer elektrostatiskt immobiliserade på den modifierade glimmerytan. (A) höjd bilden. B) den motsvarande AFM-fasbilden bekräftar att kornen i höjd bilden är mjuka nanopartiklar, vilket bör förväntas för membran blåsor. C) höjd uppgifterna för de tre vesiklarna som korsas av den linje som visas i panelen (a) illustrerar en tillplattad form orsakad av exosomers elektrostatiska attraktion till den positivt laddade ytan på den modifierade glimmer. D) form förvrängningen är uppenbar i en förstorad vy den immobiliserade vesikeln boxed i panel (a) och dess tvärsnitt. Fas bilden av samma vesikel visas i (E). Denna siffra är modifierad från referens3 och omtryckt med tillstånd. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 12: dimensionell karakterisering av hydrerade blåsor immobiliserade på ytan och uppskattningen av deras globulära storlek i lösningen. (A) fördelningen av topphöjder över ytan (röd kurva) har medelvärdet lika med 7,9 nm. Det område som upptas av immobiliserade undanflykt har 69,6 Nm genomsnittlig diameter (blå kurva). (B) AFM höjd bild för en av de immobiliserade undanflykt illustrerar dess mycket Oblate form orsakad av elektrostatiska krafter. Den globulära storleken på exosomala blåsor i lösningen kan uppskattas genom matchande volymer som omges av ytfixerade och sfäriska membran kuvert. (C) storleksfördelningen av globulära blåsor i lösningen (röd kurva) fastställdes från AFM-data för 561 immobiliserade blåsor. Vesikelstorlekarna i cryo-TEM-bilder (blå kurva) överensstämmer med AFM-resultaten. Denna siffra är modifierad från referens3 och omtryckt med tillstånd. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 13: ytkoncentration och storleks segregering artefakter under passiv avsättning av EVs från avduntande vätska. (A) bilden av scanningelektronmikroskopi (SEM) visar att den ytkoncentration av exosomer som passivt deponeras från en tork vätska är rumsligt varierande när ytimmobilisering från en suspendering av kroppsvätskemetabolomik inte utförs. (B) passiv avsättning av EVS från ett tork prov orsakar vesikler storleks segregering. Väsentligheten storleksanpassar variation kvantifieras av probabilitytätheten fungerar (PDF) för blåsor i olika regioner i avbilda (a) definierat av vit Diagonal fodrar. Denna siffra är modifierad från referens1 och omtryckt med tillstånd. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 14: skålformad geometri för Desiccated vesikler deponeras passivt på ytan under vätskeavdunstning. Ytan uttorkning av blåsor som inte immobiliserats av elektrostatiska krafter är kända för att resultera i en kopp-formad utseende ofta observerats i SEM bilder av EVs. Denna siffra är modifierad från referens1 och omtryckt med tillstånd. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Immobiliseringen av EVs från en biologisk vätska, ytscanning, och bildanalys är de väsentliga stegen i det utvecklade protokollet för AFM karakterisering av EVs i vätska. Antalet blåsor som kan vara mottagliga för AFM-avbildning vågar med den avbildade ytan och ytkoncentrationen av vesiklarna immobiliserade på underlaget. Givet en negativ Zeta-potential hos EVS och undanflykt18förespråkar vi elektrostatisk fixering av EVS från vätskeprover till AFM-substrat. Immobiliseringen är effektiv när ytan är positivt laddad. Före EV immobilisering kan den positiva ytan laddning behöva förmedlas till underlaget, som i fallet med Mica ― en skiktad silikat mineral med allmän formel KAl2(AlSi3O10) (OH)2. Nyligen klyvs Mica yta är nära helt platt, vilket är idealiskt för avbildning nanopartiklar av AFM, men dess yta laddning är negativ och, sålunda, måste ändras. I protokollet beskrivs förfarandet för att ge en positiv ytförändring till AFM-underlaget. De representativa resultaten visar markant förbättring av EV-fixering från en kroppsvätskemetabolomik till det modifierade glimmer substratet.
Vid avbildning hydrerade blåsor, är det viktigt att minimera prov avdunstning som orsakar ytan deposition artefakter och konvektiva flöden och ökar vätske koncentrationen av vesikler med tiden, vilket leder till högre ytkoncentration av immobiliserade EVs än väntat, särskilt under långvariga inkuberingar. Sondhållare som uttryckligen utformats för vätske prov eliminerar eller saktar ned avdunstning och bör användas för att avbilda hydrerade EVs. Icke-specifika bindningar till scanning sonden reduceras i närvaro av Joniska arter. Därför, när Imaging hydratiserade EVs, är det bättre att täcka underlaget med ett buffrat medium, såsom PBS, i stället för DI vatten.
Vikten av ytimmobilisering
Den konsekventa och förutsägbara immobiliseringen av EVs på det modifierade substratet avlägsnar den primära källan till variationer i AFM-resultaten. Alla underordnade steg, från skanning till dataanalys, är lättare att kontrollera genom att välja instrumentering, avsökningar, skannings parametrar och data analyssekvens och algoritmer. Användaren bör vara medveten om uppströms variationer i biologiska prover och EV isolerings protokoll, som är viktiga frågor utöver omfattningen av detta arbete.
Vi rekommenderar att du utför ytan immobilisering av EV på den modifierade Mica yta från flytande prover även när målet är att karakterisera uttorkade blåsor i luften-behovet är mindre uppenbar eftersom blåsor kommer oundvikligen att sätta in på något substrat som vätskan avdunstar. I själva verket, AFM resultat för Desiccated EV erhålls utan att modifiera glimmer yta avgifter, vilket är ett nödvändigt steg för elektrostatisk immobilisering av EVS från en vätska, har rapporterats under de senaste19,20,21 . När EVs inte är fast på ytan från vätske provet, men deras passiva deposition genom avdunstning kommer att producera artefakter kollektivt kallas en kaffe ring effekt22. Två sådana artefakter, som uppstår som en torkning vätska avtar, illustreras i SEM bilden (figur 13a) av serum undanflykt deponeras genom avdunstning på en negativt laddad glasyta. Signifikanta variationer i ytkoncentrationen av utfälld vesikler är omedelbart uppenbara. Den andra artefakten, som kvantifierades i figur 13b, är den avsevärda variationen i vesikelstorlekar i olika områden inom omkretsen av det torkade provet. Med tanke på dessa artefakter, AFM karakterisering av passivt deponerade blåsor från en torkning vätska kan ge partiska eller inkonsekventa resultat om inte hela ytan initialt upptas av ett nu torkat flytande provet skannas.
Två ytterligare frågor bör övervägas vid avbildning av de uttorkade proverna som erhållits utan fast immobilisering av vesikler på underlaget. Minns att vårt protokoll instruerar användare att grundligt tvätta ytan med DI vatten efter blåsor är immobiliserade från ett flytande prov. Detta steg syftar till att förhindra joniska och andra icke-vesikulär lösta ämnen från att bilda ytbeläggningar under avdunstning av komplexa biofluider med betydande osmolaritet. Om EVS inte är fasta, kommer grundlig tvättning lossa ett stort antal blåsor från ytan, potentiellt polarisering resultaten och lämnar för få partiklar för analys. En annan vanlig svårighet, reduceras genom immobilisera EVS på den modifierade glimmer ytan före AFM avbildning, är vidhäftning av partiklar till sonden23 och vilseledande artefakter som orsakas av detta fenomen.
Kontroll av ytdensiteten hos immobiliserade EVs
De två lätt kontrollerbara faktorer som anges i protokollet gör det möjligt för användaren att anpassa ytkoncentrationen hos den immobiliserade EVs på det modifierade glimmer substratet: koncentrationen av vesiklarna i vätske provet och den tid provet inkuberas på underlaget. En hög densitet av immobiliserade blåsor, uppnås med längre inkubationstider och högre koncentration av EVs i vätskan, ökar antalet blåsor analyseras under skanning och den statistiska kraften i slutsatserna från analysen av AFM Data. Samtidigt kompliserar en överdrivet tät ytkoncentration, som i det fall som visas i figur 10C där partiklar tätt täcker hela ytan utan mellanliggande delar av underlaget, bildanalysen och tolkningen av resultaten och kan leda till skanning artefakter som orsakas av samspelet mellan tätt fördelade partiklar.
Påverkan av elektrostatisk screening och hydrodynamisk mobilitet av EVs
Den transparenta kontrollen över ytkoncentrationen av immobiliserade EVs som en funktion av faktorer som påverkar det tillåter en användare att anpassa experimentella förhållanden för att tillgodose de specifika behoven hos en studie. Vid anpassning är det viktigt att inse att den elektrostatiska ytimmobiliseringen är en transport-begränsad process som påverkas av den joniska hållfastheten hos Biofluid.
Koncentrationen av Joniska och positivt laddade arter inverterat påverkar den Debye längd över vilken ytan och vesikeln avgifter screenas. Bortom denna längd är de elektrostatiska krafterna försumbara. Gränsskiktet av substratets elektrostatiska attraktion kommer att vara mycket mindre i joniskt rika PBS än i DI vatten. Denna skillnad innebär att efter en kort inkubation motsvarande den tid som behövs för att tömma lagret av vätska där elektrostatiska attraktioner känns, en ytdensitet av EVs immobiliserade från suspensionen i DI vatten kommer att vara högre än från PBS suspensionen, förutsatt att koncentrationen av EVs är densamma i båda vätskorna. Sätt annorlunda, mer blåsor måste immobiliseras för att tömma en tjockare attraktion lager i DI vatten än i PBS under annars identiska villkor.
Efter att vesiklarna är uttömda från gränsskiktet, blir immobiliseringen en helt transport-begränsad process. I denna regim kommer nedfallet inte att bero på det Suspenderande mediet (t. ex. DI-vatten eller PBS) så länge viskositeten är densamma och transporten är helt diffus. Transporten av vesikler till attraktionskraften får dock inte vara helt diffus. Till exempel, om provet i en oskaftade droppe på AFM substratet delvis avdunstar under inkubationen, kommer vätskan inne i droppe utsättas för avdunstning-driven flöde, och transporten av vesiklarna mot underlaget kommer att ha, både, diffusiva och konvektiva bidrag. När avdunstning inte är tillräckligt kontrollerad, bidraget av en konvektiv transport kommer att vara betydande, och graden av immobilisering kommer att vara högre än väntat. Effekten av konvektiv transport kommer att förändras med tjockleken på attraktionslagret, som i sig beror på det Joniska innehållet i vätskan. Dessutom kommer avdunstningen att öka vesikeln immobilisering på underlaget genom att koncentrera EVs i lösningen. Vid högre EV-koncentrationer kommer koncentrations lutningen mellan attraktionslagret och den intilliggande vätskan att öka, vilket skapar en större termodynamisk drivande kraft till migrationen av vesikler mot underlaget.
Immobiliserade blåsor kan representera ett flytande prov med en bias. För det fall då graden av immobilisering begränsas genom diffusion, är vesikler med mindre hydrodynamiska storlekar, som bestäms av kombinationen av vesikelstorlek och tjockleken på det koronala skiktet som omger den (figur 1), mer benägna att gå in i attraktionslagret på grund av deras högre rörlighet. Efter den initiala utarmningen kommer därför den hydrodynamiskt små EVs att överrepresenteras på underlaget jämfört med deras bidrag till EV-populationen i vätske provet. Observera att en mindre hydrodynamisk storlek inte automatiskt pekar på EVs med mindre vesikelstorlekar på grund av heterogenitet i tjockleken på det koronala skiktet3. Den partiska representationen undviks med långa inkuberingar som bryter ned hela populationen av EVs i vätskan genom dess immobilisering på substratet. När en användare syftar till att immobilisera alla EVs från Biofluid, för att undvika alltför tät täckning av ytan med immobiliserade blåsor, kan det vara nödvändigt att minska EV koncentrationen i vätskan under det intervall som föreslås i protokollet.
Deformation av EVs på underlaget
Extracellulära blåsor i deras ursprungliga hydrerade tillstånd och efter uttorkning kan kännetecknas av AFM, som beskrivs i protokollet. De elektrostatiska krafterna24 som immobilisera EVS på glimmerytan snedvrider också deras form från klotformig geometri där de finns i lösningen. Effekten av uttorkning på storlek och morfologi immobiliserade EVs kan analyseras genom att skanna samma yta före och efter provet får torka.
Det är lärorikt att undersöka hur prov preparationen påverkar formen på den uttorkade EVs. Den elektrostatiskt immobiliserade EVs upprätthålla mycket Oblate geometri efter torkning men ytterligare tillplattad av uttorkning. Höjden ovanför ytan av de Desiccated vesiklarna blir mindre än i figur 12A, medan deras fotavtryck område ökar (data visas inte). Å andra sidan, när blåsor deponeras passivt under vätskeavdunstning och utan tidigare immobilisering på ytan, tenderar de att uppnå en kopp-formgeometri vid uttorkning, vilket har länge observerats i SEM bilder och, mer nyligen, i AFM Skannar. Denna koppade form är nu erkänd som ett provberedning artefakt25 orsakas av icke-enhetlighet i kapillärkrafter under ytan uttorkning, som mekanistiskt förklaras i figur 141.
Bildanalys och tolkning av AFM-data
Svaren på elektrostatiska och kapillärkrafter som agerar för att förvränga formen på EVs ger värdefull information om strukturella och sammansatta egenskaper hos EVs. Till exempel användes en flerdimensionell uppsättning biofysiska egenskaper, såsom den deformerade storleken och formen som extraherats från AFM-data, nyligen för att påvisa genomförbarheten för att skilja mellan exosomer som utsöndras av olika värdceller5. Snedvridningen kan också tas i beaktande och kompenseras. Till exempel, vi visade hur man använder AFM data för att karakterisera den globulära storleken på vesikler i lösningen genom att uppskatta diametrarna av sfärer som kapslar in samma volym som immobiliserade exososmes3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna erkänner ekonomiskt stöd från National Science Foundation (Award nummer IGERT-0903715), University of Utah (Institutionen för kemiteknik Seed Grant och Graduate Research Fellowship Award), och Skolkovo Institute of Science och teknik (Skoltech Fellowship).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM/STM Controller | Bruker | Multimode Nanoscope V | This AFM controller supports imaging of biological samples in liquid and air. |
| AFM/STM metal specimen discs (10 mm) | TedPella | 16207 | Metal specimen disc on which a mica disk is attached by a double-sided tape or other means. |
| AFM/STM Mica discs (10 mm) | TedPella | 50 | Highest quality grade V1 mica, 0.21mm (0.0085”) thick. Interleaved, in packages of 10. Can be mounted on AFM/STM discs. Available in four diameters |
| AFM probe for imaging in the air | Bruker | TESP-V2 | High quality etched silicon probes for tapping mode and non-contact mode for scanning in the air. |
| AFM probe for soft sample imaging in liquid | Bruker | MLCT | Soft silicon nitride cantilevers with silicon nitride tips, which are well-suited for liquid operation. The range in force constants enables users to image extremely soft samples in contact mode as well as high load vs distance spectroscopy. |
| Double sided tape | Spectrum | 360-77705 | Used to fix the mica disk on the metal specimen disc. |
| ExoQuick-TC | System Biosciences | EXOTC50A-1 | ExoQuick-TC is a proprietary polymer-based kit designed for exosome isolation from tissue culture media. |
| Glass probe AFM holder for imaging in liquid | Bruker | MTFML-V2 | This glass probe holder is designed for scanning in fluid with the MultiMode AFM. The holder can be used in peak force tapping mode, contact mode, tapping mode, and force modulation. The probe is acoustically driven by a separate piezo oscillator for larger amplitude modulation. The holder is supplied with two ports, required fittings, and accessories kit for adding and removing fluids. |
| Gwyddion | Czech Metrology Institute. | Version 2.52 | Open Source software for visualization and analysis of data fields obtained by scanning probe microscopy techniques. |
| Lint-free blotting paper | GE Healthcare Whatman | Grade GB003 Blotting Paper | Use this blotting paper to remove NiCl2 after the modification of the mica's substrate. |
| Lint-free cleanroom wipes | Texwipe | AlphaWipe TX1004 | Use these polyester wipes for surface cleaning. |
| Nickel(II) chloride (NiCl2) | Sigma-Aldrich | 339350 | Powder used to make 10 mM NiCl2 in DI water |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | Gibco | 10010023 | PBS, pH 7.4 |
References
- Chernyshev, V. S., et al. Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 407, 3285-3301 (2015).
- Ramirez, M. I., et al. Technical challenges of working with extracellular vesicles. Nanoscale. 10, 881-906 (2018).
- Skliar, M., et al. Membrane proteins significantly restrict exosome mobility. Biochemical and Biophysical Research Communications. 501, 1055-1059 (2018).
- Parisse, P., et al. Atomic force microscopy analysis of extracellular vesicles. European Biophysics Journal. 46, 813-820 (2017).
- Ito, K., et al. Host Cell Prediction of Exosomes Using Morphological Features on Solid Surfaces Analyzed by Machine Learning. Journal of Physical Chemistry B. 122, 6224-6235 (2018).
- Sharma, S., LeClaire, M., Gimzewski, J. K. Ascent of atomic force microscopy as a nanoanalytical tool for exosomes and other extracellular vesicles. Nanotechnology. 29, 132001 (2018).
- Meyer, R. L. Immobilisation of living bacteria for AFM imaging under physiological conditions. Ultramicroscopy. 110, 1349-1357 (2010).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A., et al. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current protocols in cell biology. Chapter 3 (Unit 3.22), (2006).
- Taylor, D. D., Zacharias, W., Gercel-Taylor, C. Exosome isolation for proteomic analyses and RNA profiling. Methods in Molecular Biology. 728, 235-246 (2011).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 8, 1535750 (2019).
- Weng, Y., et al. Effective isolation of exosomes with polyethylene glycol from cell culture supernatant for in-depth proteome profiling. The Analyst. 141, 4640-4646 (2016).
- Nečas, D., Klapetek, P. Gwyddion: an open-source software for SPM data analysis. Open Physics. 10, 181-188 (2012).
- Hsueh, C., Chen, H., Gimzewski, J. K., Reed, J., Abdel-Fattah, T. M. Localized nanoscopic surface measurements of nickel-modified Mica for single-molecule DNA sequence sampling. ACS Applied Materials and Interfaces. 2, 3249-3256 (2010).
- Conde-Vancells, J., et al. Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes. Journal of Proteome Research. 7, 5157-5166 (2008).
- Zhou, Y., et al. Exosomes released by human umbilical cord mesenchymal stem cells protect against cisplatin-induced renal oxidative stress and apoptosis in vivo and in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 4, 34 (2013).
- Coleman, B. M., Hanssen, E., Lawson, V. A., Hill, A. F. Prion-infected cells regulate the release of exosomes with distinct ultrastructural features. FASEB Journal. 26, 4160-4173 (2012).
- Briegel, A., et al. Universal architecture of bacterial chemoreceptor arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 17181-17186 (2009).
- Akagi, T., et al. On-Chip Immunoelectrophoresis of Extracellular Vesicles Released from Human Breast Cancer Cells. PLOS ONE. 10, e0123603 (2015).
- Sharma, S., et al. Structural-mechanical characterization of nanoparticle exosomes in human saliva, using correlative AFM, FESEM, and force spectroscopy. ACS Nano. 4, 1921-1926 (2010).
- Radeghieri, A., et al. Cultured human amniocytes express hTERT, which is distributed between nucleus and cytoplasm and is secreted in extracellular vesicles. Biochemical and Biophysical Research Communications. 483, 706-711 (2017).
- Woo, J., Sharma, S., Gimzewski, J. The Role of Isolation Methods on a Nanoscale Surface Structure and Its Effect on the Size of Exosomes. Journal of Circulating Biomarkers. 5, 11 (2016).
- Deegan, R. D., et al. Capillary flow as the cause of ring stains from dried liquid drops. Nature. 389, 827-829 (1997).
- Johnson, C. A., Lenhoff, A. M. Adsorption of Charged Latex Particles on Mica Studied by Atomic Force Microscopy. Journal of Colloid and Interface Science. 179, 587-599 (1996).
- Pastré, D., et al. Adsorption of DNA to Mica Mediated by Divalent Counterions: A Theoretical and Experimental Study. Biophysical Journal. 85, 2507-2518 (2003).
- van der Pol, E., Böing, A. N., Harrison, P., Sturk, A., Nieuwland, R. Classification, functions, and clinical relevance of extracellular vesicles. Pharmacological Reviews. 64, 676-705 (2012).
